JPH04501365A - 白血球付着レセプターβ鎖に対するモノクローナル抗体と、この抗体の製造方法と、その応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血球付着レセプターβ鎖上のエピトープに特異なモノクローナル抗 体に関するものであり、これは細胞間白血球付着を抑制するのに用いられる。

従来技術の説明 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、重大な免疫抑制、感染症および神経障害を 特徴とする死に致る疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因である 。少量の循環リンパ球がこのウィルスに感染するにすぎないが、このウィルスの 受容体（レセプター＞　ＣＤ４を保持するＴ細胞は著しく失われる。Ｃ［１４° −Ｔ細胞が失われることがＡＩＤＳに特有な免疫抑制に大きく係わっていること は明らかである。この旧Ｖによって誘発される細胞融合の結果生じる融合細胞（ ｓｙｎｃｙｔ　Ｉｕａ）形成がインビトロでのこのウィルスの主たる細胞変性作 用（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）であるということは知られており、 インビボでのＣＤ４　”−Ｔ細胞の減少を説明するものと考えられている。この ＣＤ４は旧Ｖエンベロープのグリコプロティインｇｐ１２０との相互作用を通じ て融合細胞形成に重要な役割を果たしている。

ＣＤ４受容体はＡＩＤＳの病因として大きな役割を果たしていると考えられてい るが、ＣＤ４以外の未感染細胞表面上の分子も旧Ｖに起因する細胞融合に関連し ているということが報告されている。すなわち、先ず、旧Ｖ感染細胞の未感染細 胞への融合は未感染細胞表面のＣＤ４密度とは関係がない。さらに、非リンパ様 ヒト細胞にＣＩ］４受容体がトランスフェクションするとその細胞を旧ν感染細 胞と融合させることが可能になるが、ＣＤ４をトランスフェクションしたマウス 細胞では、このことは言えない。

さらに、旧Ｖ粒子のＣＤ４＋細胞への結合に対するＡＩＤＳ患者からの血清のブ ロック能と、ＣＤ４＋未感染細胞に対する旧Ｖ感染細胞の融合に対する同じ血清 のブロック能には差がある。

ＣＤ４はクラス■のＭＨＣ−制限（ＭＨ（ニーｒｅｓｔｒ　１ｃｔｅｄ）　Ｔ　 ヘルパー細胞応答においてクラス■の主たる組織適合性錯体（ｍａｊｏｒ　ｈｉ ｓｔｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ、　ＭＨＣ）分子に直 接作用する。この応答に白血球付着受容体（ＬＡＲ）　ＬＰＡ−１が関与すると いうことは、抗ＬＡＦ−１−モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて証明されて いる。ｇｐ１２０とクラス■のＭＨＣとは構造的に類似していることから、ＣＤ ４へのｇｐ　１２０の結合はクラス■のＭＨＣ分子とＣＤ４との間の相互作用を 模倣しているということを示唆している。同様なアナロジ−によって、ＨＩＶを 媒介とする細胞融合におけるＬＡＲの役割を研究した。本発明では、ある種の抗 ＬＰＡ−１ｍＡｂは未感染Ｔ細胞の芽細胞が旧Ｖを媒介とする旧Ｖ感染細胞への 融合を完全に阻止するということを示している。このことは、）ＩＩＶで誘発さ れる融合細胞形成においてＬＦＡ−１がこのウィルスの主たる細胞変性機構に関 係していることを示している。

ＬＰＡ−１分子はＴリンパ球およびＢ　ＩＪンバ球上の他、マクロファージ、胸 腺細胞（ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ）、顆粒球＜ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）および骨髄 細胞の亜集団−ヒに発現し、１７５．０００　ｋｄ　ｂｒ　；　ＣＤ　１ｌａ） と、９５．０００　ｋｄ　（β；　ＣＤ　１８）の非共役結合した２つのポリペ プチドによって構成されている。ＬＰＡ−１のβ鎖は他の２つの白血球抗原：　 Ｍａｃ−１ｂｒ鎮、１６５．０００　ｋｄ、　ＣＤ１ｌｂ）　；タイプ３型の相 補受容体生、Ｌ’ｅｕＭ　５　（α鎮、１５０，００　Ｋｄ、　ＣＤ　１ｌｃ） ：タイプ４型の相補受容体活性に関連する可能性のある分子とに共通している。

これらの３つのαサブユニットは互いに寸法が異なっているが、これら３つのサ ブユニット全てが単一遺伝子または複製遺伝子によってコードされていることを 示す証拠がある。ヒトβ鎖をコードするｃ　ＤＮＡは既にクローン化されており 、主構造の５０％はインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）のβ鎖、ひよこ芽細胞（ ｃｈｉｃｋ　ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔ）　フィブロネクチン受容体と同一である ということが分かっている。これらの研究等により、ＬＦＡ−１グリコプロテイ ン類の分子は、より大きな類であるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ ＲＧＤ）アトへッション類の一員であることが分かっているしインテグリン（ｉ 　ｎｔｅｇｒ　１ｎｓ）として知られている］。

リンホカイトの細胞間相互作用が疾患の原因となるＡＩＤＳ等の治療に効果のあ る方法は現在では限られている。これらの疾患に対して一般的に投与されている 医薬の使用に際しては厳しい禁忌事項が付けられている。従って、ＡＩＤＳやそ の他の免疫応答不全疾患におけるリンホカイトの細胞間相互作用を抑止できる治 療薬が強く望まれている。

発明の要旨 免疫応答不全を改善する１つの方法は、白血球付着受容体と結合するモノクロー ナル抗体を用いて細胞間白血球付着を抑止することである。細胞間白血球結合が 抑止されると、細胞から細胞へ感染源の伝播が減り、免疫応答活動が低下する。

本発明者達は、免疫応答不全疾患を改善する手段として、白血球付着受容体上の エピトープに結合して白血球が互いに付着する能力を抑止するモノクローナル抗 体を開発した。このモノクローナル抗体は治療薬または診断薬として用いること ができる。

図面の簡単な説明 図１＋ｍＡｂによる融合細胞形成抑制効果を示す図。

図２　：　Ｈ５２１ｇＧによる融合細胞形成抑制効果の投与量による変化を示す 図。

図３：Ｈ５２が８８５細胞ではなく、ＰＩＩＡ芽細胞の位置で融合細胞形成をブ ロックすることを示す図。

図４は、ｍＡｂによるｇｐ　１２０のＣ８Ｍ細胞への結合抑制効果を示す図。

発明の詳細な説明 本発明は、白血球付着受容体β鎖に特異性を有するモノクローナル抗体に関する ものである。このモノクローナル抗体はインビトロおよびインビボでこのβ鎖を 有する抗原を免疫学的に検出するのに極めて有効であり、かつ、このβ鎖を有す る上記受容体を持つ細胞の免疫療法に極めて有効である。

本発明の好ましい１実施態様で開示されたモノクローナル抗体（Ｉｔ　５２）は 白血球付着受容体β鎖（Ｉｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｒｅｃｅｐｔ −ｅｒ　β−ｃｈａ　ｉｎ）上のエピトープに結合する。この特異性によって、 Ｈ５２モノクローナル抗体およびこの１１５２の特異性を有する類似のモノクロ ーナル抗体は細胞間付着を抑止するのに用いることができる。従って、Ｈ５２は ＡＩＤＳのような免疫応答不全疾患、自己免疫疾患および移植片拒絶反応、移植 片とホストとの拒絶反応の改善に有効である。このＮ　５２は１９８９年６月１ 日以前に、メリーランド州　ロックビルのアメリカン　タイプ　カルチャアー　 コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ。

ＡＴＣＣ）に寄託番号ＨＢ　１０１６０で寄託された細胞株（ｃｅｌｌ　１ｉｎ ｅ）から得られた抗体から得られたものであり、この抗体の同定特性を有してい る。この細胞株は上記ＡＴＣＣに３０年間寄託されている。

モノクローナル抗体の製造法とその特性決定法モノクローナル抗体を産生ずるハ イブリドーマを製造するのに用いられる方法は周知である　［コーラ−（Ｋｏｈ ｌｅｒ）達、ヨーロッパ免疫字詰（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｉｍｍｚ）、第６ 号、２９２頁、１９７６年］。

その方法を簡単に説明すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトに肺臓付着細胞（ｓｐ ｌｅｎｉｃ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｃｅｌｌ）で免疫した後、同じタイプの細胞を 補助注射する。４日後にマウスを殺し、マウスのミエローマＰ３Ｘ６５　Ａｇ８ と融合した牌細胞を回収する。抗体は、ハイブリドーマをスクリーニングし、陽 性クローンのヒトの＊ｍ組織部分に対する反応性をテストして製造する。

本発明は白血球付着受容体β鎖に反応性のあるモノクローナル抗体と、それを製 造するためのハイブリドーマを提供する。

本発明のモノクローナル抗体の反応性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマの単離は、目的とするモノクローナル抗体の基本反応パターンを決定する 通常のスクリーニング技ローナル抗体が白血球付着受容体β鎖と反応して細胞間 付着を抑止した場合には、そのテストされた抗体と本発明のハイブリドーマによ って産生された抗体は同じである。

逆に、Ｈ５２が特定の抗原、例えばＬＰＡ−１受容体（これとＨ５２は通常反応 性がある）に結合するのを被試験モノクローナル抗体が阻止するか否かを調べる ことによって、不要な実験をしなくても、そのモノクローナル抗体が本発明のモ ノクローナル抗体Ｈ５２と同じ特異性を有するか否かを決定することで、モノク ローナル抗体を評価することもできる。テストしたモノクローナル抗体が、Ｈ５ ２による結合減少効果と同じような効果を示す場合のように、Ｈ５２と競合する 場合には、これら２つのモノクローナル抗体は同じエピトープと結合したと考え ることができる。

あるモノクローナル抗体がＨ５２の特異性を有するか否かを調べる別の方法は、 通常Ｈ５２と反応性のある抗原（例えばＬＦＡ−１受容体）と−緒に８５２を予 備培養し、テストしたモノクローナル抗体が上記抗原と結合する能力が阻害され るか否かを調べる方法である。テストしたモノクローナル抗体が阻害された場合 には、そのモノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体と同一のエピトー プ特性を有するといえる。

外来ドナ一種からのモノクローナル抗体を別のホスト受容種でインビボで用いる ことは一般に複雑なことではないが、ドナー抗体上に存在する抗原決定基に対す るホストによる逆免疫反応が現れるという問題が起きる可能性がある。場合によ っては逆免疫反応が激しくなり、ホストでドナー抗体をインビボで用いることが できなくなる。さらに、ホストの逆反応によってドナー抗体の細胞間付着抑制効 果を阻害することもある。ホストで起きる逆免疫反応を無くす１つの方法はキメ ラ抗体を使用する方法である［＋ン（Ｓｕｎ）達の「ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａ）　」５　（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１）　：　Ｓ１７．１９８６年 ；オイ（０１）達の［バイオテクニクス（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｊ　 ４（３）：　２１４．１９８６年）コ。

キメラ抗体は、抗体のヘビー（ｈｅａｖｙ）　１１１およびライト（ｒｉｇｈｔ ）鎖の各種領域が１つ以上の種からのＤＮＡによってコードされる抗体である。

典型的なキメラ抗体は、所望の抗原特異性の抗体を産生ずるドナ一種に由来する ヘビー鎖（Ｖ□）およびライト鎖（■、）の可変領域と、ホスト受容種に由来す るヘビー鎖（Ｃ０）およびライト鎮（Ｃ４）の可変領域とで構成されている。ド ナー抗体領域の抗原決定基、特に、Ｃ，ｌ領域の抗原決定基に対してホスト免疫 系が曝される機会を少なくすることによって、受容種で起きる逆免疫応答の可能 性を小さくすることができると考えられる。従って、例えば、上記ＡＴＣＣＨｅ 　１０１６０から単離したＤＮＡによってコードされたマウスのＶＨ領領域よび ＶＬｌ領域、ヒトの白血球から単離されたＤＮＡでコードされたＣＨ領領域よび Ｃ４領域とによって構成されるキメラ抗体でヒトのインビボ診断薬を製造するこ ともできる。

診断効果または治療効果の観点からは、１つのイソタイプのモノクローナル抗体 が他のイソタイプのモノクローナル抗体よりも好ましい場合がある。例えば、抗 体を原因とする細胞溶解（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｌｙ ｓｉｓ）の研究から、ターゲット細胞を溶解させるには、一般に、イソタイプγ −２ａおよびｒ−３の未変成マウスのモノクローナル抗体の方がイソタイプγ− １の抗体より効果的であることが知られている。この効果の違いは、ターゲット 細胞の細胞溶解破壊に活性に寄与するイソタイプｒ−２ａおよびγ−３の能力に 起因するものと考えられる。

モノクローナル抗体の特定のイソタイプは初期融合から選択することによって直 接製造するか、クラス−スイッチ変異細胞（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ　ｖａｒ ｉａｎｔｓ）を単離するシブ選択（ｓｉｂ　５ｅｌｃｔｉｏｎ）法を用いて、別 のイソタイプのモノクローナル抗体を産生ずる親ハイブリドーマから二次的に製 造することができる［ステブルースキイ（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ）達の［米国科 学アカデミ−予稿集（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎ）；ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）Ｊ、ｏｆ　 １ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　Ｊ　、７４：　３０７．１９ ８４年］。従って、本発明のモノクローナル抗体には、ＡＴＣＣＨｅ　１０１６ ０を用いて製造されるモノクローナル抗体Ｈ５２の特異性を有するタラスースイ ッチ変異体を含むものである。

本発明のモノクロ・−ナル抗体を断片、例えば、Ｆａｂ　およびＦ（ａｂ’）２ の形で用いる場合、特に、これらの断片を治療目的で用いる場合には、免疫応答 不全の改善が白血球付着受容体を有するこれらの細胞の補体を経由する白血球破 壊に依存するものではないことから、任意のイソタイプを用いることができる。

「免疫応答不全（ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｉｓ ｏｒｄｅｒ）　」という用語は、ホストの免疫系が疾患状態に直接または間接的 に関与する不全を表す用語である。免疫応答が関与する疾患の例としては　Ａ　 ！　ＯＳ、自己免疫疾患および移植片拒絶反応が挙げられる。ここで、移植片拒 絶反応という用語は、移植片に対するホストの拒絶反応と、ホストに対する移植 片の拒絶反応の両方を意味している。

本発明のモノクローナル抗体はインビボおよびインビトロで免疫診断または免疫 治療を行うのが望ましい全ての動物に使用できる。ここで、「動物」という用語 はヒトおよびヒト以外を含むものである。

本発明で用いる「抗体（ａｎｔ　１ｂｏｄｙ）　Ｊという用語は、完全な分子の 他に、エピトープ決定基を結合させることが可能なその断片、例えばＰａｂおよ びＰ　（ａｂ’　）　２を含むものである。

診断での使用 本発明のモノクローナル抗体は、それらを液相で用いるか固体担体に結合させて 用いる免疫測定法（イムノアッセイ）で用いるのに適している。また、この免疫 測定法で用いるモノクローナル抗体は種々の方法で検出できるように標識化する ことができる。本発明のモノクローナル抗体を使用可能な免疫測定法の例として は、直接または間接の競合アッセイまたは非競合アッセイが挙げられる。これら の免疫測定法の例はラジオ　イムノアッセイ　（ＲＩＡ）とサンドイッチ（イム ノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いて抗原を検 出する場合には、生理学的サンプルの免疫組織化学的アッセイを含む免疫測定法 をフォーワード法、リバース法または同時法で用いて行うことができる。

本発明のモノクローナル抗体は種々の担体に結合できる白血球付着因子の検出に 使用できる。周知の担体としてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ エチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然／変性セルロース、ポリ アクリルアミド、寒天＄よびマグネタイト等が挙げられる。担体は本発明の目的 に応じて可溶性でも不溶性でもよい。モノクローナル抗体を結合させるのに適し た他の担体は当業者に公知であり、また、担体は通常の実験によって容易に見出 すことができる。

種々の４Ｌｆ＆と標識化法が当業者に公知である。本発明で使用可能な標識の例 としては酵素、放射性同位体、蛍光性化合物、化学的発光性化合物および生物学 的発光性化合物が挙げられる。

モノクローナル抗体に結合させるのに適した他のＪｔｆｌｋは当業者に公知であ り、それらの標識を見出すことは通常の実験で行うことができる。また、これら の標識を本発明のモノクローナル抗体へ結合する方法は当業者に公知の標準的な 技術を用いて行うことができる。

本発明のモノクローナル抗体によって検出される白血球付着因子β鎖は、生物液 や組織中に存在するであろう。本発明では検出可能な量の白血球付着因子β鎖を 含んだサンプルなら任意のサンプルを用いることができる。一般にはサンプルは 尿、唾液、脳を髄液、血液、血清等の液体か、組織、***物等の固体また半固体 である。

感度がさらに高い別の検出方法としては、抗体を低分子量ハプテンに結合させ、 次いで、二次反応によってこのハプテンを特異的に検出する方法である。ハプテ ンとしては、例えばアビジンと反応するバイオチンや、特定の抗ハプテン抗体と 反応するジニトロフェニル、ビリドキサルおよびフルオロレセインが一般に用い られる。

本発明で用いる「エピトープ」という用語は、本発明のモノクローナル抗体と特 異的に相互作用することができる任意の決定基を含む用語である。エピトープの 決定基は一般にアミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基で構成さ れ、一般には特定の３次元構造特性と特定の電荷特性とを有している。

本発明のモノクローナル抗体をインビボで抗原の検出に用いる場合には、検出可 能な状態に標識されたモノクローナル抗体を診断に有効な量だけ投与する。「診 断に有効」という用語は検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗体の量が 、そのモノクローナル抗体に特異な白血球付着受容体β鎮を有するサイトを検出 することができるのに十分な量で投与されるということを意味している。

投与された検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、白血球付 着受容体を有する細胞への結合がバックグラウンド信号に対して十分に検出可能 な量でなければならない。

また、最大のターゲット対バックグウウンド信号比を得るためには、検出可能な 状態に標識されたモノクローナル抗体を循環系から迅速に取り除くのが望ましい 。

インビボ診断用の検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗体の投与量は個 体の年齢、性別および疾患の程度等の因子によって変わるが、この投与量は約０ ，０１ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ”の範囲、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２〜 約１０ｍｇ／ｍ”の範囲で変えることができる。

インビボ画像診断の場合には、使用可能な検出機器の型式が放射性同位体を選択 する上での主要なファクターであり、所定の検出機器で検出可能な崩壊型を有す る放射性同位体を選択しなければならない。インビボ画像診断の場合の放射性同 位体の選択で重要な他のファクターは、放射性同位体が、ターゲットによって最 大摂取された時に検出可能な程度の長い半減期を有し、しかも、ホストに対する 有害な放射能の量が最小となるようにすることである。理想的には、インビボ画 像診断で用いる放射性同位体は粒子放出が無く、通常のγ線カメラで容易に検出 可能な１４０〜２５０　ｋｅＶの範囲のフォトンを多量に発生させるものである 。

インビボ診断用の放射性同位体は中間官能基を用いることによって免疫グロブリ ンに直接または間接的に結合させることができる。金属イオンとして存在する放 射性同位体を免疫グロブリンに結合されるのにしばしば用いれる中間官能基は二 官能性キレート化剤、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（口ＴＰＡ）、エ チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子である。

本発明のモノクローナル抗体は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴 （ＥＳＲ）等のインビボ診断用の常磁性同位体で標識することもできる。一般に 、診断画像を視覚化するための従来の任意の方法を使用できる。カメラ画像用に は通常Ｔ線およびポジトロンを出す放射性同位体が用いられ、ＭＲＩ用には常磁 性同位体が用いられる。

本発明のモノクローナル抗体は、個人の免疫応答不全疾患の回復過程をモニター するために使用できる。すなわち、白血球数の増減または各種体液中を流れる抗 原の濃度変化を測定することによって、免疫応答不全疾患の改善を特徴とする特 定の治療法が有効か否かを決定することができる。

治療での使用 「改善する」という用語は、治療を受けた動物での免疫応答不全疾患の悪影響が 軽減するということを意味する。「治療に有効」という用語は、使用したモノク ローナル抗体の量が免疫応答に起因する疾患の原因を改善するのに十分な量であ るということを意味する。

本発明のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体に反応するエピト ープで白血球付着受容体β鎖を発現する白血球を原因とする免疫応答不全疾患を 有する動物の免疫治療にも使用することができる。この治療で使用する場合のモ ノクローナル抗体の投与量は約１０ｍｇ／ｍ２〜約２０００ｍｇ／ｍ２の範囲で 変えることができる。

免疫療法で使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体を標識しなくてもよ く、あるいは治療剤によって標識してもよい。これらの治療剤は本発明のモノク ローナル抗体に直接または間接的に結合することができる。間接結合の１つの例 は、スペーサ片を用いる方法である。このスペーサ片は不溶性でも可溶性でもよ く〔ディーナ−（Ｄｉｅｎｅｒ）達「サイエンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　＋２３ １　：　１４８．１９８６年〕、ターゲットサイトでモノクローナル抗体分子か ら医薬を放出させることができるように選択することができる。免疫療法用に本 発明のモノクローナル抗体に結合できる治療剤の例としては医薬、放射性同位体 、レクチン、トクシン等がある。

本発明のモノクローナル抗体とコンジュゲート可能な医薬には、医薬に分類的さ れる化合物、例えばマイトマイシンＣ１ダウノルビシンおよびビンブラスチン等 が含まれる。

本発明のモノクローナル抗体を放射性同位体とコンジュゲートして免疫療法で用 いる場合には、特定のイソタイプが他のイソタイプより好ましいことがある。こ れは白血球分布とイソタイプの安定性および放出特性等のファクターに依存する 。必要な場合には、上記のインビボ診断法によって白血球分布を調べることもで きる。免疫応答不全疾患によっては、あるエミッタが他のエミッターより好まし い場合がある。一般に、免疫療法ではα粒子とβ粒子を放出する放射性同位体が 好ましい。好ましい放射性同位体は２１２３ｉ等の飛程が短く、高エネルギーの α線エミッタである。本発明のモノクローナル抗体と結合される治療用放射性同 位体の例としては＋２Ｓｉ、＋３１７　、　！ＯＹ、　＋！？（：、、２１２１ ３ｉＳ２目Ａｔ、”２Ｐｂ、　”Ｓｃ、　ＩＯ’ＰｄおよびＩＩ＠Ｒｅが挙げら れる。

レクチンは一般に特定の糖部分に結合する植物材料から単離される蛋白質である 。また、多くのレクチンは細胞と癒着して、リンホカイトを刺激するとこができ る。しかし、リシンは免疫療法で使用されてきた毒性レクチンである。これは、 毒作用をサイト特異的に送るように毒性を有するリシンのα−ペプチド鎖を抗体 分子に結合させて作られる。

トクシンは植物、動物または微生物によって作られる有毒物質であり、量が多い と致死に到ることが多い。ジフテリアトキシンは治療で使用可能なコリネバクテ リウム　ジフテリア（Ｃｏ−ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉ ａ）の作る物質である。この毒素はαザブユニットとβサブユニットからなり、 適切な条件で単離することのできる。毒素成分Ａを抗体き結合して、本発明のモ ノクローナル抗体に特異性を有する白血球付着因子β鎖を発現させる白血球へサ イト特異的に運ぶのに使用することができる。

本発明のモノクローナル抗体に結合可能な他の治療医薬は公知のものであるか、 当業者が見出すことができる。

本発明のモノクローナル抗体の投与量範囲は免疫応答不全疾患の症状が改善され て所望の効果がでるのに十分な量である。

しかし、この投与量は望ましくない副作用、例えば交差反応、過敏性反応等を引 き起こすような量ではならない。一般に、投与量は患者の年齢、状態、性別、疾 患の程度によって変わり、当業者が適宜決定することができる。投与量は個々の 医師が調節することができる。投与量は約０．１ｍｇ／　ｍ２−約２０００ｍｇ ／ｍ２、好ましくは１回当たり約０，１ｍｇ／ｍ”〜約５００ｍｇの範囲で、− 日一回または数回、数日間投与することができる。

一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療医薬とコンジュゲートして投与した 場合には、インビボ診断画像用の場合に比べて、より少ない投与量で使用するこ とができる。

本発明のモノクローナル抗体は、注射または時間をかけたパーフュージョンによ って非経口投与できる。また、本発明のモノクローナル抗体は静脈内、腹膜組織 内、筋肉内、皮下、体腔内または経皮で投与することができる。

非経口投与用調製物は、無菌の水溶液または非水溶液、サスペンション、エマル ジョン等を含む。非水溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレング リコール、オリーブオイル等の植物油とオレイン酸エチル等の注射可能な有機エ ステルが挙げられる。水溶性担体には食塩水または緩衝媒を含む水、アルコール ／水溶液、エマルジョンまたはサスペンション等カ含まれる。非経口用賦形剤に は塩化ナトリウム溶液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｔ）デキストローズ、デキストロ ーズと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液または固定オイル等が含まれる。静脈 内投与用賦形剤には流体／栄養分を運ぶ補給物、電解質補給物（リンゲルデキス トロースをベースとするもの等）等が含まれる。防腐剤、その他の添加剤、例え ば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガス等を添加することも できる。

本発明はさらに本発明のモノクローナル抗体を含む医薬または薬理組成物の調製 方法を提供する。この医薬は、本発明のモノクローナル抗体に反応する白血球付 着受容体β鎖を発現する白血球に起因する免疫応答不全疾患の治療に用いられる 。

以上、本発明を一般的に説明したが、本発明は以下の実施例の説明からより明ら かになろう。しかし、以下の実施例は本発明を何ら限定するものではない。

実施例１ 抗付着モノクローナル因子抗体の調製 雌のＢａ　Ｉ　ｂ／ｃマウス（６〜８週齢）に１０７個のヒトの膵臓付着細胞の リン酸緩衝液を入れた生理食塩水を腹腔内注射した。この処置を１４日後と２１ 日後に再度繰り返した。最後の注射の４日後、免疫されたマウスの１匹から膵臓 を摘出して単細胞サスペンションを調製した。コーラ−（にｏｈｌｅｒ）とミル スティン（Ｍｉｌｓ−ｔｅｉｎ）の方法によって、５０％ポリエチレングリコー ルを用いてこの牌細胞をＢａ１ｂ／ｃ由来のＰ３Ｘ　６５３　Ａｇ　８　ミエロ ーマ細胞に融合させた［［ネーチャア（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ　、２５６　：　４９ ５．１９７６年］。

成長するハイブリドーマコロニーを形成した後、上記細胞からの上澄液を凍結し たヒト膵臓のクライオスタット断面（４μ）丘で、免疫組織化学法により、ヒト 抗原に対する抗体のテストした［ナイム（Ｎａｉｅｍ）達「免疫法認（Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、）　Ｊ　、５０．１４５、１９８２年コ。Ｈ５２（Ｈ５ ２，Ｇ１．２）をヒト細胞上での免疫組織化学およびラジオイムノアッセイと、 ヒト細胞からのラジオイムノ沈降法とでスクリーニングして、クローニングおよ び再クローニングした。

ＰＨＡ芽細胞（ＰＨＡ−ｂｅａｓｔｌへの８Ｅ５細胞の融合に対するｍＡｂの効 果を融合細胞形成アッセーで調べた。８１Ｅ５とＡ３．Ｏ１１細胞とを完全培地 ［１０％ＦＢＳ　（Ｈｙクローン）と１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳとを補給したＰＲＭ Ｉ−１６４０］中に保持した。８Ｂ５細胞株はＬＡνに感染したＡ３゜０１細胞 株の生存クローンである。８Ｅ５細胞は全ＬＡＶゲノムの１つのコピーを有して いるが、逆トランスクリプターゼ遺転子内での点突然変異によって非感染ウィル ス粒子を産生ずる。８Ｂ５細胞はＨＩＶエンベロープグリコプロティンを発現し 、ＣＤ４−陽性ＰＩＩＡ芽細胞およびＴ細胞株と混合した場合、野生型ウィルス に感染したＴ細胞の培養中に観察されるのと同じ細胞変性効果を生じる。

完全培地中で、濃度０．２５μｇ／ｍｌのＰｆｌＡ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ）の存在下で３日間、末梢血液の単核細胞を培養することによ ってＰＨＡ芽細胞を産生じた。この細胞をＰＢＳで３回洗浄し、濃度５Ｘ１０’ ｍ＋で完全培地中に再懸濁させた。ｍＡｂは濃度２５μｇ／ｍ　１の精製１ｇＧ の形態で用いた。Ｐ）ＩＡ芽細胞を同じ体積（３０μｍ）のモノクローナル抗体 または片側面積９６ウエルのプレート　［コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）　］のウェ ル中で媒質と混合させ、３０分間、２５℃で培養した。次に、８Ｂ５細胞３０μ Ｉを添加し、湿ったＣｏ２培養器内で、３７℃で１０時間培養した。対照ウェル は、同じ数の非感染Ａ、　３０１細胞で培養したＰＨＡ芽細胞で構成した。アッ セイでは、８Ｅ５細胞にＰＩＩＡ芽細胞およびＣＤ４″′Ｔ細胞株を各々混合し た後４〜１０時間以内に１０〜５０個またはそれ以上の融合した細胞からなる融 合細胞または気球様細胞が形成される。培養を続けると急速に融合細胞じ死滅す ることが生体色素排除テストによって調べられた。

ＨＩＶを仲介とする細胞融合での効果を調べるために、ヒト白血球抗原に対する ｍＡｂをＰＨＡ芽細胞と８８５細胞との共培養に添加した。テストしたｍＡｂは Ｈ５２、抗ＣＤ　１ｇ　（ＬＦＡ−１β）；　ＭＨＭ。

２４、抗ＣＤ　ｌｌａ　（ＬＦＡ−１α）；　Ｈ５Ａ４、抗ＣＤ　ｌｌｂ　（Ｍ ａｃ−１α）；Ｈ５Ａ５、抗ＣＤ　４５（白血球共通抗原）；　ＭＩＩＭ、　５ 、抗ＨＬＡ−Ａ、　Ｂ、　Ｃ）　；Ｌｅｕ３ａ、抗ＣＤ　４である。これらの抗 体は全て１匹６１、ｋイソタイプである。

図１に示すように、Ｈ５２はＬＦＡ−１のβサブユニット　（ＣＤ−１８）上の エピトープに対して融合細胞の形成を完全に抑止した。また、細胞融合はｍＡｂ 　（ＭＨＭ、　２４）によってＬＦＡ−１のαサブユニット（ＣＤ　１ｌａ）に 対して完全にブロックされた。しかし、極めて少量ながら細胞融合が稀に観察さ れるので、ｍＡｂ　（ＭｔｌＭ、　２４）は、ｍＡｈ　Ｈ５２より効果が低い。

ＬＡＲ群の別の一員であるＭａｃ−４（補体受容体、タイプ３、ＣＤ　１ｌｂ） に対するｍＡｂ　：　ｔ１５ＡＲは８８５細胞のＰＩ（Ａ芽細胞への融合には全 く効果がない。また、ｍＡｂを認識する互いに無関係な２つの細胞表面蛋白質、 すなわちＭＨＭ、　５、抗−ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、　ＣおよびＨ５Ａ４と抗白血球共 通抗原（６口４５）によっては融合は影響されない。これら２つの抗原はＬＡＲ またはＰＨＡ芽細胞と同じまたはより高い密度で発現するので、これら２つの抗 原が融合を阻止することができないということは、抗１、ＡＲ抗体による阻害は 非特異性の立体構造効果によるものではないことを示１．−Ｃいる。ＣＤ　４へ のｇｐ　１２６の結合を阻止することが示されたＣＤ　４に対するｍＡｂである Ｌｅｕ　３ａは、８Ｅ５のＰＨＡ芽細胞への融合を完全に抑＋）−Ｌ、た。Ｌｅ ｕ３ａによる融合抑止とＰＨＡ芽細胞および非感染Ａ、　３０１細胞間融合がな い（図１の対照）というこ２二から、融合にはＨＩＶが介在しでいるとういうこ とが確認された。市販の多くのｍＡｂはｇｐ　１２０に対して融合を阻止するこ とができないことが゛ｒツセーで分かっている。ＰＨＡ芽細胞および８Ｅ５細胞 は細胞融合アッセーで１時間以内の混合で極めて大きな集合体を形成した。これ らの集合体は、Ｈ５２，１４ＨＭ、２４およびＬｅｕ　３ａによって完全に抑ｌ Ｆされたが、他のｍＡｂではされなかった。ｍＡｂｌ１５２による融合細胞形成 抑止効果は、Ｐｉ（Ａ芽細胞を突然安置ウィルスに感染させた８Ｅ５細胞または 野生型の１１１Ｖ（ＨＴＬシー１１１Ｂ）に感染させたＣＥＭ−Ｔ細胞株と混合 した場合に観察された。

実施例１の記載で産生じたＰＩ（Ａ芽細胞を、精製したＨ　５２または円、Ｍ− ２ＩｇＧの濃度を種々変えて培養した後、８Ｅ５細胞を添加（−だ。ＰＬＭ−２ はＬＦＡ−１を仲介とする機能を阻害しないＣＤ　１８に対するＩｇＧ、　ｋ、 　ｍＡｂである。アッセーは実施例１と全く同様に行った。融合細胞をトリパン ブルー（０，１％）を添加した後に但倍率対物レンズ（４０Ｘ）を用しまた逆相 顕微鏡で数えた。図２に示したデータは、複製ウェルの８６５細胞１０’個当た りの平均融合細胞数である。

Ｈ５２ｍＡｂは、濃度３μｇ／ｍ１以上で８Ｅ５−ＰＨＡ芽細胞融合を完全に抑 ＋ｈが観察され、その効果は投与量に依存法する（図２）、。

ｍＡｂ　Ｈ５２によるＬＦＡ−１媒介性リンパ球付着機能の抑止も同じような投 与量依存性を示す。ＬＰＡ−１付着機構に関与しないＣＤ　１８エピトープに対 するｍＡｂであるＰ　Ｌ　Ｍ　−２は全での濃度で融合に影響しない（図２）。

Ｈ５２で融合が抑止されるレベルを決定するための調査も行った。ＰＩＩＡ芽細 胞と８Ｅ５細胞（２，５ｘ　１０’）を完全培地中のみまたは精製Ｈ５２または ＰＬＭ−２ＩｇＧを２５μｇ／ｍｌ含む完全培地０．５ｍｌ中で氷上で１時間培 養した。細胞をベレット化した後、ＰＢＳ　１０ｎ＋１で２回洗浄し、未結合の ｍＡｂを除去した。次いで、抗体で被覆されたＰＨＡ芽細胞と８８５細胞とを完 全培地に再懸濁させ、被覆されていない８Ｅ５細胞およびＰＩ（Ａ芽細胞と各々 混合した後、実施例１の方法で、１０時間、３７℃で培養し、上記の方法で融合 細胞形成を観察した。

上記研究により、抗ＬＦＡ−］抗体によるリンホカイトの相互作用の抑止効果は 、２つの細胞型がＬＰＡ−１を発現した場合でも１方向性であるということが分 かった。融合細胞形成に対する抗ＬＦＡ−１ｍＡｂの作用が同じく一方向性であ るかどうかを調べるために、１、ＦＡ−１の発現をフロー　シトメトリー（ｆｌ ｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で解析し７た。８Ｂ５上での発現は芽細胞での発現 よりかなり少ないが、８Ｅ５細胞およびＰＨＡ芽細胞のいずれもＬＰＡ−１を発 現した。

各細胞型をｍＡｂ　Ｈ５２または対照ｍＡｂ　ＰＬＭ−２で予め被覆し、洗浄し て未結合のｍＡｂを除去し、融合細胞形成をアッセイした。

）１５２で予め被覆されたＰＩＩＡ芽細胞は融合をほぼ完全に抑止したが、８Ｅ ５細胞に同様な処理をしても効果はなかったく図３）。

この結果から、抗ＬＦＡ−１抗体はＰＨＡ芽細胞のレベルでの融合は抑止するが 、［（ＩＶに感染した８Ｅ５細胞の融合はブロックしないことう示している。こ のことは、ＣＤ４＋細胞上のＬＡＲは８Ｅ５細胞に発現したリガンドと相互作用 すること示唆している。

立体構造効果によって旧Ｖエンベロープのグリコプロティンｇｐ　１２０とＣＤ 　４との相互作用をブロックする硫酸デキストラン等の非特異剤が旧Ｖを媒介と する細胞−細胞融合を抑止するということは知られている。従って、ＣＤ４＋細 胞表面上でのＬＦＡ−１へのｍＡｂＨ５２の結合を調べて、Ｈ５２がｇｐ　１２ ０のＣＤ４への結合を阻止しているか否かを調べた。

ｇｐ　１２０を精製するために、感染したＰＩＩＡ芽細胞の培養上澄み液からＨ ＩＶをヘレット化（１１０，０００ｘｇ、　１．５時間）し、ＰＢＳで１回洗浄 した。ＰＢＳ中にウィルスを再懸濁させ、激しく攪拌してｇｐ　１２０を破断し た後、１１０．０００　Ｘ　ｇで遠心分離した。生成した上澄み液を３００．０ ００ダルトン　カットオフのセントリコン（Ｃｅｎｔｒ　１ｃｏｎ）フィルタを 用いて濃縮した。主としてｇｐ　１２０とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、　１０ 〜３０％）とからなる保持タンパク質を標準的なりロロアミンーＴ方法を用いて 放射沃素化した。

標識したタンパク質（２〜５μＣｉ／ｇ）をＢＳＡ濃度の高い（２％）のＢＳＡ 中に希釈して’　”　Ｉ−ＢＳＡの結合を無くした。ＣＤ４　”″−ＣＥＭ細胞 （５Ｘ１０’）を完全培地中で、２５ｇ／ｍｌのＬｅｕ　３ａ、　Ｈ５２、ＰＬ Ｍ−２ｍＡｂと一緒に予備培養（実施例１を参照）した後、放射沃素化したｇｐ 　１２０．５０ｎｇを添加した。０℃で、１時間培養した後、細胞を２回洗浄し て、結合された放射性標識を測定した。

バックグラウンド結合は、標識されていないｇＰ　１２０を２００倍の過剰濃度 にして細胞を予備培養しで測定した。前記の結果と同じく、Ｌｅｕ　３ａ　ｍＡ ｂ　（抗−ＣＤ　４）で予め被覆された細胞はｇｐ　１２０と結合しなかったが 、ｍＡｂ　）ｌ　５２または対照１ＩＩＡｂのＰＬＭ−２で予め被覆した細胞は ｇｐ　１２０への結合に対して抑止効果を全く示さなかった。この結果から、ｇ ｐ　１２０のＣ０４に対する結合はこのｍＡｂによってブロックされていないの で、ｍＡｂ　Ｈ５２による融合細胞形成の抑止はＨＩＶ受容体機能との干渉によ るものではないということが分かった。

上記、本発明を完全に説明したが、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、当 業者が種々の変更および修正が可能であるということは明らかである。

ＦＩＧ、１ 第２図 抗体濃度（μｃ＋／ｍｌ） 第３図 予備被覆抗体 第４図 抑止抗体 国際調査報告 一一階−−＾ｍ、−ｋ　ＫＴ八へｆ１９０／５Ｑ９７９−１−−＾□１にπｌ墓 頭１０２９７９

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．白血球付着受容体β鎖と反応性するモノクローナル抗体を分泌し、このモノ クローナル抗体が細胞間白血球付着を抑止することができる連続ハイブリドーマ 細胞株。
2. ２．上記受容体がＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１およびＬｅｕＭ５からなる群の中から 選択される請求項１に記載のハイブリドーマ。
3. ３．上記ハイブリドーマがＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０細胞株およびそのイ ンタイプスイッチ変種である請求項１に記載のハイブリドーマ。
4. ４．β鎖モノクローナル抗体が細胞間白血球付着を抑止する白血球付着受容体と 反応性するモノクローナル抗体。
5. ５．上記受容体がＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１およびＬｅｕＭ５からなる群の中から 選択される請求項４に記載のモノクローナル抗体。
6. ６．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０細胞株のハイブリドーマから製造されたモ ノクローナル抗体の特異性を有する請求項４に記載のモノクローナル抗体。
7. ７．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０細胞株のハイブリドーマから製造されたモ ノクローナル抗体。
8. ８．白血球付着受容体β鎖のエピトープに結合して細胞間白血球付着を抑止する モノクローナル抗体を治療に有効な量だけ動物に投与することからなる動物の免 疫応答不全疾患を改善する方法。
9. ９．上記受容体がＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１およびＬｅｕＭ５からなる群の中から 選択される請求項８に記載の方法。
10. １０．上記疾患がＡＩＤＳ、自己免疫疾患および移植片拒絶反応からなる群の中 から選択される請求項８に記載の方法。
11. １１．上記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０細胞株から製 造されたモノクローナル抗体の特異性を有する請求項８に記載の方法。
12. １２．上記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０のハイブリド ーマ細胞株から製造される請求項８に記載の方法。
13. １３．上記投与が非経口である請求項８に記載の方法。
14. １４．上記非経口投与が皮下、筋肉内、腹腔内、体腔内、経皮または静脈内注射 である請求項１３に記載の方法。
15. １５．上記投与が投与１回当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０００ｍｇ／ｋ ｇの範囲である請求項８に記載の方法。
16. １６．上記モノクローナル抗体が治療用に標識される請求項８に記載の方法。
17. １７．上記治療用標識が放射性同位体、医薬、レクチンおよびトクシンからなる 群の中から選択される請求項１６に記載の方法。
18. １８．モノクローナル抗体Ｈ５２およびそのインタイプのスイッチ変種の特異性 を有する検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗体またはその断片を、診 断上に有効な量だけ、病因を含むと思われる原因源と接触させ、この原因源に上 記抗体が結合したか否かを調べることからなる白血球付着受容体の検出方法。
19. １９．上記モノクローナルがＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１６０のハイブリドーマ 細胞株から製造される請求項１８に記載の方法。
20. ２０．検出をインビボで行う請求項１８に記載の方法。
21. ２１．上記の検出可能な標識が放射性同位体および常磁性体からなる群の中から 選択される請求項２０に記載の方法。
22. ２２．検出をインビトロで行う請求項１８に記載の方法。
23. ２３．上記の検出可能な標識が放射性同位体、蛍光化合物、コロイダル金属、化 学発光性化合物、生物発光性化合物および酵素からなる群の中から選択される請 求項２２に記載の方法。