JPH09145713A - 抗原又は抗体の検査材の評価方法 - Google Patents
抗原又は抗体の検査材の評価方法Info
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- JPH09145713A JPH09145713A JP7302697A JP30269795A JPH09145713A JP H09145713 A JPH09145713 A JP H09145713A JP 7302697 A JP7302697 A JP 7302697A JP 30269795 A JP30269795 A JP 30269795A JP H09145713 A JPH09145713 A JP H09145713A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 固定化された抗原又は抗体の量を容易に定量
でき、抗原又は抗体の検査材の性能を安定して評価しう
る方法を提供すること。 【解決手段】 抗原又は抗体を固定担体で固定した検査
材の性能を評価するため、固定化抗原又は抗体に対する
抗体又は抗原を別途調製し、その希釈列を作成してお
き、この希釈列を評価対象である検査材と接触させ、抗
原−抗体複合体を生成させ、その複合体に特異的に結合
する標識化合物を結合させ、その標識化合物の発色反応
により検査材に固定化されていた抗原又は抗体の量を測
定する。
でき、抗原又は抗体の検査材の性能を安定して評価しう
る方法を提供すること。 【解決手段】 抗原又は抗体を固定担体で固定した検査
材の性能を評価するため、固定化抗原又は抗体に対する
抗体又は抗原を別途調製し、その希釈列を作成してお
き、この希釈列を評価対象である検査材と接触させ、抗
原−抗体複合体を生成させ、その複合体に特異的に結合
する標識化合物を結合させ、その標識化合物の発色反応
により検査材に固定化されていた抗原又は抗体の量を測
定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原−抗体反応を
利用して各種の感染症を診断するために用いられる、既
知の抗原又は抗体を固定した検査材の性能を評価する方
法に関する。
利用して各種の感染症を診断するために用いられる、既
知の抗原又は抗体を固定した検査材の性能を評価する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】唾液、血液、リンパ液などの生物学的液
体中の抗原又は抗体を検出するため、既知の抗原又は抗
体を固定した検査材が種々提案されている。それらの多
くは、担体の吸着作用によって抗原又は抗体を固定して
いるので、その抗原又は抗体の付着量が必ずしも一定せ
ず、性能の評価が問題となっている。その性能を評価す
るため操作の簡便な凝集沈降法を用いることが考えられ
るが、凝集像の判定はプレートの性質によっても左右さ
れ、安定性を欠くという問題点があった。
体中の抗原又は抗体を検出するため、既知の抗原又は抗
体を固定した検査材が種々提案されている。それらの多
くは、担体の吸着作用によって抗原又は抗体を固定して
いるので、その抗原又は抗体の付着量が必ずしも一定せ
ず、性能の評価が問題となっている。その性能を評価す
るため操作の簡便な凝集沈降法を用いることが考えられ
るが、凝集像の判定はプレートの性質によっても左右さ
れ、安定性を欠くという問題点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固定化され
た抗原又は抗体の量を容易に定量でき、抗原又は抗体の
検査材の性能を安定して評価しうる方法を提供すること
を目的とする。
た抗原又は抗体の量を容易に定量でき、抗原又は抗体の
検査材の性能を安定して評価しうる方法を提供すること
を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明による抗原又は抗
体の検査材の評価方法は、検査材を固定化抗原又は固定
化抗体に対する抗体又は抗原を含む液と接触させ、後者
の抗体又は抗原に特異的に結合する標識化合物を結合さ
せ、その標識化合物の発色反応により検査材に固定化さ
れていた抗原又は抗体の量を測定することを特徴とす
る。
体の検査材の評価方法は、検査材を固定化抗原又は固定
化抗体に対する抗体又は抗原を含む液と接触させ、後者
の抗体又は抗原に特異的に結合する標識化合物を結合さ
せ、その標識化合物の発色反応により検査材に固定化さ
れていた抗原又は抗体の量を測定することを特徴とす
る。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の評価方法を適用する検査
材には、特に制限はなく、様々な固定担体に抗原又は抗
体を固定したものであってよい。検査材の具体例として
は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０で、平均粒径が１〜１
００００ミクロンのリン酸カルシウム系化合物粒子に抗
原又は抗体を固定した抗原又は抗体の検出ビーズ、リン
酸カルシウム系化合物粒子を担持した繊維集合体に抗原
又は抗体を固定した抗原又は抗体の検出シート（特願平
６−２１４７０６号明細書参照）、ポリマー粒子中にリ
ン酸カルシウム系化合物粒子の一部分が貫入して該ポリ
マー粒子表面が該リン酸カルシウム系化合物で被覆され
ている粒状ポリマー複合体（特開平７−１９４９７０号
公報参照）に抗原又は抗体を固定したビーズ、ポリマー
粒子の表面がリン酸カルシウム系化合物で被覆されてお
り、該ポリマー粒子が染色されているか、又は全体が染
色されている粒状ポリマー複合体に抗原又は抗体を固定
したビーズ（特開平７−１７４７６２号公報参照）など
が挙げられる。
材には、特に制限はなく、様々な固定担体に抗原又は抗
体を固定したものであってよい。検査材の具体例として
は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０で、平均粒径が１〜１
００００ミクロンのリン酸カルシウム系化合物粒子に抗
原又は抗体を固定した抗原又は抗体の検出ビーズ、リン
酸カルシウム系化合物粒子を担持した繊維集合体に抗原
又は抗体を固定した抗原又は抗体の検出シート（特願平
６−２１４７０６号明細書参照）、ポリマー粒子中にリ
ン酸カルシウム系化合物粒子の一部分が貫入して該ポリ
マー粒子表面が該リン酸カルシウム系化合物で被覆され
ている粒状ポリマー複合体（特開平７−１９４９７０号
公報参照）に抗原又は抗体を固定したビーズ、ポリマー
粒子の表面がリン酸カルシウム系化合物で被覆されてお
り、該ポリマー粒子が染色されているか、又は全体が染
色されている粒状ポリマー複合体に抗原又は抗体を固定
したビーズ（特開平７−１７４７６２号公報参照）など
が挙げられる。
【０００６】リン酸カルシウム系化合物を抗原又は抗体
の吸着固定に用いる場合、リン酸カルシウム系化合物と
しては、特に制限はなく、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０
の各種の化合物を使用することができ、例えば、Ｃａ10
（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ
10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及
びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)2 のうちから選ばれた１種又は２種
以上を使用することができる。これらのうちハイドロキ
シアパタイトを主成分とするものが最も好ましい。
の吸着固定に用いる場合、リン酸カルシウム系化合物と
しては、特に制限はなく、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０
の各種の化合物を使用することができ、例えば、Ｃａ10
（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ
10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及
びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)2 のうちから選ばれた１種又は２種
以上を使用することができる。これらのうちハイドロキ
シアパタイトを主成分とするものが最も好ましい。
【０００７】リン酸カルシウム系化合物は、細菌やウイ
ルスなどの抗原及び抗体に対して優れた吸着作用を有す
るが、抗原又は抗体を吸着させた後、グルタールアルデ
ヒドなどの架橋剤、ホルムアルデヒド、シランカップリ
ング剤などの結合剤、あるいは四塩化オスミウムを用い
て固定化を確実にするのが好ましい。シランカップリン
グ剤としては、例えば、３−グリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン、３−チオプロピルトリメトキシシラ
ン、２−（３−トリメトキシシリルプロピルジチオ）−
５−ニトロピリジン、３−アミノプロピルトリエトキシ
シラン、３−クロロプロピルジメトキシメチルシランな
どが挙げられる。
ルスなどの抗原及び抗体に対して優れた吸着作用を有す
るが、抗原又は抗体を吸着させた後、グルタールアルデ
ヒドなどの架橋剤、ホルムアルデヒド、シランカップリ
ング剤などの結合剤、あるいは四塩化オスミウムを用い
て固定化を確実にするのが好ましい。シランカップリン
グ剤としては、例えば、３−グリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン、３−チオプロピルトリメトキシシラ
ン、２−（３−トリメトキシシリルプロピルジチオ）−
５−ニトロピリジン、３−アミノプロピルトリエトキシ
シラン、３−クロロプロピルジメトキシメチルシランな
どが挙げられる。
【０００８】固定化後、抗原又は抗体の未吸着部位をブ
ロッキング剤でブロックするのが好ましい。ブロッキン
グ剤としては、リン酸カルシウム系化合物の未吸着部位
に吸着されるものであって、その後の抗原−抗体反応に
影響を与えないものであれば特に制限はないが、カゼイ
ン、アルブミンなどの蛋白質が好適である。
ロッキング剤でブロックするのが好ましい。ブロッキン
グ剤としては、リン酸カルシウム系化合物の未吸着部位
に吸着されるものであって、その後の抗原−抗体反応に
影響を与えないものであれば特に制限はないが、カゼイ
ン、アルブミンなどの蛋白質が好適である。
【０００９】本発明の方法を実施する場合、まず、固定
化抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を別途調製し、そ
の希釈列を作成しておき、この希釈列を評価対象である
抗原又は抗体の検査材と接触させ、抗原−抗体反応を行
わせて抗原−抗体複合体を生成させ、この複合体と特異
的に結合する標識化合物で標識し、発色反応によって固
定化抗原又は固定化抗体を定量する。上記希釈例の作成
には、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などを用い
るのが好ましい。
化抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を別途調製し、そ
の希釈列を作成しておき、この希釈列を評価対象である
抗原又は抗体の検査材と接触させ、抗原−抗体反応を行
わせて抗原−抗体複合体を生成させ、この複合体と特異
的に結合する標識化合物で標識し、発色反応によって固
定化抗原又は固定化抗体を定量する。上記希釈例の作成
には、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などを用い
るのが好ましい。
【００１０】標識化合物としては、固定化抗原又は固定
化抗体に反応させた抗体又は抗原に特異的に結合するも
のであれば任意のものを使用しうるが、例えば、ペルオ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、
酸性ホスファターゼ又はアルカリ性ホスファターゼを標
識酵素とした抗体又は抗原を用いるのが好ましい。この
ような標識酵素を用いることによりその後の発色反応を
容易に行うことができ、それにより固定化された抗原又
は抗体の量を容易に定量することが可能となる。すなわ
ち、酵素で標識し、その酵素と反応して発色する基質を
用いて容易に発色反応を行うことができる。基質として
は、例えば、免疫組織染色用基質〔Ｋｉｒｋｅｇａａｒ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社製、商品
名：トルー・ブルー（True Blue ）、３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン及び過酸化水素を含有す
る〕、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）などが
挙げられる。
化抗体に反応させた抗体又は抗原に特異的に結合するも
のであれば任意のものを使用しうるが、例えば、ペルオ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、
酸性ホスファターゼ又はアルカリ性ホスファターゼを標
識酵素とした抗体又は抗原を用いるのが好ましい。この
ような標識酵素を用いることによりその後の発色反応を
容易に行うことができ、それにより固定化された抗原又
は抗体の量を容易に定量することが可能となる。すなわ
ち、酵素で標識し、その酵素と反応して発色する基質を
用いて容易に発色反応を行うことができる。基質として
は、例えば、免疫組織染色用基質〔Ｋｉｒｋｅｇａａｒ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社製、商品
名：トルー・ブルー（True Blue ）、３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン及び過酸化水素を含有す
る〕、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）などが
挙げられる。
【００１１】
【実施例】次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらによって制限されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はこれらによって制限されるもの
ではない。
【００１２】実施例１ （１）固定担体としての粒状ポリマー複合体の製造 キノフタロン系分散染料である商品名 MITSUI ML Color
s ML Yellow VF-2（三井東圧染料（株）製）で染色した
平均粒径７μｍ、密度１．１９ｇ／ｃｍ3 のポリメチル
メタクリレートビーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．５、平均
粒径２μｍ、比表面積１２ｍ2 ／ｇ、みかけ密度２．４
ｇ／ｃｍ3 、細孔径１０００Åのリン酸カルシウム系化
合物粒子５．０ｇを奈良ハイブリダイゼーションシステ
ムＮＨＳ−１（奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋ
ｗ、定格電流２３Ａ）を８０００回転／分で３８〜７１
℃で５分間稼動させてポリメチルメタクリレートビーズ
表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した。得られた
リン酸カルシウム系化合物被覆層の厚さは、平均０．２
７μｍであり、得られた複合体粒子は、淡黄色を呈する
平均粒径７．５μｍ、密度１．３ｇ／ｃｍ3 、細孔径１
０００Åであった。
s ML Yellow VF-2（三井東圧染料（株）製）で染色した
平均粒径７μｍ、密度１．１９ｇ／ｃｍ3 のポリメチル
メタクリレートビーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．５、平均
粒径２μｍ、比表面積１２ｍ2 ／ｇ、みかけ密度２．４
ｇ／ｃｍ3 、細孔径１０００Åのリン酸カルシウム系化
合物粒子５．０ｇを奈良ハイブリダイゼーションシステ
ムＮＨＳ−１（奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋ
ｗ、定格電流２３Ａ）を８０００回転／分で３８〜７１
℃で５分間稼動させてポリメチルメタクリレートビーズ
表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した。得られた
リン酸カルシウム系化合物被覆層の厚さは、平均０．２
７μｍであり、得られた複合体粒子は、淡黄色を呈する
平均粒径７．５μｍ、密度１．３ｇ／ｃｍ3 、細孔径１
０００Åであった。
【００１３】（２）検査材の製造 この複合体粒子に日本脳炎中山株ワクチン抗原を吸着さ
せた後、遠心処理して過剰な抗原を取り除き、さらに
０．１％グルタールアルデヒド溶液を加え、複合体粒子
に吸着した抗原を固定化し、カゼインを含む商品名ブロ
ックエース（雪印乳業（株）製）を加え、よく攪拌した
後、遠心処理し、過剰なブロックエースを除去し、中山
株ワクチン抗原固定化複合体ビーズを得た。
せた後、遠心処理して過剰な抗原を取り除き、さらに
０．１％グルタールアルデヒド溶液を加え、複合体粒子
に吸着した抗原を固定化し、カゼインを含む商品名ブロ
ックエース（雪印乳業（株）製）を加え、よく攪拌した
後、遠心処理し、過剰なブロックエースを除去し、中山
株ワクチン抗原固定化複合体ビーズを得た。
【００１４】（３）検査材の評価 得られた中山株ワクチン抗原固定化複合体ビーズ０．５
Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）が１００マイ
クロリットルずつ入った試験管に、５００倍から倍々希
釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対するウサギ抗
血清１００マイクロリットルをそれぞれ加え、室温で４
５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで５分
間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を除去した後、
抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００倍希
釈５００マイクロリットルを各試験管に加え、室温で１
時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色用基質〔Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．社製、商品名：トルー・ブルー（True Blue ）〕５
０マイクロリットルを加え、１分後に水を加えることに
より反応を停止させた。ビーズの発色は、抗血清希釈濃
度５００倍から４０００倍まで一定濃度の発色（青緑
色）が認められ、それ以上の希釈倍率では発色が薄くな
っていくのが認められ、１６０００倍まで抗血清濃度０
のコントロールに比べて明確に発色の差異が確認でき
た。したがって、上記検査方法で中山株ワクチン抗原固
定化複合体ビーズの固定抗原量、あるいは抗体量の視覚
的な判定が可能であった。
Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）が１００マイ
クロリットルずつ入った試験管に、５００倍から倍々希
釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対するウサギ抗
血清１００マイクロリットルをそれぞれ加え、室温で４
５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで５分
間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を除去した後、
抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００倍希
釈５００マイクロリットルを各試験管に加え、室温で１
時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色用基質〔Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．社製、商品名：トルー・ブルー（True Blue ）〕５
０マイクロリットルを加え、１分後に水を加えることに
より反応を停止させた。ビーズの発色は、抗血清希釈濃
度５００倍から４０００倍まで一定濃度の発色（青緑
色）が認められ、それ以上の希釈倍率では発色が薄くな
っていくのが認められ、１６０００倍まで抗血清濃度０
のコントロールに比べて明確に発色の差異が確認でき
た。したがって、上記検査方法で中山株ワクチン抗原固
定化複合体ビーズの固定抗原量、あるいは抗体量の視覚
的な判定が可能であった。
【００１５】実施例２ （１）固定担体の製造 アントラキノン系分散染料である商品名 MITSUI ML Col
ors ML red VF-２（三井東圧染料（株）製）で染色した
平均粒径５μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ3 のナイロンビ
ーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．６７、平均粒径５μｍ、比
表面積４５ｍ2／ｇ、みかけ密度１．８ｇ／ｃｍ3 、細
孔径６００Åのハイドロキシアパタイト粒子７．５ｇを
奈良ハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（奈良
機械製作所製、定格動力５．５ｋｗ、定格電流２３Ａ）
を８０００回転／分で３２〜５０℃で５分間稼動させ
て、ナイロンビーズ表面をハイドロキシアパタイトで被
覆した。得られたハイドロキシアパタイト被覆層の厚さ
は、平均０．４４μｍであり、得られた複合体粒子は、
ピンク色を呈する平均粒径５．８μｍ、密度１．１３ｇ
／ｃｍ3 、細孔径６００Åであった。
ors ML red VF-２（三井東圧染料（株）製）で染色した
平均粒径５μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ3 のナイロンビ
ーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．６７、平均粒径５μｍ、比
表面積４５ｍ2／ｇ、みかけ密度１．８ｇ／ｃｍ3 、細
孔径６００Åのハイドロキシアパタイト粒子７．５ｇを
奈良ハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（奈良
機械製作所製、定格動力５．５ｋｗ、定格電流２３Ａ）
を８０００回転／分で３２〜５０℃で５分間稼動させ
て、ナイロンビーズ表面をハイドロキシアパタイトで被
覆した。得られたハイドロキシアパタイト被覆層の厚さ
は、平均０．４４μｍであり、得られた複合体粒子は、
ピンク色を呈する平均粒径５．８μｍ、密度１．１３ｇ
／ｃｍ3 、細孔径６００Åであった。
【００１６】（２）検査材の製造及び評価 得られた複合体ビーズに実施例１（２）と同様にしてＡ
型インフルエンザ抗原を固定し、得られた抗原固定化複
合体ビーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢ
Ｓ）を９６穴Ｖ底マイクロプレートの各ウエル（well）
に５０マイクロリットルずつ入れ、上記ウイルスに対す
るウサギ抗血清及び他のウイルスに対するウサギ抗血清
を様々な濃度に希釈したものを５０マイクロリットルず
つ添加し、室温で１時間振盪した。マイクロプレートご
と遠心し、ビーズペレットを形成させた後、上澄みを捨
て、ＰＢＳを加え、遠心洗浄を２回繰り返した。抗ウサ
ギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００倍希釈５０
マイクロリットルを加え、１時間常温で振盪した後、Ｐ
ＢＳにより遠心洗浄した。免疫組織染色用基質（商品
名、トルー・ブルー）２５マイクロリットルを加え、１
分後に水を加えることにより反応を停止させた。この結
果、他のウイルスに対する抗血清を用いた場合には検査
材はすべて発色せず、一方、Ａ型インフルエンザウイル
スに対する抗血清を加えたものでは１００００倍に希釈
しても、発色（紫色）が認められた。したがって、この
評価方法は、極めて感度の良いものであることが証明さ
れた。
型インフルエンザ抗原を固定し、得られた抗原固定化複
合体ビーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢ
Ｓ）を９６穴Ｖ底マイクロプレートの各ウエル（well）
に５０マイクロリットルずつ入れ、上記ウイルスに対す
るウサギ抗血清及び他のウイルスに対するウサギ抗血清
を様々な濃度に希釈したものを５０マイクロリットルず
つ添加し、室温で１時間振盪した。マイクロプレートご
と遠心し、ビーズペレットを形成させた後、上澄みを捨
て、ＰＢＳを加え、遠心洗浄を２回繰り返した。抗ウサ
ギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００倍希釈５０
マイクロリットルを加え、１時間常温で振盪した後、Ｐ
ＢＳにより遠心洗浄した。免疫組織染色用基質（商品
名、トルー・ブルー）２５マイクロリットルを加え、１
分後に水を加えることにより反応を停止させた。この結
果、他のウイルスに対する抗血清を用いた場合には検査
材はすべて発色せず、一方、Ａ型インフルエンザウイル
スに対する抗血清を加えたものでは１００００倍に希釈
しても、発色（紫色）が認められた。したがって、この
評価方法は、極めて感度の良いものであることが証明さ
れた。
【００１７】実施例３ （１）固定担体の製造 平均粒径５μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ3 のナイロンビ
ーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．６７、平均粒径５μｍ、比
表面積４５ｍ2 ／ｇ、みかけ密度１．８ｇ／ｃｍ3 、細
孔径６００Åのハイドロキシアパタイト粒子７．５ｇを
奈良ハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（奈良
機械製作所製、定格動力５．５ｋｗ、定格電流２３Ａ）
を８０００回転／分で３４〜４７℃で５分間稼動させ
て、ナイロンビーズ表面をハイドロキシアパタイトで被
覆した。得られたハイドロキシアパタイト被覆層の厚さ
は、平均０．４５μｍであり、得られた複合体粒子は、
平均粒径５．８μｍ、密度１．１２ｇ／ｃｍ3 、細孔径
６００Åであった。
ーズ５０ｇとＣａ／Ｐ比１．６７、平均粒径５μｍ、比
表面積４５ｍ2 ／ｇ、みかけ密度１．８ｇ／ｃｍ3 、細
孔径６００Åのハイドロキシアパタイト粒子７．５ｇを
奈良ハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（奈良
機械製作所製、定格動力５．５ｋｗ、定格電流２３Ａ）
を８０００回転／分で３４〜４７℃で５分間稼動させ
て、ナイロンビーズ表面をハイドロキシアパタイトで被
覆した。得られたハイドロキシアパタイト被覆層の厚さ
は、平均０．４５μｍであり、得られた複合体粒子は、
平均粒径５．８μｍ、密度１．１２ｇ／ｃｍ3 、細孔径
６００Åであった。
【００１８】（２）検査材の製造及び評価 得られた複合体粒子に実施例１（２）と同様の方法で日
本脳炎中山株ワクチン抗原を固定させ、得られた抗原固
定化複合体ビーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液
を１００マイクロリットルずつ入れた試験管に、５００
倍から倍々希釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対
するウサギ抗血清１００マイクロリットルをそれぞれ加
え、室温で４５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１５００
ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を
除去した後、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体
の５００倍希釈５００マイクロリットルを各試験管に加
え、室温で１時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色
用基質（商品名、トルー・ブルー）５０マイクロリット
ルを加え、１分後に水を加えることにより反応を停止さ
せた。ビーズの発色は、抗血清希釈濃度５００倍から４
０００倍まで一定濃度の発色（青色）が認められ、それ
以上の希釈倍率では発色が薄くなっていくのが認めら
れ、１６０００倍まで抗血清濃度０のコントロールに比
べて明確に発色の差異が確認できた。したがって、上記
検査方法で中山株ワクチン抗原固定化複合体ビーズの固
定抗原量、あるいは抗体量の視覚的な判定が可能であっ
た。
本脳炎中山株ワクチン抗原を固定させ、得られた抗原固
定化複合体ビーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液
を１００マイクロリットルずつ入れた試験管に、５００
倍から倍々希釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対
するウサギ抗血清１００マイクロリットルをそれぞれ加
え、室温で４５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１５００
ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を
除去した後、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体
の５００倍希釈５００マイクロリットルを各試験管に加
え、室温で１時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色
用基質（商品名、トルー・ブルー）５０マイクロリット
ルを加え、１分後に水を加えることにより反応を停止さ
せた。ビーズの発色は、抗血清希釈濃度５００倍から４
０００倍まで一定濃度の発色（青色）が認められ、それ
以上の希釈倍率では発色が薄くなっていくのが認めら
れ、１６０００倍まで抗血清濃度０のコントロールに比
べて明確に発色の差異が確認できた。したがって、上記
検査方法で中山株ワクチン抗原固定化複合体ビーズの固
定抗原量、あるいは抗体量の視覚的な判定が可能であっ
た。
【００１９】実施例４ 粒径３００〜６００ミクロン（平均粒径４５０μｍ）、
細孔径０．００５〜０．０１ミクロン、比表面積１０ｍ
2 ／ｇの多孔質ハイドロキシアパタイト粒子に実施例１
（２）と同様の方法で日本脳炎中山株ワクチン抗原を固
定させ、得られた抗原固定化ハイドロキシアパタイトビ
ーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液を１００マイ
クロリットルずつ入れた試験管に、５００倍から倍々希
釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対するウサギ抗
血清１００マイクロリットルをそれぞれ加え、室温で４
５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１０００ｒｐｍで３３
分間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を除去した
後、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００
倍希釈５００マイクロリットルを各試験管に加え、室温
で１時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色用基質
（商品名、トルー・ブルー）５０マイクロリットルを加
え、１分後に水を加えることにより反応を停止させた。
ビーズの発色は、抗血清希釈濃度５００倍から４０００
倍まで一定濃度の発色（青色）が認められ、それ以上の
希釈倍率では発色が薄くなっていくのが認められ、１６
０００倍まで抗血清濃度０のコントロールに比べて明確
に発色の差異が確認できた。したがって、上記検査方法
で中山株ワクチン抗原固定化ハイドロキシアパタイトビ
ーズの固定抗原量、あるいは抗体量の視覚的な判定が可
能であった。
細孔径０．００５〜０．０１ミクロン、比表面積１０ｍ
2 ／ｇの多孔質ハイドロキシアパタイト粒子に実施例１
（２）と同様の方法で日本脳炎中山株ワクチン抗原を固
定させ、得られた抗原固定化ハイドロキシアパタイトビ
ーズ０．５Ｗ／Ｖ％を含むリン酸塩緩衝液を１００マイ
クロリットルずつ入れた試験管に、５００倍から倍々希
釈で３２０００倍まで希釈した中山株に対するウサギ抗
血清１００マイクロリットルをそれぞれ加え、室温で４
５分間振盪した。ＰＢＳを加え、１０００ｒｐｍで３３
分間遠心し、上澄みを除き、未反応の抗体を除去した
後、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体の５００
倍希釈５００マイクロリットルを各試験管に加え、室温
で１時間振盪した。遠心洗浄後、免疫組織染色用基質
（商品名、トルー・ブルー）５０マイクロリットルを加
え、１分後に水を加えることにより反応を停止させた。
ビーズの発色は、抗血清希釈濃度５００倍から４０００
倍まで一定濃度の発色（青色）が認められ、それ以上の
希釈倍率では発色が薄くなっていくのが認められ、１６
０００倍まで抗血清濃度０のコントロールに比べて明確
に発色の差異が確認できた。したがって、上記検査方法
で中山株ワクチン抗原固定化ハイドロキシアパタイトビ
ーズの固定抗原量、あるいは抗体量の視覚的な判定が可
能であった。
【００２０】実施例５ ポリエチレン５０重量％とポリエチレンテレフタレート
エステル５０重量％からなる厚さ０．２ｍｍの不織布に
ほぼ一様に平均粒径３．５μｍ、Ｃａ／Ｐ比１．６７の
多孔質ハイドロキシアパタイト顆粒を加熱処理により２
４重量％担持させたセラミックス担持繊維集合体（大き
さ５ｍｍ×５ｍｍ）にＡ型インフルエンザウイルス２５
６ＨＡ価を吸着させた後、グルタールアルデヒド０．０
５重量％溶液に浸漬して固定処理を行い、上記繊維集合
体のインフルエンザウイルス未吸着部位をマスキングす
るためにカゼインを含むブロッキング剤である商品名ブ
ロックエース（雪印乳業（株）製）の４倍希釈溶液に浸
漬した。ブロックエースを固定するために再度グルター
ルアルデヒド０．０５重量％で処理し、繊維集合体上に
残ったアルデヒド残基はブロックエースを含む中性緩衝
液に浸すことにより蛋白質との化学結合により不活化し
た。得られたウイルス結合繊維集合体（検出シート）を
上記ウイルスに対するウサギ抗血清及び他のウイルスに
対するウサギ抗血清を様々な濃度に希釈したものが入っ
た試験管に入れ、室温で１時間振盪した。その後、ＰＢ
Ｓで洗浄し、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体
の５００倍希釈液５００マイクロリットルを加え、１時
間常温で振盪した後、ＰＢＳにより遠心洗浄した。免疫
組織染色用基質（商品名、トルー・ブルー）２００マイ
クロリットルを加え、１分後に水を加えることにより反
応を停止させた。この結果、他のウイルスに対する抗血
清を加えたものではすべて発色せず、一方、Ａ型インフ
ルエンザウイルスに対する抗血清を加えたものでは１０
０００倍に希釈しても発色（紫色）が認められた。した
がって、この評価方法は、極めて感度の良いものである
ことが証明された。
エステル５０重量％からなる厚さ０．２ｍｍの不織布に
ほぼ一様に平均粒径３．５μｍ、Ｃａ／Ｐ比１．６７の
多孔質ハイドロキシアパタイト顆粒を加熱処理により２
４重量％担持させたセラミックス担持繊維集合体（大き
さ５ｍｍ×５ｍｍ）にＡ型インフルエンザウイルス２５
６ＨＡ価を吸着させた後、グルタールアルデヒド０．０
５重量％溶液に浸漬して固定処理を行い、上記繊維集合
体のインフルエンザウイルス未吸着部位をマスキングす
るためにカゼインを含むブロッキング剤である商品名ブ
ロックエース（雪印乳業（株）製）の４倍希釈溶液に浸
漬した。ブロックエースを固定するために再度グルター
ルアルデヒド０．０５重量％で処理し、繊維集合体上に
残ったアルデヒド残基はブロックエースを含む中性緩衝
液に浸すことにより蛋白質との化学結合により不活化し
た。得られたウイルス結合繊維集合体（検出シート）を
上記ウイルスに対するウサギ抗血清及び他のウイルスに
対するウサギ抗血清を様々な濃度に希釈したものが入っ
た試験管に入れ、室温で１時間振盪した。その後、ＰＢ
Ｓで洗浄し、抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体
の５００倍希釈液５００マイクロリットルを加え、１時
間常温で振盪した後、ＰＢＳにより遠心洗浄した。免疫
組織染色用基質（商品名、トルー・ブルー）２００マイ
クロリットルを加え、１分後に水を加えることにより反
応を停止させた。この結果、他のウイルスに対する抗血
清を加えたものではすべて発色せず、一方、Ａ型インフ
ルエンザウイルスに対する抗血清を加えたものでは１０
０００倍に希釈しても発色（紫色）が認められた。した
がって、この評価方法は、極めて感度の良いものである
ことが証明された。
【００２１】
【発明の効果】本発明の評価方法によれば、担体に固定
化された抗原又は抗体の量を発色反応によって容易に定
量でき、抗原又は抗体の検査材の性能を安定して評価す
ることができる。
化された抗原又は抗体の量を発色反応によって容易に定
量でき、抗原又は抗体の検査材の性能を安定して評価す
ることができる。
Claims (8)
- 【請求項１】 抗原又は抗体を固定担体で固定した検査
材の性能を評価するため、検査材を固定化抗原又は固定
化抗体に対する抗体又は抗原を含む液と接触させ、後者
の抗体又は抗原に特異的に結合する標識化合物を結合さ
せ、その標識化合物の発色反応により検査材に固定化さ
れていた抗原又は抗体の量を測定することを特徴とする
抗原又は抗体の検査材の評価方法。 - 【請求項２】 固定担体がＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０
で、平均粒径が１〜１００００ミクロンのリン酸カルシ
ウム系化合物粒子である請求項１記載の抗原又は抗体の
検査材の評価方法。 - 【請求項３】 固定担体が平均粒径が０．０１μｍ〜２
００μｍでＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシ
ウム系化合物粒子を担持した繊維集合体である請求項１
記載の抗原又は抗体の検査材の評価方法。 - 【請求項４】 固定担体がポリマー粒子中にＣａ／Ｐ比
が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子の一
部分が貫入して該ポリマー粒子表面が該リン酸カルシウ
ム系化合物で被覆されている粒状ポリマー複合体である
請求項１記載の抗原又は抗体の検査材の評価方法。 - 【請求項５】 固定担体がポリマー粒子の表面がＣａ／
Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物で被
覆されており、該ポリマー粒子が染色されているか、又
は全体が染色されている粒状ポリマー複合体である請求
項１記載の抗原又は抗体の検査材の評価方法。 - 【請求項６】 標識化合物がペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ
又はアルカリ性ホスファターゼを標識酵素とした抗体又
は抗原である請求項１記載の抗原又は抗体の検査材の評
価方法。 - 【請求項７】 標識化合物と反応して発色する基質を用
いて発色反応を行う請求項１記載の抗原又は抗体の検査
材の評価方法。 - 【請求項８】 検査材を固定化抗原又は固定化抗体に対
する抗体又は抗原の既知量を含む液と接触させる請求項
１記載の抗原又は抗体の検査材の評価方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7302697A JPH09145713A (ja) | 1995-11-21 | 1995-11-21 | 抗原又は抗体の検査材の評価方法 |
| US08/754,647 US6040196A (en) | 1995-11-21 | 1996-11-21 | Method of evaluating a testing element for antigens or antibodies |
| GB9624199A GB2307552B (en) | 1995-11-21 | 1996-11-21 | Method of evaluating a testing element for antigens or antibodies |
| DE19648304A DE19648304B4 (de) | 1995-11-21 | 1996-11-21 | Verfahren zum Bestimmen der Menge eines Antigens oder Antikörper auf einem Testelement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7302697A JPH09145713A (ja) | 1995-11-21 | 1995-11-21 | 抗原又は抗体の検査材の評価方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09145713A true JPH09145713A (ja) | 1997-06-06 |
Family
ID=17912109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7302697A Pending JPH09145713A (ja) | 1995-11-21 | 1995-11-21 | 抗原又は抗体の検査材の評価方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6040196A (ja) |
| JP (1) | JPH09145713A (ja) |
| DE (1) | DE19648304B4 (ja) |
| GB (1) | GB2307552B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP3974276B2 (ja) * | 1998-11-30 | 2007-09-12 | ペンタックス株式会社 | セラミックス複合体の製造方法およびセラミックス複合体 |
| JP4172883B2 (ja) | 1999-09-08 | 2008-10-29 | Ｈｏｙａ株式会社 | 薬物徐放用担体および薬物徐放用担体の製造方法 |
| US20020114800A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-08-22 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Carrier having immobilized antigens or antibodies and method of manufacturing thereof |
| JP4005338B2 (ja) * | 2000-11-29 | 2007-11-07 | ペンタックス株式会社 | 抗体固相化担体、および、その製造方法 |
| FR2836923B1 (fr) * | 2002-02-25 | 2007-06-15 | Pentax Corp | Support pour culture de cellules et procede pour cultiver des cellules. |
| JP2006098345A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Fuji Photo Film Co Ltd | センサの固定量測定装置及び方法 |
| JP4542172B2 (ja) * | 2008-05-19 | 2010-09-08 | 日本電波工業株式会社 | 感知装置及び感知方法 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US35267A (en) * | 1862-05-13 | 1862-05-13 | Oliver C Smith | improvement in piston-packing |
| US5039408A (en) * | 1986-07-05 | 1991-08-13 | Asahi Kogaku Kogyo K.K. | Packing material for liquid chromatography |
| US4119709A (en) * | 1976-02-17 | 1978-10-10 | Holub William R | Diagnostic test |
| JPH0653170B2 (ja) * | 1986-07-07 | 1994-07-20 | 旭光学工業株式会社 | β２ミクログロブリン吸着剤 |
| ES2184734T3 (es) * | 1987-04-27 | 2003-04-16 | Inverness Medical Switzerland | Dispositivo de prueba analitica para realizar ensayos de union especifica. |
| IT1215587B (it) * | 1987-06-26 | 1990-02-14 | Roussel Maestretti Spa | Derivati della 1-benzoil2-oxo 5-alcossi pirrolidina, loro procedimento di preparazione e loro impiego come sostanza medicinale. |
| JPS6438657A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-08 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | Solid phase antibody for immunoassay |
| JPS6438658A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-08 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | Solid phase antibody for immunoassay |
| JP2691586B2 (ja) * | 1987-10-22 | 1997-12-17 | 旭光学工業株式会社 | 多孔質セラミックス及びその製法 |
| JPH01126554A (ja) * | 1987-11-11 | 1989-05-18 | Meidensha Corp | 免疫測定用試薬 |
| JPH01291162A (ja) * | 1988-05-18 | 1989-11-22 | Meidensha Corp | 免疫分析用固相抗体 |
| JPH0832551B2 (ja) * | 1989-06-24 | 1996-03-29 | 旭光学工業株式会社 | 多孔質リン酸カルシウム系化合物粒子及びその製造方法 |
| CA2003942A1 (en) * | 1989-09-26 | 1991-03-26 | Julie Lia Rudolph | Solid assay support systems |
| CA2032959A1 (en) * | 1990-01-22 | 1991-07-23 | Brian A. Snyder | Article, test kit and sandwich assay for the detection of bacteroides intermedius, bacteroides gingivalis or actinobacillus actinomycetemcomotams |
| JPH06106012A (ja) * | 1992-03-16 | 1994-04-19 | Sumiaki Tsuru | フィルタ材及びその製造方法 |
| CA2098639A1 (en) * | 1992-06-19 | 1993-12-20 | K. Anne Kronis | Bone stimulating, non-vasoactive parathyroid hormone variants |
| JPH06214706A (ja) * | 1993-01-18 | 1994-08-05 | Seiko Instr Inc | ワイヤレス座標読取装置 |
| CH686518A5 (de) * | 1993-10-05 | 1996-04-15 | Asahi Optical Co Ltd | Granulares Polymerkomposit, Herstellungsverfahren fur dieses und diagnostische Mittel. |
| JP3504982B2 (ja) * | 1993-10-05 | 2004-03-08 | ペンタックス株式会社 | 診断剤及びその製造方法 |
| JP3751990B2 (ja) * | 1993-10-05 | 2006-03-08 | ペンタックス株式会社 | 粒状ポリマー複合体及びその製造方法 |
| JP3300542B2 (ja) * | 1994-09-08 | 2002-07-08 | 旭光学工業株式会社 | 抗原又は抗体の検出シート、検出キット及び検出方法 |
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- 1995-11-21 JP JP7302697A patent/JPH09145713A/ja active Pending
-
1996
- 1996-11-21 US US08/754,647 patent/US6040196A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-21 DE DE19648304A patent/DE19648304B4/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-21 GB GB9624199A patent/GB2307552B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| GB2307552B (en) | 2000-02-23 |
| DE19648304B4 (de) | 2005-09-29 |
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| GB9624199D0 (en) | 1997-01-08 |
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