JPH0235083A - リパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はりＩＱ−ゼの遺伝情報を有するＤＮＡに関し、
更に詳細には、３１９個のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含むＩＪ　ＩＱ−ゼの遺伝情報を有するＤＮＡ
　、これを有するベクター　これを保持する形質転換体
、当該アミノ酸配列を有するＩＪ　／ｅ−ゼ活性を示す
ポリペプチドおよび該破りペゾチドの製造法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

リノＱ−ゼは、トリグリセリ　ドやジグリセリドをグリ
セリンと脂肪酸とに加水分解する反応を触媒するかまた
はその可逆的反応を触媒する酵素であり、消化薬、臨床
検査試薬、各種脂肪酸の製造またはグリセリドの改質な
ど広範囲な分野で利用されている。そしてす）Ｑ−ゼの
起源としては、動物の膵液や胃液、植物の種子、酵母、
細菌等の微生物などが知られているが、供給安定性の面
から微生物由来のり、Ｑ−ゼが広く用いられている。

ところで臨床検査試薬や脂肪酸の製造などの反応に利用
されるリパーゼに求められる性質としてはｓＦ’Ｈｓ熱
や界面活性剤等に対する安定性が高いことが挙げられる
。そして。

このような性質を有するリパーゼを得ることを目的とし
て新しい微生物の探索（特公昭４６−２９７８７号など
）が行なわれている。

ところで、近年の遺伝子組み換え技術の進歩に伴ない徨
々の生理活性ポリ、（プチドをコードするＤＮＡが数多
く報告されており、またＩＪ　ＩＱ−ゼに関する遺伝子
工学としてはシュードモナス属およびバチルス属に属す
るり、Ｑ−ゼ生産菌よりのＤＮＡ、およびそれを用いる
り／々−ゼの製造法（特開昭６２−２２８２７９号公報
）、アスペルギルス属に属するすＪＱ−ゼ生産菌よりの
ＤＮＡおよびそれを用いるりＡ−ゼの製造法（特開昭６
２−２７２９８８号公報）が報告されている。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らはかかる有用なＩＪ　ＩＱ−ゼをコー
ドするＤＮＡを遺伝子工学の手法によって得るべく鋭意
研究した結果、りａモバクテリウム属に属するＩＪ　Ｉ
Ｑ−ゼ生産菌より分離したＤＮＡを用いて組み換えＤＮ
Ａを作成したところ、従来のＩＪ／々−ゼ活性を有する
？リペゾチドとは、そのアミノ酸配列をコードする塩基
配列、およびそのアミノ酸配列を著しく異にした新規な
りＮＡおよび安定性を示すポリペプチドが得られること
を見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はＮ末端側より第３図にて表わされる
１番目（Ａｌａ）から３１９番目（Ｖａｌ）までのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含むことを特徴とする
ＩＪ　ｌＱ−ゼの遺伝情報を有するＤＮＡ、これを有す
るベクターこれを保持する形質転換体、当該アミノ酸配
列を有するりＩＱ−ゼ活性を示す？リペゾチドおよび該
１’＋）−１！ｆチドの製造法を提供するものである。

本発明のＤＮＡは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次
の如くして製造される。す々わちリパーゼ生産能を有す
るり・Ｑ−ゼ遺伝子の供与体である微生物、例えばクロ
モバクテリウム属に属するＩ）ＩＱ−ゼ生産菌よ、９　
ＤＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素などを用い
て切断したＤＮＡ断片と切断してリニヤ−にした発現ベ
クターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部においてＤ
ＮＡ　リガーゼなどにより結合閉環させ、斯くして得ら
れた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物に移
入した後、ベクターのマーカーとジノ９−ゼの活性とを
指標としてスクリーニングして取得した該組換えＤＮＡ
ベクターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該
組換えＤＮＡベクターを分離精製し１次いで該組換えベ
クターからＩＪ　ＩＱ−ゼ遺伝情報を有する本発明ＤＮ
Ａを採取することにより製造される。

ジノ９−ゼ遺伝子の供与体である微生物としては、ＩＪ
／Ｑ−ゼ産生能を有する微生物であれば特に制限されな
いが、例えば特公昭４６−２９７８７号公報に示されて
いるクロモバクテリウム属に属する微生物であるクロモ
バクテリウム・ビスコスム・パリエタス・ノＱ　ラＩＪ
　＄リテイカム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｅｔａｒｌｕｍ　ｖ
ｉｓｃｏｓｕｒｎ　ｖ＊ｒ。

ｐａｒａｌｌｐｏｌｉｔｌｅｕｍ　）　、クロモバクテ
リウム壷ビスコスムＡＴＣＣ６９１８，クロモバクテリ
ウム・ピオラセウムＡＴＣＣ１２４７２等が挙げられる
Ｏ また、遺伝子組換え技術によりＩ）ＩＱ−ゼ産生能を付
与せしめた形質転換微生物を、す／ｌ？−ゼ遺伝子の供
与体として利用してもよい。

遺伝子の供与体である微生物から由来するＤＮＡは次の
如くにして採取される。即ち、供与微生物である上述し
た細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間
通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し
、次いでこれを溶菌させることによってＩＪ　／♀−ゼ
遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法
としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの
細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によＦ）プロ
テアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなど
の界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法
である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と
の組み合せで行ってもよい。

このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行なう。

分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの結合を
容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオ
チド配列に作用する、例えば、　　ＥａｏＲＩ　、　Ｈ
ｉｎｄ　Ｉ　。

ＢａｍＨＩなどの夏型制限酵素が適している。

また、使用するベクターは、宿主微生物の細胞中で自律
的に増殖しうるファージまたはシラスミドＤＮＡを人工
処理して遺伝子組換えベクター用として適したものに構
築されたものが好ましい。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｂｅｒｌｅｈｉａ　ｃｏｌｔ　）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢ等が使用できる
。

また、シラスミドとしては１例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２。

ｐＵＣ１３、ｐｔｒｃ　１８　、　ｐＵＣ１９等が使用
でき、バチルス・ズプチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｌｌｌｉｓ　）を宿主微生物とする場合にはｐＵＢ
　１１０．　ｐｃ　１９４等が使用でき、またサツカロ
マイセス・セレビシア（５ａｅｅｈａｒｏｒｎｙｅｅｓ
　ｅ＠ｒｓｖ［５ｉａｓ　）を宿主微生物とする場合に
は、　ＹＲｐ７、ｐｙｃ　１、Ｙｇｐ１３゜ｐＪＤＢ　
、　　ＹＩｐ　１等が使用できる。さらに、エシェリヒ
ア・コリおよびサツカロマイセス。

セレビシア等のダラム陰・陽画性にまたがる二種以上の
宿主微生物の細胞中で自律的に増殖可能なシャトルベク
ターを利用することもできる。このようなベクターを、
先に述べたりＩＱ−ゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、
ベクター断片を得ることが好ましい。

微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡＩＪガーゼを用いる方法であればよく、
例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の
接着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡＩＪガー
ゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組
換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後
、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＮソリガーゼ利
用し組換えＤＮＡを作成することもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであれはよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨＩ、エシェリヒア
・コリＩ（１１０１，エシェリヒア・コリＷ３１１０．
エシェリヒア・コ！ＪＣ６００等が使用でき、宿主微生
物がバチルス・ズグチルスの場合、バチルス°ズプチル
ス２０７−２１５　［：ゾーン（Ｇｏｎｅ）第３４巻、
第１〜８頁、１９８５年］、バチルス・ズプチルス２０
７−２１（シャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ　−ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ
）第９５巻、第８７〜９３頁。

１９８４年〕、バチルス・ズプチルスＢＤ１７０〔ネー
チャー（Ｎａｔｕｒａ）第２９３巻、第４８１〜４８３
頁、１９８１年〕、バチルス・ズブチルスＭ株（ＡＴＣ
Ｃ６０５１）等が使用でき、宿主微生物がサツカロマイ
セス・セレビシアの場合、サツカロマイセス・セレビシ
アＡＨ−２２〔ゾーン（Ｇｏｎｅ）第３９巻、第１１７
〜１２０頁、１９８５年」、サツ力ロマイセス・セレビ
シアＢＷＧＩ−７ＡＣモレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏｌｅｅｕｌ亀ｒ＆Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第６巻、第３５５〜３６７頁、１
９８６年〕等が使用できる。

宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移
入を行い、宿主微生物がバチルス属に属する微生物の場
合には、コンピテントセル法またはゾロドプラスト法な
どを採用することができ、さらにマイクロインジェクシ
ョン法を用いてもよく、また宿主微生物がサツカロマイ
セス属に属する微生物の場合には、ゾロドプラスト法、
またはリチウムアセテート法等を用いてもよい。

宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐
性マーカーとリノＱ−ゼとを同時に発現し得る微生物を
検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選
択培地で生育し、かつす、Ｑ−ゼを生成する微生物を選
択すればよい。

このようにして−度選択されたり、Ｑ−ゼ遺伝子を保有
する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出し、他
の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また
、リノＱ−ゼ遺伝子を保持する組換えＤＮＡから制限酵
素などにより切断してソノ９−ゼ遺伝子であるＤＮＡを
切り出し、これと同様な方法により切断して得られるベ
クター断片とを結合させて、宿主微生物に移入すること
も容易に実施できる。

また本質的に＋Ｊ　／Ｑ−ゼ活性を有する本発明のす、
Ｉｉ’−ゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製され
る人工変異遺伝子であるり／Ｑ−ゼムティンにおいては
、まず該人工変異遺伝子を上述の種々なる方法の使用に
より・増幅され、最終的には、この変異遺伝子をベクタ
ーに挿入せしめて組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微
生物に移入させることによって、ジノ９−ゼムティンの
製造が可能である。

かくして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列は。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１４　、１２０５〜１２１０（１９
８１年）に示されているジデオキシ法で解読し、決定す
ることができる。例えばり、Ｑ−ゼ遺伝子供与体として
クロモバクテリウム属に属する菌を用い、宿主微生物と
してエシェリヒア・コリを用いて得られたプラスミド中
のソノ９−ゼ遺伝子の塩基配列は第４図の通りである。

第４図において、Ｎ末端の１位Ａｔａを示すコドンＧＣ
Ｇの上流たる５′末端側は、アミノ酸をコードするコド
ンであればいずれでもよく、さらにその５′末端側にア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有してもよいが、
好ましくはＡＴＧまたはシグナルペノチドに対応する？
リデオキシリゼ核酸を挙げることができる。

またＣ末端Ｖａｔを示すＧＴＧの下流たる３′末端側は
翻訳終止コドンまたはアミノ酸をコードするコドンであ
ればいずれでもよく、さらにその３′末端側にアミノ酸
をコードするコドンを１個以上有してもよいが、その場
合にはこの複数個のコドンの３′末端にさらに翻訳終止
コドンを有することが好ましい。

また、本発明ＤＮＡを発現させることにより生産される
ポリペプチドのアミノ酸配列は。

ＤＮＡの塩基配列から予測決定できる。なお。

該ペゾテドのＮ−末端部を構成する部分アミノ酸配列は
、以下の如くして決定できる。すなわち、ＩＪ／Ｑ−ゼ
産生能を有するＩＪ　／♀−ゼ遺伝子供与微生物を栄養
培地で培養して菌体内にＩＪ　／Ｑ−ゼを産生蓄積せし
め、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離
などの手段により菌体を採取し１次いでこの菌体を機械
的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、ま
た必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性
剤等を添加すれば、ＩＪ　、ｅ−ゼが可溶化され、水溶
液として分離採取される。この様にして得られたり）Ｑ
−ゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫
安分画、グル濾過、吸着クロマトグラフィー　イオン交
換クロマトグラフィーにより処理して、高純度り・♀−
ゼが得られ、高純度ＩＪ　／Ｑ−ゼを用いて液相ゾロテ
ィン　シーケンサ−（ペックマン社製：　ＢＥＣＫＭＡ
Ｎ　Ｓｙｓｔｅｍ８９０ＭＥ　）によりＩＪ　、ｅ−ゼ
であるベゾテドのＮ末端部を構成する部分アミノ酸配列
が決定される。また、少なくとも、該部分アミノ酸配列
は、遺伝子操作によって得られたＩＪ　、ｅ−ゼのＮ末
端部分アミノ酸残基と一致するものであることを確認し
た。第４図で示す塩基配列から、上記の如くして決定さ
れたアミノ酸配列は第３図の通りである０第３図のアミ
ノ酸配列において、Ｎ末端のＡムで示される上流のアミ
ノ酸残基としては１個または複数個のアミノ酸よりなり
、好ましくは水素原子、Ｍｅｔまたはシグナルペノチド
が挙げられる０またＣ末端のＶａｔで示される下流のも
のとしてはそのまま、または酸アミドであってもよく、
また１個以上のアミノ酸残基であってもよい。

かくして得られる形質転換体は、栄養培地にて培養する
ことにより多量のＩＪ　／９−ゼ活性を有する？リペノ
チドを安定に産生ずる０形質転換体である宿主微生物の
培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を
選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか
、工業的には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用され得る。炭素源としては、資化可能な
炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シューク
ロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜
等が使用される。窒素源としては利用可能な鼠素化合物
であればよく、例えばペゾトン、肉エキス、酵母エキス
、カゼイン加水分解物等が使用される。その他、リン酸
塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、
特定のビタミン等が必要に応じて使用される。

培養温度は菌が発育し、す、Ｑ−ゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、宿主微生物がエシェリヒア・コリの場
合、好ましくは２０〜４２℃程度であり、宿主微生物が
バチルス・ズプチルスの場合、好ましくは３０〜３７°
Ｃ程度であり、宿主微生物がサツカロマイセス・セレビ
シアの場合、好ましくは２５〜３５°Ｃである。培養時
間は、条件によって多少異なるが、す）Ｑ−ゼが最高収
量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了す
ればよく１通常は、宿主微生物がエシェリヒア・コリの
場合１２〜４８時間程度であり、宿主微生物がバチルス
・ズプチルスの場合１８〜４２時間程度であり、宿主微
生物がサツカロマイセス・セレビシアの場合２４〜４８
時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、すＩＱ−ゼ生
産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくは、宿主
微生物がエシェリヒア・コリの場合ｐＨ６〜８程度であ
＃）、宿主微生物がバチルス・ズプチルスの場合ｐＨ７
程度であシ。

宿主微生物がサツカロマイセス・セレピシアの場合ｐＨ
５〜７程度である。

培養物中のＩＪ　ＩＱ−ゼは、菌体を含む培養液そのま
まを採取し、利用することもできるが、一般には常法に
従って、リノＱ−ゼが培養液中に存在する場合には、濾
過、遠心分離などによりＩＪ　ノｅ−ゼ含有溶液と微生
物菌体とを分離した後に利用される。す、ｅ−ゼが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠
心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌
体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破
壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および
／または界面活性剤を添加してＩＪ　／々−ゼを可溶化
し水溶液として分離採取する。

この様にして得られたＩＪ、９−ゼ含有溶液を、例えば
、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫安、硫酸ナトリウム等の塩
析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、
エタノール、アセトン等による分別沈澱法により沈澱せ
しめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透
膜にて透析せしめて、より低分子童の不純物を除去する
ことができる。また吸着剤あるいはグル濾過剤等による
グル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーにより精製し、これらの手段を用いて得ら
れる＋７　ＩＱ−ゼ含有溶液は減圧濃縮、凍結乾燥等の
処理により精製されたリノＱ−ゼを得ることができる。

斯くして得られる＋７．Ｑ−ゼの活性測定法は次の通り
である。

く反応液組成〉 ０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７５）　　　　　　Ｑ２
（ｄ）５０　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃｔ２Ｑ　０１２００ｒ
ｎＭ　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＱＯＯ５１００ｍＭ　　ＣｏＡＳＨＱＯＯ５ アシルＣｏＡシンセターゼ（５０Ｕ／ｌｌ１）　　　　
　　　Ｃｏ１水　　　　　　　　　　　　　　全体を０
５ｄとする量上記組成の反応液α５ｄを試験管に分取し
、３７℃、２〜３分子備加温した後、酵素液５０　Ａｌ
ｌ　（１０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７
３，０１％牛血清アルブミン加）を加えて３７℃、１０
分間反応を行い、次いで１０ｍＭＮ−エチルマレイミド
０５ｍおよび下記組成の試薬（Ｒ−２）Ｑ５ｄを加えて
３７℃、５分間反応させる。次に１５ｄの０５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを加えて反応を停止させた後に５５０
　ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μとのリノ
ール酸を遊離する活性を１単位（ＩＵ）とする。

く試薬組成（Ｒ−２）＞ Ｑ２Ｍ　ＰＩＰＫＳ−Ｎ鼻ＯＨ緩衝液（ＰＨ７３）ａｏ
５（ｄ）０３％４−アミノアンチピリン　　　　　　　
α０５０３％ＴＯＯ８１１）ＱＯ５ ペルオキシダーゼ（４５Ｕ／ｍｌ）　　　　　　　ＱＯ
５アシルＣｏＡオキシダーゼ（５００Ｕ、乙Ｅ／）　　
　ＱＯ２Ｑ２Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　
　　α０１水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０２７率）二Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホゾロビル−メタ−トルイジン） 本明細書に記載のアミノ酸、ペゾチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ　：　デオキシリメ核酸 ＲＮＡ　　：　　リボ核酸 Ａ　　：　アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ｋｔ＆　：アラニン Ａｒｇ　：アルギニン Ａｌｎ＠アス／Ｑラギン λｓｐ：アスノＱラギン酸 Ｃｙｓ　ニジスティン Ｇｔｎ　：グルタミン Ｇｔｕ　：グルタミン酸 ａｔｙ　ニゲリシン Ｈｌｓ　：ヒスチジン Ｉｔｅ　：イソロイシン Ｌ＠ｕ　：　ロイシン Ｌｙｓ　：　リシン Ｍ＠ｔ：メチオニン Ｐｈｅ　　：　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　：　　ゾロリン Ｓ・ｒ　：　セリン Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｔｒｐ　　：　　トリブトファン Ｔｙｒ　　：　　チロシン Ｖａｔ：　バリン 〔実施例〕 以下、実施例で本発明の詳細な説明するが、本発明は何
らこれらによって限定されるものではない。

実施例１〔染色体ＤＮＡの分離〕 クロモバクテリウム・ビスコスム・バリエタス・ノ９ラ
リポリティカム（特公昭４６−２９７８７号）の染色体
ＤＮＡ　ｆｃ次の方法で分離した。同菌株を１５０Ｍ１
の普通ブイヨン培地（Ｑ５％チオ硫酸ンーダ含有）で３
７℃−晩振盪培養後遠心（ａｏｏｏ回転１０分）により
集菌した。１０％サッカロース、５０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）　％　５０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ溶液
５ｄに懸濁させ、ｌｄのりゾチーム溶液（１０■／Ｍｌ
）を加えて３７℃、１５分間保温し、次いでｌｌ１１１
１！の１０％ＳＤＲ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を
加えた。この懸濁液に等量のクロロホルム−フェノール
混液（１：１）を加え、攪拌混合し、Ｉ　ＱＯＯ０ｒｐ
ｒｎ３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分取した
。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラ
ス棒でゆつくシ攪拌しなからＤＮＡをガラス棒にまきつ
かせて分離した。これを１０１Ｌｌの１０　ｍＭ　トリ
ス塩酸（ｐＨａＯ）、１−　ｔｎＭ　ＥＤＴＡを含んだ
溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した０これを等量のクロ
ロホルム−７エノール混液で処理後、遠心により水層を
分取し、２倍量のエタノールを加えて上記の方法でもう
一度ＤＮＡを分離し、２ｄのＴＥで溶解した。

実施例２　（ＰＡＣＹＣ１８４ｆラスミドＤＮＡの分離
〕 ｐＡＣＹＣ１８４を保有するエシェリヒア・コリ　　ｐ
Ｍ　　１　９１　　（Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ　　１３
４　　、　１　１　４１（１９８１）　；　ＡＴＣＣ３
７０３３）を１ｔのＢＨＩ培地（Ｄｌｆｃｏ社製）で振
盪培養した。濁度が０Ｄ６６Ｇ　：　Ｌ　Ｏに増殖した
とき、スペクチノマイシンＣＲｋ終濃度３００μｔ　／
　ｗｌ　）を加え、さらに３７℃で１６時間以上振盪を
続けた。

３、ｏ　ＯＯｒｐｒｎ％１０分間の遠心によｐ集菌し、
リゾチーム−３ＤＳ法とセシウムクロライド−エチジウ
ムブロマイド法（ＭａｎｌｏｒＬｉｓ　Ｃ）　：Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐｐ　８６〜９４　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８２）　）
　Ｋ従いシラスミドＤＮＡを調製した。

実施例３　［ＩＪ　）Ｑ−ゼ遺伝子を有するグラスミド
ｐＬＩＰ　１の作成］ （ｉ）　　実施例１で調製したクロモバクテリウム・ピ
スコスム・バリエタス・ノＱ　５　リｄリテイカムの染
色体ＤＮＡ２μｔ（約０５μｆ）と１００倍量のＨ緩衝
液（前述Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｐｐ　１０４）　１μｔ、　ＢｇｔＩ　（宝酒造製１０
ｕｎｉｔ／μｔ）１μｔ、水６μｔを混合し、３７℃１
時間切断した。別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８
４ＤＮＡ約０３μ２を同様の方法を用いてＢａｍＨＩで
切断し、さらにアルカリ性７オス７アターゼ（以下ＢＡ
Ｐと略すことがある。

宝酒造＃！　）　Ｑ　６　ｕｎｉｔを加え％６５℃１時
間処理した。これらの切断した２種のＤＮＡ　ｍ液を混
合し、その１７１０量の３Ｍ酢酸す）　ＩＪウムを加え
、さらに全体量と等量のクロロホルム−７エノール混液
で処理し、遠心分離により水層を分取した。この水層に
２倍容のエタノールを加え、遠心でＤＮＡ　全沈澱させ
たのち減圧乾燥した。水８９μｔで溶解後、１００倍量
のライダージョンバッファ（０，５Ｍ　ト＋）ス塩酸（
ｐＨ７６）、０１ＭＭｇＣ１２、ＱＩＭ１Ｍジチオスレ
イトールｌ　ＯｍＭスペルミジン。

１０　ｍＭ　ＡＴＰ　）　１０　ｔｔＬとＴ　４　ＤＮ
人リガーゼ１μｔ（全酒造製３５　Ｑ　ｕｎｉ　ｔ　）
を加え混合し４°Ｃで一晩放置した。このＤＮＡ溶液を
クロロホルム−フェノール処理シ、エタノール沈澱を集
め減圧乾燥した後、１０μｔのＴＥで溶解した。

（ｉｉ）　　１００ｍのＢ）（Ｉ培地（Ｂｒａｉｎ　Ｈ
ｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製）で培養し
た対数増殖期の大腸＠ＤＨ１株〔国立遺伝学研究所より
分与を受けた、ストック番号ＭＥ７７７８　；　ＡＴＣ
Ｃ２７３２５）を遠心分離により集菌しく　１０．００
Ｏｒｐｍ　、　２分間）４０ｄの水冷した３　０　ｒｎ
Ｍ酢酸カリウム、　　１００　ｍＭ　ＲｂＣＬ、　１０
　ｍＷ　ＣａＣｌ２．５０　ｒｎＭ　ＭｎＣ４および１
５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ５，８）で懸濁した
。０℃で５分間放置後、遠心口上清をすて、さらに４ｄ
の１０　ｒｎＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ドータイト社製）％
７５　ｎｎＭ　ＣａＣ２２、ｌ　ＯｍＭ　ＲｂＣｔおよ
び１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐｕｅｉ、！５　）
で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞と
した。

（ｉ）　　この大腸菌懸濁液２００μｔに（１）で調製
したＤＮＡ浴液ｌＯＡ！、を加え、３０分間ｏ　”ｃで
放置した。ＢＨＩ培地１　ｍｌを加え、３７℃で９０分
間保温後、この１００　ｌｌｔをクロラムフェニコール
（２５μ２／ｄ）を含んだＢ　ＨＩ寒天グレートにまき
、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換
体をクロスリー寒天培地（栄研化学）のゾレートにレノ
リカし、３７℃でさらに一晩培養した。

約５ＱＯＯＯニア０　ニーの形質転換体を調べたところ
、コロニーが青色に変色したもの１株ヲ得、この株をエ
シェリヒア・コＩＪＤＨＩ・ｐＬｒＰ　１株と命名した
。

実施例４　（ｐＬＩＰｌのマツピングおよヒＩＪ　／ｅ
　−ゼ遺伝子の塩基配列の決定〕 実施例３で得たエシェリヒア・コＩＪＤＨＩ・ｐＬＩＰ
　ｚ　＆からｐＡＣＹＣ１８４と同様の方法でグラスミ
ドｐｔ、ｒｐ　ｌ　　ＤＮＡを調製した。

ｐＬＩＰ　Ｉ　ＤＮＡ　Ｋ　ｐイテ制限酵素ＢａｍＨ１
、Ｃ１ｈ　Ｉ　。

ＥｃｏＲＶ　、　５ａｔｌ　、Ｍｌｕ　Ｉ　、　Ｐａｔ
ｌ　、Ｘｈｏ　Ｉ　（いずれも宝酒造袈）による切断地
図を作成した。その結果を第１図に示す。

実施例５ エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＬＩＰ　１株がら前記実
施例２の方法で分離したグラスミドｐＬＩＰ　Ｉ　ＤＮ
Ａ約１．０４ｆ（８μｔ）に１０倍濃度のＭ緩衝液（前
述ＭａｎｉａｔｉａらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ　ｐ　１０４　）　Ｉ　Ａｔとｃｚａ＋（全酒造１０
　ｕｎｉｔ／　ｔｌｔ）　１１１ｔｔ加え３７℃で２時
間切断した。電気泳動にょシ約ａ２ｋｂのＤＮＡ断片を
分離し、フェノール処理エタノール沈澱後２０１１ｔの
ＴＫ（１０ｍＭ）リス塩酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ
ａＱ　）に溶解した。別に実施例２の方法で分離精製し
たｐＢＲ３２２ｆラスミドＤＮＡ約ｏ、２μｔ　（１Ａ
ｔ　）に１０倍濃度Ｍ緩衝液ｌμｔ、水７　ＡｔとＣｔ
ａｌ（全酒造ＩＱｕｎｉｔ／μｔ）１μｔを加え、３７
℃２時間切断したのち、１Ｍトリス塩酸（ｐｕｓ、ｏ）
５μｚ、水８０μｔ１アルカリ性ホスファターゼ（宝酒
造Ｑ　５　ｕ　／　μｌ　）　５μｔを加え、６５℃２
時間反応させた。反応彼等量のクロロホルム−フェノー
ル液で３回処理したのち、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収し、２０μｔのＴＥで溶解した。以上の如く調製
した２種のＤＮＡ溶液５μｌずつを混合し１０倍濃度ラ
イダージョン緩衝液２μｔ１水７μｔとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（全酒造１７５　ｕｎｉｔ　／　μｌ）　１μｔを
加え４’Ｃ１晩放置した。このＤＮＡ溶液をクロロホル
ム−フェノール処理をしエタノール沈澱後ＴＥ１０μｔ
に溶解し、実施例３（１１）と同様の方法で調製したエ
シェリヒア・コリＤＨＩコンピテント細胞を形質転換し
た。アンビシリ／（５０μｙ　／　ｄ　）を含んだＢＨ
Ｉ寒天培地に拡げ、３７’Ｃ１晩培養後、生じたコロニ
ーを実施例３（松）と同様にクロスリー寒天培地にレプ
リカし。

ソノ９−ゼ産生大腸菌を得た。これをエシェリヒア・コ
リＤＨＩ・ｐＬＩＰｌｏと命名し、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌奇策９９２６号（Ｆ’ＥＲＭＰ
−９９２６）として寄託したＯ この菌を純粋分離後ＢＨＩ培地で３７゛Ｃ−晩培養し、
リノ髪−ゼの生産性を前述のりノリーゼ活性測定法によ
り調べたところ、約００１Ｕ／ｄのす／ラーゼ活性を有
していた。

この菌株の保有していたシラスミドを実施例２と同様に
して分離し、リパーゼ遺伝子を含み、プラスミドｐＢＲ
３２２遺伝子を含むシラスミドをｐＬＩＰｌｏと命名し
た。

実ｍ例ａ　（ＰＬＩＰ　１０のマツピングおよびリノＱ
−ゼ遺伝子の塩基配列の決定〕 エシェリヒア・コリＤＨＩ・ｐＬＩＰｌｏ株からｐＡＣ
ＹＣ１８４と同様の方法でｐＬＩＰ　１０　ｆラスミド
ＤＮＡを調製した。

ｐＬｒＰＩＯＤＮ人について制限酵素Ｃ４ａ　Ｉ　。

ＢａｎＨＩ、Ｓａｔ［、Ｘｈｏｌ、Ｐ＋＋ＬＩ、（いず
れも全酒造製）Ｋよる切断地図を作成した。その結果を
第２図に示した。リノＱ−ゼ遺伝子を含んだＤＮＡの塩
基配列をＭ１３ファーゾを用いたジデオキシ法（５ｅｉ
ｅｎｃｓ　２１４　、１２０５−１２１０（１９８１）
）を用いて決定した。＋７　／Ｑ−ゼの構造遺伝子の塩
基配列並びにアミノ酸配列を第４図および第３図に示し
た。

実施例７〔リノＱ−ゼの製造〕 エシェリヒア・コ１ｊＤＨｌ・ｐｒ、Ｉｐ１ｏａｔ２０
ｔのＢＨＩ培地（Ｄｌｆｃｏ社製）で３７℃１８時間シ
ャーファーメンタ−（３０を用）により培養し、培養後
培養物ｔ”ａｏｏＯｒｐｍ、１０分間遠心して集菌した
。次いでこの菌体を、生理食塩水２ｔで洗浄後、２１の
Ｑ　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸アルブミン緩衝液（１ａ６１　ｆ
　ＫＨ２ＰＯ，。

ａ　９２　ｔ　ＮａＯＨ、１？牛血清７　／Ｌ／ブミン
、１１　ＮａＮ３　、水ｔｚ、ｐａａｏ）に懸濁し、リ
ゾチーム１１＃！／　ｍｌ？、　　ＥＤＴＡ−２Ｎｍを
２　ｍＭ　ｓ　）リドンＸ−１００を０１％となるよう
に加えて３７℃３０分間保温し、ａ　ＯＯＯｒｐｎｏ　
ｌ　０分間の遠心により上清液を分離した。この上清１
Ｌ９ｔについてアセトン沈澱（５０％〜８０％）を行い
沈澱物を遠心（ａ　ＯＯＯｒｐｎｎ、３０分間）により
集めた。この沈澱物を１００ｔ／のリン酸アルブミン緩
衝液に溶かし、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用
いてイオン交換クロマトグラフィーを行い活性画分を分
取後脱塩し、凍結乾燥により、粉末標品を得た。この酵
素標品を前述のＩＪ　、ｅ−ゼ活性測定法により測定し
た結果３５０ｕのＩＪ　ＩＱ−ゼを得ることができた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、安定性が高い＋７　ＩＱ−ゼ活性を有
する？リペゾチドを大量に生産することができる。この
ようなリノＱ−ゼは、トリグリセリドから脂肪酸の生産
、トリグリセリドの定量試薬などとして利用できるほか
、エステル交換反応を利用した油脂の改質のための材料
として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はグラスミドｐＬｒｐｔの制限酵素地図を示す図
面である。第２図はグラスミドｐｉ、ｒｐ１ｏの制限酵
素地図を示す図面である０第３図は実施例６で得られた
ＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列を示す図面で
ある。 第４図は実施例６で得られたＤＮＡの塩基配列を示す図
面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ末端側より第３図にて表わされる１番目（Ａｌａ
   ）から３１９番目（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含むことを特徴とするリパーゼの遺伝
   情報を有するＤＮＡ。 ２、塩基配列が、５′末端側より第４図にて表わされる
   ９５７塩基である請求項第１項記載の３、請求項第１項
   記載のＤＮＡを有するベクター。 ４、ベクターがプラスミドｐＬＩＰ１またはｐＬＩＰ１
   Ｏである請求項第３項記載のベクター。 ５、宿主にとつて外来性である請求項第１項記載のＤＮ
   Ａを保持することを特徴とする形質転換体。 ６、宿主が、エシエリヒア属に属する微生物である請求
   項第５項記載の形質転換体。 ７、エシエリヒア属に属する微生物がエシエリヒア・コ
   リである請求項第６項記載の形質転換体。 ８、宿主にとつて外来性である請求項第１項記載のＤＮ
   Ａを保持する形質転換体を培養して該ＤＮＡの遺伝情報
   を発現せしめ、その培養物からリパーゼ活性を有するポ
   リペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの
   製造法。 ９、宿主が、エシエリヒア属に属する微生物である請求
   項第８項記載の製造法。 １０、エシエリヒア属に属する微生物がエシエリヒア・
   コリである請求項第９項記載の製造法。 １１、Ｎ末端側より第３図にて表わされる１番目（Ａｌ
   ａ）から３１９番目（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列を有
   することを特徴とするリパーゼ活性を示すポリペプチド
   。