JPH04341198A - アルコール類またはアルデヒド類の高感度定量法および高感度定量用組成物 - Google Patents

アルコール類またはアルデヒド類の高感度定量法および高感度定量用組成物

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JPH04341198A
JPH04341198A JP11362591A JP11362591A JPH04341198A JP H04341198 A JPH04341198 A JP H04341198A JP 11362591 A JP11362591 A JP 11362591A JP 11362591 A JP11362591 A JP 11362591A JP H04341198 A JPH04341198 A JP H04341198A
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JP11362591A
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Shigeru Ueda
成 植田
Mamoru Takahashi
守 高橋
Hideo Misaki
美崎　英生
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野において重要なアルコール類またはアルデヒド類
、あるいはこれらを反応生成物とする物質の高感度定量
法および定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、アルコール類やアルコール類の
アルコールデヒドロゲナーゼ類による代謝産物であるア
ルデヒド類を測定することは臨床検査や食品化学の上、
極めて重要であり、近年これらの成分分析には化学的方
法に代わって、より特異性の高い酵素学的測定法が普及
しつつある。
【０００３】従来、アルコール類やアルデヒド類の酵素
学的測定には、主に下記の反応を触媒するアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．１）を使用する方
法が用いられている。
【０００４】
【化２】
【０００５】本酵素を用いる測定方法は臨床検査や食品
化学以外の法医学にも利用されており、血中エタノール
を測定するキットがシグマ社等から市販されている。ま
た、食品中のエタノールを分析するキットがベーリンガ
ーマンハイム社から市販されており、更に、この逆反応
を利用したアセトアルデヒドの定量のためのキットもベ
ーリンガーマンハイム社から食品分析酵素法試薬として
市販されている。
【０００６】これらの測定法で用いられるアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）は基質特異性が
ゆるいため、多くの１級、２級アルコールや芳香族アル
コールに作用するという特徴を有する。しかしながら、
本酵素における上記反応は平衡が大きくアルコール側に
偏っているため、アルデヒド生成の方向に反応を進行さ
せるためには、反応液のｐＨを９〜１０のアルカリ性側
にし、しかも生成物であるアルデヒドを反応系から除去
するために反応液にセミカルバジド等の補足剤を加える
必要があり、操作が煩雑であるという欠点を有していた
。
【０００７】そこで、上記反応において、補酵素として
ＮＡＤの代りにＮＡＤのアナログであるアセチルピリジ
ンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）を用い、
反応方向をアルデヒド生成の方向に向けさせて測定する
方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ，　３ｒｄ　ｅｄ．，　ｖｏｌ．３，　
１０５２，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ）や、また
、上記反応において生成した還元型ＮＡＤ（Ｐ）をジア
ホラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを用いてホルマ
ザン色素として測定することも行われている。
【０００８】一般的に、酵素を用いて分析する場合、上
記の方法のように測定をしようとする対象物質を分光学
的に検出可能な過酸化水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変
換する場合が多い。しかしながら、還元型ＮＡＤ（Ｐ）
の検出は前述のように３４０ｎｍの吸収で測定する場合
は還元型ＮＡＤ（Ｐ）の蓄積によって反応の平衡が還元
型ＮＡＤ（Ｐ）生成と逆方向にかたよるため、ｐＨ管理
を厳密に行わなくてはならないという問題を有している
。更に、ジアホラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを
用いた呈色反応を利用した測定法も、還元型ＮＡＤ（Ｐ
）蓄積による生成物阻害は防ぐことはできるものの、ホ
ルマザン色素は難溶性であるため試験管やチューブへの
色素の付着が起こりやすく、自動分析装置への応用は困
難である。
【０００９】また現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては分光分析機を用いる方法が最も普及してい
るが、これも感度に限界が有り、測定対象物の含量が少
ない場合は適さないという欠点があった。従って、アル
コールデヒドロゲナーゼは基質特異性がゆるいにもかか
わらず、もっぱらエタノールまたはアセトアルデヒドの
定量のみにしか用いられていないのが現状である。
【００１０】一方、測定対象物の含量が少ない場合や、
測定対象物を含む被検体が少量である場合などは、分光
分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用いら
れている。しかしながら、これらの方法も臨床検査等の
汎用検査においては、機器の普及という点からはあまり
適したものではなかった。
【００１１】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、当該物質が等量の補酵素などに変換できる場
合は、２種類の酵素を用いて補酵素を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が行われている。例えば、ＮＡＤ
サイクリング法、ＣｏＡサイクリング法、ＡＴＰサイク
リング法等が用いられているが、これらの方法はいずれ
も臨床検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑す
ぎるために用いられていないのが現状である。
【００１２】従って、分光分析機器にも適応が可能なア
ルコール類またはアルデヒド類の高感度測定法の開発が
望まれている。
【００１３】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合には、共存
物質によるその測定系に及ぼす影響を小さくすることが
できる。また、ある限られた被検体量で検査できる項目
数を増やすことも可能であり、更には検体が人血液であ
る場合などは、採血量を減らすことができるため、被採
血者への心理的な負担を軽減することもできる。このよ
うに、検出感度を高くすることは、臨床検査においては
血液という貴重な検体を用いることや微量成分を測定す
る必要性から考えて、必然の要求である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】前述のごとく、アルコ
ールデヒドロゲナーゼを用いたアルコール類またはアル
デヒド類の測定法は種々報告されているが、いずれも未
だに満足のいくものではなく、正確で高感度な測定法が
望まれていた。
【００１５】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ア
ルコール類を基質としてアルデヒド類を生成する酵素反
応を実施するに当り、酵素としてアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類を使用する反応系において、補酵素として、一
方にチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下チオＮＡＤ類という）およびチオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート類（以下チオＮＡＤＰ
類という）からなる群より選ばれた１つを使用し、他方
に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下Ｎ
ＡＤ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート類（以下ＮＡＤＰ類という）からな
る群より選ばれた１つを使用するという、特定の２種類
の補酵素を使用するサイクリング反応を見出した。
【００１６】更にこの反応において、チオＮＡＤ類およ
びチオＮＡＤＰ類の還元型の吸収波長は４００ｎｍ付近
であり、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類の還元型の吸収波長
は３４０ｎｍ付近であることから、どちらか一方の補酵
素の変化量のみを、いずれか一方の波長における吸光度
を測定することによって定量することにより、吸光度の
測定に際して他物質の吸収波長の混雑が回避できる酵素
サイクリング反応が実施でき、高感度なアルコール類ま
たはアルデヒド類の定量が可能であることを確認し、本
発明を完成するに至った。
【００１７】すなわち、本発明はアルコール類およびア
ルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検成分
を含有する被検体に、 （１）　チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群
より選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からな
る群より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともアル
コール類を基質として該アルコール類に対応するアルデ
ヒド類を生成する可逆反応をなすアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類から選ばれるひとつ以上の酵素、 （２）　Ａ１ （３）　Ｂ１ を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
【００１８
】
【化３】
【００１９】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイク
リング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２
またはＢ１の量を測定することを特徴とするアルコール
類およびアルデヒド類からなる群より選ばれた１種の被
検成分の高感度定量法、並びに上記（１）、（２）およ
び（３）を含有することを特徴とするアルコール類およ
びアルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検
成分の高感度定量用組成物を提供するものである。
【００２０】本発明においてアルコール類とは１級、２
級アルコールや芳香族アルコールを指し、またアルデヒ
ド類とは当該アルコール類に対応するアルデヒドを指す
。
【００２１】本発明において用いられる、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ類は、少なくともアルコール類を基質と
してアルデヒド類を生成する可逆反応を触媒するもので
あって、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群
より選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からな
る群より選ばれた１つとを補酵素とするものならいずれ
をも用いることができる。
【００２２】本酵素は、動物組織、植物、バクテリア等
に広く存在するものである。具体的には、１級、２級ア
ルコールを基質とするものとしては、（チオ）ＮＡＤ類
に特異的なアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１
．１．１）や、（チオ）ＮＡＤＰ類に特異的なアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．２）が挙げら
れる。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１
．１）は酵母や哺乳類の肝などに存在し、種族間、組織
間などで性質を異にすることが多く、著しい多様性を有
する酵素である。例えば、酵母由来のアルコールデヒド
ロゲナーゼはエタノールとアリルアルコールに同程度作
用し、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、２−
プロパノールの順に相対活性が低下する（酵素ハンドブ
ック、ｐ１、朝倉書店、１９８３）。また、一般に、酵
母由来のほうが哺乳類由来のものに比べて基質特異性は
高いといわれているが、酵母、人肝、馬肝由来の酵素何
れについても、１級アルコールよりもそれに対応する２
−不飽和アルコールの方が反応性が高い（Ａｒｃｈ．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　１５９，　５
０−６０，　１９７３）。また、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ　１．１．１．２）は、ロイコノストック
メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）、サッカロミコプシス　　リポリテ
ィカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ　ｌｉｐｏｌ
ｙｔｉｃａ）等に見出すことができる酵素である（酵素
ハンドブック、ｐ１、朝倉書店、１９８３）。
【００２３】また、アルコールデヒドロゲナーゼ類のう
ち、芳香族を基質とするものを特にアリルアルコールデ
ヒドロゲナーゼと呼ぶことがあるが、この具体例として
は、（チオ）ＮＡＤ類に特異的なアリルアルコールデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．９０）や、（チオ）
ＮＡＤＰ類に特異的なアリルアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ　１．１．１．９１）が挙げられる。アリルア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．９０）
はシュウドモナスプチダ　Ｔ−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｔ−２）、ミコバクテリウム　　
ツウベクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂ
ｅｃｕｌｏｓｉｓ）等に見出すことができる。シュウド
モナス　　プチダ　Ｔ−２由来の酵素は、メタノール、
エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、
ブタノール、イソブチルアルコールには全く働かず、阻
害剤もアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１
．１）とは異なっている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　１７３−１７６，　
１９６７）。また、アリルアルコールデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ　１．１．１．９１）はニュウロスポラ　　クラ
サ（Ｎｅｕｒｏｓｕｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）（ｗｉｌ
ｄ　ｔｙｐｅ　ＳＹ７Ａ）等に見出すことができる酵素
である（酵素ハンドブック、ｐ３４、朝倉書店、１９８
３）。
【００２４】これらのアルコールデヒドロゲナーゼの類
うち、ＥＣ　１．１．１．１の酵母、馬肝臓由来のもの
は、例えば、オリエンタル酵母工業（株）、ベーリンガ
マンハイム社、シグマ社等から市販されている。これら
の酵素の活性を検討してみると、例えば、シグマ社より
市販されている馬肝臓由来の酵素の補酵素に対する相対
活性は、４０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．
５）では基質をエタノールとしてＮＡＤを用いたときを
１００％とすると、チオＮＡＤで３６３％程度である。 また、オリエンタル酵母工業（株）より市販されている
酵母由来の酵素の補酵素に対する相対活性は、４０ｍＭ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）では基質をエ
タノールとしてＮＡＤを用いたときを１００％とすると
、チオＮＡＤで１．５％程度である。
【００２５】本発明においては、基質であるアルコール
類に対して反応性を有し、且つ後記の補酵素に対する特
異性を有するものであれば、上述の酵素以外の他の起源
の酵素も使用することができ、その補酵素に対する特異
性は適宜、補酵素と基質とを用いて確認することができ
るものである。
【００２６】また、本発明において、Ａ１およびＢ２の
補酵素はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、
ＮＡＤ類を示すが、このうちチオＮＡＤＰ類またはチオ
ＮＡＤ類としては、例えばチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェー
ト、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオ
ＮＡＤ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチドが挙げられる。また、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類
としては、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニ
ンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）、
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
ホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙
げられる。なおこれら補酵素の還元型は、各々チオＮＡ
ＤＰＨ類、チオＮＡＤＨ類、ＮＡＤＰＨ類、ＮＡＤＨ類
として表示する。
【００２７】本発明においてはＡ１およびＢ１において
例えばＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１がＮＡＤ
（Ｐ）類である場合、Ｂ１はチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類であ
ることが必要である。
【００２８】定量に用いるアルコールデヒドロゲナーゼ
類が（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、上述
のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類を用いればよい。また、用い
るアルコールデヒドロゲナーゼ類が（チオ）ＮＡＤＰ類
のみを補酵素とする場合は、上記のチオＮＡＤ類とＮＡ
Ｄ類の代りにチオＮＡＤＰ類およびＮＡＤＰ類を用いれ
ばよく、更に用いるアルコールデヒドロゲナーゼ類が（
チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素
にする場合はチオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類とＮＡ
Ｄ類およびＮＡＤＰ類より適宜選択し、それらの酸化型
、還元型を適宜用いればよい。
【００２９】本発明の高感度定量法を用いて測定を行う
場合には、酵素サイクリング反応が最も効率よく進行す
るように、使用するアルコールデヒドロゲナーゼ類の各
補酵素間の相対活性を考慮して、２種の補酵素の選択と
その使用する比率の設定を行い、更に反応ｐＨを正反応
／逆反応の至適ｐＨ範囲にて設定するのが好ましい。
【００３０】また、本発明の定量法によれば被検体中の
アルコール類の定量のみならず、アルデヒド類の定量も
可能である。アルコール類またはアルデヒド類としては
、使用する酵素の基質または生成物であれば特に限定さ
れず、例示するならばエタノール、アリルアルコール（
２−プロペン−１−オール）、プロパノール、ブタノー
ル、ベンジルアルコール、ｐ−ヒドロキシベンジルアル
コール、アニスアルデヒド、アセトアルデヒド、アリル
アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド
、ベンズアルデヒド、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド
、アニスアルデヒド等が挙げられる。
【００３１】また、本発明の高感度定量法を用いれば、
アルコール類またはアルデヒド類を遊離、生成する酵素
系における基質やその酵素活性を測定することもできる
。更に、本発明の高感度定量法を用いれば、上記のよう
なアルコール類またはアルデヒド類を遊離、生成する酵
素系と連結し得る単一の、もしくは複数の工程からなる
酵素系における基質やその酵素活性をも測定することが
できる。これらの酵素系は、特に限定されるものではな
いが、例えば以下に示す種々の反応系が挙げられる。
【００３２】（１）ベンジルアミンとモノアミンオキシ
ダーゼ（ＥＣ　１．４．３．６）の酵素反応系。この系
において、遊離、生成するベンズアルデヒドを定量する
ことにより、ベンジルアミンの定量またはモノアミンオ
キシダーゼの活性測定をすることができる。 　　ベンジルアミン　　＋Ｏ２　　＋　　Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　→　　ベンズ
アルデヒド　　＋　　ＮＨ３　　＋　　Ｈ２Ｏ２
【００
３３】（２）チラミンとチラミンオキシダーゼ（ＥＣ　
１．４．３．９）の酵素反応系。この系において、遊離
、生成するｐ−ヒドロキシベンジルアルデヒドを定量す
ることにより、チラミンの定量またはチラミンオキシダ
ーゼの活性測定をすることができる。 　　チラミン　　＋Ｏ２　　＋　　Ｈ２Ｏ　　　　　　
　　　　　　→　　ｐ−ヒドロキシベンジルアルデヒド
　　＋　　ＮＨ３　　＋　　Ｈ２Ｏ２
【００３４】（３
）（２）のチラミンがチロシンとチロシンデカルボキシ
ラーゼ（ＥＣ　４．１．１．２５）の酵素反応系由来で
ある場合。この場合、最終的に生成するｐ−ヒドロキシ
ベンジルアルデヒドを定量することにより、チロシンの
定量またはチロシンデカルボキシラーゼの活性測定をす
ることができる。 チロシン　　→　　チラミン　　＋　　ＣＯ２
【００３
５】本発明の定量用組成物においては、Ａ１およびＢ１
の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍ
Ｍが好ましく、アルコールデヒドロゲナーゼ類の量は１
〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ／ｍｌが好まし
いが、その量は被検体の種類等により適宜決定すること
ができ、これ以上の量を用いることもできる。
【００３６】本発明における、Ａ１およびＢ１の量は被
検体中のアルコール類およびアルデヒド類の合計量に比
較して過剰量であること、かつアルコールデヒドロゲナ
ーゼ類のＡ１およびＢ１それぞれに対するＫｍ値に比較
して過剰量であることが必要であり、特に被検成分の２
０〜１００００倍モルが好ましい。
【００３７】また、本発明定量法はアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類が単独でまたは２種以上の組み合わせによっ
て（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補
酵素とする場合において、２つの補酵素にチオＮＡＤ類
とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、またはチオ
ＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せを
選んだときには、更に被検体にアルコール類に作用せず
、Ｂ２→Ｂ１の反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼ
および該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめる
ことにより、後記反応式（化４）のごとく、Ｂ１とＢ２
の間にＢ１の再生のための反応系を付与することにより
当該サイクリング反応を形成せしめ得る。
【００３８】すなわち、本発明はアルコール類およびア
ルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検成分
を含有する被検体に、 （１）　ＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群
より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともアルコー
ル類を基質として該アルコール類に対応するアルデヒド
類を生成する可逆反応をなすアルコールデヒドロゲナー
ゼ類から選ばれるひとつ以上の酵素、 （２）　Ａ１ （３）　Ｂ１または／およびＢ２ （４）　アルコール類に作用せず、Ｂ２→Ｂ１の反応を
形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二のデヒド
ロゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
【００３９
】
【化４】
【００４０】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２→Ｂ１はＢ２
を補酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示す）で表さ
れるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変
化するＡ２の量を測定することを特徴とするアルコール
類およびアルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上
の被検成分の高感度定量法を提供するものである。
【００４１】この場合、第二のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＡ１に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ１に作用し得ない条件を設定す
ることが好ましく、例えばＡ１を本質的に補酵素として
利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択する組合せ、
Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが
実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組合せ等が例
示される。定量の際には反応により生成したＡ２の量を
測定する。
【００４２】上記の成分（１）〜（４）を用いる定量用
組成物において、Ａ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、
特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／およ
びＢ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５０
０μＭが好ましく、アルコールデヒドロゲナーゼ類の濃
度は１〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００ｕ／ｍｌが
好ましく、第二のデヒドロゲナーゼの濃度は通常１〜１
００ｕ／ｍｌが好ましく、Ｂ２に対するＫｍ値（ｍＭ単
位）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製
すればよく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰
量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量
は被検体の種類等により適宜決定することができ、これ
以上の量を用いることもできる。
【００４３】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。また、Ｂ１の代わりにＢ２あるい
はＢ１とＢ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。こ
の場合、Ｂ１または／およびＢ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以
下が好ましい。
【００４４】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１
．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリセロール、Ｌ−
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１
．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール
−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．
１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リン
ゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ　１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ
．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリ
ン酸、Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは
、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１
．１．１．４９）（酵母由来）とグルコース−６−リン
酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１
．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリ
オキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．１７
）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ由
来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．４４）（ラット肝、
ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホスホ−Ｄ−グ
ルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ　１．２．１．１３）（植物葉緑体由来）とＤ−
グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸等が挙げられ
る。
【００４５】更にまた、本発明定量法はアルコールデヒ
ドロゲナーゼ類が単独であるいは２種以上の組み合わせ
よって（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオＮＡ
Ｄ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、または
チオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合
せを選んだときには、更に被検体にアルコール類に作用
せず、Ａ２→Ａ１の反応を形成する第三のデヒドロゲナ
ーゼおよび該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作用せし
める事により、後記反応式（化５）のごとく、Ａ１とＡ
２の間にＡ１の再生の為の反応系を付与することにより
当該サイクリング反応を形成し得る。
【００４６】すなわち、本発明はアルコール類およびア
ルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検成分
を含有する被検体に、 （１）　ＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群
より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともアルコー
ル類を基質として該アルコール類に対応するアルデヒド
類を生成する可逆反応をなすアルコールデヒドロゲナー
ゼ類から選ばれるひとつ以上の酵素、 （２）　Ａ１または／およびＡ２ （３）　Ｂ１ （４）　アルコール類に作用せず、Ａ２→Ａ１の反応を
形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒド
ロゲナーゼの基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
【００４７
】
【化５】
【００４８】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２→Ａ１はＡ２
を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を示す）で表さ
れるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変
化するＢ１の量を測定することを特徴とするアルコール
類およびアルデヒド類からなる群より選ばれた１種以上
の被検成分の高感度定量法を提供するものである。
【００４９】この場合、第三のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＢ１に作用し得ないものであ
るか、あるいは実質的にＢ１に作用し得ない条件を設定
することが好ましく、例えばＢ１を本質的に補酵素とし
て利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ１とＡ２の量的
関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的にＢ１に作
用しない条件を選択する組合せ等が例示される。定量の
際にはＢ１の消費量を測定する。
【００５０】この成分（１）〜（３）および（５）を用
いる定量用組成物において、Ｂ１の濃度は０．０２〜１
００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２ま
たは／およびＡ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特
に５〜５００μＭが好ましく、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ類の濃度は１〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２〜４００
ｕ／ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼの濃度は
通常１〜１００ｕ／ｍｌが好ましく、Ａ２に対するＫｍ
値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）以上になる
ように調製すればよく、また第三のデヒドロゲナーゼの
基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。 これらの量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
【００５１】第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生の為
に補助的に添加するものであり、これによってＡ１の使
用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価な
場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２あるい
はＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。こ
の場合、Ａ１または／およびＡ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＢ１の１／１０モル以
下が好ましい。
【００５２】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１
．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒドロキシアセト
ン、Ｌ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とジヒドロ
キシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオギ
ザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ　１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母
、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセ
リン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のとき
は、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
　１．２．１．１３）（植物葉緑体由来）と１，３−ジ
ホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられる。
【００５３】かくして、調製された本発明の定量用組成
物によって被検体中のアルコール類またはアルデヒド類
を測定するには、上記成分（１）〜（３）、（１）〜（
４）、あるいは（１）〜（３）および（５）を含有する
組成物に被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、約３７
℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の
数分ないし数十分間、例えば２分後と５分後の３分間、
または３分後と８分後の５分間における生成されたＡ２
の量または消費されたＢ１の量を、それぞれの吸収波長
に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。例えば
、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１がＮＡＤＨの場合、Ａ２の
生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増加により測定するか
、あるいはＢ１の消費を３４０ｎｍ付近の吸光度の減少
により測定し、既知濃度のアルコール類またはアルデヒ
ド類を用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中
のそれぞれの量をリアルタイムで求めることができる。
【００５４】また、被検体中にアルコール類と該アルコ
ール類に対応するアルデヒド類が共存している場合は、
本発明法によればこれらの合計量が定量される。従って
、個々の成分の値を別々に測定したい場合には、あらか
じめ被検体をどちらかの成分のにみに作用する酵素によ
って前処理し、アルコール類またはアルデヒド類のみが
被検体中に存在するようにしておけばよい。すなわち、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．３、
ＥＣ　１．２．１．４、ＥＣ　１．２．１．５）により
前処理を行えば、被検体中のアルデヒド類は酸に転換さ
れるので、引き続き本発明による酵素サイクリング反応
を実施することにより、アルコール類のみを定量するこ
とができる。また、アルコール類と該アルコール類に対
応するアルデヒド類の合計量から前記アルコール類の量
を差し引くことにより、アルデヒド類のみの量を算出す
ることができる。
【００５５】また、本発明定量法は、被検液中のアルコ
ール類またはアルデヒド類そのものを酵素サイクリング
反応に導くものであり、被検液中の共存物質の影響を受
けにくいため、被検液のブランク測定を省略することが
でき、レイトアッセイによる簡便な測定を成し得る。
【００５６】尚、本発明においてはＡ２またはＢ１の測
定に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を
使用して定量を行うこともできる。
【００５７】
【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、また
、酵素サイクリング反応を組み合わせることによって感
度を増大させることができるため、少量の検体で迅速か
つ正確に被検体中のアルコール類またはアルデヒド類を
定量することができる。
【００５８】
【実施例】次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれによって何等限定されるものではな
い。
【００５９】実施例１　　エタノールの定量＜試薬＞ ４０　　ｍＭ　　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
９．５）２　　ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）
０．４　　ｍＭ　　　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵
母工業（株）製）５　ｕ／ｍｌ　　　アルコールデヒド
ロゲナーゼ（シグマ社製：馬肝臓由来） ＜操作＞上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、５、
１０、１５、２０、２５μＭのエタノール溶液をそれぞ
れ２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応
開始後２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度を読
み取りその差を求めた。濃度０の値を試薬ブランクとし
、５〜２５μＭのそれぞれのエタノールの値からこの値
を引き、その結果を図１に示した。図１から明らかなよ
うに、エタノール量に対する吸光度変化量は良好な直線
性を示した。
【００６０】実施例２　　ｎ−ブタノールの定量〈試薬
〉 ４０　　ｍＭ　　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
９．５）１　　ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）
０．２　　ｍＭ　　　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵
母工業（株）製）１．９２ｕ／ｍｌ　　　アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（シグマ社製：馬肝臓由来） ＜操作＞上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、１、
２、３、４、５μＭのｎ−ブタノール溶液をそれぞれ２
０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始
後３分目と８分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取
りその差を求めた。実施例１と同様試薬ブランクとの差
を求め、その結果を図２に示した。図２から明らかなよ
うに、ｎ−ブタノール量に対する吸光度変化量は良好な
直線性を示した。
【００６１】実施例３　　ベンズアルデヒドの定量〈試
薬〉 ４０　　ｍＭ　　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
９．５）１　　ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）
０．２　　ｍＭ　　　　還元型デアミノＮＡＤ（シグマ
社製）１８　ｕ／ｍｌ　　　アルコールデヒドロゲナー
ゼ（シグマ社製：馬肝臓由来） ＜操作＞上記試薬１ｍｌを試験管にとり、０、０．５、
１．０、１．５、２．０、２．５μＭのベンズアルデヒ
ド溶液をそれぞれ４０μｌ添加し、３７℃にて反応を開
始させた。反応開始から２０分後に０．５％ドデシル硫
酸ナトリウム溶液を１ｍｌ加えて反応を停止させた。そ
の後４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その結果を
図３に示した。図３から明らかなように、ベンズアルデ
ヒド量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００６２】実施例４　　ベンズアルデヒドの定量＜試
薬＞ ４０　　ｍＭ　　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
９．５）２　　ｍＭ　　　　チオＮＡＤ（シグマ社製）
０．２　　ｍＭ　　　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵
母工業（株）製）５６８　ｕ／ｍｌ　　　アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業（株）製：酵母
由来） ＜操作＞上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、５、
１０、１５、２０、２５μＭのベンズアルデヒド溶液を
それぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた
。反応開始後２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光
度を読み取りその差を求めた。実施例１と同様試薬ブラ
ンクとの差を求め、その結果を図４に示した。図４から
明らかなように、ベンズアルデヒド量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における、エタノール量に対する４０
０ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である
。
【図２】実施例２における、ｎ−ブタノール量に対する
４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面で
ある。
【図３】実施例３における、ベンズアルデヒド量に対す
る４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面
である。
【図４】実施例４における、ベンズアルデヒド量に対す
る４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面
である。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　アルコール類およびアルデヒド類から
    なる群より選ばれた１種以上の被検成分を含有する被検
    体に、（１）　チオニコチンアミドアデニンジヌクレオ
    チドホスフェート類（以下チオＮＡＤＰ類という）およ
    びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下
    チオＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる１つと、
    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類
    （以下ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニ
    ンジヌクレオチド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群
    より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともアルコー
    ル類を基質として該アルコール類に対応するアルデヒド
    類を生成する可逆反応をなすアルコールデヒドロゲナー
    ゼ類から選ばれるひとつ以上の酵素、 （２）　Ａ１ （３）　Ｂ１ を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式【化１】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
    Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
    を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
    類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
    Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
    ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
    の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
    形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
    量を測定することを特徴とするアルコール類およびアル
    デヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検成分の
    高感度定量法。
  2. 【請求項２】　　ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニ
    ンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチル
    ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
    ルＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
    レオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサン
    チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）
    からなる群より選ばれたものである請求項１記載の高感
    度定量法。
  3. 【請求項３】　　ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニン
    ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
    ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
    ヒポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒ
    ポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からな
    る群より選ばれたものである請求項１記載の高感度定量
    法。
  4. 【請求項４】　　チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミ
    ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ
    ）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
    チドホスフェートからなる群より選ばれたものである請
    求項１記載の高感度定量法。
  5. 【請求項５】　　チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミド
    アデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）およびチオニコ
    チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群よ
    り選ばれたものである請求項１記載の高感度定量法。
  6. 【請求項６】　　アルコール類がエタノールであり、ア
    ルデヒド類がアセトアルデヒドである請求項１記載の高
    感度定量法。
  7. 【請求項７】　　アルデヒド類がアリルアルデヒド、ベ
    ンズアルデヒドまたはｐ−ヒドロキシベンジルアルデヒ
    ドである請求項１記載の高感度定量法。
  8. 【請求項８】　　次の成分（１）〜（３）（１）　ＮＡ
    ＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれる１つ
    と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともアルコール類を基質と
    して該アルコール類に対応するアルデヒド類を生成する
    可逆反応をなすアルコールデヒドロゲナーゼ類から選ば
    れるひとつ以上の酵素、 （２）　Ａ１ （３）　Ｂ１ （Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類ま
    たはＮＡＤ類を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
    はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
    ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
    還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示す
    ）を含有することを特徴とするアルコール類およびアル
    デヒド類からなる群より選ばれた１種以上の被検成分の
    高感度定量用組成物。
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