JPH04346792A - 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、たとえば、ヒトの疾患
の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生化学
的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学分
野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの可変領域の構造に関する。さらに詳しくは、
本発明は、ヒト子宮癌患者のＢ細胞とヒトリンパ芽球細
胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１
１が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンの重
鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列ならびにその遺伝子
の塩基配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞融合あるいは細胞の不死化によるモ
ノクローナル抗体作成の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどをつかって得られてきた。そのな
かでも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫
瘍抗原の解析等の基礎研究への利用のほかに、血清診断
、標識化抗体による腫瘍の画像診断などに利用されはじ
め、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウス等の
異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与す
ることは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、その結果
、副作用並びに抗体の治療または予防効果の低下を引き
起こす。以上の点から、ヒトの癌の予防、治療、体内診
断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を考える
と、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しかし、ヒ
ト型のモノクローナル抗体は、その作成が困難であるこ
とから、現在のところほとんど実用に供されていない。

【０００３】このような状況の中で本発明者の一人は、
特開昭５８−２０１９９４号公報（特公平０１−５９８
７８号公報）、特開昭５９−１３５８９８号公報および
特開昭５９−１３７４９７号公報に詳しく開示されてい
るごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノク
ローナル抗体を産生する細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１
１（ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．ＨＢ８３０７）を樹立した。こ
の細胞株が産生する抗体（ＣＬＮ−ｌｇＧと命名）は、
抗体クラスがｌｇＧ、アイソタイプがγ１型およびκ型
であり、免疫組織学的に癌細胞の表面に存在する癌抗原
に結合し、なおかつ癌細胞の増殖を抑制する効果をもつ
という興味ある知見が得られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このような技術背景の
中で、以下に述べる如き解決すべき課題がある。

【０００５】１）モノクローナル抗体産生細胞株は、一
般に継代と共にその抗体産性能の低下することが知られ
ている。また一般的に言って、ヒトハイブリドーマはマ
ウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。ヒトモノク
ローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の抗体
が必要であり、この問題の解決は必須である。

【０００６】２）現在の免疫学の知見によれば、モノク
ローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の作
用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅させ
る機構が知られている。更にはまた、補体もしくはＫ−
細胞やマクロフアージなどの助けを借りて癌細胞の増殖
を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力ではなく、それゆえ更に抗体の抗癌活性を上昇さ
せる試みが必要である。

【０００７】以上のような課題の解決手段、すなわち抗
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の上昇を具体化するひ
とつの手段として遺伝子操作による方法がある。例えば
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングした後、
動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入し、抗
体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によって解
決することが考えられ、また２）の問題の場合、抗体遺
伝子を人為的に換えることによって、抗体の種々の機能
、たとえば抗原との結合親和性や、免疫担当細胞を介し
た抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させるように改変
したり、さらには本来抗体が持たない機能、たとえば細
胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分子にもし
くはその断片に付加することで、より抗癌活性の高い分
子をデザインすることが考えられる。

【０００８】これらの目的を達成するためには、抗体遺
伝子の分離さらに構造の解明が重要である。しかしなが
ら、該ＣＬＮ−ｌｇＧモノクローナル抗体を構成する軽
鎖と重鎖の構造、さらには抗原と特異的に結合する機能
を有する可変領域の遺伝子構造についてはこれまで全く
知られていない。

【０００９】そこで本発明の主たる目的は、該ＣＬＮ−
ｌｇＧモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子構造を
解明することにある。

【００１０】

【課題点を解決するための手段】本発明者らは、該ＣＬ
Ｎ−ｌｇＧモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコード
するｃＤＮＡを分離し、該ＤＮＡ塩基配列を解明し、ま
たその配列より該抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ
酸配列を決定し本発明を完成するに至った。

【００１１】具体的には、ＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１よ
りｍＲＮＡを調製し、そこから作成したｃＤＮＡラムダ
フアージ・ライブラリーを、プラークハイブリダイゼー
シヨン法によりスクリーニングし、単離したフアージク
ローンの挿入ＤＮＡの塩基配列を決定することにより達
成された。以下本発明について更に詳細に説明する。

【００１２】本発明によれば、ＣＬＮ−ｌｇＧモノクロ
ーナル抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＤＮＡ塩
基配列は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖反応法）により増
幅したヒト抗体遺伝子断片をプローブとして、ＣＬＮ−
ｌｇＧモノクローナル抗体軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを
クローニングし、該ＤＮＡ塩基配列を解析することによ
り決定された。以下、これらの工程について更に詳細に
説明する。

【００１３】［１］ｍＲＮＡ単離精製 本発明において使用される細胞株は、ヒト子宮癌患者リ
ンパ球とヒトリンパ芽球を融合させたヒト／ヒトハイブ
リドーマであり、具体的には特開昭５８−２０１９９４
号公報（特公平０１−５９８７８号公報）に詳しく開示
され、ヒト脳腫瘍、肺ガン、胃ガン、悪性黒色腫などの
ごとき癌細胞の細胞表面抗原に特異的に反応するヒト型
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＣＬＮ−
ＳＵＺＨ１１である。このハイブリドーマはＡＴＣＣ（
Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）に登録番号ＨＢ８３０７として登録され
ている。

【００１４】この細胞を適当な条件下、例えば３７℃炭
酸ガス濃度５％の条件下、５％牛胎児血清を含む培養液
、たとえばＲＤＦ培地中で培養増殖させ、得られる細胞
を遠心分離によって集めた後、細胞から常法、例えばＨ
ａｎらのグアニジウムチオシアネート法［Ｈａｎ，Ｊ．
Ｈ．，　Ｓｔｒａｔｏｗａ，Ｃ．，　＆　　Ｒｕｔｔｅ
ｒ，　Ｗ．Ｊ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，　２６，１６１７−１６２５］により全ＲＮＡを抽出
し、ついでこれを常法、例えばオリゴｄＴセルロースを
用いる吸着カラムクロマトグラフイまたはバッチ法によ
りポリ（Ａ）＋ＲＮＡ画分を分離精製する。

【００１５】得られるポリ（Ａ）＋ＲＮＡはさらにｃＤ
ＮＡライブラリーの作製に利用することができる。本発
明においては、具体的にはＣＬＮ−ＳＵＺ　　Ｈ１１ハ
イブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、この抽出物か
らオリゴｄＴセルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡを精製し、以下のｃＤＮＡライブラリーの作製に供
した。

【００１６】［２］ｃＤＮＡライブラリーの作製［１］
の工程で得られるポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、ポリ
Ａに対応するオリゴｄＴ、あるいは抗体の定常領域に対
応すると考えられる塩基配列を有する合成ヌクレオチド
をプライマーとして、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰの存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的
な一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで大腸菌ＲＮＡ分解酵
素ＨでＲＮＡを断片化した後、この一本鎖ＤＮＡを鋳型
として、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。こうして得られるｃＤＮＡに、たと
えばＥｃｏＲＩリンカーを連結後、ＥｃｏＲＩ消化する
ことによって粘着末端を導入することができる。得られ
る断片を適当なフアージベクター、たとえばλｇｔ１０
ベクター、λｇｔ１１ベクターなどのＥｃｏＲＩ部位に
連結した後、インビトロパッケージングを行い、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製することができる。

【００１７】本発明の具体的操作においては、［１］の
工程で得られるポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型としｃＤＮＡ
を合成し、このｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターに連結し
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００１８】［３］プローブの作製 プローブとしては、ヒト免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の
定常領域あるいは可変領域の遺伝子もしくはその断片、
あるいはその部分のアミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを化学合成したものをたとえ
ばニックトランスレーション法により３２Ｐ、ビオチン
などで標識を行ったものを用いることができる。

【００１９】本発明において好適には、ｃＤＮＡを鋳型
に、抗体の軽鎖および重鎖の一部に相当する配列をプラ
イマーにして行ったＰＣＲにより増幅された断片を、ニ
ックトランスレーション法によりビオチン化したものを
プローブとすることができる。

【００２０】［４］ｃＤＮＡのクローニング［２］の工
程で得られるｃＤＮＡライブラリーを、［３］の工程で
得られるプローブを用いることにより目的とするクロー
ンの選択を行う。例えば［２］の工程で得られるｃＤＮ
Ａライブラリーのλｇｔ１０フアージを大腸菌株（Ｃ６
００Ｈｆｌ−）に感染させることでプラークを形成させ
、さらにプラークハイブリダイゼーシヨン法によって陽
性クローンを選別する。これにより、ＣＬＮ−ｌｇＧ重
鎖ｃＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ−Ｇ１１１が、ＣＬ
Ｎ−ｌｇＧ軽鎖ｃＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ−Ｋ４
１１が選択され塩基配列決定に供された。

【００２１】［５］塩基配列の決定 ［４］の工程で得られるｃＤＮＡクローンは、たとえば
ｐＵＣ１８のようなプラスミッドベクターやＭ１３フア
ージなどのフアージベクターあるいはｐＵＣ１１８、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋などのフアージミッドベ
クターに再クローン化し、得られるサブクローンの挿入
部分のＤＮＡ塩基配列をマキサム、ギルバート法やサン
ガー法を用いて塩基配列を決定することができる。

【００２２】本発明の具体的操作においては、［４］の
工程で得られるλＣＬＮ−Ｇ１１１およびλＣＬＮ−Ｋ
４１１のＥｃｏＲＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　
ＳＫ＋に再クローン化後、ヘルパーフアージＲ４０８感
染により一本鎖ＤＮＡを調製し、サンガー法によりその
塩基配列を決定した。

【００２３】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。

【００２４】

【実施例】実施例１：ハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ　
　Ｈ１１からのｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ）の単離精製 ヒトヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１から
ｍＲＮＡ分画を得た方法は以下のとおりである。ＣＬＮ
／ＳＵＺ　　Ｈ１１細胞から、グアニジウムチオシアネ
ート法［Ｈａｎ，　Ｊ．Ｈ．，Ｓｔｒａｔｏｗａ，　Ｃ
．，　＆　　Ｒｕｔｔｅｒ，　Ｗ．Ｊ．（１９８７）．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２６，１６１７−１６２
５］により、全ＲＮＡを調整した。培養細胞１０９個を
遠心分離で集め生理食塩水で洗浄する。８００ｒｐｍで
遠心し集めた細胞の沈殿に、あらかじめ氷冷しておいた
８％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む５Ｍグ
アニジウムチオシアネートを２０ｍｌ加え、すみやかに
ホモジェナイズする。その細胞破砕液を、あらかじめ７
．５ｍｌのエタノールをいれ−２０℃で冷やしておいた
ポリプロピレン遠心チューブに入れて混合し、即座に１
０，０００ｒｐｍで５分間遠心する。得られた沈殿にあ
らかじめ氷冷しておいた８％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ
ｈａｎｏｌを含む５Ｍグアニジウムチオシアネートを１
０ｍｌ加えホモジェナイズした後、そこへ１Ｍ酢酸０．
２５ｍｌと７．５ｍｌの冷エタノールを加え、−２０℃
で一晩放置する。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し得られた沈殿を１０ｍＭ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ
ｈａｎｏｌを含む６Ｍ塩酸グアニジン１０ｍｌに溶解し
、さらに１Ｍ酢酸０．２５ｍｌと５ｍｌの冷エタノール
を加え−２０℃で３時間放置する。１０，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し得られた沈殿を６Ｍ塩酸グアニジ
ン５ｍｌに溶解し１Ｍ酢酸０．１２５ｍｌと２．５ｍｌ
の冷エタノールを加え−２０℃でさらに３時間放置する
。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し得られた沈
殿を滅菌純水５ｍｌに溶解し、２１Ｍ酢酸ナトリウム０
．５ｍｌおよび冷エタノール１２．５ｍｌ加え−２０℃
で全ＲＮＡ分画として保存する。

【００２５】ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、上述の方法で得ら
れた全ＲＮＡ分画からＣｈｉｒｇｗｉｎの方法［Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｚｙｂｙｌａ，　Ａ．Ｅ．
，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｊ．，＆　　Ｒｕｔｔｅｒ
，　Ｗ．Ｊ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１８，５２９４−５２９９］を用いて調製した。まずＣ
ＬＮ／ＳＵＺＨ１１細胞の全ＲＮＡ９ｍｇを純水に解か
し２．５ｍｇ／ｍｌとする。１００℃で５分間熱処理し
、氷上で急冷した後、５Ｍ塩化リチウム、１０％　　Ｓ
ＤＳ、１Ｍトリエタノールアミン塩酸ｐＨ７．４をそれ
ぞれ最終濃度０．５Ｍ、０．２％、１０ｍＭになるよう
に加える。その溶液を、あらかじめ結合緩衝液（０．５
Ｍ塩化リチウム、０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭトリエタノ
ールアミン塩酸ｐＨ７．４）で平衡化しておいたオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムにかける。さらにカラム体積
の１０倍の結合緩衝液で洗浄する。カラムに結合したポ
リ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出緩衝液（１０ｍＭトリエタノー
ルアミン塩酸ｐＨ７．４）で溶出し、ＲＮＡ分画を集め
る。得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ溶液は１００℃で５分
間熱処理した後、上述のオリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ムを用いたクロマトグラフイーを新しいカラムをつかっ
てもう一度繰り返す。ＲＮＡは、溶出液に２．５倍量の
エタノールと１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウムを加え、
１０，０００ｘｇの遠心分離した後の沈殿として回収す
る。精製ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ沈殿を滅菌純水に溶解し２
μｇ／μｌの濃度で−７０℃で保存する。

【００２６】実施例２：ＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１ライ
ブラリーの作成 実施例１で得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ４μｇを用い、
アマシャム社のｃＤＮＡ合成キットのプロトコールに従
い、ｃＤＮＡを合成した３．２μｇ回収した。このｃＤ
ＮＡ断片をＥｃｏＲＩメチラーゼ処理後、ＥｃｏＲＩリ
ンカーをＴ４　　ＤＮＡ　　ｌｉｇａｓｅを用いて連結
した。ＥｃｏＲＩ消化後、アマシャム社製カラムにより
ＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤＮＡ分画を回収した。この
ｃＤＮＡ１００ｎｇをλｇｔ１０ベクター（ストラタジ
ーン社製）１μｇに連結後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケー
ジングをパッケージングキット（ＧＩＧＡＰＡＣＫ　　
ＧＯＬＤ；ストラタジーン社製）を用いて行いＣＬＮ／
ＳＵＺ　　Ｈ１１ｃＤＮＡライブラリー７．８×１０６
ｐｆｕ／μｇ　　ＤＮＡを作成した。

【００２７】実施例３：プロテインシーケンサーによる
ＣＬＮ−ｌｇＧのアミノ酸配列の決定 精製ＣＬＮ−ｌｇＧを還元後、ゲルろ過により精製した
重鎖および軽鎖のそれぞれ３０μｇをプロテインシーケ
ンサー４７７Ａ（アプライトバイオシステムズ社製）に
かけ、Ｎ末端からのアミノ酸配列を約３０残基決定した
。 また重鎖を臭化シアンによりメチオニン特異的に切断し
断片を逆相液体クロマトグラフイで分離精製後、同様に
一部のアミノ酸配列を決定した。

【００２８】実施例４：プローブの作成法（１）重鎖の
プローブ 実施例３で決定したＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖の部分アミノ酸
配列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベ
ース（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅ）から検索し
た結果、ヒト免疫グロブリンｇｅｒｍ　ｌｉｎｅ　ＶＨ
２６（エントリー名Ｈ３ＨＵ２６、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
　ｎｕｍｂｅｒ　Ａ０２０４７）が最も高いホモロジー
を持つことがあきらかとなった。そこでＥＭＢＬ　　Ｄ
ＮＡデータベース（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｇｅｎｅ　ｄｅｔａ　Ｂａｓｅ）にあるＶＨ
２６のＤＮＡ配列（ＩＤ名ＨＳＩＧＨＡＵ，Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｍ１７７４７）のうちからＮ
末端アミノ酸１０残基に相当する３０ヌクレオチド（プ
ライマーＮｏ．１）を合成した。また重鎖γ１ＣＨ１ド
メインのＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩ
ＧＣＣ４，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｊ００
２２８）のＣ末端側アミノ酸１０残基に相当する３０ヌ
クレオチド（プライマーＮｏ．２）を合成した。

【００２９】

【化９】

【００３０】この２種類のプライマーを用いて実施例２
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１ｃＤＮＡ４ｎｇを
テンプレートにＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）を行った
。その結果、約６６０塩基対の断片（ＰＣＲγＣ３）が
増幅され、塩基配列決定により抗体重鎖γ１　　ＣＨ１
ドメインおよび可変領域に相当することがあきらかとな
った。 このγＣ３をニックトランスレーションの方法でビオチ
ン化しプローブ（ビオチン化ＰＣＲγＣ３）を得た。

【００３１】（２）軽鎖のプローブ 実施例３で決定したＣＬＮ−ｌｇＧ軽鎖の部分アミノ酸
配列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベ
ースから検索した結果、Ｄａｕｄｉ細胞由来のヒト免疫
グロブリン（エントリー名Ｋ１ＨＵＤＩ、Ａｃｃｅｓｓ
ｉｏｎｎｕｍｂｅｒ　Ａ０１８８４）の配列と最も高い
ホモロジーがあった。そこでＥＭＢＬ　　ＤＮＡデータ
ベースにあるＤａｕｄｉ抗体軽鎖のＤＮＡ配列（ＩＤ名
ＨＳＶＫ０２，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ
００９６６）のうちからＮ末端アミノ酸１０残基に相当
する３０ヌクレオチド（プライマーＮｏ．３）を合成し
た。また軽鎖（κ鎖）ＣドメインのＤＮＡ配列（ＥＭＢ
Ｌ−ＧＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩＧＫ１，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
　ｎｕｍｂｅｒ　Ｖ００５５７）のＣ末端側アミノ酸１
０残基に相当する３０ヌクレオチド（プライマーＮｏ．
４）を合成した。

【００３２】

【化１０】

【００３３】この２種類のプライマーを用いて実施例２
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１ｃＤＮＡ４ｎｇを
テンプレートにＰＣＲを行った。その結果、約６６０塩
基対の断片（ＰＣＲκＡ４）が増幅され、塩基配列決定
により抗体軽鎖（κ鎖）Ｃドメインおよび可変領域に相
当することがあきらかとなった。このＰＣＲκ４をニッ
クトランスレーションの方法でビオチン化しプローブ（
ビオチン化ＰＣＲκＡ４）を得た。

【００３４】実施例５：ｃＤＮＡのクローニング（１）
重鎖ｃＤＮＡのクローニング 前記実施例２で得られたＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１ｃＤ
ＮＡライブラリーに対して実施例４で得られたビオチン
化プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを
行い１３個の陽性クローンを得た。この中のクローンの
ひとつは約１．６Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、
このフアージをλＣＬＮ−Ｇ１１１と命名した。

【００３５】（２）軽鎖ｃＤＮＡのクローニング前記実
施例２で得られたＣＬＮ／ＳＵＺ　　Ｈ１１ｃＤＮＡラ
イブラリーに対して実施例４で得られたビオチン化プロ
ーブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行い２
７個の陽性クローンを得た。この中のクローン４１１は
約１．０Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、このフア
ージをλＣＬＮ−Ｋ４１１と命名した。

【００３６】実施例６：塩基配列の決定実施例５におい
てクローン化したλＣＬＮ−Ｇ１１１およびλＣＬＮ−
Ｋ４１１のＥｃｏＲＩ断片をフアージミッドＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋に再クローン化した。このフアージ
ミッドで形質転換した大腸菌ＫＬ１−Ｂｌｕｅにヘルパ
ーフアージＲ４０８を感染させ、一本鎖ＤＮＡを調整し
、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．　Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
．７４；５４６３（１９７７））により塩基配列を決定
した。その結果得られたＣＬＮ−ｌｇＧ軽鎖ｃＤＮＡク
ローンの可変領域の塩基配列およびそれから予測される
アミノ酸配列を以下に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【表２】

【００３９】またＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖および軽鎖のサブ
グループを決定するためコンピューター検索を行い相同
性の高い遺伝子を調べた結果、ＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖可変
領域はサブグループ３に、まだ軽鎖（κ鎖）可変領域は
サブグループ１に属することが明かとなった。

【００４０】実施例７：超可変領域の決定種々の抗体の
重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を各々比較すると、配列が
一定の領域（定常領域）と異なっている領域（可変領域
）が存在することがわかる。可変領域の中でも特に変異
性に富んでいるところを超可変領域（ｈｙｐｅｒ−ｖａ
ｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ，　Ｈｖ領域）と呼び、重
鎖及び軽鎖それぞれ３箇所ずつ存在する。アミノ末端か
ら、それぞれＨｖ１、Ｈｖ２、Ｈｖ３と呼ぶ。これらの
超可変領域は抗原との結合部位を形づくり、抗原決定基
と直接接触するアミノ酸残基を含んでいると考えられて
いる。そのため超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ
；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれ、抗体の抗原特異性
を支配している領域である。

【００４１】ＣＬＮ−ｌｇＧの超可変領域を決定するた
めにＫａｂａｔ　＆　Ｗｕプロットを用いた。［Ｋａｂ
ａｔ，Ｅ．Ａ．，　Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ
，Ｈ．Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆＩｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｃｈａｉｎｓ（Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ｃｏｍｐｕｔ．　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｂｏｌｔ，　
Ｂｅｒａｎｅｋ　＆Ｎｅｗｍａｎ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，１９７６）］これは種々の抗体の配列を並べて、各
位置ごとに変異度を計算してプロットするものである。 ここでいう変異度とは、「任意の位置における出現アミ
ノ酸の種類数」と「その位置で最も頻繁に出現するアミ
ノ酸の頻度」の比であり、理論的に１から４００の値を
とる。 変異度の値が大きい領域が超可変領域である。

【００４２】（１）ＣＬＮ−ｌｇＧ軽鎖の超可変領域の
決定 ＣＬＮ−ｌｇＧ軽鎖のアミノ酸配列から、カッパ鎖サブ
グループ１に属することが明かとなった。そこでＮＢＲ
Ｆ−ＰＤＢ（ｒｅｌ．２６）に含まれているサブグルー
プ１に属する２４の配列をＣＬＮ−ｌｇＧ軽鎖と共に並
べ、各位置で変異度を計算しＫａｂａｔ　＆　Ｗｕプロ
ットを作製した（図１）。その結果から、Ｈｖ１、Ｈｖ
２、Ｈｖ３をそれぞれ残基番号２８から３４、５０から
５６、９１から９６と決定した。

【００４３】（２）ＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖の超可変領域の
決定 ＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖のアミノ酸配列から、Ｈｖサブグル
ープ３に属することが明かとなった。そこでＮＢＲＦ−
ＰＤＢ（ｒｅｌ．２６）に含まれているサブグループ３
に属する２１の配列をＣＬＮ−ｌｇＧ重鎖と共に並べ、
各位置で変異度を計算しＫａｂａｔ　＆　Ｗｕプロット
を作製した（図２、残基番号９６まで表示）。その結果
、Ｈｖ１、Ｈｖ２をそれぞれ残基番号３１から３５、４
９から５９と決定した。Ｈｖ３に関しては、重鎖の場合
、以下に示すごとく、各配列間で顕著に鎖長が異なるた
め位置を正確にあわせることが困難である。ギャップを
考慮せずに変異度を計算すると、残基番号９６システイ
ンが１．０、９７グリシンが２．１、９８アルギニンが
３．９、９９バリンが２９．３、１０９チロシンが１８
．４、１１０トリプトフアンが３．５、１１１グリシン
が１．０となる。明かに残基番号９９から１０９までの
位置で変異度が高く、この領域がＨｖ３に相当する。

【００４４】

【表３】

【００４５】

【発明の効果】ＣＬＮ−ｌｇＧ抗体及びその遺伝子構造
が明かになったことによって、この遺伝子を動物細胞や
大腸菌などの宿主細胞に導入し発現させ、抗体を多量に
得ることが可能となる。更には完全抗体のみならず、あ
る種の抗体断片、たとえば重鎖のみ、軽鎖のみ、Ｆａｂ
断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆｖ断片、ドメイン断片（
ｄＡｂ）、ＣＤＲ断片などの各種抗体由来断片を得るこ
とが可能となる。また更に抗体遺伝子に人為的突然変異
を起こすことにより、アミノ酸配列の一部異なる完全抗
体もしくは各種抗体由来断片を得ることができる。

【００４６】現在までの研究の結果、ＣＬＮ−ｌｇＧは
、たとえばヒト胃ガン、肺ガン、脳腫瘍、悪性黒色腫な
どのごときヒト癌細胞に働き、それ自体の作用でこれら
癌細胞の増殖を抑制し、或は癌細胞を死滅させ、さらに
は補体もしくはＫ−細胞やマクロフアージなどの助けを
借りて癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こ
すことが期待される。しかし、ＣＬＮ−ｌｇＧの遺伝子
を改変し抗体のアミノ酸を一部置換することにより、更
に抗体の活性を上昇させることが可能である。たとえば
抗原との結合親和性や、免疫担当細胞を介した抗癌活性
、あるいは組織への浸潤性などが上昇するように改変で
きる。さらには、たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘
導活性などを抗体分子もしくはその断片に遺伝子レベル
で付加する毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分
子もしくはその断片に遺伝子レベルで付加することで、
より抗癌活性の高い分子をデザインすることが考えられ
る。具体例を挙げれば、癌特異的抗体をキャリアーとし
て利用して、例えば化学療法剤結合−ヒトモノクローナ
ル抗体、インターフエロン結合−ヒトモノクローナル抗
体、高分子毒素結合−ヒトモノクローナル抗体、薬物入
りリポゾーム結合−ヒトモノクローナル抗体、などの形
で癌細胞の増殖抑制や死滅を誘導する薬剤として有用で
ある。また、抗体に放射線感受性物質を結合させて患者
に投与し、癌細胞に選択的に集積させ、治療、診断の効
果を上げることも考えられる。このような癌に対する利
用に際しては、ヒトモノクローナル抗体として完全な抗
体を用いてもよいし、前述したとおり、例えば重鎖のみ
、軽鎖のみ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆｖ断
片、ドメイン断片（ｄＡｂ）、ＣＤＲ断片などの特異的
抗原認識部位を含むより小さな断片を用いることもでき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトκ鎖サブグループ１に属する２４
の可変領域配列のＫａｂａｔ　＆　Ｗｕ　ｐｌｏｔを示
す。

【図２】図２は、ヒト重鎖サブグループ３に属する２１
の可変領域配列のＫａｂａｔ　＆　Ｗｕ　ｐｌｏｔを示
す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記のアミノ酸配列 【化１】 を有する超可変領域Ｈｖ１、Ｈｖ２及びＨｖ３から選ば
   れる少なくとも１つの超可変領域を含むことを特徴とす
   る免疫グロブリン重鎖可変領域断片。
2. 【請求項２】　　下記のアミノ酸配列 【化２】 を有する免疫グロブリン重鎖可変領域断片。
3. 【請求項３】　　下記のアミノ酸配列 【化３】 を有する超可変領域Ｈｖ１、Ｈｖ２及びＨｖ３から選ば
   れる少なくとも１つの超可変領域をコードする塩基配列
   を含むことを特徴とする免疫グロブリン重鎖可変領域の
   少なくとも一部をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。
4. 【請求項４】　　請求項２記載のアミノ酸配列をコード
   するＤＮＡ及びＲＮＡ塩基配列。
5. 【請求項５】　　下記の塩基配列 【化４】 を有する請求項４のＤＮＡ塩基配列及びこれに対応する
   ＲＮＡ塩基配列。
6. 【請求項６】　　下記のアミノ酸配列 【化５】 を有する超可変領域Ｈｖ１、Ｈｖ２及びＨｖ３から選ば
   れる少なくとも１つの超可変領域を含むことを特徴とす
   る免疫グロブリン軽鎖可変領域断片。
7. 【請求項７】　　下記のアミノ酸配列 【化６】 を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片。
8. 【請求項８】　　下記のアミノ酸配列 【化７】 を有する超可変領域Ｈｖ１、Ｈｖ２及びＨｖ３から選ば
   れる少なくとも１つの超可変領域をコードする塩基配列
   を含むことを特徴とする免疫グロブリン軽鎖可変領域の
   少なくとも一部をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。
9. 【請求項９】　　請求項７記載のアミノ酸配列をコード
   するＤＮＡ及びＲＮＡ塩基配列。
10. 【請求項１０】　　下記の塩基配列 【化８】 を有する請求項９のＤＮＡ塩基配列及びこれに対応する
    ＲＮＡ塩基配列。