JPH04262781A - ゼラチンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はゼラチンて修飾された（
ゼラチンを化学的に結合した）スーパーオキシドジスム
ターゼに関するもので、抗炎症剤などとしての他、虚血
再還流時に生ずるスーパーオキシドラジカルの生成によ
る組織障害の減弱、更に末梢循環改善等の作用も期待さ
れる医薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドジムスターゼ（以下Ｓ
ＯＤという。）は生体内で生じたスーパーオキシドラジ
カルによる障害を防ぐ作用があるといわれ、ウシＳＯＤ
であるオルゴテインは抗炎症剤として使用されている。 更に血流遮断後の血流再開通時の血管内で生ずるスーパ
ーオキシドラジカルの消去剤として注目されている。し
かしながら、非修飾のＳＯＤの生体内での半減期が非常
に短かく、用途によっては薬効を十分発揮できないこと
から、ポリアルキレングリコールで修飾されたＳＯＤ（
特開昭６１−２４９３８８）などで半減期を長くし、そ
の有効性を高めようとする試みがなされている。一方本
発明者らはゼラチンおよびその加水分解物あるいはその
サクシニル化などの化学修飾物、あるいは本来水に不溶
性のコラーゲンの加水分解物、そのサクシニル化などの
化学修飾物が微小循環改善能を有することを見出してい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＳＯＤ
の半減期が長く、薬効を十分に発揮でき、抗炎症作用、
スーパーオキシドラジカル除去作用に優れ、かつ抗原性
などの問題も少なく、生体親和性が高く、更に末梢循環
改善能も併せもつＳＯＤ誘導体を見い出すべく、各種合
成高分子等を結合した化学修飾ＳＯＤを種々検討した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】その結果本発明を完成し
たもので、生体成分であるゼラチンで修飾されたＳＯＤ
（ゼラチンをＳＯＤに化学的に結合させたＳＯＤ）（以
下ゼラチン−ＳＯＤ結合体という。）が上記目的を達成
することを見い出し、本発明を完成した。

【０００５】本発明のゼラチン−ＳＯＤ結合体は通常次
のようにして製造される。 （１）ゼラチンへの架橋基の導入 ゼラチンに低級脂肪族ジカルボン酸無水物、例えば炭素
数２ないし８程度のジカルボン酸無水物、好ましくは無
水マレイン酸、無水コハク酸、無水シトラコン酸、アス
パラギン酸、グルタミン酸、無水グルタル酸、アスコル
ビン酸などを直接または必要に応じて縮合剤の存在下に
反応させ、ゼラチンのアミノ基に架橋基となるカルボキ
シル基を導入する。架橋基にカルボキシル基を導入する
利点は、このものが特定の臓器に集積せず、血中濃度を
高くし、溶解度を高め、抗原性等生体との反応性を減弱
するメリットが期待されるためである。

【０００６】（２）ゼラチン−ＳＯＤ結合体の形成上記
の（１）で得られた架橋基の導入されたゼラチン側のカ
ルボキシル基とＳＯＤのアミノ基の結合は、酸アミド結
合を形成させるのに、ペプチド化学において一般的に使
用される下記方法がいずれも使用できる。

【０００７】例えば縮合剤としてジシクロヘキシルカル
ボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピ
ルカルボジイミドなどを用いるカルボジイミド法又は縮
合剤としてジフェニルホスホルアジデイト、ジエチルホ
スホロシアニデイト、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エ
トキシジヒドロキノリンまたはＮ−エチル−５−フェニ
ルイソオキサゾリウム−３′−スルホネートなどを用い
る方法、また場合により、これらの縮合剤とともにＮ−
ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、ペ
ンタクロロフェノール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジ
カルボキシイミド等を併用する方法等があげられる。

【０００８】縮合剤の使用割合は通常架橋基導入ゼラチ
ンに対して１モル当量〜２０モル当量程度である。この
縮合に使用される溶媒は反応に影響を与えないものであ
れば特に制限はないが、通常原料化合物を溶解する極性
溶媒が好ましく、最も一般的には水が使用される。反応
温度は通常０℃〜５０℃程度の範囲で行うことができる
。得られたゼラチン−ＳＯＤ結合体はゲルろ過法などに
より単離することができる。

【０００９】本発明で原料として用いるゼラチンとは一
般にコラーゲンなどの加水分解によって得られるゼラチ
ンの他、その部分加水分解物も含めた広い意味であり、
通常分子量が２，０００〜５００，０００程度のものが
使用され、より好ましくはゼラチンを加水分解などによ
り分離精製した抗原性の少ない分子量２，０００〜５０
，０００程度のものである。またＳＯＤとしては、特に
制限はないが、遺伝子組換えで製造されるヒトに対して
抗原性がないヒトＣｕＺｎＳＯＤが使用される。

【００１０】得られたゼラチン−ＳＯＤ結合体における
ゼラチンとＳＯＤの割合は反応条件等により異なるので
一概には言えないが、通常１分子のＳＯＤに対して１−
２０好ましくは２〜１０程度のゼラチン分子が結合する
。従ってゼラチン−ＳＯＤ結合体の平均分子量にすると
約４０，０００〜２４０，０００程度である。

【００１１】得られたゼラチン−ＳＯＤ結合体はそのま
ま、もしくは通常使用される医薬用担体例えば乳糖など
とともに凍結乾燥等により製剤化し、抗炎症その他の目
的での医薬として使用することができる。ゼラチン−Ｓ
ＯＤ結合体と医薬用担体との割合は特に制限はないがゼ
ラチン−ＳＯＤ結合体１に対して０〜１０の割合で使用
することができる。

【００１２】次に本発明を実施例及び試験例により具体
的に説明する。 実施例１．ゼラチン−ＳＯＤ結合体の合成（１）サクシ
ニル化ゼラチンの調製 ゼラチン〔ブロモイズ（登録商標）Ｗ５２、平均分子量
１０，０００、成和化成（株）〕１ｇを０．５モル炭酸
水素ナトリウム水溶液４０ｍｌに溶解し、無水コハク酸
を１０分ごとに１００ｍｇずつ５回添加した。これを室
温で６０分間攪拌放置した。なお反応中は０．５モル炭
酸ナトリウム水溶液を随時添加することによりｐＨを８
に保った。反応終了後、限外ろ過法〔アミコン（Ａｍｉ
ｃｏｎ）（登録商標）ＹＷ５、分画分子量５，０００〕
により過剰の試薬、塩等を除去した後、凍結乾燥してサ
クシニル化ゼラチン標品８５０ｍｇを得た。得られたサ
クシニル化ゼラチンに残存する遊離のアミノ基をＴＮＢ
Ｓ（２，４，６−トリニトロベンゼン−１−スルホン酸
ナトリウム）法にて測定したところ、残存率は５％以下
であった。

【００１３】（２）ゼラチン−ＳＯＤ結合体の調製ＳＯ
Ｄ（ヒト遺伝子組換ＣｕＺｎＳＯＤ）５０ｍｇとサクシ
ニル化ゼラチン１６０ｍｇを０．１モル、リン酸バッフ
ァー（ｐＨ６）５ｍｌに溶解し、水溶性カルボジイミド
〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド〕１００ｍｇを加えた。これを室温で１時
間、さらに４℃で１６時間攪拌放置した。限外ろ過法に
より過剰のサクシニル化ゼラチンを除去した後、ゲルろ
過法により脱塩し、凍結乾燥してゼラチン−ＳＯＤ結合
体標品６４．５ｍｇを得た。

【００１４】ゼラチン−ＳＯＤ結合体の性状ＳＯＤに結
合したゼラチンの個数を明らかにするため、非修飾ＳＯ
Ｄおよびゼラチン−ＳＯＤ結合体のアミノ酸分析、およ
び原子吸光分析を行った。アミノ酸分析ではコラーゲン
の構成アミノ酸であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を
指標として、ゼラチン−ＳＯＤ結合体中のゼラチン含量
及びＳＯＤ含量を求めた。また原子吸光分析によって非
修飾ＳＯＤ及びゼラチン−ＳＯＤ結合体中のＣｕ及びＺ
ｎ含量を測定し、その結果から、ＳＯＤ含量及びゼラチ
ン結合数を求めた。またＳＯＤ残存活性はチトクローム
Ｃ還元法によって求めた。その結果を表１に示す。

【００１５】 表１．ゼラチン−ＳＯＤ結合体の性状 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ
ＯＤ含量　　　　　　ＳＯＤ残存　　　　　　　　ゼラ
チン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　（Ｗ／Ｗ％）　　　　活性（％）　　　　　　　　結
合数アミノ酸分析（Ｈｙｐ）　　　　３２．５　　　　
　　１００．０　　　　　　　　　　６．６原子吸光分
析（Ｃｕ）　　　　　　３３．３　　　　　　　　９７
．９　　　　　　　　　　６．４　　　　〃　　　　　
　（Ｚｎ）　　　　　　３１．７　　　　　　１０２．
８　　　　　　　　　　６．９上表の結果より、平均分
子量は約９６，０００〜１１０，０００程度である。

【００１６】試験例１ ゼラチン−ＳＯＤ結合体中の血中半減期ｄｄｙ系雄性マ
ウス（２０〜３０ｇ）に非修飾ＳＯＤ及びゼラチン−Ｓ
ＯＤ結合体を１５，０００ユニット／ｋｇ尾静脈より投
与した。各時間に採血し、その血漿中のＳＯＤ活性をチ
トクロームＣ還元法により測定した。得られた血中半減
期は非修飾ＳＯＤが約５分、ゼラチン−ＳＯＤ結合体が
約３０分であった。また生体内活性の改善を、活性の時
間的変化をプロットしたグラフから、その曲線下面積で
外捜すると、非修飾ＳＯＤの約４倍であった。

【００１７】試験例２ ゼラチン−ＳＯＤ結合体の薬理効果 マウス虚血性足浮腫の形成に対する抑制率ｄｄｙ系雄性
マウス（３０〜３５ｇ）を透明プラスチック固定具に入
れ、切れ目から片足のみを出した。この足に事務用のゴ
ムバンドを１０回巻き付けた後、固定具より出しケージ
に入れた。２０分間後マウスを再び固定具に移し、ハサ
ミでゴムを切り、すぐにミツトヨ製Ｎ１１０２５型マイ
クロメータで足の厚さを測定した。さらにマウスをゲー
ジに戻し、一定時間後に足の厚さを測定し、ゴムを切っ
た直後の値との差を腫れとした。なお、薬剤の投与は虚
血開始３０分前に静脈内投与により行った。コントロー
ル群は生理食塩水のみを０．２ｍｌ投与し、非修飾ＳＯ
Ｄおよびゼラチン−ＳＯＤ結合体はいずれもＳＯＤ活性
として２０，０００ｕｎｉｔ／ｋｇ／０．２ｍｌを投与
した。その結果を表２に示した。

【００１８】

【００１９】

【００２０】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ゼラチンで修飾されたスーパーオキシ
   ドジスムターゼ