JPH0453579Y2 - - Google Patents

Description

【考案の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本考案は生体由来物質を定性的ないしは半定量
的に、且つ極めて簡易に測定するためのキツト、
特に抗体を固定して成るロ紙上に於ける呈色反応
を利用して前記測定を行なうためのキツトに係わ
る。

［従来の技術］ 病態を正しく把握するためには、血清、尿又は
リンパ液等の体液試料中の特定成分（例えばホル
モンなど）値の変動の具合を知ることが必要であ
る。

更に、病気が大事に至らないうちに治療する為
には、健康状態に於いて前記成分を定期的に検出
して変動を常時観察し、その異常を早期発見する
ことが重要である。

近年、このような特定成分を測定し得る方法と
して、酵素標識物質を結合した物質と他の生体由
来物質との間の特異的結合反応を利用するものが
開発されている。

一般に酵素免疫測定法と呼ばれるものは上記測
定方法の代表的な例であり、放射性同位元素を標
識物質として用いた以前の方法と較べて特に安全
性の点で非常に優れたものである。

上記の酵素免疫測定法の中でもヘテロジーナス
法と呼ばれる一般的な方法に於いては、被検物質
と特異的に反応する物質（例えば、抗原又は抗体
等）を固相と呼ばれる物質に固定し、各反応段階
後の洗浄操作によつて、いわゆるＢ（bound）／
Ｆ（free）分離を行なつている。この固相として
従来用いられている物質には、ポリスチレンビー
ズ、ガラスビーズ、デキストラン、シリコンデイ
スク、シリコンラバー、アガロース及びロ紙等が
ある。

［考案が解決しようとする問題点］ しかしながら、従来の上記酵素免疫測定を行な
う為の装置は、主に、設備等の充実している実験
室や検査室等で用いられることを前提として作ら
れているものである。従つて、これらの装置は比
較的高価であり、且つ、前記の洗浄という繁雑な
操作が要求されるものである。

そこで、病気を早期に発見する為に、一般の家
庭で誰でも手軽に扱え、前記の特定成分の検出を
日常的に簡単にし得る為の方法及びその為の安価
で簡易な装置が強く望まれているものである。

本考案者は以上の課題を解決する為に、物質間
の特異的結合反応及び標識物質である酵素を触媒
とする呈色反応を利用した、家庭等に於いて一般
人が誰でも極めて簡単に生体由来物質を定性的又
は半定量的に測定することのできる安価で簡易な
キツトを開発し、本考案に至つたものである。

［問題点を解決するための手段］ 即ち、本考案は、生体由来物質を測定するため
のキツトであり、折りたたみ容器と、該生体由来
物質と特異的に結合し得る物質をロ紙上に固定し
て成る領域、該生体由来物質と特異的に結合し得
る物質であつて酵素で標識されて成る該物質を含
有する溶液が封入されている領域及び前記標識酵
素と反応し得る発色試薬を含有する溶液が封入さ
れている領域を有するフイルム状支持体とからな
り、前記フイルム状支持体が前記容器の底部に接
合されていることを特徴とする前記キツトに係わ
るものである。

本考案のキツトで用いる折りたたみ容器は、反
応に必要な量の尿、血液等の検体を反応に必要な
時間に亘つて収容・保持することができるだけの
容量及び強度を備えたものであるならばどのよう
な大きさ、形状及び材質を有するものでも構わな
いが、経済性、輸送性及び在庫性等の観点から、
例えば、実用新案出願公告昭51−52545号公報に
開示の、非熱接着性基材である板紙製の折りたた
みコツプが好適なものである。

該折りたたみ容器の内表面は例えばポリエチレ
ンのような撥水性及び熱接着性のフイルムで被覆
されていると好ましい。

本考案のフイルム状支持体は、例えばプラスチ
ツク又は紙等のような、前記検体（尿、血液等）
中で不活性な材質からできており、薄いスリツプ
状の形態のものが好適である。

好ましくは、生体由来物質と特異的に結合し得
る物質が固定されるロ紙が適当な手段により該フ
イルム状支持体上に接合されている。又、このロ
紙がそのまま本考案のフイルム状支持体として機
能することも可能である。

前記の溶液が封入されている領域は、好ましく
は、袋状に形成されており、その袋が前記フイル
ム状支持体上に適当な手段により接合されてい
る。

所望の被検物質の種類に対応して、複数個の前
記ロ紙がフイルム状支持体上に接合されていても
良い。

この袋は、通常の中性領域の水溶液を安定に保
持し得、板紙の角、例えば本考案のキツトに於け
る折りたたみ容器の角にあたる部分でひつかくこ
とにより容易に破れる性質のものであればどのよ
うな材質のものでも良いが、特にビニール製の袋
が好適である。

化学の分野に於いて使用される通常のロ紙であ
れば本考案のロ紙として好適に用いることができ
るが、東洋ロ紙のNo.２からNo.８までのものが本考
案のキツトに用いるロ紙としては特に好ましい。
ロ紙は呈色反応が視覚的に確認し得る程度の任意
の大きさであれば良い。

被検物質としては、例えば、HCG，FSH，
LH，T₃，T₄，ETR及びTSH等のホルモン、
CEA及びAFP等の腫瘍マーカー並びにHBs抗原、
更にそれら各物質に対する各種抗体又は受容体の
ような生体由来物質が挙げられる。

従つて、本考案のキツトのロ紙に固定させる物
質としては、上記生体由来物質と特異的に結合し
得る物質、即ち、例えば被検物質がHCGの場合
にはロ紙に固定させる物質としては抗HCG抗体
が好ましい。更に、被検物質と特異的に結合し得
る物質が抗体である場合には、該抗体はモノクロ
ーナル抗体であることが好ましい。

被検物質とロ紙に固定された物質との特異的結
合反応としては前記のような抗原−抗体反応の他
に、例えば、リガンド（ホルモン）−レセプタ−
間の反応が挙げられる。

所望の物質（例えば被検物質に対する抗体）
は、例えば、Porath，J.の方法により、BrCNで
ロ紙を活性化した後に該物質をロ紙に固定化させ
る（Porath，J.，Aspberg，K.，Drevin，H.，
＆ Axen，R.，Prepeation of cyanogen
bromide activated agarose gels.J.
Chromatography，86：53，1973参照）。

本考案のフイルム状支持体は折りたたみ容器の
底部に、例えば、両面テープのような接着剤で直
接固定されているか、又は他の適当な手段により
底部に接合されている。

標識物質として用いることのできる酵素として
は、酵素免疫測定法の分野で通常使用されるもの
であればどれでもよいが、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（HRP）が好適なものである。

該酵素は例えば、グルタルアルデヒド架橋法
（AVRAMEAS，S.，Immunochemistry，６：
43−52，1969参照）及び過ヨウ素酸架橋法
（NAKANE，Ｐ，K.，＆ KAWAOI，A.，J.
Histochm，Cytochem.，22：1084−1091，1974
参照）などの前記酵素免疫測定法の分野に於いて
通常行われる方法で目的物質（例えば、前記抗
HCG抗体）と結合させることができる。酵素で
標識された該物質は好ましくは、例えば、リン酸
緩衝食塩水などの緩衝溶液中に溶解されている。

更にまた、酵素免疫測定法に於いて通常用いら
れる方法によつて、ビオチン及びアビジンにより
上記反応の測定感度を高めることもできる
（Heggeness and Ash（1977）参照）。

発色試薬としては、該標識酵素を触媒として呈
色反応を生起し得るようなもの、例えば酵素が前
記HRPの場合には、２，２−アジノビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６スルホン酸）
（ABPC）又はOPT、及びH₂O₂であり、この場
合ABPC又はOPTはH₂O₂により酸化されてそれ
ぞれ青色又は赤色の呈色反応を示す。

これらの発色試薬は、例えば、リン酸緩衝食塩
水又は水に溶解された溶液状となつており、H₂
O₂とABPC、又はH₂O₂とOPTはそれぞれ別々の
袋に封入されていることが好ましい。

本考案のキツトは更に、呈色反応の標準として
用いる色調表及び操作マニユアル等を含むことが
できる。

［作用・効果］ 本考案のキツトに於いては、まず、折りたたみ
容器を組み立て、尿、血液等の検体を十分量この
容器に受け取り、該容器の底部に接合されている
ロ紙と接触させ、このロ紙に固定されている物質
と上記検体中に含まれている被検物質との間で、
一定時間特異的結合反応を生起せしめ、次いで該
検体を容器から捨て去り、その後に、酵素標識さ
れた物質の溶液が封入されている袋を破き、その
溶液を該容器の底部に接合されているロ紙と一定
時間接触させ、このロ紙に前記反応により特異的
に結合された被検物質と該酵素標識された物質と
の間で、一定時間特異的結合反応を生起せしめ、
次いで発色試薬を含む溶液が封入された袋を破
き、その溶液を前と同様にロ紙と一定時間接触さ
せ、ロ紙上に前記結合被検物質を介して固定化さ
れた該標識酵素を触媒として呈色反応をロ紙上で
生起せしめ、その呈色反応により、目的とする被
検物質を定性的又は半定量的に測定するものであ
る。

尚、この操作の際に、上記の袋を同時に破いて
封入されている各溶液を同時にロ紙と接触させる
こともできる。

尿、血液等の検体中に目的とする被検物質が存
在しているときには、その被検物質がロ紙上に特
異的に結合し、更にその被検物質に酵素標識され
た物質が特異的に結合して該標識酵素の触媒作用
によりロ紙上で呈色反応が生起する訳である。

このキツトの特徴は、上記反応に於いて固相で
あるロ紙が容器の底部に接合されていることによ
り、従来この種の測定装置で必要とされていた洗
浄操作というわずらわしい段階が不必要になつた
ことである。即ち、各反応終了後に、単に容器を
傾けるか又は各反応液を容器外に単に捨て去るこ
とにより、ロ紙に未結合の被検物質及び呈色反応
溶液がロ紙上から排除される結果、各反応成分の
いわゆる（bound）／Ｆ（free）分離が、従来は
必要とされていた洗浄というわずらわしい操作な
しに、極めて容易に行なえるようになつたもので
ある。

この結果、本発明のキツトを使用することによ
つて、生体由来物質を家庭等で極めて簡便に且つ
経済的に測定することができるようになり、この
キツトを用いてこのような測定を日常的、定期的
に行なうことにより生体の異常を早期発見するこ
とが可能になたものである。

以下、添附図面に基づき本考案を説明する。添
附図面で示される本考案のキツトは本考案を具体
化したものであつて本考案の内容はこれらに限定
されるものではない。

第１図は本考案キツトのフイルム状支持体であ
るプラスチツク片１の拡大平面図である。プラス
イツク片の中央部上には被検物質と特異的に結合
し得る物質を固定して成るロ紙２が接合されてい
る。

被検物質と特異的に結合し得る物質であつて酵
素で標識されて成る該物質を含有する溶液が封入
されている袋３及び前記標識酵素と反応し得る発
色試薬を含有する溶液が封入されている袋４，
４′は、前記ロ紙２の片側にこれらも前記ロ紙２
と同様にプラスチツク片１上に接合されている。

第２図は、本考案の生体由来物質測定キツトの
折りたたみ容器５の外観展開図である。一部に切
欠穴６を設けた板紙７の内表面一面にポリエチレ
ンフイルム８が貼合されており、板紙７の四辺の
縁に沿つて一定巾の熱接着部９が設けられてい
る。中央部１０と、それに平行した折り込み部１
１，１２に沿つた１３及び１４にミシン目が形成
されている。これによつてこの折りたたみ容器は
Ｗ状に折りたたみ込まれ、熱接着部９によつて密
閉され、偏平な袋状形態をとるものである。

折りたたみ容器５を組み立てたときにその底部
となる折り込み部１１，１２の内面に点線で示さ
れるように前記プラスチツク片１が接合されてい
る。

折りたたみ容器５の上部に形成されたミシン目
１５に沿つてこの上部を切り取つてこの容器を開
封する。次いで、熱接着部９を各々指でつまみ、
左右から中央部に向けて軽く押すことによつて折
り込み部１１，１２は開き、更に折りたたみ容器
に対して縦に形成されているミシン目１６及び１
７によつて折りたたみ容器が全体として折り込み
部１１及び１２を底部とする四角い升状のコツプ
状に組み立てられる。

このコツプの内表面はポリエチレンフイルム８
で一様に覆われている為に、コツプ内に入れた液
体検体は漏洩することなく保持される。

以下、本考案のキツトの作製及びそれに用いた
測定の一実施例を示す。

［実施例］ Ｉ ロ紙の前処理 東洋ロ紙（No.６）100gを室温で20〜60分間蒸
留水７mlで浸潤させ、ロ紙に対して３〜10重量％
の蒸留水を含有させた。次に、これに３〜10重量
％のBrCN水溶液７mlを撹拌しながら加えた。こ
の後直ちに、1MのNaOH水溶液を加えて前記
BrCN溶液をPH10〜10.5に調節した。２〜５分後
に、４℃に冷した0.005MのNaHCO₃水溶液を140
ml添加して撹拌し、最後にこの溶液をブフナー漏
斗を通してロ過し、前記反応溶液を除去した。
NaHCO₃による洗浄操作を３〜４回繰返した。

次にこのブフナー漏斗上のロ紙を、それぞれ約
50mlの30重量％、70重量％、100重量％及び100重
量％の冷アセトン水溶液（４℃）で順次洗浄し
た。洗浄した前処理済のロ紙を冷蔵庫にて１〜２
時間かけて乾燥させた。このロ紙はその後−30℃
で保存すれば約２年間は活性が保持された状態で
安定である。

抗体の固定 目的とするHCG抗原量（800IU／ｌ〜
1000IU／ｌ以上）を検出し得るだけの抗HCG抗
体（UCB（ベルギー）製）を含む水溶液20〜30ml
中に前記前処理済のロ紙100gを入れ４℃で36時
間〜72時間マグネチツクスターラーを用いて撹拌
させながら反応させた。その後、過剰の該抗体溶
液を除去し、重曹水（0.1M）を70〜100ml加えて
混和後、吸引ロ過で重曹水を除いた。次にβ−エ
タノールアミン（0.05M）の0.1M NaHCO₃水溶
液を70〜100ml加え室温で２時間半〜３時間半マ
グネチツクスターラーにて撹拌した。その後、吸
引ロ過で前記β−エタノールアミン溶液を除去
し、次にロ紙を0.1MのNaHCO₃水溶液約100mlで
洗浄し、次に0.1Mアセテート緩衝液（PH3.5〜
4.5）約100mlで３〜４回繰り返し洗浄した。

その後、ロ紙を0.5〜0.2重量％のBSAを含むリ
ン酸緩衝食塩水（0.05〜0.1重量％のTween20，
PH7.4〜PH7.6）約100mlにて２〜３回洗浄し、冷
蔵庫に保存した（乾燥状態または、リン酸緩衝食
塩水中でも保存が可能）。

抗体と標識酵素との複合体の作製 目的とするHCG抗原量（800IU／ｌ〜
1000IU／ｌ以上）を検出し得るだけの抗HCG抗
体（前記と同じもの）水溶液50mlを約等量の
HRP水溶液（２〜５重量％）マグネチツクスタ
ーラを使用して、４℃にて２〜３時間インキユベ
ーシヨンした。

発色試薬の作製 20〜30mg／mlの２，２−アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）及び５〜
10重量％のH₂O₂を含む水溶性の発色試薬0.5〜１
mlをビニール袋に封入し折りたたみ容器内に収容
した。

以上の各反応試薬から成る本発明のキツトを用
いて次のように尿検体中のHCGの量を測定した。

まず初めに、前述したように折りたたみ容器を
組み立て、各尿検体約５mlをこの容器にとつた。
数十秒後にこの尿を捨てた。

次に、前記HRP−抗HCG抗体複合体溶液が封
入されているビニール袋及び発色試薬が封入され
ているビニール袋を同時に破いてこれらの溶液と
ロ紙を接触させた。

約２分後に容器を傾けて、反応液を容器のすみ
に集め、ロ紙と該反応後とを分離した。

陽性の場合はロ紙が青色を呈した。

以上の検査結果を市販の検査装置を使用して同
一検体について得られた結果と比較した。

市販品との相関 検体No. 本発明のキツト 持田ラテツクス 試薬を用いる装置 １〜10 陽 性 陽 性 11〜20 陰 性 陰 性 ｎ＝20例のうち、陽性10例、陰性10例について
いずれも両者の間に100％の相関がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本考案のプラスチツク片１の拡大平面
図である。第２図は本考案の折りたたみ容器５の
外観展開図である。 １……プラスチツク片、２……ロ紙、３，４，
４′……袋、５……折りたたみ容器、６……切欠
穴、７……板紙、８……ポリエチレンフイルム、
９……熱接着部、１０……中央部、１１，１２…
…折り込み部、１３，１４，１５，１６，１７…
…ミシン目。

Claims (1)

1. 【実用新案登録請求の範囲】 (1) 生体由来物質を測定するためのキツトであ
   り、折りたたみ容器と、該生体由来物質と特異
   的に結合し得る物質をロ紙上に固定して成る領
   域、該生体由来物質と特異的に結合し得る物質
   であつて酵素で標識されて成る該物質を含有す
   る溶液が封入されている領域及び前記標識酵素
   と反応し得る発色試薬を含有する溶液が封入さ
   れている領域を有するフイルム状支持体とから
   なり、前記フイルム状支持体が前記容器の底部
   に接合されていることを特徴とする前記キツ
   ト。 (2) 生体由来物質と特異的に結合し得る物質が抗
   体であることを特徴とする実用新案登録請求の
   範囲第１項に記載のキツト。 (3) 抗体が抗HCG抗体であることを特徴とする
   実用新案登録請求の範囲第２項に記載のキツ
   ト。 (4) 標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであ
   り、発色試薬が２，２−アジノビス（３−エチ
   ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）及び過
   酸化水素であることを特徴とする実用新案登録
   請求の範囲第２項又は第３項に記載のキツト。 (5) 標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであ
   り、発色試薬がOPT及び過酸化水素であるこ
   とを特徴とする実用新案登録請求の範囲第２項
   又は第３項に記載のキツト。 (6) 呈色反応の標準として色調表を含む実用新案
   登録請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか
   に記載のキツト。 (7) 生体由来物質と特異的に結合し得る物質であ
   つて酵素で標識されて成る該物質を含有する溶
   液が更に緩衝剤を含むことを特徴とする実用新
   案登録請求の範囲第１項ないし第６項のいずれ
   かに記載のキツト。