JP3288996B2 - 白血球付着レセプターβ鎖に対するモノクローナル抗体と、この抗体の製造方法と、その応用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白血球付着レセプ
ターβ鎖上のエピトープに特異なモノクローナル抗体に
関するものであり、これは細胞間白血球付着を抑制する
のに用いられる。

【０００２】

【従来技術】ヒト免疫不全ウイルス (HIV)は、重大な免
疫抑制、感染症および神経障害を特徴とする死に致る疾
患である後天性免疫不全症候群(AIDS)の病因である。少
量の循環リンパ球がこのウイルスに感染するにすぎない
が、このウイルスの受容体 (レセプター) CD4 を保持す
るＴ細胞は著しく失われる。 CD4−Ｔ細胞が失われるこ
とが AIDS に特有な免疫抑制に大きく係わっていること
は明らかである。このHIVによって誘発される細胞融合
の結果生じる融合細胞(syncytium) 形成がインビトロで
のこのウイルスの主たる細胞変性作用(cytopathic effe
ct) であるということは知られており、インビボでの C
D4−Ｔ細胞の減少を説明するものと考えられている。こ
のCD4は HIVエンベロープのグリコプロティインgp120と
の相互作用を通じて融合細胞形成に重要な役割を果たし
ている。

【０００３】CD4 受容体はAIDSの病因として大きな役割
を果たしていると考えられているが、CD4 以外の未感染
細胞表面上の分子もHIVに起因する細胞融合に関連して
いるということが報告されている。すなわち、先ず、HI
V 感染細胞の未感染細胞への融合は未感染細胞表面の C
D4密度とは関係がない。さらに、非リンパ様ヒト細胞に
CD4受容体がトランスフェクションするとその細胞を H
IV感染細胞と融合させることが可能になるが、CD4 をト
ランスフェクションしたマウス細胞では、このことは言
えない。さらに、HIV 粒子の CD4細胞への結合に対する
AIDS患者からの血清のブロック能と、CD4 未感染細胞に
対するHIV 感染細胞の融合に対する同じ血清のブロック
能には差がある。

【０００４】CD4 はクラスIIのMHC-制限(MHC-restricte
d)Ｔヘルパー細胞応答においてクラスIIの主たる組織適
合性錯体(major histo-compatiblility complex, MHC)
分子に直接作用する。この応答に白血球付着受容体(LA
R) LFA-1 が関与するということは、抗LAF-1-モノクロ
ーナル抗体 (mAb)を用いて証明されている。gp120 とク
ラスIIの MHCとは構造的に類似していることから、CD4
へのgp 120の結合はクラスIIの MHC分子と CD4との間の
相互作用を模倣しているということを示唆している。同
様なアナロジーによって、 HIVを媒介とする細胞融合に
おける LARの役割を研究した。本発明では、ある種の抗
LFA-1mAb は未感染Ｔ細胞の芽細胞が HIVを媒介とする
HIV 感染細胞への融合を完全に阻止するということを示
している。このことは、 HIVで誘発される融合細胞形成
においてLFA-1 がこのウイルスの主たる細胞変性機構に
関係していることを示している。

【０００５】LFA-1 分子はＴリンパ球およびＢリンパ球
上の他、マクロファージ、胸腺細胞(thymocyte)、顆粒
球 (granulocyte)および骨髄細胞の亜集団上に発現し、
175,000 kd（α; CD 11a) と、95,000 kd （β; CD 18)
の非共役結合した２つのポリペプチドによって構成され
ている。LFA-1 のβ鎖は他の２つの白血球抗原： Mac-1
（α鎖、165,000 kd、CD 11b）; タイプ３型の相補受容
体と、LeuM 5（α鎖、150,00 Kd, CD 11c); タイプ４型
の相補受容体活性に関連する可能性のある分子とに共通
している。これらの３つのαサブユニットは互いに寸法
が異なっているが、これら３つのサブユニット全てが単
一遺伝子または複製遺伝子によってコードされているこ
とを示す証拠がある。ヒトβ鎖をコードするｃDNA は既
にクローン化されており、主構造の50％はインテグリン
(integrin)のβ鎖、ひよこ芽細胞(chick fibroblast)
フィブロネクチン受容体と同一であるということが分か
っている。これらの研究等により、LFA-1 グリコプロテ
ィン類の分子は、より大きな類であるアルギニン−グリ
シン−アスパラギン酸塩 (RGD)アドヘッション類の一員
であることが分かっている [インテグリン(integrins)
として知られている]。

【０００６】リンホカイトの細胞間相互作用が疾患の原
因となる AIDS 等の治療に効果のある方法は現在では限
られている。これらの疾患に対して一般的に投与されて
いる医薬の使用に際しては厳しい禁忌事項が付けられて
いる。従って、AIDSやその他の免疫応答不全疾患におけ
るリンホカイトの細胞間相互作用を抑止できる治療薬が
強く望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】免疫応答不全を改善す
る１つの方法は、白血球付着受容体と結合するモノクロ
ーナル抗体を用いて細胞間白血球付着を抑止することで
ある。細胞間白血球結合が抑止されると、細胞から細胞
へ感染原の伝播が減り、免疫応答活動が低下する。本発
明者達は、免疫応答不全疾患を改善する手段として、白
血球付着受容体上のエピトープに結合して白血球が互い
に付着する能力を抑止するモノクローナル抗体を開発し
た。このモノクローナル抗体は治療薬または診断薬とし
て用いることができる。

【０００８】 〔発明の詳細な説明〕本発明は、白血球付着受容体β鎖
に特異性を有するモノクローナル抗体に関するものであ
る。このモノクローナル抗体はインビトロおよびインビ
ボでこのβ鎖を有する抗原を免疫学的に検出するのに極
めて有効であり、かつ、このβ鎖を有する上記受容体を
持つ細胞の免疫療法に極めて有効である。

【０００９】本発明の好ましい１実施態様で開示された
モノクローナル抗体(H 52)は白血球付着受容体β鎖(leu
kocyte adhesion recepter β-chain) 上のエピトープ
に結合する。この特異性によって、H 52モノクローナル
抗体およびこのH 52の特異性を有する類似のモノクロー
ナル抗体は細胞間付着を抑止するのに用いることができ
る。従って、H 52は AIDS のような免疫応答不全疾患、
自己免疫疾患および移植片拒絶反応、移植片とホストと
の拒絶反応の改善に有効である。このH 52は1989年６月
１日以前に、メリーランド州 ロックビルのアメリカン
タイプ カルチャアー コレクション(American Type
Culture Collection,ATCC) に寄託番号HB 10160 で寄
託された細胞株 (cell line)から得られた抗体から得ら
れたものであり、この抗体の同定特性を有している。こ
の細胞株は上記ATCCに30年間寄託されている。

【００１０】モノクローナル抗体の製造法とその特性決
定法 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造す
るのに用いられる方法は周知である [コーラー(Kohler)
達、ヨーロッパ免疫学誌(European J. Immz)、第６号、
292頁、1976年] 。その方法を簡単に説明すると、BALB
/cマウスをヒトに脾臓付着細胞(splenic adhesion cel
l) で免疫した後、同じタイプの細胞を補助注射する。
４日後にマウスを殺し、マウスのミエローマ P3X65 Ag8
と融合した脾細胞を回収する。抗体は、ハイブリドーマ
をスクリーニングし、陽性クローンのヒトの脾臓組織部
分に対する反応性をテストして製造する。本発明は白血
球付着受容体β鎖に反応性のあるモノクローナル抗体
と、それを製造するためのハイブリドーマを提供する。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体の反応性を有
するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの単離は、
目的とするモノクローナル抗体の基本反応パターンを決
定する通常のスクリーニング技術を用いて行うことがで
きる。すなわち、テストされたモノクローナル抗体が白
血球付着受容体β鎖と反応して細胞間付着を抑止した場
合には、そのテストされた抗体と本発明のハイブリドー
マによって産生された抗体は同じである。

【００１２】逆に、H 52が特定の抗原、例えばLFA-1 受
容体（これとH 52は通常反応性がある) に結合するのを
被試験モノクローナル抗体が阻止するか否かを調べるこ
とによって、不要な実験をしなくても、そのモノクロー
ナル抗体が本発明のモノクローナル抗体H 52と同じ特異
性を有するか否かを決定することで、モノクローナル抗
体を評価することもできる。テストしたモノクローナル
抗体が、H 52による結合減少効果と同じような効果を示
す場合のように、H 52と競合する場合には、これら２つ
のモノクローナル抗体は同じエピトープと結合したと考
えることができる。

【００１３】あるモノクローナル抗体がH 52の特異性を
有するか否かを調べる別の方法は、通常H 52と反応性の
ある抗原（例えば LFA-1受容体）と一緒にH 52を予備培
養し、テストしたモノクローナル抗体が上記抗原と結合
する能力が阻害されるか否かを調べる方法である。テス
トしたモノクローナル抗体が阻害された場合には、その
モノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体と同
一のエピトープ特性を有するといえる。

【００１４】外来ドナー種からのモノクローナル抗体を
別のホスト受容種でインビボで用いることは一般に複雑
なことではないが、ドナー抗体上に存在する抗原決定基
に対するホストによる逆免疫反応が現れるという問題が
起きる可能性がある。場合によっては逆免疫反応が激し
くなり、ホストでドナー抗体をインビボで用いることが
できなくなる。さらに、ホストの逆反応によってドナー
抗体の細胞間付着抑制効果を阻害することもある。ホス
トで起きる逆免疫反応を無くす１つの方法はキメラ抗体
を使用する方法である [サン(Sun) 達の「ハイブリドー
マ (Hybridoma)」５(supplement 1)： S17、1986年; オ
イ(Oi)達の「バイオテクニクス(Bio Techniques)」 4
(3): 214、1986年)]。

【００１５】キメラ抗体は、抗体のヘビー(heavy) 鎖お
よびライト(right)鎖の各種領域が１つ以上の種からの
DNAによってコードされる抗体である。典型的なキメラ
抗体は、所望の抗原特異性の抗体を産生するドナー種に
由来するヘビー鎖(V_H)およびライト鎖(V_L)の可変領域
と、ホスト受容種に由来するヘビー鎖(C_H)およびライト
鎖（Ｃ_L）の可変領域とで構成されている。ドナー抗体
領域の抗原決定基、特に、Ｃ_H領域の抗原決定基に対し
てホスト免疫系が曝される機会を少なくすることによっ
て、受容種で起きる逆免疫応答の可能性を小さくするこ
とができると考えられる。従って、例えば、上記ATCC H
B 10160 から単離した DNAによってコードされたマウス
のＶ_H領域およびＶ_L領域と、ヒトの白血球から単離され
た DNAでコードされたＣ_H領域およびＣ_L領域とによって
構成されるキメラ抗体でヒトのインビボ診断薬を製造す
ることもできる。

【００１６】診断効果または治療効果の観点からは、１
つのイソタイプのモノクローナル抗体が他のイソタイプ
のモノクローナル抗体よりも好ましい場合がある。例え
ば、抗体を原因とする細胞溶解(antibody-mediated cyt
olysis) の研究から、ターゲット細胞を溶解させるに
は、一般に、イソタイプγ−２ａおよびγ−３の未変成
マウスのモノクローナル抗体の方がイソタイプγ−１の
抗体より効果的であることが知られている。

【００１７】この効果の違いは、ターゲット細胞の細胞
溶解破壊に活性に寄与するイソタイプγ−２ａおよびγ
−３の能力に起因するものと考えられる。モノクローナ
ル抗体の特定のイソタイプは初期融合から選択すること
によって直接製造するか、クラス−スィッチ変異細胞(c
lass-switch variants) を単離するシブ選択(sib selc
tion)法を用いて、別のイソタイプのモノクローナル抗
体を産生する親ハイブリドーマから二次的に製造するこ
とができる[ステプルースキィ(Steplewski)達の「米国
科学アカデミー予稿集(Proceedings of the National A
cademy of Science, U.S.A.)」、82：8653、1985年；ス
ピラ(Spira) 達の「免疫療法誌(Journalof Immunologic
al Methods) 」、74： 307、1984年]。従って、本発明
のモノクローナル抗体には、ATCC HB 10160 を用いて製
造されるモノクローナル抗体H 52の特異性を有するクラ
ス−スイッチ変異体を含むものである。

【００１８】本発明のモノクローナル抗体を断片、例え
ば、Fab およびF(ab')₂の形で用いる場合、特にこれら
の断片を治療目的で用いる場合には、免疫応答不全の改
善が白血球付着受容体を有するこれらの細胞の補体を経
由する白血球破壊に依存するものではないことから、任
意のイソタイプを用いることができる。「免疫応答不全
(immune response mediated disorder)」という用語
は、ホストの免疫系が疾患状態に直接または間接的に関
与する不全を表す用語である。免疫応答が関与する疾患
の例としては AIDS、自己免疫疾患および移植片拒絶反
応が挙げられる。ここで、移植片拒絶反応という用語
は、移植片に対するホストの拒絶反応と、ホストに対す
る移植片の拒絶反応の両方を意味している。

【００１９】本発明のモノクローナル抗体はインビボお
よびインビトロで免疫診断または免疫治療を行うのが望
ましい全ての動物に使用できる。ここで、「動物」とい
う用語はヒトおよびヒト以外を含むものである。本発明
で用いる「抗体(antibody)」という用語は、完全な分子
の他に、エピトープ決定基を結合させることが可能なそ
の断片、例えば FabおよびF(ab')₂を含むものである。

【００２０】診断での使用 本発明のモノクローナル抗体は、それらを液相で用いる
か固体担体に結合させて用いる免疫測定法（イムノアッ
セイ）で用いるのに適している。また、この免疫測定法
で用いるモノクローナル抗体は種々の方法で検出できる
ように標識化することができる。本発明のモノクローナ
ル抗体を使用可能な免疫測定法の例としては、直接また
は間接の競合アッセイまたは非競合アッセイが挙げられ
る。これらの免疫測定法の例はラジオイムノアッセイ(R
IA)とサンドイッチ(イムノメトリック) アッセイであ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いて抗原を検出す
る場合には、生理学的サンプルの免疫組織化学的アッセ
イを含む免疫測定法をフォーワード法、リバース法また
は同時法で用いて行うことができる。

【００２１】本発明のモノクローナル抗体は種々の担体
に結合できる白血球付着因子の検出に使用できる。周知
の担体としてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラー
ゼ、天然／変性セルロース、ポリアクリルアミド、寒天
およびマグネタイト等が挙げられる。担体は本発明の目
的に応じて可溶性でも不溶性でもよい。モノクローナル
抗体を結合させるのに適した他の担体は当業者に公知で
あり、また、担体は通常の実験によって容易に見出すこ
とができる。種々の標識と標識化法が当業者に公知であ
る。本発明で使用可能な標識の例としては酵素、放射性
同位体、蛍光性化合物、化学的発光性化合物および生物
学的発光性化合物が挙げられる。モノクローナル抗体に
結合させるのに適した他の標識は当業者に公知であり、
それらの標識を見出すことは通常の実験で行うことがで
きる。また、これらの標識を本発明のモノクローナル抗
体へ結合する方法は当業者に公知の標準的な技術を用い
て行うことができる。

【００２２】本発明のモノクローナル抗体によって検出
される白血球付着因子β鎖は、生物液や組織中に存在す
るであろう。本発明では検出可能な量の白血球付着因子
β鎖を含んだサンプルなら任意のサンプルを用いること
ができる。一般にはサンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血
液、血清等の液体か、組織、***物等の固体また半固体
である。感度がさらに高い別の検出方法としては、抗体
を低分子量ハプテンに結合させ、次いで、二次反応によ
ってこのハプテンを特異的に検出する方法である。ハプ
テンとしては、例えばアビジンと反応するバイオチン
や、特定の抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェニ
ル、ピリドキサルおよびフルオロレセインが一般に用い
られる。

【００２３】本発明で用いる「エピトープ」という用語
は、本発明のモノクローナル抗体と特異的に相互作用す
ることができる任意の決定基を含む用語である。エピト
ープの決定基は一般にアミノ酸または糖側鎖等の分子の
化学的に活性な表面基で構成され、一般には特定の３次
元構造特性と特定の電荷特性とを有している。本発明の
モノクローナル抗体をインビボで抗原の検出に用いる場
合には、検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗
体を診断に有効な量だけ投与する。「診断に有効」とい
う用語は検出可能な状態に標識されたモノクローナル抗
体の量が、そのモノクローナル抗体に特異な白血球付着
受容体β鎖を有するサイトを検出することができるのに
十分な量で投与されるということを意味している。

【００２４】投与された検出可能な状態に標識されたモ
ノクローナル抗体の濃度は、白血球付着受容体を有する
細胞への結合がバックグウウンド信号に対して十分に検
出可能な量でなければならない。また、最大のターゲッ
ト対バックグウウンド信号比を得るためには、検出可能
な状態に標識されたモノクローナル抗体を循環系から迅
速に取り除くのが望ましい。インビボ診断用の検出可能
な状態に標識されたモノクローナル抗体の投与量は個体
の年齢、性別および疾患の程度等の因子によって変わる
が、この投与量は約O.O1mg／m²〜約20mg／m²の範囲、好
ましくは約 0.1mg／m²〜約10mg／m²の範囲で変えること
ができる。

【００２５】インビボ画像診断の場合には、使用可能な
検出機器の型式が放射性同位体を選択する上での主要な
ファクターであり、所定の検出機器で検出可能な崩壊型
を有する放射性同位体を選択しなければならない。イン
ビボ画像診断の場合の放射性同位体の選択で重要な他の
ファクターは、放射性同位体が、ターゲットによって最
大摂取された時に検出可能な程度の長い半減期を有し、
しかも、ホストに対する有害な放射能の量が最小となる
ようにすることである。理想的には、インビボ画像診断
で用いる放射性同位体は粒子放出が無く、通常のγ線カ
メラで容易に検出可能な 140〜250 keＶの範囲のフォト
ンを多量に発生させるものである。

【００２６】インビボ診断用の放射性同位体は中間官能
基を用いることによって免疫グロブリンに直接または間
接的に結合させることができる。金属イオンとして存在
する放射性同位体を免疫グロブリンに結合されるのにし
ばしば用いられる中間官能基は二官能性キレート化剤、
例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸(EDTA)および類似の分子である。
本発明のモノクローナル抗体は磁気共鳴画像化 (MRI)
または電子スピン共鳴 (ESR)等のインビボ診断用の常磁
性同位体で標識することもできる。一般に、診断画像を
視覚化するための従来の任意の方法を使用できる。カメ
ラ画像用には通常γ線およびポジトロンを出す放射性同
位体が用いられ、MRI 用には常磁性同位体が用いられ
る。

【００２７】本発明のモノクローナル抗体は、個人の免
疫応答不全疾患の回復過程をモニターするために使用で
きる。すなわち、白血球数の増減または各種体液中を流
れる抗原の濃度変化を測定することによって、免疫応答
不全疾患の改善を目的とする特定の治療法が有効か否か
を決定することができる。

【００２８】治療での使用 「改善する」という用語は、治療を受けた動物での免疫
応答不全疾患の悪影響が軽減するということを意味す
る。「治療に有効」という用語は、使用したモノクロー
ナル抗体の量が免疫応答に起因する疾患の原因を改善す
るのに十分な量であるということを意味する。本発明の
モノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体に
反応するエピトープで白血球付着受容体β鎖を発現する
白血球を原因とする免疫応答不全疾患を有する動物の免
疫治療にも使用することができる。この治療で使用する
場合のモノクローナル抗体の投与量は約10mg／m²〜約20
00mg／m²の範囲で変えることができる。

【００２９】免疫療法で使用する場合には、本発明のモ
ノクローナル抗体を標識しなくてもよく、あるいは治療
剤によって標識してもよい。これらの治療剤は本発明の
モノクローナル抗体に直接または間接的に結合すること
ができる。間接結合の１つの例は、スペーサ片を用いる
方法である。このスペーサ片は不溶性でも可溶性でもよ
く〔ディーナー(Diener)達「サイエンス (Science)」23
1 ： 148、1986年〕、ターゲットサイトでモノクローナ
ル抗体分子から医薬を放出させることができるように選
択することができる。免疫療法用に本発明のモノクロー
ナル抗体に結合できる治療剤の例としては医薬、放射性
同位体、レクチン、トクシン等がある。本発明のモノク
ローナル抗体とコンジュゲート可能な医薬には、医薬に
分類的される化合物、例えばマイトマイシンＣ、ダウノ
ルビシンおよびビンブラスチン等が含まれる。

【００３０】本発明のモノクローナル抗体を放射性同位
体とコンジュゲートして免疫療法で用いる場合には、特
定のイソタイプが他のイソタイプより好ましいことがあ
る。これは白血球分布とイソタイプの安定性および放出
特性等のファクターに依存する。必要な場合には、上記
のインビボ診断法によって白血球分布を調べることもで
きる。免疫応答不全疾患によっては、あるエミッタが他
のエミッターより好ましい場合がある。一般に、免疫療
法ではα粒子とβ粒子を放出する放射性同位体が好まし
い。好ましい放射性同位体は²¹²Bi 等の飛程が短く、高
エネルギーのα線エミッタである。本発明のモノクロー
ナル抗体と結合される治療用放射性同位体の例としては
¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Cu、²¹²Bi、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷S
c、¹⁰⁹Pdおよび¹⁸⁸Reが挙げられる。

【００３１】レクチンは一般に特定の糖部分に結合する
植物材料から単離される蛋白質である。また、多くのレ
クチンは細胞と癒着して、リンホカイトを刺激するとこ
ができる。しかし、リシンは免疫療法で使用されてきた
毒性レクチンである。これは、毒作用をサイト特異的に
送るように毒性を有するリシンのα−ペプチド鎖を抗体
分子に結合させて作られる。

【００３２】トクシンは植物、動物または微生物によっ
て作られる有毒物質であり、量が多いと致死に到ること
が多い。ジフテリアトキシンは治療で使用可能なコリネ
バクテリウム ジフテリア(Co-rynebacterium diphther
ia) の作る物質である。この毒素はαサブユニットとβ
サブユニットからなり、適切な条件で単離することので
きる。毒素成分Ａを抗体と結合して、本発明のモノクロ
ーナル抗体に特異性を有する白血球付着因子β鎖を発現
させる白血球へサイト特異的に運ぶのに使用することが
できる。本発明のモノクローナル抗体に結合可能な他の
治療医薬は公知のものであるか、当業者が見出すことが
できる。

【００３３】本発明のモノクローナル抗体の投与量範囲
は免疫応答不全疾患の症状が改善されて所望の効果がで
るのに十分な量である。しかし、この投与量は望ましく
ない副作用、例えば交差反応、過敏性反応等を引き起こ
すような量ではならない。一般に、投与量は患者の年
齢、状態、性別、疾患の程度によって変わり、当業者が
適宜決定することができる。投与量は個々の医師が調節
することができる。投与量は約 0.1mg／m²〜約2000mg／
m²、好ましくは１回当たり約 0.1mg／m²〜約 500mgの範
囲で、一日一回または数回、数日間投与することができ
る。一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療医薬と
コンジュゲートして投与した場合には、インビボ診断画
像用の場合に比べて、より少ない投与量で使用すること
ができる。

【００３４】本発明のモノクローナル抗体は、注射また
は時間をかけたパーフュージョンによって非経口投与で
きる。また、本発明のモノクローナル抗体は静脈内、腹
膜組織内、筋肉内、皮下、体腔内または経皮で投与する
ことができる。非経口投与用調製物は、無菌の水溶液ま
たは非水溶液、サスペンジョン、エマルジョン等を含
む。非水溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、オリーブオイル等の植物油とオレ
イン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられ
る。水溶性担体には食塩水または緩衝媒を含む水、アル
コール／水溶液、エマルジョンまたはサスペンジョン等
が含まれる。非経口用賦形剤には塩化ナトリウム溶液、
リンゲル(Ringer)デキストローズ、デキストローズと塩
化ナトリウム、乳酸化リンゲル液または固定オイル等が
含まれる。静脈内投与用賦形剤には流体／栄養分を運ぶ
補給物、電解質補給物（リンゲルデキストロースをベー
スとするもの等）等が含まれる。防腐剤、その他の添加
剤、例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤およ
び不活性ガス等を添加することもできる。

【００３５】本発明はさらに本発明のモノクローナル抗
体を含む医薬または薬理組成物の調製方法を提供する。
この医薬は、本発明のモノクローナル抗体に反応する白
血球付着受容体β鎖を発現する白血球に起因する免疫応
答不全疾患の治療に用いられる。

【００３６】

【実施例】以上、本発明を一般的に説明したが、本発明
は以下の実施例の説明からより明らかになろう。しか
し、以下の実施例は本発明を何ら限定するものではな
い。実施例１ 抗付着モノクローナル因子抗体の調製 雌のBalb/cマウス（６〜８週齢）に 10⁷個のヒトの脾臓
付着細胞のリン酸緩衝液を入れた生理食塩水を腹腔内注
射した。この処置を14日後と21日後に再度繰り返した。
最後の注射の４日後、免疫されたマウスの１匹から脾臓
を摘出して単細胞サスペンションを調製した。コーラー
(Kohler)とミルステイン(Mils-tein) の方法によって、
50％ポリエチレングリコールを用いてこの脾細胞をBalb
/c由来のP3X 653 Ag 8 ミエローマ細胞に融合させた
[「ネーチャア(Nature)」、256 ：495、1976年] 。成長
するハイブリドーマコロニーを形成した後、上記細胞か
らの上澄液を凍結したヒト脾臓のクライオスタット断面
（４μ）上で、免疫組織化学法により、ヒト抗原に対す
る抗体のテストした [ナイム (Naiem)達「免疫法誌(J.
Immun. Meth.) 」、50、145, 1982 年] 。H 52（H 52.
G1. 2)をヒト細胞上での免疫組織化学およびラジオイム
ノアッセイと、ヒト細胞からのラジオイムノ沈降法とで
スクリーニングして、クローニングおよび再クローニン
グした。

【００３７】実施例２ モノクローナル抗体による融合細胞形成の抑止 PHA 芽細胞 (PHA-blast)への 8E5細胞の融合に対する m
Abの効果を融合細胞形成アッセーで調べた。 8E5と A3.
01細胞株とを完全培地[ 10％ FBS(Hy クローン）と10mM
HEPESとを補給した PRMI-1640 ]中に保持した。 8E5細
胞株は LAVに感染したA3. 01細胞株の生存クローンであ
る。8E5 細胞は全 LAVゲノムの１つのコピーを有してい
るが、逆トランスクリプターゼ遺伝子内での点突然変異
によって非感染ウイルス粒子を産生する。 8E5細胞は H
IVエンベロープグリコプロテインを発現し、CD4-陽性PH
A 芽細胞およびＴ細胞株と混合した場合、野生型ウイル
スに感染したＴ細胞の培養中に観察されるのと同じ細胞
変性効果を生じる。

【００３８】完全培地中で、濃度0.25μg/mlのPHA(Well
come Diagnostics)の存在下で３日間、末梢血液の単核
細胞を培養することによってPHA 芽細胞を産生した。こ
の細胞を PBSで３回洗浄し、濃度５×10⁶ml で完全培地
中に再懸濁させた。 mAbは濃度25μg/mlの精製 IgGの形
態で用いた。 PHA芽細胞を同じ体積（30μｌ）のモノク
ローナル抗体または片側面積96ウェルのプレート [コス
ター(Costar)] のウェル中で媒質と混合させ、30分間、
25℃で培養した。次に、 8E5細胞30μｌを添加し、湿っ
たＣＯ₂培養器内で、37℃で10時間培養した。対照ウェ
ルは、同じ数の非感染 A. 301 細胞で培養した PHA芽細
胞で構成した。アッセイでは、8E5 細胞にPHA 芽細胞お
よび CD4 Ｔ細胞株を各々混合した後４〜10時間以内に10
〜50個またはそれ以上の融合した細胞からなる融合細胞
または気球様細胞が形成される。培養を続けると急速に
融合細胞じ死滅することが生体色素排除テストによって
調べられた。

【００３９】HIV を仲介とする細胞融合での効果を調べ
るために、ヒト白血球抗原に対するmAbを PHA芽細胞と
8E5細胞との共培養に添加した。テストした mAbはH 5
2、抗CD 18 (LFA- 1 β); MHM. 24、抗CD 11a (LFA-１
α); H5A4、抗CD 11b (Mac-１α); H5A5、抗CD 45(白血
球共通抗原); MHM. 5、抗HLA-A,B,C)； Leu 3a、抗CD4
である。これらの抗体は全て IgG 1、k イソタイプであ
る。

【００４０】［図１］に示すように、H 52は LFA-1のβ
サブユニット (CD-18)上のエピトープに対して融合細胞
の形成を完全に抑止した。また、細胞融合は mAb (MHM.
24)によって LFA-1のαサブユニット(CD 11a)に対して
完全にブロックされた。しかし、極めて少量ながら細胞
融合が稀に観察されるので、mAb (MHM. 24) は、mAbH 5
2より効果が低い。 LAR群の別の一員である Mac-1（補
体受容体、タイプ３、CD 11b) に対する mAb：H5ARは 8
E5細胞の PHA芽細胞への融合には全く効果がない。ま
た、mAb を認識する互いに無関係な２つの細胞表面蛋白
質、すなわちMHM.5、抗-HLA-A, B, CおよびH5A4と抗白
血球共通抗原 (CD 45)によっては融合は影響されない。
これら２つの抗原は LARまたは PHA芽細胞と同じまたは
より高い密度で発現するので、これら２つの抗原が融合
を阻止することができないということは、抗 LAR抗体に
よる阻害は非特異性の立体構造効果によるものではない
ことを示している。

【００４１】CD 4への gp 120 の結合を阻止することが
示されたCD 4に対する mAbであるLeu 3aは、8E5 の PHA
芽細胞への融合を完全に抑止した。 Leu 3a による融合
抑止と PHA芽細胞および非感染A. 301細胞間融合がない
(［図１］の対照）ということから、融合には HIVが介
在しているとういうことが確認された。市販の多くのmA
bはgp 120に対して融合を阻止することができないこと
がアッセーで分かっている。 PHA芽細胞および 8E5細胞
は細胞融合アッセーで１時間以内の混合で極めて大きな
集合体を形成した。これらの集合体は、H 52、 MHM. 24
および Leu 3aによって完全に抑止されたが、他の mAb
ではされなかった。 mAb H 52による融合細胞形成抑止
効果は、 PHA芽細胞を突然変異ウイルスに感染させた8E
5 細胞または野生型のHIV(HTLV-111B)に感染させた CEM
- Ｔ細胞株と混合した場合に観察された。

【００４２】実施例３ H 52による融合細胞形成の抑止 実施例１の記載で産生した PHA芽細胞を、精製したH 52
または PLM-2 IgGの濃度を種々変えて培養した後、 8E5
細胞を添加した。 PLM-2は LFA-1を仲介とする機能を阻
害しない CD 18に対する IgG，k, mAbである。アッセー
は実施例１と全く同様に行った。融合細胞をトリパンブ
ルー（0.1 ％）を添加した後に低倍率対物レンズ（40
×) を用した逆相顕微鏡で数えた。［図２］に示したデ
ータは、複製ウェルの 8E5細胞 10⁶個当たりの平均融合
細胞数である。

【００４３】H 52 mAbは、濃度３μｇ／ml以上で 8E5-P
HA芽細胞融合を完全に抑止が観察され、その効果は投与
量に依存法する（図２) 。mAb H 52による LFA-1媒介性
リンパ球付着機能の抑止も同じような投与量依存性を示
す。LFA-1 付着機構に関与しない CD 18エピトープに対
するmAb である PLM-2は全ての濃度で融合に影響しない
（［図２］) 。H 52で融合が抑止されるレベルを決定す
るための調査も行った。 PHA芽細胞と8E5細胞(2.5×1
0⁶)を完全培地中のみまたは精製H 52または PLM-2 IgG
を25μg/ml含む完全培地 0.5ml中で氷上で１時間培養し
た。細胞をペレット化した後、PBS10mlで２回洗浄し、
未結合の mAbを除去した。次いで、抗体で被覆された P
HA芽細胞と 8E5細胞とを完全培地に再懸濁させ、被覆さ
れていない 8E5細胞およびPHA芽細胞と各々混合した
後、実施例１の方法で、10時間、37℃で培養し、上記の
方法で融合細胞形成を観察した。

【００４４】上記研究により、抗 LFA-1抗体によるリン
ホカイトの相互作用の抑止効果は、２つの細胞型が LFA
-1を発現した場合でも１方向性であるということが分か
った。融合細胞形成に対する抗LFA-1 mAb の作用が同じ
く一方向性であるかどうかを調べるために、 LFA-1の発
現をフロー シトメトリー(flow cytometry)で解析し
た。8E5 上での発現は芽細胞での発現よりかなり少ない
が、8E5 細胞および PHA芽細胞のいずれもLFA-1 を発現
した。

【００４５】各細胞型をmAb H 52または対照 mAb PLM-2
で予め被覆し、洗浄して未結合の mAbを除去し、融合細
胞形成をアッセイした。H 52で予め被覆された PHA芽細
胞は融合をほぼ完全に抑止したが、 8E5細胞に同様な処
理をしても効果はなかった（［図３］）。この結果か
ら、抗 LFA-1抗体は PHA芽細胞のレベルでの融合は抑止
するが、HIV に感染した 8Ｅ5 細胞の融合はブロックし
ないことう示している。このことは、CD4 細胞上の LAR
は 8E5細胞に発現したリガンドと相互作用すること示唆
している。

【００４６】実施例４ H 52によるHIV gp120 結合の抑止 立体構造効果によって HIVエンベロープのグリコプロテ
インgp 120とCD 4との相互作用をブロックする硫酸デキ
ストラン等の非特異剤が HIVを媒介とする細胞−細胞融
合を抑止するということは知られている。従って、 CD4
細胞表面上でのLFA-1への mAb H 52の結合を調べて、H
52が gp 120 のCD4 への結合を阻止しているか否かを
調べた。

【００４７】gp 120を精製するために、感染した PHA芽
細胞の培養上澄み液からHIV をペレット化（110,000 ×
ｇ、1.5 時間) し、 PBSで１回洗浄した。 PBS中にウイ
ルスを再懸濁させ、激しく攪拌して gp 120 を破断した
後、110,000 ×ｇで遠心分離した。生成した上澄み液を
300,000ダルトン カットオフのセントリコン(Centrico
n) フィルタを用いて濃縮した。主としてgp 120とウシ
血清アルブミン(BSA、10〜30％）とからなる保持タンパ
ク質を標準的なクロロアミン−Ｔ方法を用いて放射沃素
化した。標識したタンパク質（２〜５μCi/g）を BSA濃
度の高い(2％）の BSA中に希釈して¹²⁵Ｉ-BSAの結合を
無くした。 CD4-CEM細胞（５×10⁵）を完全培地中で、2
5ｇ／mlのLeu 3a、H 52、PLM-2 mAb と一緒に予備培養
（実施例１を参照) した後、放射沃素化したgp 120、50
ngを添加した。

【００４８】０℃で、１時間培養した後、細胞を２回洗
浄して、結合された放射性標識を測定した。バックグラ
ウンド結合は、標識されていないgp 120を200 倍の過剰
濃度にして細胞を予備培養して測定した。前記の結果と
同じく、Leu 3a mAb（抗−CD4）で予め被覆された細胞
はgp 120と結合しなかったが、mAb H 52または対照 mAb
の PLM-2で予め被覆した細胞はgp 120への結合に対して
抑止効果を全く示さなかった。この結果から、gp 120の
CD 4に対する結合はこの mAbによってブロックされてい
ないので、mAb H 52による融合細胞形成の抑止は HIV受
容体機能との干渉によるものではないということが分か
った。上記、本発明を完全に説明したが、本発明の精神
及び範囲を逸脱しない限り、当業者が種々の変更および
修正が可能であるということは明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 mAb による融合細胞形成抑制効果を示す図。

【図２】 H 52 IgGによる融合細胞形成抑制効果の投与
量による変化を示す図。

【図３】 H 52が 8E5細胞ではなく、PHA 芽細胞の位置
で融合細胞形成をブロックすることを示す図。

【図４】 mAb による gp 120 の CEM細胞への結合抑制
効果を示す図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 Ｃ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/28 A61K 39/395 C12P 21/08 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 白血球付着受容体β鎖に対して特異的に
   結合するＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ 10160によって産生され
   る抗体の結合特異性を有し且つヘビー鎖およびライト鎖
   中に一種以上の種からのＤＮＡによってコードされる領
   域を有する抗体。
2. 【請求項２】 上記領域が可変領域である請求項１に記
   載の抗体。
3. 【請求項３】 上記抗原結合断片がFabおよびF(ab')₂か
   らなる群の中から選択される請求項１に記載の抗体。
4. 【請求項４】 上記抗原結合断片がF(ab')₂である請求
   項３に記載の抗体。
5. 【請求項５】 抗体がイソタイプγ−２ａである請求項
   １に記載の抗体。
6. 【請求項６】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   １に記載の抗体。
7. 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   ４に記載の抗体。
8. 【請求項８】 LFA-1に結合するＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ
   10160によって産生される抗体と競合する請求項１に記
   載の抗体。
9. 【請求項９】 LFA-1に対する抗体の結合がＡＴＣＣ寄
   託番号ＨＢ 10160によって産生される抗体とLFA-1とを
   予備培養することで阻止される請求項１に記載の抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の抗体と担体とからな
    る免疫応答不全の治療用組成物。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の抗体の有効量を投与
    することからなるヒトを除く動物の免疫応答不全疾患を
    改善する方法。
12. 【請求項１２】 上記疾患が自己免疫疾患または移植片
    拒絶反応である請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 皮下、筋肉内、腹腔内、体腔内、経皮
    または静脈内注射で投与される請求項１１に記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 １回当たりの投与量が0.01mg／kgから
    2000mg／kgの範囲である請求項１１に記載の方法。