JPH04281791A

JPH04281791A - ヒトパピローマウイルスの短鎖ヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH04281791A
Application number: JP3282171A
Authority: JP
Inventors: Jeffrey L Joseph; ジェフリー・エル・ジョゼフ; Stanley R Bouma; スタンリー・アール・ボーマ; Ronald L Marshall; ロナルド・エル・マーシャル; Thomas G Laffler; トーマス・ジー・ラフラー
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1992-10-07
Also published as: JP2003144182A; KR920006510A; EP0477972A3; CA2052413C; TW205568B; DK0477972T3; EP0477972B1; JP2001231587A; EP0477972A2; AU8482691A; ES2094178T3; DE69121821D1; CA2052413A1; ATE142276T1; GR3021724T3; AU650055B2; DE69121821T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般にヒトパピローマ
ウイルス（ＨＰＶ）の検出方法に関する。さらに詳しく
は、ヒトパピローマウイルスの短鎖ヌクレオチド配列お
よび該配列を用いたＨＰＶの検出方法に関する。本発明
のヌクレオチド配列は、増幅することができ、および／
または試料中のヒトパピローマウイルス産物の存在の決
定に用いることができ、また増幅することができ、試料
中に存在する６型、１１型、１６型、１８型、３１型、
３３型および６１型のヒトパピローマウイルスの特定の
型の決定に用いることができる。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
パピローマウイルス（ＨＰＶ）は、頸部癌およびその前
駆体病変の病因をしばしば伴う肛門生殖器の性器伝播疾
患と認められている。５６以上の型のＨＰＶが特徴付け
られている。これらの型のうち、少なくとも２１の型が
肛門生殖器に感染する［グレゴワール（Ｌ．Ｇｒｅｇｏ
ｉｒｅ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２７（１２）
：２６６０〜２６６５（１９８９）］。これら向粘膜性
（ｍｕｃｏｓｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスは、一層しばし
ば良性のコンジロームまたは潜伏感染を伴う。しかしな
がら、前癌性病変および浸潤性癌（とりわけ頸部におけ
る）中のＨＰＶの存在は、これらウイルスが腫瘍原性で
ある可能性を反映しているのかもしれない［ハウリー（
Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ）、インポータント・アドバンス
ィズ・イン・オンコロジー（Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、デゥ・ビタ
（Ｄ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．）ら編、ジェー・ビー
・リッピンコット（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、
フィラデルフィア、ペンシルベニア州、５５〜７３頁参
照］。

【０００３】ある種のＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６型
および１８型、および頻度は劣るがＨＰＶ３１型、３３
型および３５型は、浸潤性の頸部癌およびその転移部位
に高比率で認められている。しかしながら、肛門生殖器
に感染する多くのＨＰＶ、たとえば６型や１１型などは
普通、良性のコンジローム中に認められ、浸潤性癌中に
はごくまれにしか認められていない。肛門生殖器中で検
出されるＨＰＶは、特定のＨＰＶ型が悪性腫瘍に付随す
ることに基づいて、大きく低リスクパピローマウイルス
（ＨＰＶ６型および１１型）、中リスクパピローマウイ
ルス（ＨＰＶ３１型、３３型および３５型）または高リ
スクパピローマウイルス（ＨＰＶ１６型および１８型）
に分類することができる［ロリンツ（Ａ．Ｔ．Ｌｏｒｉ
ｎｃｚ）ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．
，７９：６７１（１９８７）］。それゆえ、ＨＰＶの存
在を検出しＨＰＶの特定の型を決定することにより、あ
るＨＰＶ型に付随する臨床的重要性（ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）を決定するのに有用な診断
および予後手段を提供することが可能である。また、高
感度かつ特異的な試薬および方法により早期にＨＰＶを
検出することによっても、早期の管理およびカウンセリ
ングを提供することができるであろう。

【０００４】それゆえ、臨床試料中のＨＰＶを同定およ
び型決定するための正確かつ信頼性の高い方法に対する
必要性が存在する。しかしながら、破砕ビリオンで動物
を免疫することにより調製した公知のポリクローナル抗
血清では、皮膚および粘膜のゆうぜいのわずかに約３０
〜７０％においてしかＨＰＶ抗原を検出することができ
ない。さらに、抗血清は広く交差反応を起こす。現在利
用できる免疫学的試験は２つの主要な欠点を有する。第
一に、充分に分化した細胞しかウイルス抗原を表出でき
ないように思われる。高度の腫瘍形成を示すＨＰＶ感染
組織（たとえば、癌部位など）は、ＨＰＶ抗原を含有す
ることが希である。それゆえ、悪性腫瘍が進行すればす
るほど、被験組織中で検出できるウイルスの量は少なく
なることになる。第二に、これら免疫学的試験は特定の
ウイルス型を同定することができない。

【０００５】パピローマウイルス群は、主要なカプシド
タンパク質において共通のアミノ酸配列を有しているこ
とが知られている［たとえば、ベーカー（Ｃ．Ｃ．Ｂａ
ｋｅｒ）、ザ・パポバビリダエ（Ｔｈｅ　Ｐａｐｏｖａ
ｖｉｒｉｄａｅ）（Ｖｏｌ．２）、ハウリーおよびザル
ツマン（Ｎ．Ｐ．Ｓａｌｚｍａｎ）編、プレナム・パブ
リッシュ・コーポレーション（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌ
．Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク（１９８７）、３２１〜
３８５頁参照］。このウイルスのＤＮＡはクロスハイブ
リダイズし、相同配列を示す［ロー（Ｍ．Ｆ．Ｌａｗ）
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：２２５〜２２９（１９７９
）］。それゆえ、臨床試料中のＨＰＶ　ＤＮＡおよびＲ
ＮＡの検出および識別のための一層高感度で特異的な手
段として、分子ハイブリダイゼーション法が開発されて
いる［ロリネツ（Ａ．Ｔ．Ｌｏｒｉｎｅｚ）、Ｏｂｓｔ
ｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎｉｃ
ｓ　ｏｆ　Ｎ．Ａｍｅｒｉｃａ１４：４５１（１９８７
）］。

【０００６】ヒトパピローマウイルスのＤＮＡおよびＲ
ＮＡに特異的な配列は知られており、出版されている［
たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／６９９４０（１９８９
年１０月１９日公開）、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０５８１
６（１９８６年１０月９日公開）およびヨーロッパ特許
出願第０３０１９６８号（１９８９年２月１日公開）参
照］。

【０００７】相同なＤＮＡ配列を検出するために使用す
る分子ハイブリダイゼーション法は、特定ＨＰＶ型にし
かない核酸配列に結合するプローブとともに使用した場
合には、高度に特異的となり得る。しかしながら、所定
の臨床試料中の全ウイルスＤＮＡの濃度は、該試験の感
度の限界を下回っているかもしれない。たとえば、異形
成頸部病変中のウイルスＤＮＡの量は、異形成が増大す
るにつれて減少する。

【０００８】この感度の問題を克服するため、たとえば
複製連鎖反応（ＰＣＲ）法やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ
）法を使用することによりウイルスＤＮＡ配列を増幅さ
せることができる。かくして得られた生成物を、サザー
ンブロッティングなどのウイルス型の同定のための通常
のハイブリダイゼーション法により同定することができ
る［オステ（Ｃ．Ｏｓｔｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ　６：１６３（１９８８）、マリス（Ｋ．Ｂ．Ｍｕ
ｌｌｉｓ）、米国特許第４，６８３，２０２号、および
ＥＰ−Ａ−３２０３０８（バイオテクニカ）参照］。

【０００９】ＰＣＲおよびＬＣＲの両方とも、試料中に
存在するＤＮＡを検出可能なレベルまで増幅させる。実
際には、感度レベルは、試料当たり約５０〜１００コピ
ーである。その次に感度の良好な方法はドット−ブロッ
ティング法であり、この方法は約１０，０００分子を検
出することができる。一方、サザーンブロッティング法
では、試料当たり約１００，０００コピーのＤＮＡが信
頼性をもって検出される。

【００１０】それゆえ、適当なＨＰＶの診断には２つの
工程が必要となる。一つのやり方として、まず臨床的に
関連のあるＨＰＶ型の存在を群特異的プライマーを用い
て検出する。ＨＰＶの存在を検出した後、該群のＨＰＶ
間で低い相同性を有する型特異的プローブを用いて型間
での識別を行うことができる。別法として、最初に型特
異的プローブの混合物を用いて識別を行うことができる
。ただし、これらプローブはそれぞれ独立にＤＮＡを増
幅することができなければならず、また独立に検出する
ことができなければならない。過去においては、そのよ
うなことは特異的抗体を用いて行った。一般に、核酸プ
ローブおよびプライマーは抗体に比べてサブタイプ間の
識別を一層顕著に行うことができる。このようなＤＮＡ
に基づく試験の使用により、従来の抗体に基づく試験に
比べて感度および特異性の両方を向上させることができ
る。

【００１１】それゆえ、増幅させることができ、試料中
のＨＰＶの存在の検出のために使用することのできるＤ
ＮＡのオリゴヌクレオチド鎖を提供することが有利であ
る。また、増幅させることができ、試料中の特定のＨＰ
Ｖ型の存在の検出のために使用することのできるＤＮＡ
の短いオリゴヌクレオチド鎖を提供することが有利であ
る。オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせての使用は、試
料中に存在するＨＰＶおよびその特定の型の特異的かつ
高感度のインビトロ診断を可能にするのに有利である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、約１０〜約６
０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを提供す
るものであり、本発明のヌクレオチドは、増幅すること
ができ、特定の型のヒトパピローマウイルスの特定配列
の検出か、または異なる型の間で高い相同性を示す共通
領域の検出に用いることができる。ＨＰＶの存在の決定
は、ＨＰＶ６型、１１型、１６型、１８型、３１型、３
３型および６１型の存在を検出するために提供される配
列に試料を接触させることにより行う。この決定は、た
とえばＰＣＲまたはＬＣＲにより前以て増幅するかまた
は増幅することなく行う。型特異的な増幅および共通増
幅のいずれも可能である。これら公知の増幅手順に従っ
て、ＰＣＲにより配列を増幅させる場合には２つのオリ
ゴヌクレオチドを用意し、ＬＣＲにより増幅させる場合
には４つのオリゴヌクレオチドを用意する。

【００１３】ＨＰＶの存在が検出されたら、その後にＨ
ＰＶ型特異的プローブを用いて行うＰＣＲまたはＬＣＲ
によって試料中に存在するＨＰＶ型を決定することがで
きる。別法として、型特異的ＨＰＶの存在はまた、ＨＰ
Ｖ６型、１１型、１６型、１８型、３１型、３３型およ
び６１型の検出のために本発明により提供される型特異
的ヌクレオチド配列に試料を直接接触させることによっ
ても決定することができる。本発明はまた、該オリゴヌ
クレオチドを用いた、ヒトパピローマウイルスの増幅お
よび検出のため方法およびキットをも提供する。

【００１４】適切なＨＰＶの診断には２つの条件が必要
である。第一の条件は、関係するすべての型の検出を可
能とし、第二の条件は、それら型間での識別を可能とす
る。過去においては、そのようなことは特異的抗体を用
いて行っていた。一般に、核酸プローブおよびプライマ
ーは、抗体に比べてサブタイプ間での識別を一層顕著に
行うことができる。それゆえ、ＤＮＡに基づく試験は、
抗体に基づく試験に比べて感度および特異性の両方とも
向上している。

【００１５】米国特許第４，６８３，１９５号および同
第４，６８３，２０２号には、ＰＣＲを用いてＤＮＡ配
列を増幅させる方法が教示されている。この方法は、い
まや多くの分子生物学研究機関での標準法となっている
。下記実施例１〜４では、これら２つの特許に記載され
た手順および市販のジーン−アンプＴＭキットの使用説
明書に記載された方法（書類Ｎｏ．５５６３５−６／８
９、パーキン−エルマー／シータス、エメリービル、カ
リフォルニア州）を利用した。

【００１６】ＰＣＲにおいては、２つの相補的なポリヌ
クレオチド鎖を２つのオリゴヌクレオチドプライマーで
処理して、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長生成
物が合成されるようにする。これらプライマーは、いっ
たん一方のプライマーの伸長生成物が鋳型から分離され
たら、該一方のプライマーの伸長生成物が他方のプライ
マーからの伸長生成物の合成のための鋳型となるように
選択する。連鎖反応は、プライマー伸長生成物を鋳型か
ら変性させ、得られた一本鎖分子を同じプライマーと再
アニールさせ、ついで該プライマーからさらに伸長生成
物を生成させるというサイクルにより維持される。この
サイクルは、目的核酸断片が検出可能な濃度まで増加す
るまで、いかに多くの回数でも繰り返すことができる。

【００１７】かくして増幅した目的配列は、幾つかの公
知方法のいずれかにより検出することができる；たとえ
ば、ＰＣＲにより生成した二本鎖生成物を変性させ、つ
いで該伸長生成物とハイブリダイズする１または２以上
のリポータープローブで処理することにより検出するこ
とができる。このリポータープローブは検出可能な標識
を有しており、通常、過剰に加える。それゆえ、ハイブ
リダイズしなかったリポータープローブは、ハイブリダ
イズしたリポータープローブから分離工程により分離し
なければならない。リポータープローブおよび分離工程
を用いない伸長生成物の他の検出方法では、臭化エチジ
ウムで染色したゲルにより伸長生成物を検出する。ＤＮ
Ａをニトロセルロースに移し、試料中に存在すると思わ
れるＨＰＶ型に特異的なプローブを用いて釣り上げる（
ｐｒｏｂｉｎｇ）ことにより診断を確認することができ
る。

【００１８】ＰＣＲを用いた別法では、ＨＰＶ　ＤＮＡ
内の既知制限部位を利用し、１種または２種以上の制限
エンドヌクレアーゼで生成した開裂パターンを調べるこ
とにより、増幅ＤＮＡが予想配列を含んでいることを示
すことができる。２つの理由から、増幅配列の真正さを
確かめる必要がある。すなわち、（１）増幅プライマー
に相補的な配列が、ＨＰＶ　ＤＮＡを含有しない細胞Ｄ
ＮＡ中に偶然に存在するものではないことを確認するた
め、および（２）試料中に存在するＨＰＶ型を同定する
ため、である。増幅のために選択した配列がＨＰＶ型間
で保存されているならば、増幅配列を見いだしても特定
のＨＰＶ型を示すことにはならない。

【００１９】また、これら２つのプライマーの結合部位
に基づいて、増幅生成物のサイズの予測が可能でなけれ
ばならない。それゆえ、生成物が認められた場合には、
ＨＰＶが存在することが妥当に確実でなければならない
。しかしながら、２つの異なるＨＰＶ型からは、同じか
または異なるサイズの生成物が得られるかもしれない。それゆえ、得られた結果の解釈が信頼のおけるものであ
るという確信が得られるまでは、増幅配列の同定を確認
するためハイブリダイゼーションを行うべきである。ま
た、ＰＣＲ法ではゲノムの小さな部分しか分析されない
ので、相同性の高いプライマーが存在しない限り、密接
に関連した配列すなわち型特異的な配列しか同定できな
いことに注意すべきである。

【００２０】他の特に有用な検出法は、ＥＰ−Ａ−３５
７０１１号に記載されている。この方法では、異なるリ
ポーター分子、たとえばハプテンを各プライマーに結合
させる。増幅後、変性前に、ハプテン（ハプテン１）を
抗ハプテン１抗体コーティング固相で「捕捉する」こと
により検出することができる。分離された複合体は、標
識と抗ハプテン２抗体との結合体により検出することが
でき、固相に付随する標識を測定する。

【００２１】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、ＤＮＡの
切片をコピーし、ＤＮＡの切片のコピーをコピーし、以
下これを何度も繰り返すことにより該ＤＮＡの切片を増
幅させる。この方法は、ヨーロッパ特許出願第０３２０
３０８号（１９８９年６月１４日公開）に記載されてい
る。この方法では、目的配列中のすぐ隣合わせの領域に相補
的な２つのプローブ（たとえば、ＡおよびＢ）をハイブ
リダイズさせ、ライゲートさせる。かくしてライゲート
したプローブを、ついで該目的配列から変性して分離さ
せ、その後、最初のプローブＡおよびＢとは反対のセン
スの別の２つのプローブ（Ａ’およびＢ’）とハイブリ
ダイズさせる。ついで、これら第二のプローブ間でライ
ゲートさせる。その後、変性／ハイブリダイゼーション
／ライゲーションのサイクルを繰り返して、センス（＋
）およびアンチセンス（−）の両方の２倍長プローブを
生成させる。

【００２２】ＬＣＲ法では、試料核酸は、一本鎖ＤＮＡ
として提供するか、または二本鎖ＤＮＡとして提供して
それを変性して各鎖に分離させる。４つのプローブを用
いる。最初の２つのプローブ（ＡおよびＢ）は、いわゆ
る主プローブであり、その次の２つのプローブ（Ａ’お
よびＢ’）は、いわゆる副プローブである。第一プロー
ブ（Ａ）は、目的ヌクレオチド配列の主鎖の第一部分と
ハイブリダイズし得る一本鎖である。第二プローブ（Ｂ
）は、目的ヌクレオチド配列の主鎖の第二部分とハイブ
リダイズすることができる。これらプローブが目的ヌク
レオチド配列の主鎖にハイブリダイズしたときに第一プ
ローブの３’末端と第二プローブの５’末端とが結合で
きるように、目的配列の主鎖の第一部分の５’末端と目
的配列の主鎖の第二部分の３’末端とが相対して位置し
ている。

【００２３】第三のプローブ（Ａ’）は該第一のプロー
ブとハイブリダイズすることができ、第四のプローブ（
Ｂ’）は該第二のプローブとハイブリダイズすることが
できる。これらハイブリダイズしたプローブは、ライゲ
ートさせて再構成した融合プローブ配列を生成させる。ついで、試料中の該ＤＮＡを変性させて、試料ＤＮＡか
らライゲートしたプローブを分離させる。引き続き上記
ライゲートプローブおよび目的ＤＮＡを上記手順に供す
るサイクルを繰り返し行って、試料中の検出可能なＤＮ
Ａの量を増加させる。サイクルを行う回数は、使用した
配列および試験に必要な感度に依存する。通常、１５〜
６０回のサイクルを行う。少なくとも一つのプローブを
シグナル生成化合物と結合させることができる。

【００２４】上記４つのプローブを適当な結合成分に結
合してある場合は、増幅生成物の検出は、当業者に知ら
れた標準的な手動または自動イムノアッセイ法により行
うことができる。これら方法の例としては、たとえば、
イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡおよび
ＭＥＩＡなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは
また、当該技術分野で知られたドットブロッティング法
、スロットブロッティング法またはレプリカブロッティ
ング法に従って行うことができる。

【００２５】これら配列は適当なシグナル生成化合物（
標識）で標識することができる。該シグナル生成化合物
（標識）は、外部手段により検出できる測定可能なシグ
ナルを生成させることができる。本発明で用いることの
できる種々のシグナル生成化合物の例としては、色原体
；酵素などの触媒；フルオレセインおよびローダミンな
どの発光化合物；化学発光化合物；３２Ｐなどの放射性
元素；および当業者に知られた他の標識などが挙げられ
る。特定の標識を選択することは重要ではないが、標識
はそれ自体かまたは１または２以上の他の物質と組み合
わせるかによってシグナルを生成することができなけれ
ばならない。

【００２６】標識および特異的結合成分から種々の異な
る指示試薬を調製することができる。標識および特異的
結合成分のいずれかを変えることができる。指示試薬中
に用いることのできる特異的結合成分の例としては、抗
体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および
それらのフラグメントを含む）、アビジンまたはビオチ
ン、ビオチンおよび抗−ビオチン抗体、炭水化物または
レクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子
またはレセプター分子、酵素補助因子または酵素、酵素
インヒビターまたは酵素、あらゆる抗原性物質、ハプテ
ン、抗体、およびそれらの組み合わせなどが挙げられる
。

【００２７】試料は、ＨＰＶを含有していると思われる
すべての生物学的物質であってよい。それゆえ、試料は
、人体組織であってよく、またはＨＰＶを含有している
と思われる細胞を含む試料であってよい。

【実施例】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではない
。なお、実施例中に使用した略語は下記のとおりである
。

【００２８】ＴＲＩＳ：［トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン］の略（緩衝液として使用）ＥＤＴＡ：エ
チレンジアミン四酢酸の略（キレート化剤）ＦＩＴＣ：
フルオレセインイソチオシアネートの略（蛍光ハプテン
誘導体）ＮＨＳ−エステル：Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエス
テルの略ＭＥＳ：［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］
の略（緩衝液）ＴＷＥＥＮＲ−２０：アトラス・ケミカル（Ａｔｌａｓ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社のポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレートの商標名（界面活性剤）ＢＩＳ−ＴＲＩＳ：［ビス−（２−ヒドロキシエチル）
アミノ］トリス（ヒドロキシメチル）メタンの略（緩衝
液）ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００Ｒ：ローム・アンド・ハ
ース（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）社のノナエチレングリ
コールオクチルフェノールエーテルの商標名（界面活性
剤）ＩＭｘＲ：アボット・ラボラトリーズ社の微細粒子
酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）を行うための自動装置
の商標名

【００２９】実施例１市販のジーン−アンプＴＭキットの使用説明書（書類Ｎ
ｏ．５５６３５−６／８９、パーキン−エルマー／シー
タス、エメリービル、カリフォルニア州から入手可能）
に実質的に従ってＰＣＲを行った。下記試薬を０．５ｍ
ｌ容のポリプロピレンチューブ中で混合し、ＰＣＲを行
うのに使用した。

【００３０】　　試薬　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　最終濃度水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（最終容量を
５０μＬまたは１００μＬとする）反応緩衝液　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ　ＴＲＩＳ　ｐ
Ｈ８．３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５０ｍＭ　ＫＣｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５ｍＭ
　ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０１％ゼラチンｄＮＴＰ混合物
　　　　　　　　　　　　　　各２００μＭのｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　およびｄＴＴＰＰＣＲ１　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＭＰＣＲ
２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＭプ
ラスミド　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μ
Ｌ　　　　　　　　１ｎｇ／１００μＬ（またはコント
ロール−ヒト胎盤ＤＮＡ（プールした胎盤ＤＮＡ、カタ
ログＤ−３２８７、シグマ・ケミカル、セントルイス、
ミズーリ州））ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ
）　　　　　　２５または６３．９単位／１ｍＬ

【００
３１】混合後、反応混合物に鉱油（１００μＬ）を重層
した。ついで、幾つかの温度にてインキュベーションす
ることが可能な装置中に該チューブを入れ、プログラム
した温度変化を３０または４０サイクル行った。正確な
温度変化のサイクル数および使用した装置は、各実験に
依存して変わり、その詳細は実施例３に記載する。

【００３２】実施例２実施例１の手順に従い、下記配列がＰＣＲ法によりパピ
ローマウイルス６型、１１型、１６型、１８型、３１型
、３３型および６１型の切片を増幅させることがわかっ
た。

【化１９】配列ＩＷＤＯは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／００６２
９（ＷＯ８６／０５８１６）に開示された配列に由来す
る。

【００３３】下記配列が、ＰＣＲ法によりパピローマウ
イルス６型、１１型、１６型、１８型および３１型の切
片を増幅させることがわかった。下記表１は、配列と該
配列の各種型中での位置を示す。

【化２０】表１（プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いるこ
とのできる配列）

【表１】

【００３４】実施例３ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
する直鎖状プラスミドを目的鎖として用いた。これらは
、ｐＨＰＶ６．１（ＨＰＶ６）、ｐＳＰ６５．１１．５
（ＨＰＶ１１）、ｐ６５．１６．８（ＨＰＶ１６）、ｐ
ＨＰＶ１８Ｈ（ＨＰＶ１８）、ｐＧ３．ＨＰＶ３１（Ｈ
ＰＶ３１）、ｐＬＮＫ３２２．ＨＰＶ３３（ＨＰＶ３３
）およびｐＢＲ３２２．ＨＰＶ６１（ＨＰＶ６１）であ
った。インキュベーション装置としては、プログラマブ
ルサイクリックリアクター（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ
　Ｃｙｃｌｉｃ　Ｒｅａｃｔｏｒ）ＴＭ（エリカンプ（
Ｅｒｉｃｏｍｐ）、サンジエゴより入手可能）を用いた
。実施例１に記載したＰＣＲ法に従い、０．０８９Ｍ　
ＴＲＩＳ、０．０８９Ｍホウ酸塩、２ｍＭＥＤＴＡ、お
よび０．５ｐｐｔ臭化エチジウムを含有する緩衝液中、
アガロース（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）Ｒ：シーケム
（ＳｅａＫｅｍ）ＲＧＴＧを５：３の比率で含有、ＦＭ
Ｃコーポレーション、ロックランド、メイン州より入手
可能）により電気泳動により１０μＬアリコートを分析
した。

【００３５】図１は、ＤＮＡサーマルサイクラーＴＭ（
パーキン−エルマー／シータス、エメリービル、カリフ
ォルニア州）中で６３．９単位／ｍＬのＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて得られた結果を示す、臭化エチジウム染色
１．２％アガロースゲルの写真の模式図である。試料を
９４℃で５分間加熱し、ついで、９４℃で１分間、４０
℃で２分間および７２℃で１．５分間の温度プログラム
に４０サイクル供した。この場合に使用したＰＣＲプラ
イマーは、実施例２のＰＣＲ１およびＰＣＲ５であった
。電気泳動後のゲルを調べたところ、予測された位置、
すなわち２９２ｂｐにバンドが示された［レーン１、Ｈ
ＰＶ６；レーン２、ＨＰＶ１１；レーン３、ＨＰＶ１６
；レーン４、ＨＰＶ１８；レーン５、ＨＰＶ３１；レー
ン６、ＨＰＶ３３；レーン７、ＨＰＶ６１；レーン８、
プールしたヒト胎盤ＤＮＡ（ＨＰＶ感染を含むと思われ
る）；レーン９、分子量マーカー：ΦＸ１７４のＨａｅ
ＩＩＩ消化物］。

【００３６】図２は、プログラマブルサイクリックリア
クターＴＭ（エリカンプ、サンジエゴ、カリフォルニア
州）中で２５単位／ｍＬのＤＮＡポリメラーゼを用いて
得られた結果を示す、臭化エチジウム染色４％アガロー
スゲルの写真の模式図である。この場合は、試料を、５
０℃で１分間、７２℃で２分間および９５℃で１分間の
温度プログラムに３０サイクル供した。この場合は、プ
ラスミドｐ６５．１６．８（ＨＰＶ１６）を増幅させる
ため、実施例２のプライマーＰＣＲ１、ＰＣＲ２、ＰＣ
Ｒ３、ＰＣＲ４およびＰＣＲ５を用いた。図２のゲルは
、予測された位置、すなわちＰＣＲ１およびＰＣＲ４は
２３５ｂｐ、レーン２；ＰＣＲ１およびＰＣＲ５は２６
７ｂｐ、レーン４；ＰＣＲ２およびＰＣＲ４は２５４ｂ
ｐ、レーン６；ＰＣＲ２およびＰＣＲ５は２８６ｂｐ、
レーン８；ＰＣＲ３およびＰＣＲ４は１７４ｂｐ、レー
ン１０；ＰＣＲ３およびＰＣＲ５は２０６ｂｐ、レーン
１２；分子量マーカー、１２３、２４６、３６９、４９
２、・・・ｂｐ、レーン１にそれぞれバンドを示してい
る。

【００３７】図３は、図１と同じ条件で得られた結果を
示す、臭化エチジウム染色１．２％アガロースゲルの写
真の模式図である。この場合は、プライマーとしてＰＣ
Ｒ１４およびＰＣＲ１５をＩＷＤＯとともに用いた。Ｐ
ＣＲ１４およびＩＷＤＯの増幅ＰＣＲ生成物の予測され
るサイズは、試験したＨＰＶのすべての型において４３
７ｂｐである。ＰＣＲ１５およびＩＷＤＯの生成物の予
測されるサイズは、９８ｂｐである。これらサイズの生
成物はゲル中に認められ、ＰＣＲ１４およびＰＣＲ１５
をＩＷＤＯとともに用いた場合に６型、１１型、１６型
、１８型、３１型、３３型および６１型のＨＰＶ　ＤＮ
Ａを増幅することが確認された。

【００３８】図３において、レーン１は分子量マーカー
（ΦＸ１７４のＨａｅＩＩＩ消化物）；レーン２〜９は
ＰＣＲ１４＋ＩＷＤＯであり、レーン２はＨＰＶ６、レ
ーン３はＨＰＶ１１、レーン４はＨＰＶ１６、レーン５
はＨＰＶ１８、レーン６はＨＰＶ３１、レーン７はＨＰ
Ｖ３３、レーン８はＨＰＶ６１、レーン９はＨＰＶに感
染していると思われるヒト胎盤ＤＮＡ；レーン１０〜１
７はＰＣＲ１５＋ＩＷＤＯであり、レーン１０はＨＰＶ
６、レーン１１はＨＰＶ１１、レーン１２はＨＰＶ１６
、レーン１３はＨＰＶ１８、レーン１４はＨＰＶ３１、
レーン１５はＨＰＶ３３、レーン１６はＨＰＶ６１、レ
ーン１７はＨＰＶに感染していると思われるヒト胎盤Ｄ
ＮＡ；レーン１８は分子量マーカー（ΦＸ１７４のＨａ
ｅＩＩＩ消化物および１ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物
）である。

【００３９】実施例４２つの工程、すなわち非特異的な増幅と特異的な検出を
同時に行わうことができる領域として、４つの領域を選
択した。これら４つの領域の境界部分には、１セットの
プライマーを用いたＰＣＲによりＨＰＶ６型、１１型、
１６型、１８型または３３型のいずれをも増幅すること
ができるように、高相同性の領域が含まれていた。また
、これら４つの領域の内部には、これらパピローマウイ
ルス型のいずれか一つに特異的なプローブがその特異的
な相補的な相手にはハイブリダイズするが他の相手とは
ハイブリダイズしないように、低相同性の領域が含まれ
ていた。

【００４０】本実施例に記載する４つの領域を利用する
ことができるように、組み合わせて用いるべく下記セッ
トの配列をデザインした。各セット中のＰＣＲｎで示さ
れる２つのものは、パピローマウイルス６型、１１型、
１６型、１８型および３３型のいずれをも認識する。他
のＰＲＯＢＥｎで示されるものは、特定セット中のもの
と一緒に用いて１つの特定の型のみを認識する。下記表
２〜５は、配列および種々の型における位置を示す。

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【００４１】表２（（１）普遍プローブまたはＰＣＲプ
ライマーとして用いることのできる配列および（２）型
特異的プローブとして用いることのできる配列；セット
「ａ」）

【表２】表３（（１）普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとし
て用いることのできる配列および（２）型特異的プロー
ブとして用いることのできる配列；セット「ｂ」）

【表
３】表４（（１）普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとし
て用いることのできる配列および（２）型特異的プロー
ブとして用いることのできる配列；セット「ｃ」）

【表
４】表５（（１）普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとし
て用いることのできる配列および（２）型特異的プロー
ブとして用いることのできる配列；セット「ｄ」）

【表
５】

【００４２】実施例５共通配列を選択するために開発した独特の手法に従い、
配列を選択した。下記配列がかくして選択した共通配列
であり、それぞれヒトパピローマウイルス６型、１１型
、１６型、１８型および３３型のそれぞれとハイブリダ
イズする。これら配列は独特の部位でハイブリダイズし
、その位置を下記表６および７に示す。

【表６】

【表７】

【００４３】実施例６リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のため、下記試薬を０．５
ｍＬ容ポリプロピレンチューブ中で混合した。　　試薬　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　容
量　　　　　　最終濃度水　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２１μＬ　　　　反応緩衝液　　　
　　　　　　　　　　　１０μＬ　　　　５０ｍＭ　Ｅ
ＰＰＳ　ｐＨ７．８　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ　
ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００ｍＭ　Ｋ＋（あらゆる
採取源から）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００１％ＢＳ
Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１ｍＭ　ＤＤＴ

【００４４】ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）　　０．５μＬ　　１００μ
ＬプローブＡ（センス）　　　　　　４μＬ　　　　　
　５．０×１０１１分子プローブＡ’（アンチセンス、５’−リン酸）　　　　　　　　４μＬ　　　　　
　７．５×１０１１分子プローブＢ（センス、５’−リン酸）　　　　　　　　　　　　４μＬ　　　
　　　７．５×１０１１分子プローブＢ’（アンチセンス）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４μ
Ｌ　　　　　　５．０×１０１１分子目的配列（１０μ
ｇ／ｍＬのヒト胎盤担体ＤＮＡを含有）　１．５μＬ　　　　１５ｎ
ｇ／５０μＬＤＮＡリガーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒ− ｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　　　　　　　１
μＬ

【００４５】この反応混合物に鉱油（３０μＬ）を
重層した。幾つかの温度にてインキュベーションするこ
とが可能な装置［たとえば、コイ・ラボラトリー・プロ
ダクツ（ＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）（アンアーバー、ミシガン州）から入手した熱サイ
クラーまたはプログラマブルサイクラーリアクターＴＭ
（エリカンプ、サンジエゴ、カリフォルニア州より入手
可能）］中に上記チューブを入れ、幾つかのサイクルの
プログラムした温度変化に供した。各サイクルは、５０
℃で１分間および８５℃で１分間であった。

【００４６】実施例７リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を行う際に、ヨーロッパ特
許出願公開第０３２０３０８Ａ２に記載の下記手順を用
いた。実施例６の試薬を用いて下記手順を行った。目的
配列中のすぐ隣の領域に相補的な２つのプローブ（Ａお
よびＢ）をハイブリダイズさせ、ライゲートした。この
ライゲートしたプローブを変性させて鋳型配列から分離
させ、最初のプローブ（ＡおよびＢ）とはセンスが反対
の別の２つのプローブ（Ａ’およびＢ’）とハイブリダ
イズさせた。ついで、これら第二のプローブをライゲー
トさせた。その後、変性／ハイブリダイゼーション／ラ
イゲーションのサイクルを行って、＋および−の両方の
センスの２倍長プローブを生成させた。

【００４７】実施例８実施例６および７に記載の手順に従い、下記配列がＨＰ
Ｖ１６型のＬ１領域部分を増幅させることがわかった。

【化２５】

【００４８】実施例９完全長のパピローマウイルス１６型挿入を含有する直鎖
状プラスミド（ｐ６５．１６．８；ＨＰＶ１６）を目的
配列として用いた。ＬＣＲ１（実施例８）は、５’末端
に３２Ｐ−リン酸を含んでいた。使用した熱サイクラー
（幾つかの温度でインキュベーションを行うことができ
る）はコイ・ラボラトリー・プロダクツ（アンアーバー
、ミシガン州）から入手した。実施例６および７に記載
のＬＣＲサイクルを行った後、０．０８９Ｍ　ＴＲＩＳ
、０．０８９Ｍホウ酸塩および２ｍＭ　ＥＤＴＡ中、４
％アガロース（ヌシーブＲ：シーケムＲＧＴＧを５：３
の比率で含有、ＦＭＣコーポレーション、ロックランド
、メイン州より入手可能）を用いた電気泳動により１０
μＬアリコートを分析した。

【００４９】図４は、オートラジオグラムの写真を示す
模式図である。レーン１および２は、ＨＰＶ１６型目的
配列の不在下でのＬＣＲを示す。レーン３および４は、
１０４分子のｐ６５．１６．８の存在下でのＬＣＲを示
す。レーン５および６は、１０６分子のｐ６５．１６．
８の存在下でのＬＣＲを示す。すべてのレーンは約２４
〜２５ｂｐのバンド（ライゲートしていないプローブに
対応）の存在を示している。レーン１〜４では約５０ｂ
ｐでのバンド（ライゲートしたＬＣＲプローブに対応）
は非常にわずかであるが、レーン５および６では該サイ
ズの強度のバンドが示されていることが観察できる。

【００５０】実施例１０目的配列、サイクラーおよび配列は実施例８および９の
ものと同じであった。プローブとして使用したオリゴヌ
クレオチドの幾つかは、ライゲーションから遠位末端に
化学標識を共有結合により結合させておいた。これら標
識は、５’−フルオレセイン−ＬＣＲ１Ａ、３’−フル
オレセイン−ＬＣＲ１Ａ’、３’−ビオチン−ＬＣＲ１
Ｂおよび５’−ビオチン−ＬＣＲ１Ｂ’であった。共有
結合は標準法、すなわち、カンサル（Ｋａｎｓａｌ）ら
のＴｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ２９：５５３７〜５５４０（
１９８８）に記載の方法に実質的に従ってアミン末端オ
リゴヌクレオチドをＦＩＴＣまたはビオチン−ＮＨＳ−
エステルと反応させることにより行った。

【００５１】実施例６および７に記載のＬＣＲを行った
後、ヨーロッパ特許出願公開第０２６２３２８号に記載
のイムノクロマトグラフィー検出システムを用いて混合
物を分析した。簡単に説明すると、この方法には、２つ
のイムノクロマトグラフィー試薬、すなわち抗体コーテ
ィングコロイドおよび抗体処理ニトロセルロースの調製
が含まれていた。

【００５２】上記コロイドは、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
０）中に０．０５％固形分となるようにポリピロールを
希釈することにより調製したポリピロールであった（全
容量５００μＬ中に１２０μｇの抗ビオチン抗体を含有
）。５分毎に短時間回転撹拌しながら混合物を５５°Ｃ
で２０分間インキュベートした。このインキュベーショ
ンの後に、＠１％ＴＷＥＥＮ−２０（１０μＬ）および
２５ｍＭ　ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（ｐＨ６．５）中の＠１０
％卵アルブミン（２５μＬ）を加えた。この混合物を短
時間超音波処理し、遠心分離により洗浄した。ニトロセ
ルロースの孔径は５μｍであり、これに毛管ホイップに
より細い線で抗フルオレセイン抗体を加えた。

【００５３】ライゲートしたＬＣＲ生成物は二重標識（
フルオレセインおよびビオチン）してあるため、抗ビオ
チン抗体結合ポリピロールを抗フルオレセイン抗体結合
ニトロセルロースに連結させた。ライゲートしていない
ＬＣＲ生成物は単独の標識しかされていないため、この
連結は生成しなかった。このＬＣＲ混合物の２５μＬア
リコートを、１００ｍＭ　ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、１
５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび２％ＢＳＡからなる緩衝液（
１００μＬ）に加えた。ポリピロールの１０μＬアリコ
ートを加えた。ついで、この懸濁液中に、下端から１．
５ｃｍの箇所に抗フルオレセイン抗体を吸着させたニト
ロセルロースの７×０．３ｃｍストリップを浸漬した。溶媒フロントがニトロセルロースストリップの上端から
１ｃｍ以内に達するまで、この懸濁液を毛管作用により
該ストリップを上昇させた。ストリップ上の抗フルオレ
セイン抗体の位置にむらのない黒線が存在することによ
り陽性の反応が示された。

【００５４】図５は、得られたニトロセルロースストリ
ップの写真を示す模式図である。図５中、「Ｏ」は化学
標識の結合していないすべてのプローブを示す。「Ｆ」
は、ＬＣＲ１ＢまたはＬＣＲ１Ｂ’上の標識を有しない
、フルオレセイン−ＬＣＲ１Ａおよびフルオレセイン−
ＬＣＲ１Ａ’を示す。「Ｂ」は、ＬＣＲ１ＡまたはＬＣ
Ｒ１Ａ’上の標識を有しない、ビオチン−ＬＣＲ１Ｂお
よびビオチン−ＬＣＲ１Ｂ’を示す。「ＢＦ」は、フル
オレセイン−ＬＣＲ１Ａ、フルオレセイン−ＬＣＲ１Ａ
’、ビオチン−ＬＣＲ１Ｂおよびビオチン−ＬＣＲ１Ｂ
’を示す。ＢＦの場合のみ、ニトロセルロースストリップ上の抗フ
ルオレセイン抗体の部位にポリピロール複合体が存在す
ることに注意すべきである。

【００５５】実施例１１下記表８に示す配列がＨＰＶ１１型、１６型および１８
型にそれぞれ特異的であることが決定された。

【表８】

【００５６】実施例１２実施例３と同様にして、ｐＧＥＭ３中に完全長のパピロ
ーマウイルス挿入を有する直鎖状プラスミドを目的配列
として用いた。これらのプラスミドは、ｐＳＰ６５．１
１．５（ＨＰＶ１１）、ｐＳＰ６５．１６．８（ＨＰＶ
１６）およびｐ６３ＨＰＶ１８Ｈ（−）（ＨＰＶ１８）
であった。実施例１１のプローブを実施例９と同様にしてビオチン
で標識した。熱サイクラーはコイ・ラボラトリー・プロ
ダクツからのものを用いた。

【００５７】実施例６および７に記載のようにしてＬＣ
Ｒを行った後、反応混合物を逆ブロット法により下記の
ようにして分析した。特定のＨＰＶ型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドをセルロース膜（メンテック（Ｍｅｍｔｅ
ｋ）ＴＭ、ベレリカ、マサチューセッツ州）に共有結合
により結合させた。これら配列は、表９に示すように、
型特異的ＬＣＲプローブであるＬＣＲ２、ＬＣＲ３およ
びＬＣＲ４の内部「半分」を結合させることにより得た
。

【表９】

【００５８】ハイブリダイゼーションは下記のようにし
て行った。膜をハイブリダイゼーション緩衝液（０．７
５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ
７．０、０．５％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、０．
５％ポリビニルピロリドン、１．０％ドデシル硫酸ナト
リウム［ＳＤＳ］、および０．１％ニシン***ＤＮＡ）
中、３７°Ｃで１５分間プレハイブリダイズした。試料
を約５分間沸騰させた。ついで、沸騰させた試料の２５
μＬアリコートを新たなハイブリダイゼーション緩衝液
（１ｍＬ）中に入れた。この混合物を膜とともに３７°
Ｃで２０時間インキュベートした。ついで、これら膜を
、新たなハイブリダイゼーション緩衝液中のストレプト
アビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ＢＲＬ、ガ
イセルスバーグ、メリーランド州より入手可能）の１：
１０００希釈液とともにインキュベートした。ついで、
膜を室温にて１％ＳＤＳ含有ＳＳＣ緩衝液（１５０ｍＭ
　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
）中で２回、および１％トリトンＸ−１００Ｒ（シグマ
・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より入手可能）
をさらに含有するＳＳＣ緩衝液中で２回洗浄した。この
膜を１％トリトンＸ−１００Ｒを含有する３７°Ｃにて
ＳＳＣ緩衝液中で２回、ついで再び室温にてＳＳＣ緩衝
液中で２回洗浄した。

【００５９】これら膜を、モレキュラー・バイオシステ
ムズ（ロットＷＦＰ−０１８８、サンジエゴ、カリフォ
ルニア州）から得た希釈液（約２ｍＬ）中のテストパッ
ク（ＴｅｓｔＰａｃｋ）ＴＭ基質（ストレップ（Ｓｔｒ
ｅｐ）ＡテストパックＴＭ試薬Ｃ、リスト１３０１Ｇ、
アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ
州より入手可能）に１：５希釈液（約１ｍＬ）とともに
インキュベートした。青色が陽性反応を示していた。

【００６０】これらの結果を図６〜８に示す。図６にお
いて、写真はＬＣＲ２Ａ、ＬＣＲ２Ａ’、ＬＣＲ２Ｂお
よびＬＣＲ２Ｂ’とｐＳＰ６５．１１．５との反応から
得られたＬＣＲ生成物の量を示す。６つのすべての捕捉
オリゴヌクレオチドは膜上に存在していた。反応生成物
の大部分はＨＰＶ−１１特異的オリゴヌクレオチドの部
位に認められた。図７において、写真はＬＣＲ３Ａ、Ｌ
ＣＲ３Ａ’、ＬＣＲ３ＢおよびＬＣＲ３Ｂ’とｐＳＰ６
５．１６．８との反応から得られたＬＣＲ生成物の量を
示す。６つのすべての捕捉オリゴヌクレオチドは膜上に
存在していた。すべての反応生成物がＨＰＶ−１６特異
的オリゴヌクレオチドの部位に認められた。図８におい
て、スケッチはＬＣＲ４Ａ、ＬＣＲ４Ａ’、ＬＣＲ４Ｂ
およびＬＣＲ４Ｂ’とｐＧ３Ｇ３ＨＰＶ１８Ｈ（−）と
の反応から得られたＬＣＲ生成物の量を示す。６つのす
べての捕捉オリゴヌクレオチドは膜上に存在していた。実質的にすべての反応生成物がＨＰＶ−１８特異的オリ
ゴヌクレオチドの部位に認められた。

【００６１】実施例１３下記配列が、ＨＰＶ１６型のＥ６領域部分に特異的であ
ることが決定された。

【化２６】

【００６２】実施例１４ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
する塩基変性プラスミドを目的配列として用いた。これ
らのプラスミドは、ｐＧ３ＨＰＶ６（＋）（ＨＰＶ６）
、ｐＳＰ６５．１１．５（ＨＰＶ１１）、ｐＳＰ６５．
１６．８（ＨＰＶ１６）、ｐ６３ＨＰＶ１８Ｈ（−）（
ＨＰＶ１８）、ｐ６３：ＨＰＶ３１（ＨＰＶ３１）、ｐ
ＬＮＫ３２２：ＨＰＶ３３（ＨＰＶ３３）、ｐＢＲ３２
２：ＨＰＶ３５（ＨＰＶ３５）、ｐＵＣ１９：ＨＰＶ５
２（ＨＰＶ５２）、ｐＬＮＫ３２２：ＨＰＶ５８（ＨＰ
Ｖ５８）、ｐＵＣ９：ＨＰＶ５９（ＨＰＶ５９）および
ｐＢＲ３２２：ＨＰＶ６１（ＨＰＶ６１）であった。

【００６３】プローブとして使用する実施例１３からの
すべてのオリゴヌクレオチドに、ライゲーションからの
遠位末端に化学標識を共有結合により結合させた。これ
らの標識は、５’−フルオレセイン−ＬＣＲ５Ａ、３’
−フルオレセイン−ＬＣＲ５Ａ’、３’−ビオチン−Ｌ
ＣＲ５Ｂおよび５’−ビオチン−ＬＣＲ５Ｂ’であった
。共有結合は、公知の方法、すなわちカンサルらのＴｅ
ｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ２９：５５３７〜５５４０（１９８
８）に記載の方法に実質的に従ってアミン末端オリゴヌ
クレオチドをＦＩＴＣまたはビオチン−ＮＨＳ−エステ
ルと反応させることにより行った。使用した熱サイクラ
ーは、コイ・ラボラトリー・プロダクツ、アンアーバー
、ミシガン州より入手したものであった。

【００６４】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従い
、標準型のＩＭｘＲ装置（アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州）を用い、下記微細粒子酵
素イムノアッセイのプロトコールに従って混合物を分析
した。ＬＣＲ混合物の４０μＬアリコートを蒸留水で１
：１に希釈した。この希釈混合物を抗フルオレセイン抗
体結合ポリスチレン微細粒子（５０μＬ）とともに５分
間インキュベートして、微細粒子上の免疫複合体の懸濁
液を生成させた。ついで、この懸濁液を不活性ガラス繊
維マトリックスに移すと、微細粒子は該マトリックスに
結合した。このマトリックスを緩衝液（０．３Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ　ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、０．１％Ｎａ
Ｎ３）で洗浄した。４−メチルウンベリフェロンの加水
分解を触媒するアルカリホスファターゼ標識結合体を用
い、ガラスマトリックスに結合した免疫複合体を検出し
た。マトリックス上に４−メチルウンベリフェロンが生
成する速度は、反応混合物中に生成したＬＣＲ生成物の
濃度に比例した。

【００６５】図９のグラフは、１０７分子の目的配列に
ついてＬＣＲを行って得られた結果を示す。図９に示す
速度は、４−メチルウンベリフェロンの生成速度であり
、蛍光カウント／秒／秒として表してある。ヒト胎盤Ｄ
ＮＡの増幅により示されるように、バックグラウンドシ
グナルは約１０ｃ／ｓ／ｓである。バックグラウンドを
越える値が得られた唯一のものは、ＨＰＶ１６を含有す
る試料からのものであり、その値はバックグラウンドシ
グナルの約６０倍である。

【００６６】実施例１５下記配列が、ＨＰＶ１８型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２７】

【００６７】実施例１６ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。プローブとして使用する実施例１５で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラーは
、コイ・ラボラトリー・プロダクツ、アンアーバー、ミ
シガン州からのものであった。

【００６８】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従い
、標準型のＩＭｘＲ装置（アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州）を用い、実施例１４に記
載のようにして混合物を分析した。図１０のグラフは、
１０７分子の目的配列についてＬＣＲを行って得られた
結果を示す。図１０に示す速度は、４−メチルウンベリ
フェロンの生成速度であり、蛍光カウント／秒／秒とし
て表してある。ヒト胎盤ＤＮＡの増幅により示されるよ
うに、バックグラウンドシグナルは約１５ｃ／ｓ／ｓで
ある。バックグラウンドを越える値が得られた唯一のも
のは、ＨＰＶ１８を含有する試料からのものであり、そ
の値はバックグラウンドシグナルの約４０倍である。

【００６９】実施例１７下記配列が、ＨＰＶ１８型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２８】

【００７０】実施例１８ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。プローブとして使用する実施例１７で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラーは
、実施例１６に記載したものと同じであった。実施例６
および７に記載のＬＣＲ法に従い、標準型のＩＭｘＲ装
置（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリ
ノイ州）を用い、実施例１４に記載のようにして混合物
を分析した。図１１のグラフは、１０７分子の目的配列
についてＬＣＲを行って得られた結果を示す。図１１に
示す速度は、４−メチルウンベリフェロンの生成速度で
あり、蛍光カウント／秒／秒として表してある。ヒト胎
盤ＤＮＡの増幅により示されるように、バックグラウン
ドシグナルは約１５ｃ／ｓ／ｓである。バックグラウン
ドを越える値が得られた唯一のものは、ＨＰＶ１８を含
有する試料からのものであり、その値はバックグラウン
ドシグナルの約８０倍である。

【００７１】実施例１９下記配列が、ＨＰＶ１６型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２９】

【００７２】実施例２０ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。プローブとして使用する実施例１９で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラーは
、実施例１６に記載したものと同じであった。

【００７３】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従い
、標準型のＩＭｘＲ装置（アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州）を用い、実施例１４に記
載のようにして混合物を分析した。図１２のグラフは、
１０７分子の目的配列についてＬＣＲを行って得られた
結果を示す。図１２に示す速度は、４−メチルウンベリ
フェロンの生成速度であり、蛍光カウント／秒／秒とし
て表してある。ヒト胎盤ＤＮＡの増幅により示されるよ
うに、バックグラウンドシグナルは約１０ｃ／ｓ／ｓで
ある。バックグラウンドを越える値が得られた唯一のも
のは、ＨＰＶ１６を含有する試料からのものであり、そ
の値はバックグラウンドシグナルの約３６倍である。

【００７４】実施例２１本実施例では、下記に示すように本発明の配列を公知配
列に配置させて開示する。下記にＨＰＶ６型、１１型、
１６型、１８型、３１型および３３型の配列を示す。ま
た、これらＨＰＶ配列に対して本発明の配列がどこに対
応するかをも示す。さらに、１９９０年９月２８日現在
で本発明者らに知られ他の出願人もしくは研究者によっ
てクレームされまたは開示された他の配列がＨＰＶ配列
に対してどこに対応するかをも示す（配列中、ｃｏｎは
共通配列を示す）。

【００７５】なお、配列中の略語は以下の通りである。１．本発明の配列および領域：ＰＣＲ＝実施例１〜４による配列ＪＪ＝実施例５による領域ＬＣＲ＝実施例６〜２０による配列

【００７６】２．他の出願人によってクレームされた配
列および領域（イタリック体はアンチセンス配列を示す
）：ＡＵＳ＝国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／０００４７（ＷＯ
８８／０６６３４）（オーストラリア人による）ＷＬ＝
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／００６２９（ＷＯ８６／０
５８１６）［ウエイン・ランカスター（Ｗａｙｎｅ　Ｌ
ａｎｃａｓｔｅｒ）、ウエイン州立大学］ＢＥ＝ヨーロッパ特許出願第８９−０３３８３４（Ｘ＝
ＴまたはＵ）（ベルギー人による）

【００７７】Ｃ＝国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３７４
７（ＷＯ／９０／０２８２１）（シータス）Ｏ＝国際出
願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１３１８（ＷＯ／８９／０９９
４０）（オンカー（Ｏｎｃｏｒ））３．他の研究者によ
り開示された配列および領域：Ｓ＝サーカー（Ｓａｒｋ
ａｒ，Ｆ．Ｈ．）およびクリスマン（Ｃｈｒｉｓｓｍａ
ｎ，Ｊ．Ｄ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ９、１８
０〜１８４（１９９０）（イタリックはアンチセンス配
列を示す）

【００７８】

【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

【００７９】

【化３８】

【化３９】

【化４０】

【化４１】

【化４２】

【化４３】

【化４４】

【化４５】

【化４６】

【００８０】

【化４７】

【化４８】

【化４９】

【化５０】

【化５１】

【化５２】

【化５３】

【００８１】

【化５４】

【化５５】

【化５６】

【化５７】

【化５８】

【化５９】

【化６０】

【００８２】

【化６１】

【化６２】

【化６３】

【化６４】

【化６５】

【化６６】

【化６７】

【化６８】

【化６９】

【００８３】

【化７０】

【化７１】

【化７２】

【化７３】

【化７４】

【化７５】

【化７６】

【化７７】

【化７８】

【化７９】

【００８４】

【化８０】

【化８１】

【化８２】

【化８３】

【化８４】

【化８５】

【化８６】

【化８７】

【化８８】

【化８９】

【００８５】

【化９０】

【化９１】

【化９２】

【化９３】

【化９４】

【化９５】

【化９６】

【化９７】

【化９８】

【化９９】

【００８６】

【化１００】

【化１０１】

【化１０２】

【化１０３】

【化１０４】

【化１０５】

【化１０６】

【化１０７】

【化１０８】

【化１０９】

【００８７】

【化１１０】

【化１１１】

【化１１２】

【化１１３】

【化１１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】　　プライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ５を用い
て選択プラスミドを増幅させた場合の結果を示す、電気
泳動後のゲルの写真の模式図である（ＨＰＶ６はレーン
１に、ＨＰＶ１１はレーン２に、ＨＰＶ１６はレーン３
に、ＨＰＶ１８はレーン４に、ＨＰＶ３１はレーン５に
、ＨＰＶ３３はレーン６に、ＨＰＶ６１はレーン７に、
分子量標準はレーン８にそれぞれ示す）。

【図２】　　プライマーＰＣＲ１、ＰＣＲ２、ＰＣＲ３
、ＰＣＲ４およびＰＣＲ５を用いてプラスミドｐ６５．
１６．８（ＨＰＶ１６）を増幅させた場合の結果を示す
、電気泳動後のゲルの写真の模式図である。

【図３】　　増幅ＰＣＲ生成物を得るためにＰＣＲ１４
およびＰＣＲ１５をＩＷＤＯとともに用いた場合の臭化
エチジウム染色ゲルの写真の模式図である。

【図４】　　ＰＣＲ１Ａ、ＰＣＲ１Ａ’、ＰＣＲ１Ｂお
よびＰＣＲ１Ｂ’を用いてプラスミドｐ６５．１６．８
を２つの異なるプラスミド濃度にて増幅させた場合の結
果を示すオートラジオグラムの写真の模式図である。

【図５】　　ＬＣＲプライマーＬＣＲ１Ａ、ＬＣＲ１Ａ
’、ＬＣＲ１ＢおよびＬＣＲ１Ｂ’をフルオレセインと
ともに、ビオチンとともにまたはシグナル生成化合物な
しで用いた場合のニトロセルロースストリップの写真の
模式図である。

【図６】　　ＬＣＲ２Ａ、ＬＣＲ２Ａ’、ＬＣＲ２Ｂお
よびＬＣＲ２Ｂ’とｐＳＰ６５．１１．５との反応から
得られたＬＣＲ生成物の量を示す写真の模式図である。

【図７】　　ＬＣＲ３Ａ、ＬＣＲ３Ａ’、ＬＣＲ３Ｂお
よびＬＣＲ３Ｂ’とｐＳＰ１６．８との反応から得られ
たＬＣＲ生成物の量を示す写真の模式図である。

【図８】　　ＬＣＲ４Ａ、ＬＣＲ４Ａ’、ＬＣＲ４Ｂお
よびＬＣＲ４Ｂ’とｐＧ３Ｇ３ＨＰＶ１８Ｈ（−）との
反応から得られたＬＣＲ生成物の量を示すグラフである
。

【図９】　　ＬＣＲ５Ａ、ＬＣＲ５Ａ’、ＬＣＲ５Ｂお
よびＬＣＲ５Ｂ’を用い、１０７分子の選択した目的配
列上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４
−メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウント
／秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロット
してある。

【図１０】　　ＬＣＲ６Ａ、ＬＣＲ６Ａ’、ＬＣＲ６Ｂ
およびＬＣＲ６Ｂ’を用い、１０７分子の選択した目的
配列上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウン
ト／秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロッ
トしてある。

【図１１】　　ＬＣＲ７Ａ、ＬＣＲ７Ａ’、ＬＣＲ７Ｂ
およびＬＣＲ７Ｂ’を用い、１０７分子の選択した目的
配列上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウン
ト／秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロッ
トしてある。

【図１２】　　ＬＣＲ８Ａ、ＬＣＲ８Ａ’、ＬＣＲ８Ｂ
およびＬＣＲ８Ｂ’を用い、１０７分子の選択した目的
配列上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウン
ト／秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロッ
トしてある。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　４つのオリゴヌクレオチドプローブの
セットからなり、該プローブのセットが下記オリゴヌク
レオチドのセットよりなる群から選ばれたものである、
試料中に存在するヒトパピローマウイルスのＤＮＡを増
幅させるためのＬＣＲに使用するのに有用な組成物。【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】【化６】【化７】および【化８】
【請求項２】　　試料中に存在するヒトパピローマウイ
ルス１１型のＤＮＡを増幅させるためのものであり、該
４つのオリゴヌクレオチドプローブのセットがＬＣＲ２
（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．６３、６４、６５および６６）
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】　　試料中に存在するヒトパピローマウイ
ルス１６型のＤＮＡを増幅させるためのものであり、該
４つのオリゴヌクレオチドプローブのセットが、ＬＣＲ
１（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５９、６０、６１および６２
）、ＬＣＲ３（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ．６７、６８、６９お
よび７０）、ＬＣＲ５（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．８１、８
２、８３および８４）およびＬＣＲ８（ＳＥＱ　ＩＤ　
Ｎｏ．９３、９４、９５および９６）よりなる群から選
ばれたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】　　試料中に存在するヒトパピローマウイ
ルス１８型のＤＮＡを増幅させるためのものであり、該
４つのオリゴヌクレオチドプローブのセットが、ＬＣＲ
４（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．７１、７２、７３および７４
）、ＬＣＲ６（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ．８５、８６、８７お
よび８８）およびＬＣＲ７（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．８９
、９０、９１および９２）よりなる群から選ばれたもの
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】　　請求項１から４のいずれかに記載の組
成物およびリガーゼからなることを特徴とする、試料中
のヒトパピローマウイルスＤＮＡの存在を検出するため
のキット。
【請求項６】　　該リガーゼが熱安定性のものである、
請求項５に記載のキット。
【請求項７】　　試料中に存在するヒトパピローマウイ
ルスＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに使用するのに有
用な組成物であって、該ヒトパピローマウイルスＤＮＡ
のアンチセンス鎖とハイブリダイズすることができ、長
さが約１０〜約３０ヌクレオチドであり、下記配列より
なる群から選ばれた配列を有するセンス方向の第一核酸
プライマー；【化９】および、該ヒトパピローマウイルスＤＮＡのセンス鎖と
ハイブリダイズすることができ、長さが約１０〜約３０
ヌクレオチドであり、下記配列よりなる群から選ばれた
配列を有するアンチセンス方向の第二核酸プライマー；
【化１０】からなり、該第一核酸プライマーおよび該第二核酸プラ
イマーは、それぞれのアンチセンス鎖およびセンス鎖へ
のハイブリダイズにおいて、伸長方向においてそれぞれ
の３’末端が重複せず、それぞれの５’末端が３’末端
よりも離れて位置するような仕方でハイブリダイズする
、ことを特徴とする組成物。
【請求項８】　　該第一プライマーおよび該第二プライ
マーが、下記オリゴヌクレオチド配列のペアよりなる群
から選ばれたものである、請求項７に記載の組成物；Ｓ
ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１と４、１と５、１と１０、１と１
７、１と３１、２と４、２と５、２と１０、２と１７、
２と３１、３と４、３と５、３と１０、３と１７、３と
３１、６と４、６と５、６と１７、６と２４、６と３１
、７と４、７と５、７と１７、７と２４、７と３１、９
と４、９と５、９と１０、９と１７、９と２４、９と３
１、１６と４、１６と５、１６と１７、１６と２４、１
６と３１、２３と４、２３と５、２３と１０、２３と２
４、２３と３１、３０と１０、３０と１７、３０と３１
、５９と６２、６３と６６、６７と７０、７１と７４、
８１と８４、８５と８８、８９と９２、および９３と９
６。
【請求項９】　　請求項７または８に記載の組成物およ
びポリメラーゼからなることを特徴とする、試料中のヒ
トパピローマウイルスＤＮＡの存在の検出用キット。
【請求項１０】　　該ポリメラーゼが熱安定性のもので
ある請求項９に記載のキット。
【請求項１１】　　長さが約１０〜約６０ヌクレオチド
であり、下記配列：【化１１】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス６型、１１
型、１６型、１８型および３３型とハイブリダイズさせ
るための共通オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】　　さらにヒトパピローマウイルス３１
型および６１型とハイブリダイズすることができ、下記
配列：【化１２】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
、請求項１１に記載の共通オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】　　下記配列：【化１３】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス６型の存在
を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】　　下記配列：【化１４】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス１１型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】　　下記配列：【化１５】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス１６型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】　　下記配列：【化１６】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス１８型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】　　下記配列：【化１７】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス３３型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】　　長さが約１０〜約６０ヌクレオチド
であり、下記配列：【化１８】（式中、Ｎは非特定ヌクレオチドを示す）およびその相
補体よりなる群から選ばれた配列を有することを特徴と
する、ヒトパピローマウイルス６型、１１型、１６型、
１８型および３３型とハイブリダイズさせるための共通
オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】　　請求項１８に記載のオリゴヌクレオ
チドの少なくとも１種を検出用に標識したものと、該オ
リゴヌクレオチドを検出するための手段とからなること
を特徴とする、ヒトパピローマウイルスの検出用キット
。
【請求項２０】　　ポリメラーゼおよびリガーゼから選
ばれた、試料ＤＮＡを増幅させるための酵素をさらに含
む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
８に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成し
たシグナルを検出することによりヒトパピローマウイル
スの存在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパ
ピローマウイルスの存在の決定方法。
【請求項２２】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項２１に記載の方法。
【請求項２３】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
１に記載の共通オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を
検出可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に
結合させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生
成したシグナルを検出することによりヒトパピローマウ
イルスの存在を決定することを特徴とする、試料中のヒ
トパピローマウイルスの存在の決定方法。
【請求項２５】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項２４に記載の方法。
【請求項２６】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
３に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成し
たシグナルを検出することによりヒトパピローマウイル
ス６型の存在を決定することを特徴とする、試料中のヒ
トパピローマウイルスの存在の決定方法。
【請求項２８】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項２７に記載の方法。
【請求項２９】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
４に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成したシグナルを検出することによりヒトパピ
ローマウイルスの存在を決定することを特徴とする、試
料中のヒトパピローマウイルス１１型の存在の決定方法
。
【請求項３１】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項３０に記載の方法。
【請求項３２】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
５に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成したシグナルを検出することによりヒトパピ
ローマウイルスの存在を決定することを特徴とする、試
料中のヒトパピローマウイルス１６型の存在の決定方法
。
【請求項３４】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項３３に記載の方法。
【請求項３５】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
６に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成したシグナルを検出することによりヒトパピ
ローマウイルスの存在を決定することを特徴とする、試
料中のヒトパピローマウイルス１８型の存在の決定方法
。
【請求項３７】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項３６に記載の方法。
【請求項３８】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】　　（ａ）試料中のＤＮＡを、請求項１
７に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出
可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合
させたものとハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）生成したシグナルを検出することによりヒトパピ
ローマウイルスの存在を決定することを特徴とする、試
料中のヒトパピローマウイルス３３型の存在の決定方法
。
【請求項４０】　　該ハイブリダイズ工程の前または該
ハイブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請
求項３９に記載の方法。
【請求項４１】　　該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲで
ある、請求項４０に記載の方法。