JP2000511403A

JP2000511403A - 抗癌胎児抗原抗イディオタイプ抗体のヒト化と腫瘍ワクチンとしての使用及びターゲッティング用途のための使用

Info

Publication number: JP2000511403A
Application number: JP09533776A
Authority: JP
Inventors: リュン，シュイ―オン; ロスマン，ミシェル・ジェイ; ハンセン，ハンス
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2000-09-05
Also published as: AU2342897A; US20050048053A1; US6730300B2; EP0939653B1; US7413736B2; WO1997034636A1; CA2250080C; DE69734109D1; US20030054003A1; CA2250080A1; DE69734109T2; US7348419B2; EP0939653A1; EP0939653A4; US20080069775A1; ATE303161T1

Abstract

(57)【要約】ＣＥＡ、たとえばｈＷＩ2に対するヒト化された形態の抗イディオタイプ抗体は、免疫活性を保持している。ヒト化抗イディオタイプを抗ＣＥＡ抗体や抗体フラグメントのクリアリング剤として使用することにより、抗ＣＥＡ抗体の臨床効果を最大にすることができる。さらにまた、ヒト化抗イディオタイプを免疫原性ワクチンとして使用することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】抗癌胎児抗原抗イディオタイプ抗体のヒト化と腫瘍ワクチンとしての使用及びターゲッティング用途のための使用技術分野本発明は、癌胎児抗原抗体と特異的に結合するヒト化キメラ抗イディオタイプ抗体に関する。さらに、本発明は、治療法におけるクリーニング剤（cleaning a gent）としてのヒト化キメラ抗イディオタイプ抗体の使用、およびワクチンとしての使用、およびＣＥＡと特異的に結合する抗体またはその抗体フラグメンントの存在を生物液体サンプル中で検出することを目的とする使用に関する。背景技術ターゲッティングモノクローナル抗体を放射性同位体その他の細胞毒性薬剤と複合させて使用すると、この薬剤を直接腫瘍部位に輸送し、正常組識が毒性薬剤に暴露されるのを制限することができる。(Goldenberg,semin.Nucl.Med.,19:332 (1989))。最近では、抗体系療法により腫瘍関連抗原の位置を正確に測定出来ることが、基礎研究および臨床研究のいずれにおいても立証されるようになった。 (例えば、Thorpe，TIBTECH，11:42(1993);Goldenberg，Scientific American,Sc ience & Medicine,1:64(1994);Baldwin et al.,U.S.4,925,922 and 4,916,213;Y oung,U.S.4,918,163;U.S.5,204,095;Irie et al.,U.S.5,196,337;Hellstrom et al.,U.S.5,134,075 and U.S.5,171,665を参照されたい)。一般に、これまで腫瘍関連マーカーに対しては、標識抗体または抗体フラグメントを用いる方がより効果的であった。この一部の理由として、腫瘍による抗体の取り込み量が一般に低く、注射総量の0.01％から0.001％の範囲にすぎないことが挙げられる(Vaughan et al.,Brit.J.Radiol.,60:567(1987))。腫瘍に対する投与量を増量しようとして標識の濃度を高くしても、一般に健康組識が放射能に暴露される程度が大きくなり反って逆効果である。癌胎児抗原（Carcinoembryonic antigen;ＣＥＡ）は、内胚葉由来のほどんとの消化系上皮腺癌、および乳癌や非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）など一部他のタイプの癌において発現される180,000Ｄａのグリコプロテインである。ＣＥＡの主たる利点の一つは、ＡＢ１抗ＣＥＡが癌患者の放射免疫検出剤として広範に使用されていることである。このような抗体の一つであるＭＮ１４は、ヒトＣＥＡに高い親和性（Ｋ_D＝１０^-9Ｍ）を持つネズミＩｇＧ₁Ｋモノクローナル抗体（Ｍａｂ）である。癌患者において、¹³¹Ｉ-ＭＮ１４はＣＥＡを産生する腫瘍を標的として効果的に捉えるので、標識ＭＮ１４−Ｆａｂ’は直径２ｃｍの小さな病変も検出することができる。抗癌胎児抗原抗体（ＭＮ１４）に対するラット抗イディオタイプ抗体（ｒＷＩ２）は、免疫された動物のＡｂ３反応を誘発することができる有望なイディオタイプワクチンであると考えられてきた。ＷＩ２は、例えば、米国特許第4,624.84 6号で開示されているように、余剰の標識ＭＮ１４を取除くのに用いると、腫瘍／非腫瘍率を向上し、脊髄毒性を低下させる有効なクリーニング剤としても役割を果たすことができることが立証されている。しかしながら、ヒト宿主の拒絶反応のため、ラット抗体（antibody;Ａｂ）の生物半減期が短く、使用が限られている。発明の概要従って、本発明の目的は、抗ＣＥＡ抗体を癌治療に用いた後、ヒト患者において抗イディオタイプＡｂがヒトＭＡｂの免疫原特性をもっている場合に、この有機体を取除くのに有用な免疫試薬として、抗癌胎児抗体特性を持つキメラ抗イディオタイプＡｂ、即ち抗癌胎児抗体特性を持つヒト化抗イディオタイプＡｂを提供し、および検出剤またはワクチンの役割を果たすこともできる抗癌胎児抗体特性を持つ抗イディオタイプＡｂを提供することにある。本発明の他の目的は、該抗体をコードするＤＮＡ構成体を提供することにある。該目的を達成するため、本発明の一態様において、ｒＷＩ２の軽鎖（Ｌ鎖）および重鎖（Ｈ鎖）可変部またはそのサイレント突然変異を含む抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するキメラ抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメントを提供する。好ましい実施態様においては、重鎖可変部は図１に示すラットＷＩ２ＶＫ配列を含み、軽鎖可変部は図２に示すラットＷＩ２ＶＫ配列を含む。本発明の他の態様において、ｒＷＩ２ＣＤ部およびヒト化ＦＲ領域を含む抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するヒト化抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメントを提供する。好ましい実施態様においては、重鎖可変部は図１に示すＫＯＬＷＩ２ＶＨ−１またはＫＯＬＷＩ２ＶＨ− ２配列を含み、軽鎖可変部は図２に示すＲＥＩＷＩ２ＶＫまたはＲＥＩＷＩ２ＶＫＲＳ配列を含む。本発明の他の態様において、相補性決定域−１（ＣＤＲ−１）配列ＮＹＷＭＴ、相補性決定域−２（ＣＤＲ−２）配列ＳＩＴＳＴＧＧＴＹＨＡＥＳＶＫＧ、および相補性決定域−３（ＣＤＲ−３）配列ＤＤＹＧＧＱＳＴＹＶＭＤＡからなるＣＤＲ群から選ばれる少なとも二つのｒＷＩ２重鎖ＣＤＲｓをコードする配列を含んでなる抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するキメラまたはヒト化抗体、または抗体フラグメントの重鎖または重鎖可変部をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の他の態様において、相補性決定域−１（ＣＤＲ−１）配列ＲＡＳＱＤＩＧＮＹＮＲ、相補性決定域−２（ＣＤＲ−２）配列ＧＡＴＮＬＡＡ、および相補性決定域−３（ＣＤＲ−３）配列ＬＨＨＳＥＹＰＹＴからなるＣＤＲ群から選ばれる少なとも二つのｒＷＩ２ＣＤＲをコードする配列を含んでなる抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ部と特異的に結合するキメラまたはヒト化抗体、または抗体フラグメントの軽鎖または軽鎖可変部をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の他の態様において、キメラＷＩ２重鎖に対する遺伝子を含む単離第一発現ベクターおよびキメラＷＩ２軽鎖に対する遺伝子を含む単離第二発現ベクターを提供する。本発明の他の態様において、ヒト化ＷＩ２重鎖に対する遺伝子を含む単離第一発現ベクターおよびヒト化ＷＩ２軽鎖に対する遺伝子を含む単離第二発現ベクターを提供する。本発明の他の態様において、キメラＷＩ２重鎖に対する遺伝子を含む単離第一発現ベクターおよびキメラＷＩ２軽鎖に対する遺伝子を含む単離第二発現ベクター、またはヒト化ＷＩ２重鎖に対する遺伝子を含む単離第一発現ベクターおよびヒト化ＷＩ２軽鎖に対する遺伝子を含む単離第二発現ベクターを含んでなる宿主を提供する。本発明の他の態様において、可溶免疫原性担体タンパク質と複合した、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するヒト化抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントと、任意に、製薬的に許容し得るワクチンアジュバントとを含んでなる有効量のワクチンを患者に投与することを含む癌胎児抗原を発現する癌に対する患者の免疫反応を刺激する方法を提供する。本発明の他の態様において、非標的抗体または抗体フラグメントをクリーニングするために抗イディオタイプ抗体を使用する方法の改良法として、ＣＥＡと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントをそのまま、あるいは複合体成分として、ターゲティング剤、プレターゲティング剤または治療薬に使用する、患者の診断または治療方法を提供する。本発明の他の態様において、液体生物サンプルをｒＷＩ２あるいは抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するキメラ抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントあるいは抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ部と特異的に結合するヒト化抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントに接触させて、該抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントと該サンプル中の抗体イディオタイプまたは抗体イディオタイプフラグメントとの結合を検出することを含む、ＣＥＡと特異的に結合する抗体またはフラグメントの存在の検出方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ｈＶＨのデザインを示す図である。ｒＶＨとしては、ＫＯＬ、デザインされているＫＯＬＷ２ＶＨ−１および二個の配列を並べて示してある。ダッシュは、配列がその位置でｒＷＩ２ＶＫ配列と一致していることを示している。小さな四角は、ヒト化FR配列中でラットアミノ酸(aa)が保持されている位置を示している。ＫＯＬＷＩ２ＶＫ−１には、ＫＯＬＷＩ２ＶＫ−２と５位で比較すると、余剰のラットアミノ酸が含まれていることに注意されたい。ＣＤＲは大きい四角に入れてあって、各四角の上にＣＤＲ1〜ＣＤＲ3とラベルする。図２は、ｈＶＫのデザインを示す図である。ＲＡＴＷＩ２ＶＫ配列としては、ＲＥＩ、デザインされているＲＥＩＷＩ２ＶＫおよびＲＥＩＷＩ２ＶＫＲＳを並べて示してある。ダッシュは、配列がその位置でＲＡＴＷＩ２ＶＫ配列と一致していることを示している。小さな四角は、ヒト化ＦＲ配列中でラットアミノ酸が保持されている位置を示している。示されているとおり、四個のラットアミノ酸残基がＦＲ領域に保持されている。ＣＤＲは大きい四角に入れてあって、各四角の上にＣＤＲ1〜3としてラベルする。図３は、ｈＷＩ２重鎖可変部のポリヌクレオチド配列を示す図である。本文で説明する使用ＰＣＲプライマーおよび合成オリゴＫおよびオリゴＬを示してある。アミノ酸の一文字コードをポリヌクレオチド配列の下に記して、翻訳産物を示している。ＣＤＲは、タンパク質配列上でアンダーラインが付けられている。図４は、ｈＷＩ２軽鎖可変部のポリヌクレオチド配列を示す図である。本文で説明する使用されたＰＣＲプライマーおよび合成オリゴＭ’およびオリゴＮを示してある。アミノ酸の一文字コードをポリヌクレオチド配列の下に記して、翻訳産物を示している。ＣＤＲは、タンパク質配列上でアンダーラインが付けられている。図５は、競合的結合分析によるｈＷＩ２（ＲＳ）、ｈＷＩ２、ｃＷＩ２およびｒＷＩ２の比較を示す図である。これら抗体各々の結合は、ペルオキシダーゼとＭＮ１４抗体の複合体による結合阻害率によって示している。図６は、ｒＷＩ２軽鎖可変部の核酸配列を示す図である。タンパク質翻訳産物は、核酸配列の下のアミノ酸一文字コードによって示している。ＣＤＲ1〜3を表すアミノ酸残基はアンダーラインが付けられ、ラベルされている。図７は、ｒＷＩ２重鎖可変部の核酸配列を示す図である。タンパク質翻訳産物は、核酸配列の下のアミノ酸一文字コードによって示している。ＣＤＲ1〜3を表すアミノ酸残基はアンダーラインが付けられ、ラベルされている。用語の説明本明細書においては次の語または略語が使用されている。本章では例示目的としてのみ、その意味を説明する。これらの語の完全な意味を当業者に明らかにする。「ＣＤＲ」は、相補性決定領域(Complementarity Determing Region)の略語である。相補性決定領域とは、抗体可変部内の領域のことであり、そこは主として抗原抗体結合の原因となるが、そこのみがその原因となるわけではない。「ＦＲ」は、フレームワーク領域（Framework Region）の略語である。フレームワーク領域とは、ＣＤＲに隣接する、または側面に位置する抗体可変部の部分のことである。この領域は、可変部の構成に影響する一以上の構成機能を持っているが、抗原が抗体に結合する直接原因とはならない。但し、フレームワーク領域は相互作用に影響する。「抗体結合領域」とは、抗原と相互作用する抗体の構造を維持する責任を全体で負っている抗体の部分である。一般的には、抗体の軽鎖および重鎖可変部を組み合せたものである。本明細書に言う「キメラ」とは、可変部がラットの抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体のことである。「ヒト化」とは、上記で定義されているキメラ抗体を指すものであるが、ＦＲ可変部が修飾されていて、配列がヒト抗体に近似しているものを言う。「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示するＤＮＡ配列を指す。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’領域に配置されている。プロモーターが誘導プロモーターである場合は、誘導薬剤に反応して転写速度が速くなる。対照的に、プロモーターが構成プロモーターである場合は、転写速度は誘導薬剤によって制御されない。「単離ＤＮＡ分子」とは、生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていないＤＮＡフラグメントのことである。例えば、クローン化されたＴ細胞レセプター遺伝子は、哺乳動物の細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＤＮＡフラグメントである。さらに、単離ＤＮＡ分子のもう一つの例として、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学的に合成されたＤＮＡ分子が挙げられる。「相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)」とは、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子のことである。典型的には、ｍＲＮＡの部分と相補的なプライマーを用いて逆転写を開始する。当業者は「ｃＤＮＡ」なる語を、該一本鎖ＤＮＡ分子とその相補ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖ＤＮＡ分子を指すのにも用いている。「発現」なる語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現とは、構造遺伝子をｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡを一以上のポリペプチドに翻訳することに関する。「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製することができるプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどのＤＮＡ分子のことである。クローニングベクターには、典型的に、ベクターの必須生物機能を失うことなく、外来ＤＮＡ配列を決定可能な方法で挿入できる一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターによってトランスフォームされた細胞の同定と選択に使用するのに好適なマーカー遺伝子が含有されている。マーカー遺伝には典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を付与する遺伝子が含まれている。「発現ベクター」とは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子のことである。典型的に、遺伝子の発現は、構成または誘導プロモーター、組識特異性制御因子やエンハンサーなどの制御因子によって制御されている。このような遺伝子は、制御因子と「操作可能なように結合している」といわれる。「組み換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含有している原核または真核細胞のことである。さらにこの語には、遺伝的に操作され、宿主細胞の染色体またはゲノムに遺伝子のクローンを含む原核細胞または真核細胞も含まれる。本明細書に言う「サイレント突然変異」とは、抗体遺伝子のコード配列に導入され、その結果、抗体のアミノ酸配列の発現も変化したが、その他の点では配列を変えなかった抗体と免疫活性が実質的に近似している変異をいう。「腫瘍関連抗原」とは、通常は正常タンパク質によって発現されないか、あるいはされても発現度が極めて低いタンパク質のことである。腫瘍関連抗原の例としては、αフェトプロテインや癌胎児抗原（ＣＥＡ）が挙げられる。本明細書において、「抗ＣＥＡＭＡｂ」とは、Primus et al.,Cancer Researc h 43:686(1983)and Primus et al.,U.S.patent No.4,818,709によって説明されているクラスIIIのＭＡｂのことである。これらの文献は引用することにより、本明細書の一部とする。本明細書に言う「Ａｂ１」とは、腫瘍関連抗原と結合する抗体のことである。本明細書に言う「抗イディオタイプ抗体(Ａｂ２)」とは、Ａｂ１と結合する抗体である。重要なことは、Ａｂ２がＡｂ１の可変部と結合し、それゆえ、腫瘍関連抗原または感染物質（infectious agent）関連抗原のエピトープときわめて似ていることである。「抗体フラグメント」とは、Ｆ（ａｂ'）₂，Ｆ（ａｂ）₂，Ｆａｂ'，Ｆａｂなどの抗体の部分を指す。構造の如何を問わず、抗体フラグメントは完全な抗体が認識する同一の抗原と結合する。例えば、抗ＣＥＡＭａｂ（Ａｂ１）フラグメントはＣＥＡと結合する一方、Ａｂ₂フラグメントはＡｂ１の可変部と結合してＣＥＡのエピトープときわめて似ている。「抗体フラグメント」なる語にはさらに、抗体と同様の作用によって特定の抗原と結合して複合体を形成する合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質が含まれている。例えば、抗体フラグメントには、軽鎖可変部からなる単離フラグメント、Ｈおよび軽鎖可変部からなる「Ｆｖ」フラグメント、Ｌおよび重鎖可変部がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子や、超可変部ときわめてよく似るアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれている。本明細書に言う「抗体成分」なる語または「抗体」なる語には、完全な抗体と抗体フラグメントの両方を含むものとする。本明細書に言う「ワクチン」は、免疫反応をより効率的に刺激するように操作された抗体または抗体フラグメントを指す。典型的には、抗体成分を可溶免疫原性担体タンパク質と複合させてこれを達成する。発明の詳細な説明概論キメラヒト化ＷＩ２抗イディオタイプ抗体の作成ラットＷＩ２（ｒＷＩ２）は、ＭＮ１４のＣＤＲと結合する抗イディオタイプモノクローナル抗体である。前掲のLosman et al.,(1994)を参照されたい。過去に、ＲＮＡ基質からラット抗体の可変部を単離するようにＰＣＲプライマー対を設計することが提案された。Kutemeier et al.,Hybridoma,11:23−32(1992)を参照されたい。また、同様の方法により、マウス抗体の可変部が単離されていた。 Orlandi et al.,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA86:3833(1989)を参照されたい。本発明においては、前掲のKutemeier et al．とOrlandi et al.が説明したＰＣＲプライマーを組み合せてｒＷＩ２可変部を単離する。これらのプライマーを使って他のラット可変部を単離することも可能となった。ｒＷＩ２の軽鎖と重鎖両方の可変部ｃＤＮＡを単離して、多くのクローンの配列を確認する。ラット可変部をプラスミドベクター中にクローニングして、ラットの可変Ｋ領域およびＨ領域を各々のヒトIgG定常部に付着させる。プラスミドをＳＰ2/Ｏ細胞中にトランスフェクションし、両プラスミドを含むクローンを選択すると、キメラＷＩ2（ｃＷＩ2）抗体が発現される。可変部をヒト化するためには、ＦＲラット領域をヒトIgGの同一領域と置換する。抗体の特異性維持のため、ラットＣＤＲ領域は保持する。しかしながら、抗体の安定性の増進と特異性および結合親和性の維持のためには、新たに同定されたラットＦＲ配列ともっとも近似するヒト配列を用いるのが最善である。ＣＤＲに近接している、または過去の経験からＣＤＲとの相互作用に重要であることが知られているラットの残基は保持する。重鎖および軽鎖両方について、可変部に対応するロングオリゴヌクレオチドを操作して、ヒト化デザインを反映する。オリゴヌクレオチドはプラスミド構成物中のラット可変部を置換して、全長のヒトＷＩ2（ｈＷＩ2）を生成する。ペルオキシダーゼと複合しているＭＮ１４との競合的結合分析によりｃＷＩ2またはｈＷＩ2の効果とｒＷＩ2を比較する。ｃＷＩ2とｈＷＩ2sを発現させるためには、ラットおよびヒト化可変部を、全長のＬおよびＨ抗体鎖が共発現（coexpression）するように、一個または別々のプラスミドベクターに挿入する。ベクターはＳＰ2／Ｏ細胞中にトランスフェクションすることができる。同一のプラスミド中に存在するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現に基づいてトランスフェクションされた細胞を選択し、クローンを実際に増幅する。結合試験によって各種構成物の機能性を測定する。例えば、最終的なｈＷＩ2構成物は、ＭＮ１４との結合力をｒＷＩ2やｃＷＩ2と比較する。図５を参照されたい。モノクローナルAblおよびAb2抗体の産生当業者に公知の方法により、特定の抗原に対するネズミモノクローナル抗体を得ることができる。例えば、Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)and Co ligan et al.,(eds.),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,VOL.1,pages2.5.1−2 .6.7(John Wiley＆Sons 1991)(以下「Coligan」と称す)を参照されたい。簡単に述べると、ラットに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体が産生されていることを確認し、脾臓を摘出してこれからＢリンパ球を得、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマのクローニングを行い、該抗原に対する抗体を産生するポジティブクローンを選択して、該抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。この方法は、他の哺乳動物にも用いることが可能であり、抗原を注射してモノクローナル抗体を産生することができる。これまでに、腫瘍関連抗原や感染性物質に対して、極めて広範なモノクローナル抗体が開発された。例えば、Goldenberg et al.,international application publication No.WO 91／11465(1991)and Goldenberg et al.,international ap plication publication No.WO 94／04702(1994)を参照されたい。これらの特許各々は引用することにより本明細書の一部とする。標準法を用いてＡｂ１やフラグメントにより動物を免疫して、ポリクローナル抗体を調製することができる。例えば、Green et al.,“Production of Polyclo nal Antisera,”in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:IMMUNOLOGICAL PROTOCOLS,M anson(eds.),pages 1-12(Humana Press 1992)を参照されたい。さらに、Coligan at pages 2.4.1-2.4.7を参照されたい。あるいは、Ａｂ１やそのフラグメントを免疫原として用い、上述の方法でモノクローナルＡｂ２を調製することができる。 MAbをハイブリドーマ培養物から単離精製するのは、各種の良く確立された技術によって行うことができる。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いるアフィニテイクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Coligan at p ages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3を参照されたい。さらに、Baines e t al.，“Purification of Immunoglobulin G (IgG),”in METHODS IN MO LECULAR BIOLOGY，VOL．10,pages 79-104(The Humana Press，Inc.1992)を参照されたい。ヒト化抗体のデザイン本発明の抗体の一つは、「ヒト化」モノクローナル抗体である。つまり、ラット相補性決定域をラット免疫グロブリンのＨ可変鎖およびＬ可変鎖から、ヒトIg GのＦＲ領域で見出された多数のアミノ酸残基を含有するように設計された可変部に移動させるのである。マウス／ヒトキメラ抗体を同様にヒト化抗体に転換することは前章において説明した。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的方法は、例えば、Orlandi et al.,が発表したProc.Nat'l Acad .Sci.USA 86:3833(1989)で説明されている。この文献を引用することにより全文を本明細書の一部とする。ヒト化Mabの産生方法は、Johnes et al.,Nature 321: 522(1986),Riechmann et al.,Nature 332:323(1988),Carter et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4285(1992),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)およびSi nger et al.,J.Immu.150:2844(1993)が説明している。これらの文献各々は引用することにより本明細書の一部とする。ｃＷＩ2およびｈＷＩ2の構成キメラヒト化ＷＩ2の操作には標準的な分子生物学の方法や細胞生物学の方法、例えば、ＰＣＲ反応、ＤＮＡの配列決定、ロングオリゴヌクレオチドの合成、クローニング、部位指向性変異誘発、ベクターの細胞へのトランスフェクション、キメラやヒト化抗体の発現やこれらの精製などを用いる。使用する技術は当業者に良く知られており、良く確立されている標準的な技術である。当業者は何らの困難もなくこれらの技術を実施することができる。必要な原材料はすべて容易に入手することができる。これらの技術の参考書は広く求めることができる。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second ed.,C old Spring Harbor Press,(1989);Co et al.,J.Immnunol.,148:1149(1992);Ausu bel et al.,eds.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULA RBIOLOGY,と最新版John Wile y ＆ Sons,NY,(1987;“Protocols−Current Methods and Applications”White, ed.,Methods in Mol.Biol.(15),Humana Press,Totawa,New Jersey(19939;Uhlman n,Gene 71:29(1998);Wosnick et a.,Gene 60:115(1988);およびHuse,in ANTIBOD Y ENGINEERING:A PRACTICAL GUIDE,Boerrbaeck,ed.,W.H.Freeman ＆ Co.,103-12 0(1992)を参照されたい。ラット可変部を初めてクローニングする場合に使用するＰＣＲプライマーは、ヒト抗体間で比較的に保存度が高いと思われる配列の領域上にデザインする。さらに、一般にアミノ酸（aa）は一以上のコドンで表すことができるが、コドンは三番目の位置でしか変化しないことが多い。このようなコドンは「縮重(degener ate)」であると言われることがある。ＰＣＲプライマーのデザインでは、縮重したコドンの数が限られているタンパク質配列を選択する。前述した保存されたタンパク質配列上にデザインする必要もあるので、方法はさらに限定される。従って、デザインされたプライマーは実際に、配列の特定位置で異なっているおびただしい分子の混合物からなっていることが多い。このプライマー混合物のうち総量から見てほんの微量ではあるが。増幅されるべき特定ｍＲＮＡ基質と完全に一致するプライマー分子の何か一つが存在する。成功の可能性を向上するために、数個のプライマー対を使ってｍＲＮＡの異なる領域に作用させることが一般に行われている。当業者は代替方法が直ぐにでも実施できること認識している。例えば、多数の部位特異性変異誘発プロトコルのうちのいくつかを、クローニングされたラット可変部に初めから導入することができた。さらに、本質的にサイレントな変化を起こすことを目的として、可変部や、特にFR領域で付加的なアミノ酸変化が可能であることを認識すべきである。サイレントな変化とは、抗体または抗体フラグメントの結合親和性や特異性に顕著な影響を与えないで、一個または少数個のアミノ酸を置換したり、除去したり、あるいは付加したりすることである。このようなサイレントな変化のうちで最も明白なものは、アミノ酸一個を大きさと化学特性が似ているアミノ酸で置換する場合である。このような変化は、当業者に良く知られており、一般に、「保存的な」アミノ酸置換と呼ばれている。例えば、ロイシンをイソロイシンで置換しても、一般的にタンパク質の構造に影響があるとは考えられない。このような保存的アミノ酸の変化、ならびに抗癌胎児抗体の結合親和性や特異性に顕著な影響を与えないサイレントな変化は、すべて本発明の範囲内とする。操作されたｃＷＩ2またはｈＷＩ2の発現本発明では抗体をコードしている遺伝子を、発現ベクターを介して宿主細胞に導入して発現させる。好ましい実施態様においては、軽鎖および重鎖遺伝子の両方を１個の発現ベクターに導入し、この発現ベクターを宿主細胞に導入する。一般には、トランスフォメーションされた細胞を選択することを目的として、発現ベクターに薬剤マーカーを含有させる。薬剤マーカーは、さらに、近接する遺伝子のコピー数を増幅させて、抗体を過剰発現するクローンを造るのにも使用することができる。例えば、ｃＷＩ2またはｈＷＩ2の軽鎖および重鎖を発現するベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するベクターのＳＰ2／Ｏ細胞中に導入した。元のクローンをメトトレキセート(ＭＴＸ)のもとで増殖をさせて選択した後、増幅させた。軽鎖および重鎖遺伝子を共発現させるには、代替方法の実施も可能であることを認識すべきである。当業者は、選択を他の計画で行うこと、軽鎖および重鎖遺伝子を一個のプラスミドに導入したり、あるいは軽鎖遺伝子や重鎖遺伝子を別々のベクターにコードさせて共発現させること、さらには、他の細胞系をトランスフェクションさせることを考えることができるかもしれない。さらに他の系で抗体を発現させることも可能である。例えば、酵母で発現することが可能であった。代わりに、重鎖および重鎖遺伝子でバキュロウイルスを操作して、培養細胞中で発現させたり、あるいは昆虫を感染させるために使用することもできる。前述したハイブリドーマからMabを精製する方法に類似する方法により、抗体を発現系から精製する必要がある。本発明の抗体の使用本発明によるヒト化モノクローナル抗体は、療法に使用するのに好適である。例えば、これまでにＭＮ１４は、治療薬またはAb2を刺激するワクチンとして提案されてきた。未結合のＭＮ１４がｈＷＩ2と結合したり、あるいはｈＷＩ2と凝集を形成することにより、除去またはクリーニングが可能である場合には、薬剤と複合したＭＮ１４の用量を増量することができる。同様に、選択的に抗イディオタイプ抗体ワクチンと交互に投与することにより、ＭＮ１４をワクチンとして使用することができる。過剰な、自由に浮遊するＭＮ１４ワクチンの存在下で、 Ab2を輸送することは逆効果である。従って、例えば、ｈＷＩ2でＭＮ１４ワクチンを除去すれば、Ab2ワクチンの効率的な投与が可能となる。さらに、ｈＷＩ2そのものをワクチンとすることもできる。一般に本発明の抗体やフラグメントは、可溶免疫原性担体タンパク質と複合させることにより、ワクチンとして使用することができる。好適な担体タンパク質としてはキーホールリンペットヘモシアニン（カギアナカサガイヘモシアニン）を挙げることができるが、これは好ましい担体タンパク質である。抗体およびフラグメントと担体タンパク質との複合体は、標準方法により調製することができる。例えば、Hancoc k et al.，“Synthesis of Peptides for Use as Immunogen,”in METHODS IN M OLECULAR BIOLOGY:IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS,Manson(ed.),pages 23-32(Humana Press 1992)を参照されたい。好ましいワクチン組成は、抗体複合体またはフラグメント複合体とアジュバント含んでなる。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムと脂質を挙げることができる。ワクチン組成物の配合方法は、通常の当業者に良く知られている。例えば、Rola,“Immunizing Agents and Diagnostic Skin Antigens,” in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，18th Edition，Gennaro(ed.),pages 1389-1404(Mack Publishing Company 1990)を参照されたい。治療に用いるワクチンの作用継続時間を、別法により制御することができる。ポリマーを使って抗体やフラグメントと複合体を形成させたり、あるいはこれらをポリマーに吸着させることにより、除法製剤を調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーにpoly(ethylene-co-vinyl-acetate)のマトリックスと、ステアリン酸およびセバシン酸のポリアンヒドリド(polyanhydride)コポリマーのマトリックスを含有させる。Sherwood et al.,Bio／Technology 10:1446(1992 ).これらのマトリックスから抗体やフラグメントが放出される速度は、抗体やフラグメントの分子量、マトリックス内の抗体やフラグメントの用量、および分散している粒子のサイズに依存している。Saltzman et al.,Biophys.J.55:163(198 9);前掲のSherwood et al.他の固体剤形はAnsel et al.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea ＆ Febiger 1990)およびG ennaro(ed.),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition(Mack Publis hing Company 1990)で説明されている。本発明の抗イディオタイプ抗体(Ab)は、抗癌胎児抗体の検出に用いることができる。例えば、ｒＷＩ2,ｃＷＩ2とｈＷＩ2は、患者の血液サンプル中における抗癌胎児抗体の存在のin vitro検出検査用として使用することができるＭＮ１４が治療薬あるいはワクチンとして使用されている場合、ＭＮ１４濃度の検出は重要であるＭＮ１４の存在はｒＷＩ2,ｃＷＩ2またはｈＷＩ2によって検出することができる。同様に、ｈＷＩ2は患者の天然の抗ＣＥＡ Absの存在の測定用として使用することができる。抗イディオタイプAbsが、抗ＣＥＡ Abの検出に有用となるためには、標識と共役させる。好適標識としては、例えば、放射性標識、酵素や蛍光標識が挙げられる。このような標識剤や共役方法は当業者に良く知られている。本発明の抗体製剤は公知の方法により配合し、抗体や抗体フラグメントと製薬的に許容できる担体との混合物として製薬的に有用な組成物を調製する。組成物の投与が被投与哺乳動物によって忍容される場合、製薬的に許容される担体という。無菌リン酸緩衝食塩水は製薬的に許容される担体の一例である。他の好適担体は、当業者に良く知られている。例えば、Ansel et al.,PHARMACEUTICAL DO SAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea ＆ Febiger 1990)およびGennaro(ed.),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCEINCES,18th Edition,(Mack Publishing Company 1990)を参照されたい。抗体やフラグメントは哺乳動物に静脈内投与または皮下投与する。さらに、連続注入による投与や単回または複数回の大量投与も行うことができる。抗体ワクチンは皮下投与し、ワクチンではない抗体製剤は静脈内投与することがが好ましい。一般に、ヒトに対する抗体やフラグメントの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般治療条件、および病歴によって変わらなければならない。典型的には、約1pg／kg〜約10mg／kg（薬剤量／患者の体重）の用量範囲の抗体やフラグメントを被投与者に投与することが望ましい。但し、場合によっては、これよりも低いあるいは高い用量を用いても良い。治療目的のためには、治療有効量の抗体やフラグメントを哺乳動物に投与する。抗体製剤の投与量が生理的に顕著である場合、これを「治療有効量」であると言う。薬剤の存在によって被投与哺乳動物の生理に検出し得る変化が生じた場合、生理的に顕著であると言う。特に、本発明の抗体製剤の場合は、その存在によって被投与哺乳動物の体液および／または細胞免疫反応を誘発する場合を生理的に顕著であるとする。本発明は技術、細胞系およびベクターの具体的説明の他に、米国特許第5,443, 953号および第4,624,846号、ならびに米国特許出願番号第08／318,157号および第08／289,576号で開示されている該技術、細胞系およびベクターの説明に依存している。例１ＷＩ2クローンのヒト化ＷＩ2ハイブリドーマから調製したＲＮＡをテンプレートとして用い、逆転写酵素とそれに続くＰＣＲ反応（ＲＴ-ＰＣＲ）により、ＷＩ2 ＶＨおよびＶＫドメインをコードする配列を得た。ＷＩ2抗体配列はラット由来のものであるので、O rlanndiのVH1FOR／BACKおよびVK1FOR／BACKプライマーの組み合せは、ＶＨとＶＫのＰＣＲクローニングするのに有用ではないと思われた。前掲のOrlandi et a l.,1989を参照されたい。前掲のKutemeier et al.,が提案した配列に基づいて、ＷＩ2のＶＨおよびＶＫドメインをＰＣＲクローニングすることを目的とする次の組み合せのプライマーを合成した。配列中、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、およびＷ＝Ａ＋Ｔである。さらに、およびＶＨ配列のクローニングヘキソマーをアニーリングプライマーとして用い、ＷＩ2ハイブリドーマから単離した全ＲＮＡから一次鎖（first-strand）cDNAを調製した。ＲＣＨ1（ラットIgG1 ＣＨ1ドメインにアニールする）およびＲＶＨ-1ＢＡＣＫ(ラット５'ＶＨ領域にアニールする）をプライマー対として、標準プロトコルにより一次鎖cDNA テンプレートからのＶＨ配列をＰＣＲ増幅して単離することを試みた。しかしながら、ＰＣＲ産物は得られなかった。予期せざるとことであったが、ＲＣＨ1プライマーがOrlandiのプライマーVH1BACK(5'−AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G− 3'）と連携して、予期していたサイズのＰＣＲ産物を産生した。ＰＣＲ増幅したＶＨ配列は、制限酵素Pst1／BstEIIで消化して、重鎖ステージングベクターVHpB sの対応する部位にサブクローンした。Leung et al.,Hybridomas 13:469(1994) を参照されたい。六個のクローン各々を配列決定して、お互いに同一であることを確認した。ラット３’ＶＨ領域にアニールするＲＶＨ-1ＦＯＲとRVH-1BACKもまた、予期していたサイズのＰＣＲ産物を産生したが、これはさらに分析しなかった。図７は重鎖可変部の配列を示している。ＶＫ配列のクローニングヘキソマーをアニーリングプライマーとして用い、ＷＩ2ハイブリドーマから単離した全ＲＮＡから一次鎖cDNAを調製した。ＲＫ1（ラットＣＫメインにアニールする）をＲＶＫ-3ＢＡＣＫ(5'ＶＫ領域にアニールする)と連携させて、標準プロトコルによりｒＷＩ2のＶＫ領域をＰＣＲ増幅して単離した。その結果、予期していた通りの320塩基対（bp）の産物を得た。このＰＣＲ産物はさらに分析した。他のプライマー対は試験しなかった。図６は軽鎖可変部の配列を示している。 320bpのＶＫＰＣＲ産物を制限分析した結果、別のPvuII部位が存在していて、後でステージングベクター、VKpBRのPvuII／BcII部位中にクローニングするのに干渉する可能性があることが明らかになった。同上。ＰＣＲ産物にはステージングベクター用の適当な末端がないので、ＰＣＲＤＮＡを直接挿入する余裕があるＴＡクローニングベクター（Invitrogen）に直接サブクローンした。六個のクローン各々を配列決定して、六個すべてが同一であることを証明した。推定タンパク質配列の分析では、機能性があるＶＫドメインであることを示していた。配列をステージングベクターにサブクローンするために、新しいプライマーをデザインした。このプライマーでは、制限認識部位全体ではなく、相容性があるPvuI I末端を導入して、ＰＣＲ産物が５'末端で相容性部位を持ち、ＶＫＰＢＲステージングベクター内の対応するPvuII部位に連結できるようにした。ＰＣＲ産物をB g1IIで消化して、VKpBRステージングベクターのPvuII／BcIIクローニング部位にサブクローンした。同上。連結はE.coli内でトランスフォームして、選択平板で平板培養した。Miniprep ＤＮＡを調製して分析した。ポジティブクローンからのＤＮＡを配列決定して、PvuII部位の連結領域が期待通りのものであることを確かめた。HindIII／BamI制限消化により、ＷＩ2に対するＰＣＲ増幅のＶＨおよびＶＫ配列を各々のステージングベクターから切除して、単離したフラグメントを各々の重鎖および軽鎖発現ベクター、pG1gおよびpKhにサブクローンした。同上。重鎖および軽鎖発現ベクターと共トランスフェクトされたクローンからキメラＷＩ1（ｃＷＩ2）を精製して、ｃＷＩ2の免疫活性をラットＷＩ2のそれと比較した。その結果、両抗体ともにＭＮ１４がＣＥＡに結合するのを同程度に抑制したことが立証され、ＶＨおよびＶＫ配列の信頼性が確認された。ヒト化ＷＩ2配列のデザインＶＨおよびＶＫのデザイン多数のヒトIgGのフレームワーク領域とｒＷＩ2のそれとの配列相同性を比較して、ヒトＫＯＬフレームワークを選択して重鎖ＣＤＲの移植を行った。ＫＯＬＷ12ＶＨ−１とＫＯＬＷ12ＶＨ−２と名付ける２種のヒト化重鎖を調製した。図１を参照されたい。しかしながら、ＫＯＬＷ12ＶＨ−１のみを合成して、試験した。ＫＯＬＷ12ＶＨ−１とＫＯＬＷ12ＶＨ−２とは、５位でアミノ酸一個が異なるに過ぎない(Ｖの代わりにＱ)。ＣＤＲに近接するか、あるいは過去の経験からＣＤＲとの相互作用に重要であることが分かっているラットの残部は、両方のヒト化配列に保持された。合計五個のラット残部をヒト化ＷＩ2重鎖配列ＫＯＬＷ12ＶＨ−１のＦＲ領域に保持した。ＫＯＬＷ12ＶＨ−２配列は、四個のラットアミノ酸残基を保持する能力があった。ＲＥＩフレームワーク領域を選択して、軽鎖ＣＤＲを移植した。デザインされた軽鎖のＦＲ領域には、ラット残体四個を保持した。デザインされた軽鎖、ＲＥＩＷ12ＶＫの配列を図３に示す。ヒト化ＷＩ2ＶＨおよびＶＫドメインの遺伝子合成コンピューター分析により、ヒト化ＷＩ2のＶＨおよびＶＫドメインをコードするヌクレオチド配列を次のようにして組み立てた。ｈＷＩ2ＶＨフランキングプライマーであるオリゴ21（45mer）とオリゴ22（54mer）を用いて、ロングオリゴＫ（135mer）をＰＣＲ増幅した。オリゴＫのＰＣＲ産物はＶＨドメインのＮ末端の半分をコードしている。同様に、フランキングプライマーであるオリゴ23（48mer）とオリゴ24（45mer）を用いて、ロングオリゴＬ（133mer ）をＰＣＲ増幅した。オリゴＬのＰＣＲ産物はＶＫドメインのＣ末端の半分をコードしている。ヒト化ＷＩ2ＶＨドメインのＰＣＲ合成に使用した異なるオリゴ類の配列を図３に示す。オリゴＫのＰＣＲ産物はPst1／A1wHIで消化し、オリゴＬのＰＣＲ産物はA1wHI ／BstEIIで消化した。ＫおよびＬフラグメントはゲル精製して、ステージングベクタ−VHpBRのPstI／BstEII部位に連結した。ミニプレップは制限分析ならびに配列決定反応によって分析した。ＭＰ33＃4（1.6.95）はｈＷＩ２の正しい配列を持っていることが確認されたので、その後のクローニングとサブクローニングに使用された。ｈＷＩ２ＶＨドメインを含有するBamHI／HindIIIフラグメントは消化後ＤＮＡからゲル精製されて、重鎖発現ベクターpG1gの対応する部位にクローンされた。Leung et al.,Hybridomas 13:469(1994).ｈＷＩ2ＶＫフランキングプライマーであるPvuII部位を含有するオリゴ25とオリゴ26を用いて、ロングオリゴＭ'（129mer）をＰＣＲ増幅した。オリゴＭ'のＰＣＲ産物はＶＫドメインのＮ末端の半分をコードしている。フランキングプライマーであるオリゴ27(44mer)とオリゴ28（39mer）を用いて、ロングオリゴＮ（127mer）をＰＣＲ増幅した。オリゴＮのＰＣＲ産物はＶＫドメインのＣ末端の半分をコードしている。ヒト化ＷＩ2ＶＨドメインのＰＣＲ合成に使用した異なるオリゴヌクレオチド類の配列を図４に示す。オリゴＭ'のＰＣＲ産物はPvuIIで消化し、オリゴＮのＰＣＲ産物はPstI/Bg1II で消化した。ＭおよびＮフラグメントはゲル精製して、ステージングベクターVH pBRのPvuII／BcII部位に連結した。ミニプレップＤＮＡの分析によって三個のクローンがｈＷＩ2VKpBRに対する正の可能性があることが確認された。これらの三個のミニプレップのHognessストックを調製した。配列は両方向からBg1II／BcII 連結点を横断して確認した。プラスミドＤＮＡを調製した。ＨＷI2ＶＫＨドメインを含有するBamHI／HindIIフラグメントは、消化後ＤＮＡからゲル精製されて、軽鎖発現ベクターpkhの対応する部位にクローニングされた。ｈＷＩ2を発現する重鎖と軽鎖両方のベクターのプラスミドＤＮＡを調製して、エレクトロポレーションによりＳＰ2／Ｏ骨髄腫細胞中に共トランスフェクトした。エライザ分析により合計八個の抗体産生コロニーが同定された。最高産生コロニー三個を維持して、細胞アリコートを凍結保存した。最高産生コロニーを拡大して、その後の精製と試験に備えた。ミックスアンドマッチ法実験によるｈＷＩ2重鎖の免疫活性の試験ＷＩ2のヒト化重鎖とキメラ軽鎖を含有するミックスアンドマッチ法による抗体を精製した。各種濃度のミックスアンドマッチ法抗体が、ペルオキシダーゼが複合したＭＮ１４と結合するためにＣＥＡを塗布したエライザ培養平板を用いた競合試験に用いられた。キメラ抗体を作成して、発現したところ、ラットＷＩ２に匹敵する免疫原反応性を持つことが証明された。ミックスアンドマッチ法抗体の免疫活性は、これまでにラットＷＩ２の免疫活性と同等であることが確認されているｃＷＩ２に匹敵した。ＷＩ２のヒト化重鎖は、ラットＷＩ２の原免疫活性を維持していた。ＷＩ２ヒト化ＷＩ2重鎖および軽鎖の原配列は、コンピューターモデリングを使わずに、配列の相同性を比較してデザインされたものである(図２)。競合的結合試験において、最初のヒト化ＷＩ2（ｈＷＩ2）は、ｒＷＩ2やｃＷＩ2と比較して、ペルオキシダーゼが複合したＭＮ１４とＣＥＡの結合を阻害する効果が僅かに劣ることが証明された。前述のミックスアンドマッチ法実験（rVK＋hVH）において、ヒト化重鎖ノデザインは良好であることが認められた。従って、ｈＷＩ2に完全な免疫活性を復活させるためにヒト化ＶＫ配列の再デザインに着手した。ＲＥＩプロテインの結晶構造を検討した結果では、ラット残体Arg（66）とSer（69）軽鎖ＣＤＲと相互作用している可能性があることが示唆された。これら二つのラット残部、ArgとSer、を部位指向性変異誘発によりｈＷＩ2のＶＫＦＲ3に導入した。新しくデザインした軽鎖、ＲＥＩＷＩ2ＶＫＲＳ、を図２に示す。これら二つの変異体を含有するヒト化ＷＩ2をｈＷＩ2ＲＳと命名した。すべたの変異体とベクター構成物は、配列決定ならびに広範な制限分析によって確認した。この新しい種のヒト化軽鎖（ｈＷＩ2ＲＳｐＫｈ）用の発現ベクターは、エレクトロポレーションによるトランスフェクション実験に使用された。理由は不明であるが、これまで抗体産生クローンをｈＷＩ2ＲＳ発現ベクターでトランスフェクトさせることが困難であった。クローン131A9と132F7は、ｈＷＩ2ＲＳ抗体をそれぞれ約0.4および0.2mg／リットルづつ産生するポジティブクローンであることが確認されている。クローン131A9と132F7の培養物１リットルを回転壜（roller bottle）で増殖し、抗体を標準タンパク質精製法で精製した。これにより、131A9と132F7からそれぞれｈＷＩ2ＲＳ約0.4および0.2mgを得ることができた。131A9および132F7 ｈＷＩ2ＲＳの免疫活性は、ＭＮ１４のＣＥＡへの結合に対する阻害力で測定する時、両者同等であった。例２異なる種のＷＩ２の免疫活性比較一実験においてｈＷＩ2およびｈＷＩ2ＲＳの免疫活性をＭＮ１４がＣＥＡに結合を阻害する能力で測定して、それぞれｒＷＩ２およびｃＷＩ２の免疫活性と比較した(図５)。ｈＷＩ２とｈＷＩ2ＲＳの免疫活性は共にｒＷＩ２とｃＷＩ２のそれよりも僅かに低いように見受けられた。ＲＳ変異体をｈＷＩ２のＦＲ３領域に導入しても、期待通りに免疫活性を向上させなかったと思われた。しかしながら、ｈＷＩ２の免疫活性は、ｒＷＩ２やｃＷＩ２と略同等であった。ｈＷＩ２とｈＷＩ２ＲＳとの間では、免疫活性は同等ではないにせよ、極めて近似していた。ｈＷＩ２ＲＳは軽鎖ＦＲ３領域にラット残部を二つ余分に含有して、ヒト化された最初の種のＷＩ２よりも免疫原性が高い可能性があるので、スケールアップさせる抗体としてはｈＷＩ２を選択した。、例３増幅可能のｈＷＩ２用発現ベクターの構成ｈＷＩ２のＶＨおよびＶＫ配列をそれぞれのステージングベクターから切り出して、１個の増幅可能ベクターであるｐｄＨＬ２に連結した。ｐｄＨＬ２ベクターには、各々別個のプロモターによって制御されいるヒトＣＫの配列、ＩｇＧ1 、および増幅可能ＤＨＦＲ遺伝子が含有されている。Leung et al.，Tumor Targ eting 2:184(#95)(1996);およびLosman et al.,Tumor Targeting 2:183(#93)(19 96)を参照されたい。このｈＷＩ2を発現するベクターをｈＷＩ2ｐｄＨＬ2と命名した。ｈＷＩ2ｐｄＨＬ2のプラスミドDNAを直鎖状にして、エレクロトポレーションによりＳＰ2／Ｏ細胞中にトランスフェクトした。選択は、培養基中にメトトレキセート（ＭＴＸ）0.1μＭを添加して行った。増幅はＭＴＸの濃度を上げて行くに従って（0.1〜3μＭ）徐々に実施した。増幅されたクローンから精製されたｈＷＩ2は、従来の増幅されていないクローン由来のｈＷＩ2と同等の免疫活性を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 ＡＣ０７Ｋ 16/42 Ｃ０７Ｋ 16/42 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＮＧ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｅ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ハンセン，ハンスアメリカ合衆国、08087 ニュー・ジャージー、ミスティック・アイランド、ノース・バージー・ドライヴ 2617

Claims

【特許請求の範囲】１．ｒＷＩ２の軽鎖および重鎖可変部またはそのサイレント変異体を含んでなる、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するキメラ抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント。２．ｒＷＩ２のＣＤＲ領域とヒト化ＦＲ領域を含んでなる、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のイディオタイプ領域と特異的に結合するヒト化抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント。３．請求項１または２に記載のキメラ抗体またはヒト化抗体または抗体フラグメントの重鎖または重鎖可変部をコードする単離されたポリヌクレオチドにおいて、相補性決定域−１（ＣＤＲ−１）配列ＮＹＷＭＴ、相補性決定域−２（ＣＤＲ−２）配列ＳＩＴＳＴＧＧＴＹＨＡＥＳＶＫＧ、および相補性決定域−３（ＣＤＲ−３）配列ＤＤＹＧＧＱＳＴＹＶＭＤＡからなるＣＤＲ群から選ばれる少なくとも二個のｒＷＩ２の重鎖ＣＤＲをコードする配列を含んでなるポリヌクレチオド。４．請求項１または２に記載のキメラ抗体またはヒト化抗体または抗体フラグメントの軽鎖または軽鎖可変部をコードする単離ポリヌクレオチドにおいて、相補性決定域−１（ＣＤＲ−１）配列ＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＲ、相補性決定域−２（ＣＤＲ−２）配列ＧＡＴＮＬＡＡ、および相補性決定域−３（ＣＤＲ−３）配列ＬＨＨＳＥＹＰＹＴからなるＣＤＲ群から選ばれる少なくとも二個のｒＷＩ２の軽鎖ＣＤＲをコードする配列を含んでなるポリヌクレチオド。５．前記重鎖可変部が、図１に示すラットＷＩ2ＶＫ配列を含んでなる請求項１に記載のキメラ抗イディオタイプ抗体。６．前記軽鎖可変部が、図２に示すラットＷＩ2ＶＫ配列を含んでなる請求項１に記載のキメラ抗イディオタイプ抗体。７．前記重鎖可変部が、図１に示すＫＯＬＷＩ2ＶＨ−１またはＫＯＬＷＩ2ＶＨ−２配列を含んでなる請求項２に記載のヒト化抗イディオタイプ抗体。８．前記軽鎖可変部が図２に示すＲＥＩＷＩ2ＶＫまたはＲＥＩＷＩ2ＶＫＲＳ配列を含んでなる請求項１に記載のヒト化抗イディオタイプ抗体。９．ＷＩ2の重鎖に関する第一の遺伝子とＷＩ2の軽鎖に関する第二の遺伝子とを含んでなる単離された発現ベクター。１０．前記軽鎖および重鎖がキメラであるか、あるいはヒト化されている請求項９に記載の単離された発現ベクター。１１．請求項９に記載の前記発現ベクターを含む宿主。１２．ＷＩ2の重鎖に関する遺伝子を含む単離された第一の発現ベクター、および、ＷＩ2軽鎖に関する遺伝子を含む単離された第二の発現ベクター。１３．前記遺伝子がキメラまたはヒト化ＷＩ2軽鎖および重鎖に関する請求項１２に記載の第一および第二の発現ベクター。１４．請求項１２に記載の前記第一および第二の発現ベクターを含む宿主。１５．可溶免疫原性担体タンパク質と複合した請求項２のヒト化抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントを含み、任意に、製薬的に許容できるワクチンアジュバントと組み合わせた有効量のワクチンを患者に投与することを含む、癌胎児抗原を発現する癌に対する患者の免疫応答を刺激する方法。１６．患者の診断または治療方法において、ＣＥＡに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを、そのままで、あるいは複合体の成分として、ターゲッティング剤、プレターゲィティング剤または治療薬として使用する方法において、請求項２に記載の抗イディオタイプ抗体を、標的と結合していない抗体または抗体フラグメントを除去するために使用することを特徴とする改良された診断または治療方法。１７．生物液体サンプルをｒＷＩ2、請求項１のキメラ抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメント、または請求項２のヒト化抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントと接触させるステップと、該抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントが、サンプル中の抗体のイディオタイプまたは抗体イディオタイプフラグメントと結合しているのを検出するステップとを含む、生物液体サンプル中でＣＥＡに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの存在を検出する方法。１８．前記抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントが、放射性標識、酵素または蛍光剤で標識されている請求項１６に記載の方法。１９．ＣＥＡの発現を特徴とする癌に対する患者の免疫応答を刺激するために使用することを目的とする、可溶免疫原性担体タンパク質と複合している請求項２のヒト化抗イディオタイプ抗体または抗体フラグメントを含んでなるワクチン。