DE69121821T2

DE69121821T2 - Nukleotid-Sequenzen nützlich als typenspezifische Sonden, PCR Primers und LCR Sonden zur Amplifikation und zum Nachweis von humanem Papillomavirus, sowie dazu verwendete Kits und Verfahren

Info

Publication number: DE69121821T2
Application number: DE69121821T
Authority: DE
Inventors: Stanley R Bouma; Jeffrey L Joseph; Thomas G Laffler; Ronald L Marshall
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: JP2003144182A; KR920006510A; EP0477972A3; CA2052413C; JPH04281791A; TW205568B; DK0477972T3; EP0477972B1; JP2001231587A; EP0477972A2; AU8482691A; ES2094178T3; DE69121821D1; CA2052413A1; ATE142276T1; GR3021724T3; AU650055B2

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein den humanen Papillomavirus, und insbesondere betrifft sie Nukleotid- Sequenzen kurzer Stränge des humanen Papillomavirus, die vervielfacht und/oder verwendet werden können, um die Anwesenheit von humanem Papillomavirusprodukten in einer Testprobe zu bestimmen, und von denen einige ebenfalls vervielfältigt und/oder verwendet werden können, um den spezifischen Typ des humanen Papillomavirus der Typen 16 und 18, der in der Testprobe vorhanden ist, zu bestimmen.
Der humanen Papillomavirus (HPV) ist als venerisch übertragene Krankheit des Anogenitaltraktes anerkannt, die oft mit der Pathogenese des cervicalen Krebses und dessen Vorläuferlesionen im Zusammenhang steht. Es sind mehr als 56 Typen des HPV charakterisiert worden. Von diesen infizieren wenigstens 21 Typen den Anogenitaltrakt. L. Gregoire et al., J. Clin. Micro 27 (12):2660-2665(1989). Diese mucosotropischen Viren stehen am häufigsten mit gutartiger Condylomie oder mit latenten Infektionen im Zusammenhang. Jedoch kann die Anwesenheit des HPV in premalignen Lesionen und invasiven Krebsgeschwüren, insbesondere der Cervix, das onkogene Potential dieser Viren ausdrücken. Siehe zum Beispiel P. M. Howley, in Important Advances in Oncology, D. T. DeVita, Jr. et al., eds. J. B. Lippincott, Philadelphia, PA (1987) auf den Seiten 55-73.
Gewisse Typen des HPV, nämlich HPV-Typ 16 und 18 und in einem geringeren Ausmaß ebenfalls die Typen HPV 31, 33 und 35 werden in hohen Anteilen bei invasiven cervicalen Krebsgeschwüren und deren Metastasen aufgefunden. Jedoch werden viele HPV-Typen, die den Anogenitaltrakt infizieren, wie etwa die HPV-Typen 6 und 11 am geläufigsten in gutartigen Condylomen gefunden und nur selten in invasiven Krebsgeschwüren. Das HPV, das im Anogenitaltrakt nachgewiesen kann, kann grob als niedrig- Risiko-Papillomavirus (HPV-Typen 6 und 11), Papillomavirus mittleren Risikos (HPV-Typen 31, 33 und 35), oder hoch-Risiko- Papillomavirus (HPV-Typen 16 und 18), klassifiziert werden, beruhend auf dem Zusammenhang des besonderen HPV-Typus mit der Bösartigkeit. A. T. Lorincz et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 79:671 (1987). Daher kann der Nachweis der Anwesenheit von HPV und die Bestimmung des spezifischen Types des HPV ein diagnostisches und prognostisches Werkzeug liefern, das für die Bestimmung der klinischen Signifikanz, die mit gewissen HPV- Typen auftritt, nützlich ist. Der frühe Nachweise des HPV mittels empfindlicher und spezifischer Reagenzien und Verfahren kann ebenfalls eine frühere therapeutische Behandlung und Beratung zur Verfügung stellen.
Es besteht daher ein Bedarf an genauen und zuverlässigen Verfahren, um HPV in klinischen Proben zu identifizieren und den Typus zu bestimmen. Jedoch sind die bekannten polyklonalen Antiseren, die mittels Immunisierung von Tieren mit zerstückelten Virionen hergestellt werden, nur in der Lage, die HPV-Antigene in ungefähr 30-70% der Hautabstriche und mukosen Abstriche nachzuweisen. Darüber hinaus sind die Antiseren weitgehend kreuzreaktiv. Die erhältlichen immunologischen Tests weisen zwei Hauptnachteile auf. Zunächst sind nur gut differenzierte Zellen offensichtlich in der Lage, das virale Antigen zu exprimieren. HPV-infizierte Gewebe, die höhere Ausmaße an Neoplasie, wie etwa Carcinome in situ aufweisen, enthalten selten HPV-Antigen. Daher ist die Menge des nachweisbaren Virus in dem getesteten Gewebe umso geringer, je weiter die Entwicklung der Bösartigkeit fortgeschritten ist. Zweitens sind diese immunologischen Tests nicht in der Lage, spezifische virale Typen zu identifizieren.
Es ist bekannt, daß die Papillomaviren gemeinsame Aminosäuresequenzen in den Hauptcapsidproteinen aufweisen. Siehe zum Beispiel, C. C. Baker, in The Papovaviridae (Band 2), P. M. Howley and N. P. Salzman, Ausgabe Plenum Publ. Corp., New York (1987) auf den Seiten 321-385. Die DNAs dieses Virus können über Kreuz hybridisieren, was die homologen Sequenzen anzeigt. M. F. Law et al., J. Virol. 58:225-229 (1979). Daher sind molekulare Hybridisierungsverfahren als ein empfindlicheres und spezifischeres Mittel zum Nachweis und zur Differenzierung von HPV - DNA - RNA in klinischen Proben entwickelt worden. Siehe A. T. Lorinez Obstetrics and Gynecol. Clinics of N. America 14:451 (1987).
Die Sequenzen, die für die DNA und RNA des humanen Papillomavirus spezifisch sind, sind bekannt und sind veröffentlicht worden. Siehe zum Beispiel die PCT-Anmeldung Nr. WO 89/69940, veröffentlicht am 19. Oktober 1989, die PCT- Anmeldung Nr. WO 86/05816, veröffentlicht am 9. Oktober 1986, und die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 301 968, veröffentlicht am 1. Februar 1989.
Die molekularen Hybridisierungsverfahren, die zum Nachweis homologer DNA Sequenzen verwendet werden, sind empfindlich, und sie können hochgradig spezifisch sein, wenn sie mit Sonden verwendet werden, die an Nukleinsäuresequenzen binden, die für einen besonderen HPV-Typus einzigartig sind. Jedoch kann sich die Konzentration an gesamter viraler DNA in einer gegebenen klinischen Probe unterhalb der Empfindlichkeitsgrenze des Tests befinden. Zum Beispiel ist die Menge an viraler DNA bei dysplastischen cervicalen Lesionen mit zunehmender Dysplasie vermindert.
Um dieses Empfindlichkeitsproblem auszuschalten, können die viralen DNA-Sequenzen unter Verwendung von zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion (PCR), "polymerase chain reaction" oder der Ligasekettenreaktion (LCR), "ligase chain reaction" vervielfacht ("amplifiziert") werden. Die so erhaltenen Produkte können unter Anwendung herkömmlicher Hybridisierungsverfahren zur Identi-fikation von Virustypen, wie etwa dem Southern blotting, identifiziert werden. Siehe C. Oste, Biotechniques 6:163 (1988), K. B. Mullis, U. S. Patent Nr. 4 683 202 und EP-A- 320 308 (BioTechnica).
Sowohl die PCR als auch die LCR dienen der Vervielfachung der DNA, die in einer Testprobe vorhanden ist, bis hin zu nachweisbaren Pegeln. In der Praxis beträgt der Empfindlichkeitspegel ungefähr 50 bis 100 Kopien pro Probe. Das nächste am meisten empfindliche Verfahren ist das Dot-Blotting, das ungefähr 10 000 Moleküle nachzuweisen vermag, während das Southern Blotting zuverlässig üngefähr 100 000 Kopien der DNA pro Probe nachweist.
Daher kann eine geeignete Diagnose von HPV zwei Schritte benötigen. Bei einer Strategie wird die Anwesenheit eines klinisch relevanten Typs von HPV zunächst von einem gruppenspezifischen Primer nachgewiesen. Nachdem die Anwesenheit des HPV nachgewiesen worden ist, kann die Differenzierung zwischen den Typen durchgeführt werden, indem eine typenspezifische Sonde verwendet wird, die eine geringe Homologie zwischen den HPVs der Gruppe aufweist. Alternativ kann die Differenzierung durchgeführt werden, indem eine Mischung von typenspezifischen Sonden beim Ansatz verwendet wird, vorausgesetzt, daß diese Sonden unabhängig voneinander die DNA vervielfachen, und daß sie unabhängig nachgewiesen werden können. In der Vergangenheit, ist versucht worden, solche Ziele zu erreichen, indem spezifische Antikörper verwendet wurden. Im allgemeinen erlauben die Nukleinsäuresonden und Primer eine größere Unterscheidung zwischen den Subtypen, als es die Antikörper tun. Die Verwendung von auf DNA beruhenden Tests steigert sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität gegenüber auf Antikörper beruhenden Tests gemäß dem Stand der Technik.
Es wäre daher vorteilhaft, Oligonucleotidstränge von DNA zur Verfügung zu stellen, die vervielfacht werden und zum Nachweis der Anwesenheit von HPV, sofern HPV in einer Testprobe vorhanden ist, verwendet werden können. Es wäre ebenfalls vorteilhaft, kurze Oligonucleotidstränge von DNA zur Verfügung zu stellen, die vervielfacht werden können, und die zum Nachweis oder Anwesenheit, sofern dies zutreffend ist, von spezifischen Typen des HPV in der Testprobe verwendet werden können. Die kombinierte Verwendung von Oligonucleotidsträngen wäre vorteilhaft, um die spezifische und empfindliche in vitro-Diagnose der Anwesenheit und des spezifischen HPV-Typs, der in den Testproben vorhanden ist, zu erlauben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden Oligonukleotide aus ungefähr 10 bis ungefähr 60 Nukleotiden bereitgestellt die vervielfacht werden können, und die sowohl zum Nachweis spezifischer Sequenzen spezifischer Typen des humanen Papillomavirus oder von Konsensus-Regionen mit hoher Homologie unter den verschiedenen Typen verwendet werden können. Die Anwesenheit von HPV wird bestimmt, indem die Testprobe mit Sequenzen in Kontakt gebracht wird, die zum Nachweis der Anwesenheit, falls zutreffend, der HPV Typen 6, 11, 16, 18, 31, 33 und 61 zur Verfügung gestellt werden. Dies kann mit oder ohne vorhergehende Vervielfachung, durch zum Beispiel PCR oder LCR durchgeführt werden. Sowohl die Typ-spezifische als auch die Konsensus-Vervielfachung ist möglich. Es werden zwei Nukleotide zur Verfügung gestellt, wenn die Sequenz mittels PCR vervielfacht wird, und es werden vier Oligonukleotide bereitgestellt, wenn die Sequenz mittels LCR vervielfacht wird, in Übereinstimmung mit diesen bekannten Vervielfachungsverfahren. Nachdem die Anwesenheit von HPV nachgewiesen worden ist, kann der Typ des in der Probe befindlichen HPVs unter Verwendung von HPV-Typ-spezifischen Sonden bestimmt werden, und zwar durch nachfolgende Durchgänge von PCR oder LCR. Alternativ kann die Anwesenheit des Typ- spezifischen HPV bestimmt werden, indem die Testprobe direkt mit der Typ-spezifischen Nukleotidsequenz in Kontakt gebracht wird, die von der Erfindung zum Nachweis der HPV-Typen 16 und 18 zur Verfügung gestellt wird. Es werden ebenfalls Verfahren zur Verwendung der Oligonukleotide und der Kits zur Vervielfachung und zum Nachweis der Anwesenheit des humanen Papillomavirus zur Verfügung gestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Photographie eines Gels näch einer Elektrophorese, die die Ergebnisse zeigt, wenn die Primer PCR 1 und PCR 5 verwendet wurden, um ausgewählte Plasmide zu vervielfachen, wobei HPV 6 sich in Rasen 1 befindet, HPV 11 sich im Rasen 2 befindet, HPV 16 sich in Rasen 3 befindet, HPV 18 sich in Rasen 4 befindet, und HPV 31 sich in Rasen 5 befindet, HPV 33 sich in Rasen 6 befindet, HPV 61 sich in Rasen 7 befindet, und wobei sich die Molekulargewichtstandards in Rasen 8 befinden.
Fig. 2 ist eine Photographie eines Gels nach einer Elektrophorese, die die Ergebnisse zeigt, wenn die Primer PCR 1, PCR 2, PCR 3, PCR 4 und PCR 5 verwendet worden sind, um das Plasmid p65.16.8 (HPV 16) zu vervielfachen. PCR 1 und PCR 5 sind Primer im Sinne der Erfindung.
Fig. 3 ist eine Photographie des Ethidiumbromid-gefärbten Gels, worin PCR 14 und PCR 15 zusammen mit IWDO verwendet wurden, um vervielfachtes PCR-Produkt zu erhalten.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des ausgewählten Ziels erhalten wurde, unter Verwendung von LCR 5A, LCR 5A', LCR 5B und LCR 5B'. Die Reaktionsgeschwindigkeit von 4- Methyllumbelliferon ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt und gegen den Ziel-HPV-Typus aufgetragen.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die nach der Durchführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des ausgewählten Ziels erhalten wurde, unter Verwendung von LCR 6A LCR 6A', LCR 6B und LCR 6B'. Die Reaktionsgeschwindigkeit des 4- Methyllumbelliferons ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt und gegen den Ziel-HPV-Typus aufgetragen.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR mit 10&sup7; Molekülen des ausgewählten Ziels unter Verwendung von LCR 7A, LCR 7A', LCR 7B und LCR 7B' erhalten wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeit von 4- Methyllumbelliferon ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt und gegen den Ziel-HPV-Typus aufgetragen.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR mit 10&sup7; Molekülen des ausgewählten Ziels erhalten wurde, unter Verwendung von LCR 8A, LCR 8A', LCR 8B und LCR 8B'. Die Reaktionsgeschwindigkeit des 4- Methyllumbelliferons ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt und gegen den Ziel-HPV-Typus aufgetragen.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die geeignete Diagnose von HPV benötigt zwei Sätze von Bedingungen. Der erste ermöglicht den Nachweis aller relevanten Typen, und der zweite Satz erlaubt die Unterscheidung unter ihnen. In der Vergangenheit ist versucht worden, solche Ziele zu erreichen, indem spezifische Antikörper verwendet wurden. Im allgemeinen erlauben Nukleinsäuresonden und -primer eine größere Unterscheidung unter den Sübtypen, als es die Antikörper tun. Daher neigt die Verwendung von auf DNA-basierenden Tests dazu, sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität, verglichen mit auf Antikörpern beruhenden Tests, zu erhöhen.
Die U.S. Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 lehren ein Verfahren zur Vervielfachung von DNA-Sequenzen unter Verwendung der PCR. Dieses Verfahren ist heute ein Standardverfahren in vielen molekularbiologischen Laboratorien. Die Beispiele 1-3, die unten folgen, verwenden die Verfahren, die in diesen beiden Patenten gelehrt werden, und das Verfahren, wie es in der Packungsbeilage des handelsüblich erhältlichen Gene-Amp Kits beschrieben ist (Dokument Nr. 55635-6/89, Perkin-Elmer/Cetus, Emeryville, CA).
Bei der PCR werden zwei komplementäre Polynukleotidstränge vervielfacht, indem die Stränge mit zwei Oligonukleotidprimern so behandelt werden, daß ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nukleinsäurestrang komplementär ist. Die Primer werden so ausgewählt, daß das Verlängerungsprodukt eines Primers eine Schablone für die Synthese eines Verlängerungspröduktes des anderen Primers bildet, sobald das Verlängerungsprodukt des einen Primers von der Schablone abgetrennt wird. Es wird eine Kettenreaktion dadurch aufrechterhalten, daß ein Zyklus durchgeführt wird, in welchem die Primer-Verlängerungsprodukte von ihren Schablonen abdenaturiert werden, in welchem die erzeugten Einzelstrangmoleküle mit den gleichen Primern unter erneuter Verschmelzung ("re-annealing) behandelt werden, und in welchem die Primer weitere Verlängerungsprodukte ausbilden können. Der Zyklus wird so oft wiederholt, bis die Anzahl der Zielnukleinsäuresegmente bis zu einer Konzentration hin erhöht ist, bei der sie nachgewiesen werden können.
Die vervielfachten Zielsequenzen können mittels jedwedem von vielen bekannten Verfahren nachgewiesen werden, z. B. indem die doppelsträngigen Produkte, die sich durch die PCR gebildet haben, denaturiert werden, und indem diese Produkte mit einer oder mehreren Reportersonden behandelt werden, die mit den Verlängerungsprodukten hybridisieren. Die Reportersonde weist eine nachweisbare Markierung auf, und sie wird üblicherweise im Überschuß zugesetzt. Die unhybridisierte Reportersonde muß daher von der hybridisierten Reportersonde abgetrennt werden, was einen Abtrennungsschritt umfaßt. Bei einem anderen Verfahren zum Nachweis der Verlängerungsprodukte ohne die Reportersonde und ohne einen Abtrennungsschritt werden die Verlängerungsprodukte mittels Gelen nachgewiesen, die mit Ethidiumbromid gefärbt werden. Die Diagnose kann bestätigt werden, indem die DNA auf Nitrozellulose überführt wird, und in dem mit einer Sonde getestet wird, die für den HPV-Typus spezifisch ist, von dem angenommen wird, daß er in der Probe vorhanden ist.
Alternativ kann man bei der PCR Vorteile aus den bekannten Restriktionsstellen auf der HPV-DNA ziehen, um zu beweisen, daß die vervielfachte DNA die erwartete Sequenz enthält, indem man das/die Spaltungsmuster untersucht, die mit einer oder mehreren Restriktionsindunukleasen erhalten werden. Die Überprüfung der Authentizität der vervielfachten Sequenz kann aus zwei Gründen notwendig sein: (1) um sicherzustellen, daß die Sequenzen, die zu den vervielfachenden Primern komplementär sind, nicht zufällig in der zellulären DNA vorhanden sind, die keine HPV-DNA enthält und (2) um den Typus des HPV zu identifizieren, der in der Probe vorhanden ist. Wenn die Sequenzen, die für die Vervielfachung ausgewählt worden sind, den unterschiedlichen HPV-Typen gemeinsam sind, steht das Auffinden eines vervielfachten Produktes nicht für einen besonderen HPV-Typus. Es sollte ebenfalls möglich sein, die Größe des vervielfachten Produktes, beruhend auf den Bindungspositionen der beiden Primer, vorherzusagen. Daher kann man vernünftiger Weise sicher sein, daß HPV vorhanden ist, wenn man dieses Produkt findet. Jedoch können zwei unterschiedliche Typen von HPV das gleiche Produkt oder Produkte unterschiedlicher Größe ergeben. Daher sollte die Hybridisierung angewendet werden, um die Identität der vervielfachten Sequenz zu bestätigen, bis das Vertrauen gerechtfertigt ist, daß die Interpretation der Ergebnisse zuverlässig ist. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß das PCR-Verfahren nur engverwandte oder Typ-spezifische Sequenzen in der Abwesenheit von hochhomologen Primern identifiziert, da nur ein kleiner Anteil des Genoms untersucht wird.
Ein anderes besonders nützliches Nachweisverfahren ist in der EP-A-357 011 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein unterschiedliches Reportermolekül, z. B. ein Hapten, an jeden Primer angehängt. Nach der Vervielfachung, aber vor Denaturierung, können die Duplexe nachgewiesen werden, in dem ein Hapten (Hapten 1) mit einer festen Phase, die mit anti- Hapten 1 beschichtet ist, "eingefangen" wird. Der abgetrennte Komplex kann mit einem Konjugat aus Markierung und anti-Hapten 2 nachgewiesen werden, und die Markierung, die an die feste Phase gebunden ist, kann gemessen werden.
Die Ligasekettenreaktion (LCR), "Ligase chain reaction" vervielfacht Abschnitte der DNA, indem der DNA-Abschnitt kopiert wird, und indem die Kopien dieses DNA-Abschnittes viele Male überkopiert werden. Dieses Verfahren ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 320 308 beschrieben, die am 14. Juni 1989 veröffentlicht wurde, die hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird. Bei diesem Verfahren werden zwei Sonden (z. B. A und B), die zu unmittelbar aneinander angrenzenden Bereichen einer Zielsequenz komplementär sind, hybridisiert und ligiert. Diese ligierte Sonde wird dann von dem Ziel abdenaturiert, wonach sie mit zwei zusätzlichen Sonden hybridisiert wird, (A' und B'), deren Richtung zu derjenigen der anfänglichen Sonden A und B entgegengerichtet ist. Die Sekundärsonden werden dann ihrerseits ligiert. Die nachfolgenden Zyklen von Denaturierung/Hybridisierung/Ligation sorgen für die Bildung von Sonden doppelter Länge sowohl in Richtung (+) als auch in Gegenrichtung (-).
Bei der LCR wird die Nukleinsäure der Probe entweder als einzelsträngige DNA oder als doppelsträngige DNA zur Verfügung gestellt, die denaturiert wird, um die Stränge zu trennen. Es werden vier Sonden verwendet: die ersten beiden Sonden (A und B) sind die sogenannten, primären Sonden, und die zweiten beiden Sonden (A' und B') sind die sogenannten sekundären Sonden. Die erste Sonde (A) ist ein einzelner Strang, der an einen ersten Abschnitt des Primärstranges der Zielnukleotidsequenz zu hybridisieren vermag. Die zweite Sonde (B) vermag an ein zweites Segment des Primärstranges der Zielnukleotidsequenz zu hybridisieren. Das 5'-Ende des ersten Abschnittes des, Primärstranges auf dem Ziel befindet sich relativ zu dem 3'-Ende des zweiten Abschnittes des Primärstranges des Ziels in einer Position, die das Verbinden des 3'-Endes der ersten Sonde mit dem 5'-Ende der zweiten Sonde erlaubt, wenn die Sonden an den Primärstrang der Zielnukleotidsequenz hybridisiert sind. Die dritte Sonde (A') vermag an die erste Sonde zu hybridisieren, und die vierte Sonde (B') vermag an die zweite Sonde (B) zu hybridisieren. Die hybridisierten Sonden werden ligiert, wobei sich reorganisierte, fusionierte Sondensequenzen ausbilden. Dann wird die DNA in der Probe denaturiert, um die ligierten Sonden von der Proben-DNA abzutrennen. Es werden aufeinander abfolgende Zyklen durchgeführt, bei denen die ligierten Sonden und die Ziel-DNA den oben beschriebenen Vorgang eingehen, um die Menge an nachweisbarer DNA in der Probe zuerhöhen. Die Anzahl der Zyklen, die durchgeführt werden, hängt von der verwendeten Sequenz und von der erforderlichen Empfindlichkeit des Tests ab. Üblicherweise kann der Zyklus von 15 bis 60 mal wiederholt werden. Wenigstens eine der Sonden kann an eine signalerzeugende Verbindung konjugiert sein.
Wenn die vier Sonden an geeignete Bindungsglieder konjugiert sind, kann der Nachweis des vervielfachten Produktes unter Anwendung von manuellen Standardmethoden oder von automatisierten Immunoassayverfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren umfassen z. B. die Immunochromatographie, ELISA, EIA und MEIA. Die Hybridisierung kann ebenfalls gemäß Standardverfahren wie den Dot-, Slot- oder Replica-Blotverfahren vollzogen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Sequenzen können mit einer geeigneten signalerzeugenden Verbindung (Markierung) markiert werden, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals in der Lage ist, das mittels externen Mitteln nachweisbar ist. Die verschiedenen signalerzeugenden Verbindungen, die in Betracht gezogen werden, umfassen Chromogene, Katalysatoren, wie etwa Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie etwa Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Elemente, wie etwa ³²P, und andere Markierungen, die dem Fachmann bekannt sind. Die Auswahl einer besonderen Markierung ist an sich nicht kritisch, aber die Markierung muß, ein Signal erzeugen, entweder aus sich selbst heraus, oder im Zusammenwirken mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen. Es kann eine Vielzahl von verschiedenen Indikatorreagenzien aus der Markierung und spezifischen Bindungsgliedern gebildet werden. Sowohl die Markierung als auch ein spezifisches Bindungsglied können geändert werden. Beispiele für spezifische Bindungsglieder, die als ein Bestandteil des Indikatorreagenzes verwendet werden können umfassen Antikörper, sowohl monoklonale als auch poloklonale und Fragmente von diesen, Avidin oder Bioton, Biotin und anti-Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotidsequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptormolekül, ein Enzymkocaktor oder ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym, wie auch beliebige antigenische Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon.
Die Testprobe kann jedes biologische Material sein, von dem vermutet wird, daß es HPV enthält. Daher kann die Testprobe menschliches Körpergewebe sein, oder eine Testprobe, die Zellen enthält, von denen vermutet wird, daß sie HPV enthalten.
Die Erfindung wird nun mittels Beispielen beschrieben, die die Erfindung beschreiben, nicht aber den Erfindungsgedanken und den Schutzumfang der Erfindung einschränken sollen.
Die folgenden Ausdrücke, die in den Beispielen verwendet werden, sind Warenzeichen, Handelsbezeichnungen oder chemische Abkürzung, die wie folgt angegeben werden:
TRIS - chemische Abkürzung für [tris(Hydroxy methyl)aminomethan], das als Puffer verwendet wird.
EDTA - chemische Abkürzung für Ethylendiamintetraessigsäure, ein Chelator.
FITC - chemische Abkürzung für Fluoresceinisothiocyanat, ein fluorescentes Haptenderivat.
NHS-Ester - chemische Abkürzung für N-Hydroxysuccinimidester.
MES - chemische Abkürzung für [2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure], ein Puffer.
TWEEN -20 - Warenzeichen von Atlas Chemical für Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, ein Detergenz.
BIS-TRIS - chemische Abkürzung für [bis-(2-Hydroxyethyl)amino]tris-(hydroxymethyl)methan, ein Puffer.
TRITON X-100 - Warenzeichen von Rohm & Haas für Nonaethylenglykoloktylphenolether, ein Detergenz.
IMX - Warenzeichen der Abbott Laboratories für ein automatisiertes Instrument zur Durchführung eines Mikropartikel- Enzym-Immunoassays (MEIA).

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Die PCR wurde durchgeführt, indem im wesentlichen gemäß der Packungsbeilage des handel=süblich erhältlichen Gene-Amp Kits (Dokument Nr. 55635-6/89, erhältich von Perkin-Elmer/Cetus, Emeryville, CA) vorgegangen wurde. Die folgenden Reagenzien wurden in einem 0,5ml-Polypropylen Reagenzglas vermischt und zur Durchführung einer PCR verwendet:
Nach dem Mischen wurde die Reaktionsmischung mit 100µl Mineralöl überschichtet. Das Röhrchen wurde dann in ein Instrument eingebracht, das zur Inkubation bei mehreren Temperaturen befähigt war, und dann wurde es 30 oder 40 Zyklen eines programmierten Temperaturwechsels unterzogen. Der besondere Temperaturwechselzyklus, der verwendet wurde, und das verwendete Instrument änderten mit dem Experiment, und die näheren Einzelheiten sind in den Beschreibungen der Figuren in Beispiel 3 aufgeführt.

BEISPIEL 2

Gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde von den folgenden Sequenzen festgestellt, daß sie Abschnitte des Papillomavirus der Typen 6, 11, 16, 18, 31, 33 und 61 unter Verwendung der PCR vervielfachen.
Die Sequenz IWDO ist von einer Sequenz abgeleitet, die in der Internationalen Anmeldung mit der Nummer PCT/U586/00629 (WO 86/05816) offenbart ist.
Die Tabelle, 1 zeigt die Sequenzen,= und sie zeigt, wo diese an die verschiedenen Typen passen ("map"). TABELLE 1 SEQUENZEN, DIE ALS SONDEN ODER ALS PCR-PRIMER VERWENDET WERDEN KÖNNEN
Beachte: PCR 2, PCR 3 und PCR 4 sind keine Sonden oder PCR- Primer gemäß der Erfindung.

BEISPIEL 3

Linearisierte Plasmide, die Einschübe des Papillomavirus von voller Länge in pGEM3 enthielten, wurden als Ziele verwendet. Diese waren pHPV6.1 (HFV6) pSP65.11.5 (HPV11), p65.16.8 (HPV16), pHPV18H (HPV18), pG3.HPV31 (HPV31), pLNK322.HPV33 (HPV33) und pBR322.HPV61 (HPV61). Ein Programmable Cyclic Reactor (von der Ericomp, San Diego, erhältlich) wurde als Inkubationsinstrument verwendet. Nach dem PCR-Verfahren, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, wurden 10µl-Anteile mittels Elektrophorese durch Agarose (enthaltend ein 5:3 Verhältnis von NuSieve :SeaKem GTG, erhältlich von der FMC Corp., Rockland, ME in einem Puffer, der 0.089M TRIS, 0.089M Borat, 2mM EDTA und 0.5ppt Ethidiumbromid enthielt, analysiert.
FIG. 1 ist eine Photographie eines Ethidiumbromidgefärbten 1,2%igen Agarosegels, die die Ergebnisse zeigt, die unter Verwendung von 63,9 Einheiten/ml DNA-Polymerase im DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer/CETUS, Emeryville, CA) erhalten wurden. Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 94º C erhitzt, dann wurden sie 40 Zyklen eines Temperaturprogramms von je 1 Minute bei 94º C, je 2 Minuten bei 400 C und je 1,5 Minuten bei 72º C unterzogen. Die PCR-Primer, die in diesem Fall verwendet wurden, waren PCR 1 und PCR 5 aus Beispiel 2. Die Untersuchung des Gels nach der Elektrophorese zeigte Banden an den erwarteten Stellen, d. h. bei 292BP. Rasen 1, HPV6; Rasen 2, HPV11; Rasen 3, HPV16; Rasen 4, HPV18; Rasen 5, HPV31; Rasen 6, HPV33; Rasen 7, HPV61; Rasen 8, vereinigte humane placentäre DNA (von der vermutet wurde, daß sie mit HPV infiziert war); Rasen 9, Molekulargewichtsmarkierungen - Hae III Aufschluß von φX 174.
FIG. 2 ist eine Photographie eines Ethidiumbromidgefärbten 4%igen Agarosegels, das die Ergebnisse zeigt, die unter Verwendung von 25 Einheiten/ml DNA-Polymerase in dem Programmable Cycler Reactor (Ericomp, San Diego, CA) erhalten wurden. Die Proben wurden in diesem Fall 30 Zyklen folgenden Temperaturprogramms unterworfen: 50º C eine (1) Minute lang, 72º C zwei (2) Minuten lang, und 95º C eine (1) Minute lang. In diesem Fall wurden die Primer PCR 1, PCR 2, PCR 3, PCR 4 und PCR 5 von Beispiel 2 verwendet, um das Plasmid p65.16.8(HPV16) zu vervielfachen. Die Untersuchung des Gels nach Figur 2 zeigte Banden in den erwarteten Positionen, d. h. PCR 1 und PCR 4, 235BP, Rasen 2; PCR 1 und PCR 5, 267BP, Rasen 4; PCR 2 und PCR 4, 254BP, Rasen 6; PCR 2 und PCR 5, 286BP, Rasen 8; PCR 3 und PCR 4, 174BP, Rasen 10; PCR 3 und PCR 5, 206BP, Rasen 12; Molekulargewichtsmarkierung, 123, 246, 369, 492,...BP-Leiter, Rasen 1. Siehe Fußnote zur Tabelle 1.
FIG. 3 ist eine Photographie eines Ethidiumbromidgefärbten 1,2%igen Agarosegels, das die Ergebnisse unter Anwendung derselben Bedingungen wie in FIG. 1 zeigt. In diesem Falle wurden PCR 14 und PCR, 15 als die Primer zusammen mit IWDO verwendet. Die erwartete Größe für das vervielfachte PCR-Produkt von PCR 14 und IWDO beträg 437BP für alle getesteten HPV-Typen. Die erwartete Größe des Produktes von PCR 15 und IWDO beträgt 988P. Die Produkte dieser Größen treten in den Gelen auf, was bestätigt, daß PCR 14 und PCR 15, wenn sie zusammen mit IWDO verwendet werden, HPV-DNA der Typen 6, 11, 16, 18, 31, 33 und 61 vervielfachen. Rasen 1, Molekulargewichtsmarkierung (Hae III- Aufschluß von FX 174); PCR 14 + IWDO, Rasen 2-9; Rasen 2, HPV6; Rasen 3, HPV11; Rasen 4, HPV16; Rasen 5, HPV18; Rasen 6, HPV31; Rasen 7, HPV33; Rasen 8, HPV61; Rasen 9, humane placentäre DNA von der vermutet wurde, daß sie mit HPV infiziert war; PCR 15 + IWDO, Rasen 10-17; Rasen 10, HPV6; Rasen 11, HPV11; Rasen 12, HPV16; Rasen 13, HPV18; Rasen 14, HPV31; Rasen 15, HPV33; Rasen 16, HPV61; Rasen 17, humane placentäre DNA, von der vermutet wurde, daß sie mit HPV infiziert war; Rasen 18, Molekulargewichtsmarkierung (Hae III-Aufschluß von FX 174 und Hind III-Aufschluß von 1-DNA).

BEISPIEL 4

Die folgenden Reagenzien wurden in einem 0,5ml- Polypropylenteströhrchen wie folgt für die Ligasekettenreaktion (LCR) vermischt:
Diese Reaktionsmischung wurde mit 30µl Mineralöl überschichtet. Das Röhrchen wurde in ein Gerät eingesetzt, das zur Inkubation bei verschiedenen Temperaturen befähigt ist (z. B. thermal cycler von den Coy Laboratory Products (Ann Arbor, MI) oder den Programmable Cycler Reactor (erhältlich von Ericomp, San Diego, CA) und dann wurden sie mehreren Zyklen eines programmierten Temperaturwechsels unterzogen. Jeder Zyklus umfaßte eine Inkubation bei 50º C für eine Minute und bei 85º C für eine Minute.

BEISPIEL 5

Das folgende Verfahren wurde angewendet, als die Ligasekettenreaktion (LCR) durchgeführt wurde, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 320 308 A2 beschrieben und veröffentlicht ist. Die Reagenzien aus Beispiel 4 wurden in dem Verfahren wie folgt verwendet: Zwei Sonden (A und B), die zu den unmittelbar angrenzenden Bereichen einer Zielsequenz komplementär waren, wurden hybridisiert und ligiert. Diese ligierte Sonde wurde von dem Ziel abdenaturiert, und sie wurde mit zwei zusätzlichen Sonden (A' und B') die gegenüber den anfänglichen Sonden (A und B) entgegengesetzt ausgerichtet waren, hybridisiert. Die sekundären Sonden wurden dann ligiert. Aufeinander abfolgende Zyklen von Denaturierung/Hybridisierung/Ligation sorgten für die Bildung von Sonden doppelter Länge, sowohl in + (Plus-) als auch in - (Minus-)Richtung.

BEISPIEL 8

Von den folgenden Sequenzen wurde ermittelt, daß sie für einen Anteil der E6-Region des HPV Typ 16 spezifisch sind:

BEISPIEL 9

Basen-denaturierte Plasmide, die Einschübe des Papillomavirus von voller Länge in pGEM3 enthielten, wurden als Ziele verwendet. Diese Plasmide waren, pG3HPV6(+) (HPV6), pSP65.11 .5 (HPV11), pSP65.16.8 (HPV16), p63HPV18H(-) (HPV18), p63:HPV31 (HPV31), pLNK322:HPV33 (HPV33), pBR322:HPV35 (HPV35), pUC19:HPV52 (HPV52), pLNK322:HPV58 (HPV58), pUC9:HPV59 (HPV59) und pBR322:HPV61 (HPV61). Alle Nukleotide, die als Sonden von Beispiel 8 verwendet wurden, wiesen chemische Markierungen auf, die kovalent an den in bezug auf die Ligation distalen Enden angebracht waren. Diese Markierungen waren die folgenden: 5'- Fluorescein-LCR5A, 3'-Fluorescein-LCRSA, 3'-Biotin-LCR5B und 5'-Biotin-LCR5B'. Die kovalente Anbindung wurde mittels bekannter Verfahren durchgeführt, d. h. der Reaktion von Aminoterminierenden Oligonukleotiden mit FITC oder Biotin-NHS-Ester und zwar im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Kansal et al., Tet. Letters 29:5537-5540 (1988). Der verwendete thermische Cycler wurde von den Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI erhalten.
Gemäß dem LCR-Verfahren der Beispiele 4 und 5 wurden die Mischungen analysiert, wobei eine Prototypversion des IMx - Instrumentes (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) verwendet wurde, wobei die Versuchsvorschrift für Mikropartikel-Enzym- Immunoassays wie folgt angewendet wurde: Ein Anteil von 40µl = einer LCR-Mischung wurde 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnt. Diese verdünnte Mischung wurde mit 50µl Antifluoresceinkonjugierten Polystyrolmikropartikeln fünf (5) Minuten lang inkubiert, wobei sich eine Suspension von Immunkomplexen auf den Mikropartikeln ausbildete. Diese Suspension wurde dann auf eine inerte Glasfasermatrix= überführt, an der die Mikropartikel hafteten. Die Matrix wurde mit Puffer (0,3m NaCl, 10mM TRIS pH8, 0,1%NaN&sub3;) gewaschen. Alle Immunkomplexe, die an die Glasmatrix angebunden waren, wurden unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Konjugat nachgewiesen, das die Hydrolyse von 4-Methylumbelliferon katalysierte.
Unter Bezugnahme auf die FIG. 4 zeigt die graphische Darstellung die Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des gezeigten Ziels erhalten wurden. Die aufgezeigte Geschwindigkeit ist die Geschwindigkeit der Erzeugung von 4-Methylumbelliferon, und sie ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde dargestellt. Das Hintergrundsignal beträgt ungefähr 10 z/s/s, wie dies bei der Vervielfachung von humaner plazentaler DNA gezeigt ist. Die einzigen Werte oberhalb des Hintergrundes sind diejenigen für die Probe, die das HPV16 enthielt, und diese Werte betragen ungefähr das 60-fache des Hintergrundsignals.

BEISPIEL 10

Von den folgenden Sequenzen wurde festgestellt, daß sie für einen Anteil des E6-Bereiches des HPV Typ 18 spezifisch sind:

BEISPIEL 11

Plasmide, die Einschübe des Papillomavirus von voller Länge in pGEM3 enthielten, wurden als Ziele verwendet. Die verwendeten Plasmide waren diejenigen, die in Beispiel 9 beschrieben sind. Alle Oligonukleotide, die als Sonden von Beispiel 10 erhalten wörden waren, wiesen chemische Markierungen auf, die an den in Bezug auf die Ligation distalen Enden kovalent angebunden waren. Der thermische Cycler wurde von Coy Laboratory Product, Ann Arbor, MI erhalten.
Nach dem LCR-Verfahren, wie es in den Beispielen 4 und 5 beschrieben ist, wurden die Mischungen analysiert, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist, unter Verwendung der Prototyp- Version des IMx -Instrumentes (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
Unter Bezugnahme auf FIG. 5 zeigt die graphische Darstellung die Ergebnisse, die bei der Duychführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des Ziels erhalten wurden. Die gezeigte Geschwindigkeit, ist die Geschwindigkeit der Erzeugung von 4- Methylumbelliferon, und sie ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt Das Hintergrundsignal beträgt ungefähr 15 z/s/s, wie dies durch die Vervielfachung von humaner plazentaler DNA gezeigt ist. Die einzigen Werte, die überhalb dem Hintergrund liegen, sind diejenigen für die Probe, die das HPV18 enthielt, und diese Werte betragen ungefähr das 40-fache des Hintergrundsignals.

BEISPIEL 12

Von den folgenden Sequenzen wurde festgestellt, daß sie für einen Anteil des E6-Bereichs des HPV Typus 18 spezifisch sind:

BEISPIEL 13

Plasmide, die Einschübe des Papillomavirus von voller Länge in pGEM3 enthielten, wurden als Ziele verwendet. Die Plasmide waren diejenigen des Beispiel 9. Alle Oligonukleotide aus Beispiel 12, die als Sonden verwendet wurden, wiesen chemische Markierungen auf, die kovalent an die Enden, die in Bezug auf die Ligation distal waren, angebunden waren. Der thermische Cycler war der gleiche, wie derjenige, der in Beispiel 11 beschrieben ist.
Nach den LCR-Verfahren der Beispiele 4 und 5 wurden die Mischungen analysiert, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist, unter Verwendung der Prototyp-Version des IMx-Instrumentes (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
Unter Bezugnahme auf die FIG. 6 zeigt die graphische Darstellung die Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des Ziels erhalten wurde. Die gezeigte Geschwindigkeit ist die Geschwindigkeit der Erzeugung von 4- Methylumbelliferon, und sie ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt. Das Hintergrundsignal beträgt ungefähr 15 z/s/s, wie dies durch die Vervielfachung der humanen plazentalen DNA gezeigt ist. Die einzigen Werte oberhalb dem Hintergrund sind diejenigen für die Probe, die HPV18 enthält, und diese Werte betragen ungefähr das 80-fache des Hintergrundsignals.

BEISPIEL 14

Von den folgenden Seq=uenzen-wurde festgestellt, daß sie für einen Anteil des E6-Bereiches von HPV Typ 16 spezifisch sind:

BEISPIEL 15

Plasmide, die Einschübe des Papillomavirus von voller Länge in pGEM3 enthielten, wurden als Ziele verwendet. Alle Oligonukleotide aus Beispiel 14, die als Sonden verwendet wurden, wiesen chemische Markierungen auf, die kovalent an den Enden in distaler Position in Bezug auf die Ligation angebunden waren. Der thermische Cycler war der gleiche, wie er in Beispiel 11 beschrieben ist.
Nach dem LCR-Verfahren der Beispiele 4 und 5 wurden die Mischungen analysiert, wie dies im Beispiel 9 beschrieben ist, unter Verwendung der Prototyp-Version des IMx -Instrumentes (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
Unter Bezugnahme auf FIG. 7 zeigt die graphische Darstellung die Ergebnisse, die bei der Durchführung der LCR an 10&sup7; Molekülen des Ziels erhalten wurden. Die gezeigte Geschwindigkeit ist die Geschwindigkeit der Erzeugung von 4- Methylumbelliferon, und sie ist als Fluoreszenzzählungen/Sekunde/Sekunde ausgedrückt. Das Hintergrundsignal beträgt ungefähr 10 z/s/s, wie dies durch die Vervielfachung von humaner plazentaler DNA gezeigt ist. Die einzigen Werte oberhalb des Hintergrundes sind diejenigen für die Probe, die HPV16 enthält, und diese Werte betragen ungefähr das 36-fache des Hintergrundsignals.

BEISPIEL 16

Der beigefügte Anhang (Beispiel 16) offenbart die Sequenzen der Erfindung, die gegenüber bekannten Sequenzen aufgereiht sind.

BEISPIEL 16

ANHANG

HUMANER PAPILLOMAVIRUS

Ausrichtung der Typeh 6, 11, 16, 18, 31 und 33 mit gleichgerichteter Sequenz

Der Anhang führt die Sequenzen der HPV Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 auf. Es zeigt ebenfalls, wo die Sequenzen dieser Erfindung unter Bezugnähme auf diese HPV-Sequenzen auftreten. Zusätzlich zeigt der Anhang, wo andere Sequenzen, die den Erfindern am 28 September 1990 bekannt waren, und die von Dritten beansprucht oder offenbart werden oder diesen unbekannt sind, unter Bezugnahme auf diese Sequenzen auftreten.

1. Sequenzen und Bereiche, die von uns beansprucht werden:

PCR = Sequenzen nach den Beispielen 1 bis 3 (nur PCR 1, PCR 5, PCR 14-und PCR 15)
LCR = Nur Sequenzen gemäß den Beispielen 4 bis 14

2. Sequenzen und Bereiche, die Dritten nicht bekannt sind, und die wir nicht beanspruchen:

PCR = Die mit PCR bezeichneten Sequenzen, die von den obigen verschieden sind.
LCR = Die mit LCR bezeichneten Sequenzen, die von den obigen verschieden sind.

3. Sequenzen und Bereiche, die von Dritten beansprucht werden:

(Die Kursivschrift steht für entgegengerichtete Sequenzen)
AUS = Internationale Anmeldenummer PCT/AU88/00047 (WO 88/06634) (Australians)
WL = Internationale Anmeldenummer PCT/U586/00629 (WO 86/05816) (Wayne Lancaster, Wayne State University)
BE = Europäische Patentanmeldung 89-033834 (X=T oder U) (Belgier)
C = Internationale Anmeldenummer PCT/U589/03747 (WO 90/02821) CETUS)
O = Internationale Anmeldenummer PCT/U589/01318 (WO 89/09940) (Oncor)

und 4. Sequenzen und Bereiche) die von Dritten offenbart wurden:

S = Sarkar, F.H. und Crissman, J.D. Biotechniques 9 180-184 (1990)
(Die Kursivschrift stellt entgegengerichtete Sequenzen dar.)

Claims

1. Zusammensetzung, die für die LGR ("ligase chain reaction", Ligasekettenreaktion) zur Vervielfachung der DNA des humanen Papillomavirus nützlich ist, der in einer Testprobe vorhanden ist, wobei die Zusammensetzung einen Satz von vier Oligonukleotidsonden umfaßt, wobei die Sondensätze aus der Gruppe gewählt sind, die aus den folgenden Oligonukleotidsätzen besteht:

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Vervielfachung der DNA des humanen Papillomavirus Typ 16, der in einer Testprobe vorhanden ist, wobei die Zusammensetzung einen Satz von vier Oligonukleotidsonden umfaßt, wobei die Sondensätze aus der Gruppe gewählt sind, die aus den folgenden Oligonukleotidsätzen besteht:

LCR5 (SEQ ID Nrn 81, 82, 83 und 84) und LCR8 (SEQ ID Nrn 93, 94, 95 und 96).

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Vervielfachung der DNA des humanen Papillomavirus Typ 18, der in einer Testprobe vorhanden ist, wobei die Zusammensetzung einen Satz von vier Oligonukleotidsonden umfaßte wobei die Sondensätze aus der Gruppe gewählt sind, die aus den folgenden Oligonukleotidsätzen besteht:

LCR6 (SEQ ID Nrn 85, 86, 87 und 88) und LCR7 (SEQ ID Nrn 89, 90, 91 und 92).

4. Kit zum Nachweis der Anwesenheit der DNA des humanen Papillomavirus in einer Testprobe, das folgendes umfaßt:

eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und des weiteren eine Ligase.

5. Kit nach Anspruch 4, worin die Ligase thermostabil ist.

6. Zusammensetzung, die bei der PCR ("polymerase chain reaction" Polymerasekettenreaktion) zur Vervielfachung der DNA des humanen Papillomavirus nützlich ist, der in einer Testprobe vorhanden ist, wobei die Zusammensetzung folgendes umfaßt:

einen ersten Nukleinsäureprimer, der zur Richtung gleichläufig ist, welcher zur Hybridisierung an den gegenläufigen Strang der HPV-DNA befähigt ist, wobei der Primer 10 bis ungefähr 30 Nukleotide lang ist und eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Sequenzen besteht: SEQ ID Nr

einen zweiten Nukleinsäureprimer, der zur Richtung gegenläufig ist, welcher zur Hybridisierung an den gleichläufigen Strang der HPV-DNA befähigt ist, wobei der Primer 10 bis ungefähr 30 Nukleotide lang ist und eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Sequenzen besteht: SEQ ID Nr

vorausgesetzt, daß der erste und der zweite Primer an ihre jeweiligen gleich- und gegenläufigen Stränge an solchen Stellen hybridisieren, daß ihre 3'-Enden, nicht überlappen, und daß die 5'-Enden der Primer in Verlängerungsrichtung weiter räumlich abgesetzt sind als die 3'-Enden der Primer.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin der erste und zweite Primer aus den folgenden Paaren von Oligonukleotidsequnzen (die durch die Sequenz ID Nr bezeichnet sind) gewählt sind:

1 und 5, 6 und 5, 7 und 5, 81 und 84, 85 und 88, 89 und 92, und 93 und 96.

8. Kit zum Nachweis der Anwesenheit der DNA des humanen Papillomavirus in einer Testprobe, das folgendes umfaßt:

eine Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, und des weiteren eine Polymerase.

9. Kit nach Anspruch 8, worin die Polymerase thermostabil ist.

10. Consensus-Oligonukleotid zur Hybridisierung der humanen Papillomaviren Typ 6, 11, 16, 18, 31, 33 und 61, wobei das Oligonukleotid ungefähr 10 bis ungefähr 60 Oligonukleotide lang ist und aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, die aus folgendem besteht: SEQ ID Nr

und aus deren Komplementen.

11. Typ-spezifisches Oligonukleotid zur Bestimmung der Anwesenheit des humanen Papillomavirus Typ 16, das eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: SEO ID Nr

und aus deren Komplementen.

12. Typ-spezifisches Oligonukleotid zur Bestimmung der Anwesenheit des humanen Papiliomavirus Typ 18, das eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: SEQ ID Nr

und aus deren Komplementen.

13. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit irgendeines humanen Papiilomavirus in einer Testprobe, das folgendes umfaßt:

a. Hybridisieren der DNA in der Testprobe mit wenigstens einem Consensus-Oligonukleotid, das aus der Gruppe nach Anspruch 10 gewählt ist, wobei das Oligonukleötid an eine signalerzeugende Verbindung konjugiert ist, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, und

b. Bestimmen der Anwesenheit des humanen Papillomavirus, indem das erzeugte Signal nachgewiesen wird.

14. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des humanen Papillomavirus Typ 16 in einer Probe, das folgendes umfaßt:

a. Hybridisieren der DNA in der Testprobe mit wenigstens einem Oligonukleotid, das aus der Gruppe nach Anspruch 11 gewählt ist, wobei das Oligonukleotid an eine signalerzeugende Verbindung konugiert ist, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, und

15. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des humanen Papiliomavirus Typ 18 in einer Testprobe, das folgendes umfaßt:

a. Hybridisieren der DNA in der Testprobe mit wenigstens einem Oligonukleotid, das aus der Gruppe nach Anspruch 12 gewählt ist, wobei das Oligonukleotid an eine signalerzeugende Verbindung konjugiert ist, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, und

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13-15, das des weiteren einen Vervielfachungsschritt umfaßt, der vor oder in Konkurrenz mit dem Hybridisierungsschritt stattfindet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Vervielfachungsschritt PCR oder LCR umfaßt.