JPS5934116B2 - 酵素基質の動力学的測定法及びその試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、連結された反応を用いて酵素基質を動力学的
（即ち反応速度論的）に測定する方法及びこの方法の実
施のために好適な試薬に関する。

酵素基質測定の慣用の方法は、いわゆる最終値法である
。この場合は、酵素反応の被測定基質が測定され、この
際、反応を静止状態になるまで、即ち、全基質が反応す
るまで進行させる。多くの慣用の基質測定のための最終
値法では、殊に自動分析機によつても、１回の分析当り
の必要時間が現在のところ１０〜２０分である。この状
態は不満足である。それというのも必要時間が長すぎ、
測定装置及び自動分析機の最適利用が阻止されるからで
ある。測定反応の速度の測定により、基質濃度を測定す
る動力学的方法の使用により、慣用の分析時間を著るし
く短縮することができることは公知である。

このために、もちろん、この方法では、最終値法とは反
対に、盲検値の測定が一般に除かれる状態でもある。基
質の動力学的測定の理論的原則は、アナリテイカル・ケ
ミストリイ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）４３巻６９７頁及
びアドバンセス●イン●アナリテイカル●ケミストリイ
●アンド・インストルメンテーシヨン（Ａｄｖａｎ−Ａ
ｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｓｔｒｕｍ・）７巻１４１頁に
詳細に記載されている。

これから一次反応（即ち酵素反応速度論における１成分
反応）又は偽一次反応（２成分反応で１成分の濃度が大
過剰である場合、この酵素反応には一次反応が適用され
る）が特に重要であることが知られている。それという
のは、このことは自動分析機で測定技術的に特に簡単で
、いわゆる固定時間原理（Ｆｉｘｅｄ−Ｔｉｍｅ−Ｐｒ
ｉｎｚｉｐ）で追跡することができるからである。この
固定時間法では、被測定物質又は生成物の濃度変化を固
定の時間間隔内に測定する。

測定反応が選択された時間区分内に一次反応で又は偽一
次反応で進行すると、これは次の関係式に当てはまる。
ここでｋは反応の速度定数であり、ＣＯは被測定物質の
当初濃度であり、△ｃは測定時間間隔から、測定濃度変
化は、Ｋ，ｔｌ及びＴ２を一定に保持する際に、当初濃
度に正比例することが認められる。

これらの条件は、自動分析機で容易に保持できるので、
この方法はこの種の装置で特に有利に使用することがで
きる。更に、反応条件を、偽一次反応の反応が保持され
る様に選択することも公知である。

しかしながら、定量測定は、屡々較正曲線の作成を必要
とする近似法を介してのみ可能である。前記引例分献及
び従来の基質の動力学的測定に関する他の方法では、ま
ず第１に、一工程反応に関するこの方法の存在が問題に
されている。

しかしながら、この種の反応は、重要性が限られている
。即ち、重要な充分な特異性の試験系及び多くの部分反
応からの実施性を組み合せることが屡々必要である。他
方、いかにしてこの種の連結された試験系をきまつた条
件下にこれを用いて動力学的基礎に基づく基質濃度を測
定できるように構成するかは公知ではない。これとはま
つたく反対に、なお従来は、連結された反応が動力学的
測定を困難にすると指摘されている（Ｃｈｅｍ．Ｒｕｎ
ｄｓｃｈａｕ・２６巻（１９７３年）２４頁参照）。そ
れというのは、例えば関連酵素の活性損失はこの方法を
急速に使用不能にするからである。従つて、従来は、動
力学的酵素基質測定の際に一工程法を二工程（及び相応
して特に多工程）の方法よりも優先する見解であつた。
このことは、従来、通常条件下に基質濃度を動力学的に
測定できる連結された試験系が実際に選択されていなか
つた理由を説明している。従つて、本発明は、動力学を
基礎とする連結された反応を用いて、通常条件下に実施
でき、かつ、多工程試験系の部分工程をまつたく又は部
分的に酵素触媒使用下に進行する、基質濃度測定法を得
ることを目的としている。

この課題は、本発明により連結された反応を用いる硬素
基質の動力学的測定法により解決されこの方法は、反応
系列の特異的部分反応が全体の反応系列に対する速度決
定性になり、この速度決定工程が一次反応で又は偽一次
反応で進行するように反応パラメータを選択することよ
りなる。

ここで、結合された反応とは、少なくとも１つの反応が
酵素的に接触され、この際、基質の反応及び個有の測定
反応（指示薬反応）が種々の反応程で進行する少なくと
も２つの部分反応の連続と解すべきである。特異的部分
反応を、これが速度決定性であり、偽零次的（１成分反
応で濃度が充分に大きい場合、事実上零次反応が進行す
る）に進行するように行なう可能性にとつて、使用した
酵素の種類の適当な選択、使用した１種以上の酵素のミ
ハエリス定数の人為的な変化、基質の変化、関与酵素及
び試薬の濃度、温度、ＰＨ値の適当な選択、補酵素、促
進剤及び抑制物質の使用が、これに必要である。

低い特異性の部分反応をこの部分反応に有効な酵素の過
剰適用により促進するのが有利である。この実施形式は
、この酵素の活性変化を貯蔵影響により補償する付加的
利点を有する。これに反して、特異的な部分反応の酵素
で、活性低下が重要な役割をはたす。それというのは、
ミハエリス定数は一般にこれによつては影響されないか
らである。もちろん、この酵素の活性が完全に失なわれ
るのを防ぐ必要があり、そのためには、当業者に公知の
酵素安定化の慣用の方法を使用することができる。ここ
で、過剰適用とは、反応迅速進行に必要な量の少なくと
も２倍特に数倍多い酵素量の使用と解する。

この部分工程に使用される酵素の適当量により、前記の
ように、個々の部分反応の速度は著るしく変えることが
でき、比較的簡単な方法で、特異経過を示すその反応を
速度決定性にすることができる。使用した酵素の種類は
変えることができ、この′ 際所望ミハエリス定数に応
じて、まつたく一定の起源の酵素を選択する。

それというのは、同じ反応を接触する種々の起源の酵素
は、例えば微生物又は咄乳動物肝臓から得られるか否か
に応じて異なるミハエリス定数を有することができるか
らでτ ある。ミハエリス定数の人為的変動は例えば酵
素の活性中心中の金属原子の変化により達成することが
できる。

もう１つの可能性は、酵素がそれ自体から成つている場
合には解離によりその下位単位にＯなるか又はペプチド
連鎖の１部の蛋白分解による酵素の部分分解である。も
う１つの可能性は、活性中心の化学的変性である。これ
は例えば中心のアミノ酸の個々の反応性基の変動により
例えばそれのＳＨ一基の酸化により行なうことができる
。ミハエリス定数の人為的変動のもう１つの可能性は、
立体異性の酵素の添加、特定イオンの添加、緩衝液の種
類の適当な選択、溶液中の特定塩濃度の調節等による酵
素の配座変化である。基質そのものの変化は、適当な錯
形成剤の添加の際の錯化、ミセル形成例えば洗剤添加又
は類似法で行なうことができる。

ＰＨ値でも、本発明における反応速度に影響を及ぼすこ
とができる。

例えば速度決定性にされる部分反応の酵素をこの酵素の
ミハエリス定数を高めるのに最適でないＰＨ値で使用す
ることができる。同様に、有利ではないとしても酵素の
温度依存性を利用することもできる。それというのは、
酵素測定反応の温度を統一することが一般に努力されて
いるからである。本発明方法での部分反応の速度に影響
する他の手段は、反応成分及び酵素のミハエリス定数を
真に又は明白に変じる反応生成物の添加である。

同様に阻害剤も使用できる。後者は例えば西ドイツ特許
出願公開第２３４９８１９．３号公報から公知である。
最後に、非酵素的部分反応の速度を触媒又は阻害剤の添
加により影響させることができる。反応系列の特異的部
分反応とは、反応の出発物質に関する最大の特異性を示
し、更に、反応パラメータの適当な選択により速度決定
性にされうる部分反応である。

この部分反応は、酵素的に接触させることもできるが、
これは行なうべきではない。非常に高い特異性の偽一次
的反応の非酵素的反応の例は、α−とβ−グルコースと
の間の変旋光である。例えば酵素の低すぎる真の又は明
白なミハエリス定数において特異的部分反応を速度決定
性にすることができないと、速度決定性に行なうことの
できる近特異性部分反応が本発明の特異的部分反応にあ
てはまるのである。本発明のもう１つの重要な特徴は、
速度決定性の工程を、それが一次反応で又は偽一次反応
で進行するように実施すべきことである。

速度決定性になる特異的部分反応が直ちに一次反応で進
行するなら、これに関する特別な手段は必要ではない。
二次又は高次反応では別である。ここでは偽一次反応を
導びくべきである。このことは、第２の又は他の反応成
分（これは被測定基質又は結果の生成物そのものではな
い）の濃度を反応の間の適当によつて実際に一定に保持
し、従つて、過剰に使用することにより達成することが
できる。更に、これが酵素反応であるなら、試験におけ
る当該基質濃度の上限に比べて大きい様にミハエリス定
数を高く選択する。本発明のもう１つの目的物は、結合
された酵素反応を用いる酵素基質の動力学的測定用の試
薬である。

この種の試薬は、本発明により、酵素及び反応成分を、
試薬の水溶液に基質を添加する際に進行する反応系列の
特囲的部分反応が全反応系列に対する速度決定性で、一
次反応又は偽一次反応で進行する様な量で含有すること
より成る。本発明の有利な実施形式によれば、これは、
試薬が低い特異的部分反応の酵素を過剰に含有すること
により達成される。本発明は、結合された試験系での動
力学的な酵素基質測定を実施することを可能とし、従つ
て、この種の測定の実施に必要な時間を著るしく短縮す
ることを可能とする。

これにより同時に、当該酵素の活性の充分な独立性が達
成され、この方法の精度は貯蔵時に当該酵素における実
際の活性損失が現れる際にも、完全に得られる。更に、
本発明は、この種の多段の動力学的酵素基質測定を、す
べての慣用の自動分析機で実施することを可能とし、こ
の際、本発明の思想に基づき、困難なく、任意の自動分
析機に試薬の定量的組成を適合させることができる。次
に実施例につき本発明を説明する。

酵素ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を、偽零次的反応で強
力に進行するα−グルコースとβ−グルコースとの変旋
光又はグルコースに関する高いＫＭの故に同様に偽１次
反応で進行するグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）一反
応が速度決定性の反応になるように、充分過剰に適用す
る。

このことは次の組成の試薬で達成される：前記試薬は、
特に遠心性迅速分析機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｆａｓ
ｔａｎａｌｙｚｅｒ）を用いるこの方法の実施のために
好適である。

最初の読み取りは、試薬と被検試料との混合の後に約３
５秒に行ない、第２の読み取りは、１．５〜３．５分後
に行なう。反応混合物５００〜６００ｔｔ１及び試料５
〜２０μｌを用いて、血糖１０００ｍｆ／１００ｍ１ま
で測定できる。この方法は次の試薬を用いて動力学的に
実施する：試薬１： 反応を遠心性迅速分析機で、３４０ｎｍ及び２５℃で測
定する。

この試験でのＡＴＰ一濃度の増大により、ピルベートキ
ナーゼのミハエリス定数が試験におけるグリセリン一上
限に比べて大きい程度まで高める。他の酵素を過剰に適
用する。これにより、ピルベートキナーゼ反応は速度決
定性となり、グリセリン濃度は反応速度から測定できう
る。この測定の実施のために、被検血清試料１０μｊを
生理食塩水３０〜５０μｌ及びグリセロキナーゼを含有
しない試薬５００〜６００μｌと混合し、１０分放置す
る。

次いで、グリセロキナーゼを加え、５０秒後に、最初の
読み取りを、１５０〜２００秒後に第２の読み取りを行
なつた。この方法は、トリグリセリド５００〜９０００
ｍｆ／ｌの濃度範囲を検出する。

回帰式ｙ−０．９９Ｘ＋０．５１ 相関係数ｒ＝０．９９９ 例２ａ グリセリンの測定 この方法は動力学的に、次の試薬を用いて実施する：試
薬１： 反応を遠心性迅速分析機で、３４０ｎｍ及び２５゜Ｃで
測定する。

この試験でのＡＴＰ一濃度の増大により、ピルベートキ
ナーゼのミハエリス定数は、明確に高められ、この試験
におけるグリセリン上限に比べて充分である。

他の酵素を過剰適用する。これにより、ピルベートキナ
ーゼ反応は、速度決定性であり、グリセリン濃度は反応
速度から測定できる。この測定の実施のために、被検血
清試料１００μｌを生理食塩水１００ｔｔ１及びグリセ
ロキナーゼ不含試薬５００〜６００ｐ１と混合した。

次いで、グリセロキナーゼを加え、５０秒後に、第１の
読み取りを行ない、１５０〜２００秒後に第２の読み取
りを行なつた。この方法は、グリセリン５０〜 ９００
ｍ，／ｌの濃度範囲を検出する。

例３ 全コレステリン 測定は次式に従がい行なう： 酵素コレステリンエステラー及びコレステリンオキシダ
ーゼの過剰適用により、偽一次反応により進行する呈色
反応が速度決定性となる。

この方法は、例えば、次の試薬を用いてエツペンドルフ
５０３２自動測定機（ＥｐｐｅｎｄＯｒｆ５Ｏ３２Ａｕ
ｔＯｍａｔｅｎ）で実施する。燐酸アンモニウム緩衝液 （ＰＨ７．Ｏ） ０．４５〜０．７５モル／ｌメタノー
ル １．３６〜２．０４モル／ｌアセチルアセトン １
６〜２４ｍモノレ／ｌヒドロキシ ポリエトキシドデカン ０．７９〜１．１９ｇ／ｌカタ
ラーゼ ５００ｋＵ／ｌ以上 コレステリンエステラーゼ ２０Ｕ／ｌ以上コレステリ
ンオキシダーゼ ２０Ｕ／ｌ以上同様な組成の盲検試薬
は、コレステリンオキシダーゼを含有しない。

エツペンドルフ５０３２自動測定機での測定の実施のた
めに、被検試料０．０１ｍ１を試薬１．０ｍ１と混合し
、３７゜Ｃで２０分恒温保持する。

次いで、Ｈｇ４Ｏ５ｍｎｍでの吸光度を読み取つた。コ
レステリンオキシダーゼ不含の同じ組成の盲検バツチで
も同様に処理した。

試料バツチと盲検バツチとの間の吸光度差から、コレス
テリン量が計算される。回帰式ｙ ＝ ０．９８ｘ×１
．９８ 相関係数ｒ＝０．９９７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 連結された反応を用いる酵素基質の動力学的測定法
   において、反応系列の特異的部分反応が全体の反応系列
   に対して速度決定性になり、この速度決定性の部分反応
   が一次反応で又は偽一次反応で進行するように反応パラ
   メータを選択することを特徴とする、酵素基質の動力学
   的測定法。 ２ 所定の時間間隔で変化を測定することにより動力学
   的測定を実施する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 他の部分反応の酵素の過剰適用により特異的部分反
   応を速度決定性にする、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ４ 使用酵素の種類の適当な選択による特異的部分反応
   を、ミハエリスの定数に応じて、ミハエリス定数の人為
   的変化又は基質の人為的変化により、それが速度決定性
   であり、偽一次反応で進行するように実施する、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ５ 活性中心の金属原子の変化、酵素の部分分解、活性
   中心の化学的変性によるか又は／かつ配座変化によりミ
   ハエリス定数の人為的変化を行なう、特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６ 基質の変化を錯体形成又はミセル形成により行なわ
   しめる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 偽一次反応で反応を経過させ、第二の又は他の反応
   成分（これは被測定基質又はその結果の生成物でもない
   ）を過剰に加える、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 偽一次反応による反応経過を、速度決定性の部分反
   応の酵素のミハエリス定数の真の又は明白な増加により
   調節する、特許請求の範囲第１項又は第７項記載の方法
   。 ９ 反応副産物の添加又は阻害剤添加によりミハエリス
   定数の明白な増加を行なわせる、特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０ 試薬の水溶液に基質を添加する際に進行する反応
   系列の特異的部分反応が速度決定性であり、一次反応で
   又は偽一次反応で進行させるような酵素及び反応成分を
   、そのような適用量で含有することを特徴とする、連結
   された酵素反応を用いる酵素基質の動力学的測定用の試
   薬。 １１ 低い特異的部分反応の酵素を過剰量で含有する、
   特許請求の範囲第１０項記載の試薬。 １２ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）８０〜１２０ｍモル
   、ＰＯＤ０．８Ｕ／ｍｌ以上、ＧＯＤ１２Ｕ／ｍｌ以上
   、４−アミノアンチピリン０．６０〜１．８０ｍモル、
   フェノール３．０〜１３．５ｍモルよりなる、血糖測定
   用の特許請求の範囲第１１項記載の試薬。 １３ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）４５〜５５ｍモル／
   ｌ、硫酸マグネシウム４．６〜３．１ｍモル／ｌ、ドデ
   シル硫酸ナトリウム３００〜４００μモル／ｌ、ＡＴＰ
   ２．３〜３．５ｍモル／ｌ、ホスホエノールピルベート
   ２８０〜４２０μモル／ｌ、ＮＡＤＨ１２０〜２３０μ
   モル／ｌ、リパーゼ７．７×１０＾４Ｕ／ｌ以上、エス
   テラーゼ５．８×１０＾２Ｕ／ｌ以上、ピルベートキナ
   ーゼ９．６×１０＾２Ｕ／ｌ以上、ラクテートデヒドロ
   ゲナーゼ５．３×１０＾３Ｕ／ｌ以上よりなる試薬１、
   グリセロキナーゼ２．９×１０＾３Ｕ／ｌ以上よりなる
   試薬２より成るトリグリセリド測定用の特許請求の範囲
   第１１項記載の試薬。 １４ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ７０）４５〜５５ｍモル／ｌ
   、硫酸マグネシウム４．６〜３．１ｍモル／ｌ、ドデシ
   ル硫酸ナトリウム３００〜４００μモル／ｌ、ＡＴＰ２
   ．３〜３．５ｍモル／ｌ、ホスホエノールピルベート２
   ８０〜４２０μモル／ｌ、ＮＡＤＨ１２０〜２３０μモ
   ル／ｌ、ピルベートキナーゼ９．６×１０＾２Ｕ／ｌ以
   上、ラクテートデヒドロゲナーゼ５．３×１０＾３Ｕ／
   ｌ以上よりなる試薬１、グリセロキナーゼ２．９×１０
   ＾３Ｕ／ｌ以上よりなる試薬２より成るグリセリン測定
   用の特許請求の範囲第１１項記載の試薬。 １５ 燐酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７０）０．４５〜
   ０．７５モル／ｌ、メタノール１．３６〜２．０４モル
   ／ｌ、アセチルアセトン１６〜２４ｍモル／ｌ、ヒドロ
   キシポリエトキシドデカン０．７９〜１１．９ｇ／ｌ、
   カタラーゼ少なくとも５００ＫＵ／ｌ、コレステリンエ
   ステラーゼ少なくとも２０Ｕ／ｌ、コレステリンオキシ
   ダーゼ少なくとも２０Ｕ／ｌよりなる全コレステリン測
   定用の、特許請求の範囲第１１項記載の試薬。