JPH05252987A - 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体Info
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- JPH05252987A JPH05252987A JP3331046A JP33104691A JPH05252987A JP H05252987 A JPH05252987 A JP H05252987A JP 3331046 A JP3331046 A JP 3331046A JP 33104691 A JP33104691 A JP 33104691A JP H05252987 A JPH05252987 A JP H05252987A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、認識部位が異なりかつきわめて特異
性の高い複数の抗ヒトインスリン様成長因子IIモノクロ
ーナル抗体を創製することにある。 【構成】アミノ酸配列の４３番目のアミノ酸をロイシン
に変換したヒトインスリン様成長因子II誘導体を抗原と
して、ヒトインスリン様成長因子IIを認識するが、ヒト
インスリン様成長因子I は認識しない複数のモノクロー
ナル抗体を得る。当該モノクローナル抗体は、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマから得られる。
性の高い複数の抗ヒトインスリン様成長因子IIモノクロ
ーナル抗体を創製することにある。 【構成】アミノ酸配列の４３番目のアミノ酸をロイシン
に変換したヒトインスリン様成長因子II誘導体を抗原と
して、ヒトインスリン様成長因子IIを認識するが、ヒト
インスリン様成長因子I は認識しない複数のモノクロー
ナル抗体を得る。当該モノクローナル抗体は、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマから得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインスリン様成長
因子II(以下IGF-IIと称す)に対するモノクローナル抗体
およびその製造法に関する。
因子II(以下IGF-IIと称す)に対するモノクローナル抗体
およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】IGF-IIはインスリン様活性を有する67ア
ミノ酸からなるペプチドであり、血液中や骨組織等生体
内に広く存在していることが知られている。IGF-IIはヒ
トインスリン様成長因子I(以下IGF-Ｉと称する)とアミ
ノ酸レベルで高い相同性を有しており、それに伴いこれ
までに報告された抗IGF-I抗体或いは抗IGF-II抗体の中
には互いに交叉性を示すものが多く見られた（J. Clin.
Invest., 60, 646-657(1977), J. Clin. Endocrinol.
Metab., 50, 405-406 (1980), J. Clin. Invest., 68,1
321-1330 (1981)) 。
ミノ酸からなるペプチドであり、血液中や骨組織等生体
内に広く存在していることが知られている。IGF-IIはヒ
トインスリン様成長因子I(以下IGF-Ｉと称する)とアミ
ノ酸レベルで高い相同性を有しており、それに伴いこれ
までに報告された抗IGF-I抗体或いは抗IGF-II抗体の中
には互いに交叉性を示すものが多く見られた（J. Clin.
Invest., 60, 646-657(1977), J. Clin. Endocrinol.
Metab., 50, 405-406 (1980), J. Clin. Invest., 68,1
321-1330 (1981)) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】IGF-IIを正確に定量・
分析或いは生体内からIGF-IIを単離するためにはより特
異性の高い優れたモノクローナル抗体の創製が必要であ
る。
分析或いは生体内からIGF-IIを単離するためにはより特
異性の高い優れたモノクローナル抗体の創製が必要であ
る。
【０００４】
【課題を解決する為の手段】認識部位が異なりかつ極め
て特異性の高い複数の抗IGF-IIモノクローナル抗体を創
製する。これにより複数の抗体を組み合わせた酵素抗体
法などの開発を可能ならしめ、ひいてはIGF-IIの正確な
定量を可能にできるものと考える。またそのような有用
な抗体は、例えばIGF-IIのウエスタンブロッテイング分
析等の各種分析やIGF-IIの精製などにも利用することが
できる。
て特異性の高い複数の抗IGF-IIモノクローナル抗体を創
製する。これにより複数の抗体を組み合わせた酵素抗体
法などの開発を可能ならしめ、ひいてはIGF-IIの正確な
定量を可能にできるものと考える。またそのような有用
な抗体は、例えばIGF-IIのウエスタンブロッテイング分
析等の各種分析やIGF-IIの精製などにも利用することが
できる。
【０００５】本発明は、ヒトインスリン様成長因子IIを
認識するが、ヒトインスリン様成長因子Ｉは認識しない
モノクロ−ナル抗体を提供することにある。更に、この
モノクロ−ナル抗体は、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（−ＣＯＯＨ）を認識するモノクロ−ナル抗体と、これ
とは認識特性が異なるモノクロ−ナル抗体である。本発
明は、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）（ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中（ＮＨ2 −）はポリペプチドのアミノ末端を
示し、（−ＣＯＯＨ）はカルボキシ末端を示す。）で表
されるポリペプチド（以後、ポリペプチド−２と称す
る）を抗原としてほ乳類を免疫し、免疫されたほ乳類の
抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを製
し、ついで単クローン化したハイブリドーマを取捨選択
し、これを培養し、抗体を得てヒトインスリン様成長因
子IIを認識するが、ヒトインスリン様成長因子Iは認識
しないイムノグロブリンＩｇＧに属するモノクローナル
抗体を製造する方法に関する。また、このモノクローナ
ル抗体に関する。上に示したアミノ酸配列はIGF-IIの43
番目のアミノ酸をロイシンに変換したものであり、この
ポリペプチドを抗原として複数のモノクローナル抗体を
得ることができる。
認識するが、ヒトインスリン様成長因子Ｉは認識しない
モノクロ−ナル抗体を提供することにある。更に、この
モノクロ−ナル抗体は、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（−ＣＯＯＨ）を認識するモノクロ−ナル抗体と、これ
とは認識特性が異なるモノクロ−ナル抗体である。本発
明は、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）（ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中（ＮＨ2 −）はポリペプチドのアミノ末端を
示し、（−ＣＯＯＨ）はカルボキシ末端を示す。）で表
されるポリペプチド（以後、ポリペプチド−２と称す
る）を抗原としてほ乳類を免疫し、免疫されたほ乳類の
抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを製
し、ついで単クローン化したハイブリドーマを取捨選択
し、これを培養し、抗体を得てヒトインスリン様成長因
子IIを認識するが、ヒトインスリン様成長因子Iは認識
しないイムノグロブリンＩｇＧに属するモノクローナル
抗体を製造する方法に関する。また、このモノクローナ
ル抗体に関する。上に示したアミノ酸配列はIGF-IIの43
番目のアミノ酸をロイシンに変換したものであり、この
ポリペプチドを抗原として複数のモノクローナル抗体を
得ることができる。
【０００６】得られるモノクロ−ナル抗体、すなわちIG
F-IIを認識しIGF-Iを認識しない、ＩｇＧクラスに属す
るモノクローナル抗体、例えば、２Ｈ１１と付番したも
のは、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（−ＣＯ
ＯＨ）を認識することを特徴とするモノクローナル抗体
である。これとは認識特性が異なるが、IGF-IIを認識
し、IGF-Iを認識しないＩｇＧクラスに属するモノクロ
ーナル抗体も得ることができ、例えば、２Ｂ１１、ＩＤ
５またはＩＤ９と付番したものがある。これらの２つモ
ノクローナル抗体を組合わせることにより２抗体サンド
イッチ法によりIGF-II測定が可能となる。モノクロ−ナ
ル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９を得る
には、モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マ２Ｈ１
１、ハイブリド−マ２Ｂ１１、ハイブリド−マＩＤ５ま
たはハイブリド−マＩＤ９を用いればよい。上で述べた
ような製造法で得られるような動物の免疫法、抗体産生
細胞の取得、ハイブリドーマの取得法、単クローン化し
たハイブリドーマの取得法およびこれを培養してモノク
ローナル抗体を製造する方法には一般に用いられている
方法が利用できる（NATURE 256,495-497 (1975))。
F-IIを認識しIGF-Iを認識しない、ＩｇＧクラスに属す
るモノクローナル抗体、例えば、２Ｈ１１と付番したも
のは、アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（−ＣＯ
ＯＨ）を認識することを特徴とするモノクローナル抗体
である。これとは認識特性が異なるが、IGF-IIを認識
し、IGF-Iを認識しないＩｇＧクラスに属するモノクロ
ーナル抗体も得ることができ、例えば、２Ｂ１１、ＩＤ
５またはＩＤ９と付番したものがある。これらの２つモ
ノクローナル抗体を組合わせることにより２抗体サンド
イッチ法によりIGF-II測定が可能となる。モノクロ−ナ
ル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９を得る
には、モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マ２Ｈ１
１、ハイブリド−マ２Ｂ１１、ハイブリド−マＩＤ５ま
たはハイブリド−マＩＤ９を用いればよい。上で述べた
ような製造法で得られるような動物の免疫法、抗体産生
細胞の取得、ハイブリドーマの取得法、単クローン化し
たハイブリドーマの取得法およびこれを培養してモノク
ローナル抗体を製造する方法には一般に用いられている
方法が利用できる（NATURE 256,495-497 (1975))。
【０００７】本発明におけるモノクロ−ナル抗体の具体
的作成方法について詳細に説明する。 Ａ．抗原の調製 抗原に用いるポリペプチド−２は丸本らの報告したIGF-
IIの製造法(J. gen. Virol. 68, 2599-2606(1987))をも
とに通常の部位特異的変異導入技術(Sambrook,J. et a
l. "Molecular Cloning" 2nd ed., vol. 2, 15.51〜15.
80 (1989)およびKunkel, T. A. et al. Methods in Enz
ymology 154, 367-382(1987))を用いて調製できる。
的作成方法について詳細に説明する。 Ａ．抗原の調製 抗原に用いるポリペプチド−２は丸本らの報告したIGF-
IIの製造法(J. gen. Virol. 68, 2599-2606(1987))をも
とに通常の部位特異的変異導入技術(Sambrook,J. et a
l. "Molecular Cloning" 2nd ed., vol. 2, 15.51〜15.
80 (1989)およびKunkel, T. A. et al. Methods in Enz
ymology 154, 367-382(1987))を用いて調製できる。
【０００８】Ｂ．ポリペプチド−２によるマウスの免疫 雌ＢＡＬＢ／マウスを用いることができるが他の系のマ
ウスまたはラットなどを用いてもよい。ただし、免疫計
画及びポリペプチド−２による感作濃度は十分な量抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるように設定されるべ
きである。例えばマウスに0.1mgのポリペプチド−２／
子牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称する）、コンジュ
ゲイトを２〜３週間間隔で合計４回皮下投与し、更に0.
1 mgを腹腔内投与して最終免疫する。そして最終免疫の
数日後に細胞融合のために脾臓細胞を取り出す。
ウスまたはラットなどを用いてもよい。ただし、免疫計
画及びポリペプチド−２による感作濃度は十分な量抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるように設定されるべ
きである。例えばマウスに0.1mgのポリペプチド−２／
子牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称する）、コンジュ
ゲイトを２〜３週間間隔で合計４回皮下投与し、更に0.
1 mgを腹腔内投与して最終免疫する。そして最終免疫の
数日後に細胞融合のために脾臓細胞を取り出す。
【０００９】Ｃ．細胞融合 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に摘出し、単
細胞懸濁液を調製する。これらの脾臓細胞を適当なライ
ン化されたマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用
により、細胞融合させる。脾細胞対骨髄腫細胞の好まし
い比率は約20:1〜2:1（細胞数）の範囲であり、約108個
の脾臓細胞に対して約1 mlの融合媒体の使用が適当であ
る。融合媒体とは、細胞融合に用いる融合促進剤等を含
む細胞保持の為の溶液等を指す。ハイブリド−マを得る
ための細胞融合に用いいる骨髄細胞としては、マウス由
来P3 × 63 Ag8細胞、P3 × 63 Ag8 U1細胞、P3 × 63
653細胞、NS Ｉ細胞およびラット由来210 RCY Ag1.2.3
細胞などが使用できるが、実施例ではP3 ×63 Ag8 U1細
胞(Current Topics in Microbiology, 81, 1-7 (1978))
を用いた。細胞融合促進剤としては、ポリエチレングリ
コ−ル、ジメチルスルホキシドおよびＬ−アルギニン等
が上げられる。詳しくは、平均分子量1,000〜6,000程度
のポリエチレングリコ−ルなどが用いられるが、他の融
合促進剤も用いることができ、２つ以上の組み合わせで
用いることもできる。この融合促進剤を溶解する、媒体
は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水および各種細胞培養
用培地等が上げられる。実施例では平均分子量約1,500
のポロエチレングリコ−ルを蒸留水にとかし融合媒体と
して用いた。更に、細胞融合装置を使用した電気融合法
（FEBS Lett．， 147, 64-67 (1982））およびＨＶＪ
（センダイウイルス）を用いた細胞融合法（Nature 25
6, 495-497(1975))等も用いることが出来る。
細胞懸濁液を調製する。これらの脾臓細胞を適当なライ
ン化されたマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用
により、細胞融合させる。脾細胞対骨髄腫細胞の好まし
い比率は約20:1〜2:1（細胞数）の範囲であり、約108個
の脾臓細胞に対して約1 mlの融合媒体の使用が適当であ
る。融合媒体とは、細胞融合に用いる融合促進剤等を含
む細胞保持の為の溶液等を指す。ハイブリド−マを得る
ための細胞融合に用いいる骨髄細胞としては、マウス由
来P3 × 63 Ag8細胞、P3 × 63 Ag8 U1細胞、P3 × 63
653細胞、NS Ｉ細胞およびラット由来210 RCY Ag1.2.3
細胞などが使用できるが、実施例ではP3 ×63 Ag8 U1細
胞(Current Topics in Microbiology, 81, 1-7 (1978))
を用いた。細胞融合促進剤としては、ポリエチレングリ
コ−ル、ジメチルスルホキシドおよびＬ−アルギニン等
が上げられる。詳しくは、平均分子量1,000〜6,000程度
のポリエチレングリコ−ルなどが用いられるが、他の融
合促進剤も用いることができ、２つ以上の組み合わせで
用いることもできる。この融合促進剤を溶解する、媒体
は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水および各種細胞培養
用培地等が上げられる。実施例では平均分子量約1,500
のポロエチレングリコ−ルを蒸留水にとかし融合媒体と
して用いた。更に、細胞融合装置を使用した電気融合法
（FEBS Lett．， 147, 64-67 (1982））およびＨＶＪ
（センダイウイルス）を用いた細胞融合法（Nature 25
6, 495-497(1975))等も用いることが出来る。
【００１０】Ｄ． 融合したハイブリド−マの選択未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞及び融合した
ハイブリド−マ細胞の混合物を、例えばＨＡＴ培地のご
とき未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないような選択
培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるに十分な時間
（約１週間）培養する。この選択培地中では未融合のマ
ウス骨髄細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍細胞なので、やはりある一定期間後（約１週間）には
死滅する。これに対して融合細胞はこの条件で選択培地
中で生存できる。
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞及び融合した
ハイブリド−マ細胞の混合物を、例えばＨＡＴ培地のご
とき未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないような選択
培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるに十分な時間
（約１週間）培養する。この選択培地中では未融合のマ
ウス骨髄細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍細胞なので、やはりある一定期間後（約１週間）には
死滅する。これに対して融合細胞はこの条件で選択培地
中で生存できる。
【００１１】Ｅ．抗体価の測定 マウス免疫期間中の抗体価及びハイブリド−マ細胞の産
生する抗体の検出、確認はポリペプチド−２に対する抗
体について酵素免疫定量法(Enzyme Linked Immunosorbe
nt Assay; ELISA)により実施する。
生する抗体の検出、確認はポリペプチド−２に対する抗
体について酵素免疫定量法(Enzyme Linked Immunosorbe
nt Assay; ELISA)により実施する。
【００１２】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリド−マ
細胞の選択 目的の抗体を産生するハイブリド−マ細胞を適当な方
法、例えば、限界希釈法でクローン化することにより達
成される。
細胞の選択 目的の抗体を産生するハイブリド−マ細胞を適当な方
法、例えば、限界希釈法でクローン化することにより達
成される。
【００１３】Ｇ．各モノクローナル抗体の産生 所望のモノクローナル抗体は２種類の方法で産生させる
ことができる。その第１の方法は、各ハイブリドーマ細
胞を一定期間適当な培地で培養することにより、その培
養上清からハイブリドーマ細胞の産生する抗体を得ると
いうものである。また第２の方法はハイブリドーマ細胞
をマウス腹腔内に注入し、一定時間後にその宿主マウス
の血液中及び腹水中からそのハイブリドーマ細胞が産生
する抗体を得るというものである。本発明におけるいず
れのハイブリドーマ細胞もこの２種類の抗体産生方法に
適している。
ことができる。その第１の方法は、各ハイブリドーマ細
胞を一定期間適当な培地で培養することにより、その培
養上清からハイブリドーマ細胞の産生する抗体を得ると
いうものである。また第２の方法はハイブリドーマ細胞
をマウス腹腔内に注入し、一定時間後にその宿主マウス
の血液中及び腹水中からそのハイブリドーマ細胞が産生
する抗体を得るというものである。本発明におけるいず
れのハイブリドーマ細胞もこの２種類の抗体産生方法に
適している。
【００１４】Ｈ．モノクローナル抗体の精製 Ｇ．で述べた方法で得られたモノクローナル抗体含有培
養液または腹水を精製サンプルとすることができる。例
えば腹水の場合、プロテインＡカラムを用いたアフィニ
テイークロマトグラフィーにより精製し、限外ろ過膜で
濃縮できる。かくして今まで述べた本発明の製造法によ
りモノクローナル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５また
はＩＤ９などのヒトインスリン様成長因子IIを認識する
が、ヒトインスリン様成長因子Ｉは認識しないイムノグ
ロブリンＩｇＧに属するモノクローナル抗体を得る。
養液または腹水を精製サンプルとすることができる。例
えば腹水の場合、プロテインＡカラムを用いたアフィニ
テイークロマトグラフィーにより精製し、限外ろ過膜で
濃縮できる。かくして今まで述べた本発明の製造法によ
りモノクローナル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５また
はＩＤ９などのヒトインスリン様成長因子IIを認識する
が、ヒトインスリン様成長因子Ｉは認識しないイムノグ
ロブリンＩｇＧに属するモノクローナル抗体を得る。
【００１５】
【実施例】以下実施例により本発明を説明する。 実施例１：抗原の取得 （１）変異導入用 DNAオリゴマーの調製 変異導入用 DNAオリゴマーの塩基配列は次の通りであ
る。 Mut-IGF-II-02 : (5')TTCTTCGAGGATACCTC(3') (17mer) 変異導入用 DNAオリゴマー Mut-IGF-II-02は DNA合成機
を用いて合成し、HPLC等で精製した。精製した DNAオリ
ゴマー (10 pmol)をT4ポリヌクレオチドキナーゼで 5'
末端をリン酸化し相補鎖の合成に用いた。
る。 Mut-IGF-II-02 : (5')TTCTTCGAGGATACCTC(3') (17mer) 変異導入用 DNAオリゴマー Mut-IGF-II-02は DNA合成機
を用いて合成し、HPLC等で精製した。精製した DNAオリ
ゴマー (10 pmol)をT4ポリヌクレオチドキナーゼで 5'
末端をリン酸化し相補鎖の合成に用いた。
【００１６】（２）デオキシウリジンを含む一本鎖ＤＮ
Ａの調製 プラスミド pIGF002 (J. gen. Viol. 68, 2599-2606(19
87)、このプラスミドを保持した大腸菌を、Escherichia
coli K12 MC1061 IGF-002 として通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所へ寄託、受託番号：FERM BP-93
3）をEcoR IおよびSal Iの部分消化で約230 bpのIGF-II
遺伝子DNA断片を分離し、EcoR IおよびSal Iで切断した
pUC19に挿入した。得られたプラスミド pUCIGF-IIをEc
oR IおよびHindIII で切断後、マングビーンヌクレアー
ゼ処理し、約230 bpのIGF-II遺伝子DNAを分離した。こ
の断片をSma I切断したプラスミド pUC119 に挿入し、I
GF-IIＮ末端をコードする領域がHindI II側にあるプラ
スミド p119-IGF-II (14)とIGF-II遺伝子が逆向きに組
み込まれたプラスミドp119-IGF-II(24)を得、この内 p1
19-IGF-II(14)を大腸菌 MV1184 株に保持させた。この
大腸菌を 2xYT 培地（アンピシリン、テトラサイクリ
ン、ストレプトマイシン含有）で培養し、培養液にヘル
パーファージ M13K07を感染させた（m.o.i. 2-10)。37
℃で30分静置後カナマイシンを加え、一晩培養後遠心分
離し、上清を得た。このファージ液を大腸菌BW 313株培
養液（LB）に加え感染させた（m.o.i.2-10)。37℃で30
分静置後カナマイシンを加えさらに 37 ℃で一晩培養し
た。培養液を遠心分離し、上清に2.5 M NaCl/20 %ポリ
エチレングリコール6000溶液25 mlを加え室温で10分静
置後遠心分離し沈澱を得た。沈澱を 1mM EDTA/10mM Tri
s・HCl (PH 8)緩衝液( 以下TE緩衝液と称す）5 mlに溶解
し、まずフェノール次いでフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（25:24:1)、最後にクロロホルム
／イソアミルアルコール(24:1)の順で処理し、水層を回
収した。水層に3 M 酢酸ナトリウム（pH 8.0)500 μlと
イソプロピルアルコール ５ mlを加えて撹拌し、遠心分
離後得られた沈澱を70 %エタノールで洗浄後減圧乾燥
し、これをTE緩衝液に溶かしデオキシウリジンを含む一
本鎖DNA（以下 p119-IGF-II・ dUssDNA と略す）溶液と
した。
Ａの調製 プラスミド pIGF002 (J. gen. Viol. 68, 2599-2606(19
87)、このプラスミドを保持した大腸菌を、Escherichia
coli K12 MC1061 IGF-002 として通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所へ寄託、受託番号：FERM BP-93
3）をEcoR IおよびSal Iの部分消化で約230 bpのIGF-II
遺伝子DNA断片を分離し、EcoR IおよびSal Iで切断した
pUC19に挿入した。得られたプラスミド pUCIGF-IIをEc
oR IおよびHindIII で切断後、マングビーンヌクレアー
ゼ処理し、約230 bpのIGF-II遺伝子DNAを分離した。こ
の断片をSma I切断したプラスミド pUC119 に挿入し、I
GF-IIＮ末端をコードする領域がHindI II側にあるプラ
スミド p119-IGF-II (14)とIGF-II遺伝子が逆向きに組
み込まれたプラスミドp119-IGF-II(24)を得、この内 p1
19-IGF-II(14)を大腸菌 MV1184 株に保持させた。この
大腸菌を 2xYT 培地（アンピシリン、テトラサイクリ
ン、ストレプトマイシン含有）で培養し、培養液にヘル
パーファージ M13K07を感染させた（m.o.i. 2-10)。37
℃で30分静置後カナマイシンを加え、一晩培養後遠心分
離し、上清を得た。このファージ液を大腸菌BW 313株培
養液（LB）に加え感染させた（m.o.i.2-10)。37℃で30
分静置後カナマイシンを加えさらに 37 ℃で一晩培養し
た。培養液を遠心分離し、上清に2.5 M NaCl/20 %ポリ
エチレングリコール6000溶液25 mlを加え室温で10分静
置後遠心分離し沈澱を得た。沈澱を 1mM EDTA/10mM Tri
s・HCl (PH 8)緩衝液( 以下TE緩衝液と称す）5 mlに溶解
し、まずフェノール次いでフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（25:24:1)、最後にクロロホルム
／イソアミルアルコール(24:1)の順で処理し、水層を回
収した。水層に3 M 酢酸ナトリウム（pH 8.0)500 μlと
イソプロピルアルコール ５ mlを加えて撹拌し、遠心分
離後得られた沈澱を70 %エタノールで洗浄後減圧乾燥
し、これをTE緩衝液に溶かしデオキシウリジンを含む一
本鎖DNA（以下 p119-IGF-II・ dUssDNA と略す）溶液と
した。
【００１７】（３）変異導入プラスミド p119-M02-IGF-
IIの作成 アニーリング緩衝液中、p119-IGF-II・dUssDNA0.02 pmol
と5'末端がリン酸化された変異導入用 DNAオリゴマーMu
t-IGF-II-02 1 pmolを混合し、65℃で15分、次いで37
℃で15分静置した。255 μlの伸長バッファ−（宝酒造
社、Mutan K kit）と E. coli DNAリガーゼ 60Uおよび
T4 DNA ポリメラ−ゼ 1U を加え、25℃で２時間静置し
た。0.2 M EDTA (pH 8.0) 3 μlを加え65℃で５分間静
置して反応を停止した。
IIの作成 アニーリング緩衝液中、p119-IGF-II・dUssDNA0.02 pmol
と5'末端がリン酸化された変異導入用 DNAオリゴマーMu
t-IGF-II-02 1 pmolを混合し、65℃で15分、次いで37
℃で15分静置した。255 μlの伸長バッファ−（宝酒造
社、Mutan K kit）と E. coli DNAリガーゼ 60Uおよび
T4 DNA ポリメラ−ゼ 1U を加え、25℃で２時間静置し
た。0.2 M EDTA (pH 8.0) 3 μlを加え65℃で５分間静
置して反応を停止した。
【００１８】大腸菌 BMH71-18 mutS コンピテントセル3
0μlとこの DNA溶液3 μlを混合し、0 ℃で30分、次い
で42℃で45秒、最後に0℃で２分間静置後 2 × YT 培地
（アンピシリン、カナマイシン含有）1 mlを加え37℃で
一晩振とうした。遠心分離で上清を回収し、この内20
μlを大腸菌 MV 1184の培養液80μlと混合し、適当量を
LB寒天培地（アンピシリン含有）にひろげ、37℃で培養
した。単一コロニーを適当数取り、常法通りプラスミド
DNAを調製した後変異導入部位の塩基配列を確認し、変
異が導入されたIGF-II遺伝子が組み込まれたプラスミド
p119-M02-IGF-IIを得た。
0μlとこの DNA溶液3 μlを混合し、0 ℃で30分、次い
で42℃で45秒、最後に0℃で２分間静置後 2 × YT 培地
（アンピシリン、カナマイシン含有）1 mlを加え37℃で
一晩振とうした。遠心分離で上清を回収し、この内20
μlを大腸菌 MV 1184の培養液80μlと混合し、適当量を
LB寒天培地（アンピシリン含有）にひろげ、37℃で培養
した。単一コロニーを適当数取り、常法通りプラスミド
DNAを調製した後変異導入部位の塩基配列を確認し、変
異が導入されたIGF-II遺伝子が組み込まれたプラスミド
p119-M02-IGF-IIを得た。
【００１９】（４）組換え体ウイルス作成用プラスミド
pBM-M02-IGF-IIの調製 pFIGF II 120 (J. gen. Viol. 68, 2599 （1987))をEco
R Iで消化後 dNTPs存在下DNAポリメラ−ゼ (Klenow断
片) で平滑末端としアガロースゲル電気泳動で約10Kbp
のＤＮＡ断片を分離・抽出した。DEAEフィルターでDNA
を回収し、常法通り洗浄、乾燥後1 M Tris・HCl 200 μl
に溶解し細菌性アルカリフォスファタ−ゼ（宝酒造社
製、以下BAPと称す）処理を行ないベクターを得た。こ
れを適当量の TE 緩衝液に溶解しライゲーションサンプ
ルとした。変異が導入されたプラスミド p119-M02-IGF-
IIをそれぞれNco IおよびEco RIで消化後、dNTPs 存在
下DNAポリメラ−ゼ (Klenow断片) で平滑末端とした。
約220bp のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離
・抽出し、DEAEフィルターでフラグメントを回収後、洗
浄次いで乾燥した。これを適当量のTE緩衝液に溶解しラ
イゲーションサンンプルとした。
pBM-M02-IGF-IIの調製 pFIGF II 120 (J. gen. Viol. 68, 2599 （1987))をEco
R Iで消化後 dNTPs存在下DNAポリメラ−ゼ (Klenow断
片) で平滑末端としアガロースゲル電気泳動で約10Kbp
のＤＮＡ断片を分離・抽出した。DEAEフィルターでDNA
を回収し、常法通り洗浄、乾燥後1 M Tris・HCl 200 μl
に溶解し細菌性アルカリフォスファタ−ゼ（宝酒造社
製、以下BAPと称す）処理を行ないベクターを得た。こ
れを適当量の TE 緩衝液に溶解しライゲーションサンプ
ルとした。変異が導入されたプラスミド p119-M02-IGF-
IIをそれぞれNco IおよびEco RIで消化後、dNTPs 存在
下DNAポリメラ−ゼ (Klenow断片) で平滑末端とした。
約220bp のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離
・抽出し、DEAEフィルターでフラグメントを回収後、洗
浄次いで乾燥した。これを適当量のTE緩衝液に溶解しラ
イゲーションサンンプルとした。
【００２０】上記ベクターとＤＮＡ断片は T4 DNA ライ
ゲ−スを用いてライゲーションを行なった。この反応液
を用いて大腸菌 MC1061 株を形質転換した。培養液の一
部をアンピシリン含有LB寒天培地上にひろげ37 ℃で一
晩培養した。生成した単一コロニーの適当数を取り常法
に従いそのプラスミドDNAの塩基配列を分析・確認し、
目的とするプラスミド pBM-M02-IGF-IIを保持した大腸
菌を得た。pIGF 002より発現用組換え体ウイルス取得用
プラスミドpBM-M02-IGF-IIまでの構築過程を、図１およ
び図２に示す。
ゲ−スを用いてライゲーションを行なった。この反応液
を用いて大腸菌 MC1061 株を形質転換した。培養液の一
部をアンピシリン含有LB寒天培地上にひろげ37 ℃で一
晩培養した。生成した単一コロニーの適当数を取り常法
に従いそのプラスミドDNAの塩基配列を分析・確認し、
目的とするプラスミド pBM-M02-IGF-IIを保持した大腸
菌を得た。pIGF 002より発現用組換え体ウイルス取得用
プラスミドpBM-M02-IGF-IIまでの構築過程を、図１およ
び図２に示す。
【００２１】（５）発現用組換え体ウイルス vIGF-II-M
02の調製 カイコ核多角体病ウイルス (BmNPV T3株のウイルス DNA
(ATCC No. 40188))とpBM-M02-IGF-IIをモル比で1:100
になる様にし、下記の組成液ＩとIIを混合した。
02の調製 カイコ核多角体病ウイルス (BmNPV T3株のウイルス DNA
(ATCC No. 40188))とpBM-M02-IGF-IIをモル比で1:100
になる様にし、下記の組成液ＩとIIを混合した。
【００２２】生じた懸濁液の1 mlをカイコ培養細胞 (Bm
細胞）培養用培地（10 %牛胎児血清を含む TC-10培地：
J.Invertebr.Pathol., 25, 363 (1975)) 4 mlに加え、B
m細胞に上記DNAを導入した。20時間後に新鮮な培地と交
換し、更に 5日間培養後、培地を回収した。これを遠心
して上清をとりプラークアッセイ法（J.Seric.Sci.Jp
n.,53, 547 (1984)) によりクローン化した組換えウイ
ルスを採取し、これをvIGF-II-M02とした。
細胞）培養用培地（10 %牛胎児血清を含む TC-10培地：
J.Invertebr.Pathol., 25, 363 (1975)) 4 mlに加え、B
m細胞に上記DNAを導入した。20時間後に新鮮な培地と交
換し、更に 5日間培養後、培地を回収した。これを遠心
して上清をとりプラークアッセイ法（J.Seric.Sci.Jp
n.,53, 547 (1984)) によりクローン化した組換えウイ
ルスを採取し、これをvIGF-II-M02とした。
【００２３】（６）カイコ個体での多角体−ポリペプチ
ド-2融合蛋白質の発現 ５令１日目のカイコに、発現用ウイルス vIGF-II-MO2懸
濁液0.5 ml／匹（107pfu）を経皮的に注射し、25℃で３
日間飼育後、多角体−ポリペプチド−2融合蛋白質発現
カイコを得た。
ド-2融合蛋白質の発現 ５令１日目のカイコに、発現用ウイルス vIGF-II-MO2懸
濁液0.5 ml／匹（107pfu）を経皮的に注射し、25℃で３
日間飼育後、多角体−ポリペプチド−2融合蛋白質発現
カイコを得た。
【００２４】（７）カイコ虫体中からの多角体−ポリペ
プチド−2融合蛋白質の回収 vIGF-II-M02を感染させ３日間飼育したカイコ120匹を80
0 mlの水に浸し、高速ホモジナイザーにて虫体を完全に
破砕した。次いでこのホモジネートを超音波処理し、二
重に重ねたガーゼを用いてろ過した。ろ液及びガーゼ洗
浄液約1,200ml を10,000 rpm にて20分間遠心し、得ら
れた沈澱を250 mlの2.5 M尿素溶液に懸濁後、上記条件
にて再度遠心して沈澱部分を回収した。これを150 mlの
1.0 M塩酸グアニジン溶液に懸濁し、同条件にて遠心し
て多角体−ポリペプチド−2融合蛋白質を含む不溶画分
を得た。次いでこの画分を360 mlの6.0 M塩酸グアニジ
ン溶液に懸濁し、氷冷下超音波処理して目的蛋白質を溶
解させた。この溶液に150 mlのエチルエーテルを加えて
激しく撹拌後、更に超音波処理した。これをテフロン製
遠心管を用いて遠心するとゲル状の濃緑色中間層をはさ
んで二相に分離するのでその下層のみを回収した。同一
の操作を更に二度繰り返し狭雑物を除去した。次いで、
同じ操作を150 mlのクロロホルムを用いて行い上層のみ
を回収した。このグアニジン溶液を 4℃にて 0.2 %ギ酸
に対して充分透析すると白色の不溶物を生じるのでこれ
を遠心操作（12,000 rpm、15分間）により除去し、遠心
上清を凍結乾燥して粗製の多角体−ポリペプチド−2融
合蛋白質を得た。
プチド−2融合蛋白質の回収 vIGF-II-M02を感染させ３日間飼育したカイコ120匹を80
0 mlの水に浸し、高速ホモジナイザーにて虫体を完全に
破砕した。次いでこのホモジネートを超音波処理し、二
重に重ねたガーゼを用いてろ過した。ろ液及びガーゼ洗
浄液約1,200ml を10,000 rpm にて20分間遠心し、得ら
れた沈澱を250 mlの2.5 M尿素溶液に懸濁後、上記条件
にて再度遠心して沈澱部分を回収した。これを150 mlの
1.0 M塩酸グアニジン溶液に懸濁し、同条件にて遠心し
て多角体−ポリペプチド−2融合蛋白質を含む不溶画分
を得た。次いでこの画分を360 mlの6.0 M塩酸グアニジ
ン溶液に懸濁し、氷冷下超音波処理して目的蛋白質を溶
解させた。この溶液に150 mlのエチルエーテルを加えて
激しく撹拌後、更に超音波処理した。これをテフロン製
遠心管を用いて遠心するとゲル状の濃緑色中間層をはさ
んで二相に分離するのでその下層のみを回収した。同一
の操作を更に二度繰り返し狭雑物を除去した。次いで、
同じ操作を150 mlのクロロホルムを用いて行い上層のみ
を回収した。このグアニジン溶液を 4℃にて 0.2 %ギ酸
に対して充分透析すると白色の不溶物を生じるのでこれ
を遠心操作（12,000 rpm、15分間）により除去し、遠心
上清を凍結乾燥して粗製の多角体−ポリペプチド−2融
合蛋白質を得た。
【００２５】（８）ポリペプチド−２の調製 前例（７）により得られた粗製多角体−ポリペプチド−
2融合蛋白質を50 mlの70 % ギ酸に溶解し、減圧下充分
脱気した後チッ素ガス置換した。これに固形臭化シアン
200 mgを加えて密封し、撹拌下室温にて24時間反応し
た。反応液を約15倍量の純水で稀釈した後凍結乾燥し、
得られた粉末をまず40 mlの10 M尿素に溶解した。これ
に20 mMの酢酸緩衝液（pH 4.0）を加えて尿素濃度を6.0
Mにし、更に酢酸にてpHを4.0に調整した。予め6.0 M尿
素を含む20 mM酢酸緩衝液（pH 4.0）にて充分に平衡化
しておいたＳＰ−トヨパール650 Mカラム（東ソー社
製）（φ 2.5 × 6.0cm ）に上記溶液を送液して目的物
質を吸着させ150ml の同上緩衝液にて充分に洗浄した後
同緩衝液150 mlと0.4 MＮａＣｌを含む同緩衝液150 ml
のＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。溶出液はフラクシ
ョンコレクターにて16 mlずつ分画し、各フラクション
をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析して目的
物質の溶出位置を確認したのち回収した。次いでこの溶
液のpHを約8.0に調整し、これに最終濃度が100 mMとな
るように２−メルカプトエタノールを加え、室温にて４
時間放置して還元した。透析膜としてスペクトラ／ポア
３（スペクトラム社製）を用い前記溶液を４℃で6.0 M
尿素と50 mM２−メルカプトエタノールを含む20 mM酢酸
緩衝液（pH 4.0）に対して充分透析した。予め同緩衝液
にて平衡化しておいたＳＰ−トヨパールカラム（φ1.5
× 6.0 cm）にこの透析液を送液し、以後前記クロマト
グラフィーと全く同様の手順にて50 mM２−メルカプト
エタノール存在下、0から0.4 MのＮａＣｌ直線濃度勾配
で溶出して部分精製された還元型ポリペプチド画分を得
た。これを前記と同様の透析膜を用いて0.1 %ギ酸に対
して充分に透析し、透析液を凍結乾燥して粉末220 mgを
得た。前記凍結乾燥粉末に30 mlの6.0 M塩酸グアニジン
溶液を加え、減圧下30分間撹拌して溶解させた。撹拌下
これに150 mlの50 mM Tris・HCl 緩衝液（pH 8.4）をゆ
っくりと加え、減圧下更に約 1時間撹拌した後直ちに容
器の口をパラフィルムで覆い密封した。この蓋に注射針
で数個の穴をあけ、空気が徐々に入り込むようにして室
温にて３日間静置して空気酸化を行った。この溶液を限
外ろ過（ダイアフロメンブレンＹＭ−５：アミコン社
製）にて約25 mlまで濃縮した。酸化型ポリペプチド−
２の最終精製は分取用ＨＰＬＣ（ＬＣ−８Ａ：島津製作
所社製）を用いて実施した。以下にその条件を示す。
2融合蛋白質を50 mlの70 % ギ酸に溶解し、減圧下充分
脱気した後チッ素ガス置換した。これに固形臭化シアン
200 mgを加えて密封し、撹拌下室温にて24時間反応し
た。反応液を約15倍量の純水で稀釈した後凍結乾燥し、
得られた粉末をまず40 mlの10 M尿素に溶解した。これ
に20 mMの酢酸緩衝液（pH 4.0）を加えて尿素濃度を6.0
Mにし、更に酢酸にてpHを4.0に調整した。予め6.0 M尿
素を含む20 mM酢酸緩衝液（pH 4.0）にて充分に平衡化
しておいたＳＰ−トヨパール650 Mカラム（東ソー社
製）（φ 2.5 × 6.0cm ）に上記溶液を送液して目的物
質を吸着させ150ml の同上緩衝液にて充分に洗浄した後
同緩衝液150 mlと0.4 MＮａＣｌを含む同緩衝液150 ml
のＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。溶出液はフラクシ
ョンコレクターにて16 mlずつ分画し、各フラクション
をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析して目的
物質の溶出位置を確認したのち回収した。次いでこの溶
液のpHを約8.0に調整し、これに最終濃度が100 mMとな
るように２−メルカプトエタノールを加え、室温にて４
時間放置して還元した。透析膜としてスペクトラ／ポア
３（スペクトラム社製）を用い前記溶液を４℃で6.0 M
尿素と50 mM２−メルカプトエタノールを含む20 mM酢酸
緩衝液（pH 4.0）に対して充分透析した。予め同緩衝液
にて平衡化しておいたＳＰ−トヨパールカラム（φ1.5
× 6.0 cm）にこの透析液を送液し、以後前記クロマト
グラフィーと全く同様の手順にて50 mM２−メルカプト
エタノール存在下、0から0.4 MのＮａＣｌ直線濃度勾配
で溶出して部分精製された還元型ポリペプチド画分を得
た。これを前記と同様の透析膜を用いて0.1 %ギ酸に対
して充分に透析し、透析液を凍結乾燥して粉末220 mgを
得た。前記凍結乾燥粉末に30 mlの6.0 M塩酸グアニジン
溶液を加え、減圧下30分間撹拌して溶解させた。撹拌下
これに150 mlの50 mM Tris・HCl 緩衝液（pH 8.4）をゆ
っくりと加え、減圧下更に約 1時間撹拌した後直ちに容
器の口をパラフィルムで覆い密封した。この蓋に注射針
で数個の穴をあけ、空気が徐々に入り込むようにして室
温にて３日間静置して空気酸化を行った。この溶液を限
外ろ過（ダイアフロメンブレンＹＭ−５：アミコン社
製）にて約25 mlまで濃縮した。酸化型ポリペプチド−
２の最終精製は分取用ＨＰＬＣ（ＬＣ−８Ａ：島津製作
所社製）を用いて実施した。以下にその条件を示す。
【００２６】［ＨＰＬＣ 1］ カラム：カプセルパックＣ18（ＳＧタイプ 5μm、φ 1.5
× 25 cm：資生堂社製） 流 速： 8.0 ml / 分 溶 出： 0.1 %トリフルオロ酢酸中20 %から55 %までの
アセトニトリルの直線濃度勾配（50分間） 検 出： 210 nm のＵＶ吸収 クロマトグラフィーは３回繰り返して行い、保持時間約
24.0分の目的画分を集めて一括凍結乾燥した。これを再
度、同カラムを用いたＨＰＬＣにより最終精製した。そ
の条件を以下に示す。 ［ＨＰＬＣ ２］ カラム、流速及び検出条件：同上 溶 出： 0.1 %トリフルオロ酢酸中26 %から34 %までの
アセトニトリルの直線濃度勾配（40 分間） クロマトグラフィーは２回繰り返して行い、保持時間約
21.5分の主要ピーク画分を集めて一括凍結乾燥し、ポリ
ペプチド−２粉末を約10 mgを得た。
× 25 cm：資生堂社製） 流 速： 8.0 ml / 分 溶 出： 0.1 %トリフルオロ酢酸中20 %から55 %までの
アセトニトリルの直線濃度勾配（50分間） 検 出： 210 nm のＵＶ吸収 クロマトグラフィーは３回繰り返して行い、保持時間約
24.0分の目的画分を集めて一括凍結乾燥した。これを再
度、同カラムを用いたＨＰＬＣにより最終精製した。そ
の条件を以下に示す。 ［ＨＰＬＣ ２］ カラム、流速及び検出条件：同上 溶 出： 0.1 %トリフルオロ酢酸中26 %から34 %までの
アセトニトリルの直線濃度勾配（40 分間） クロマトグラフィーは２回繰り返して行い、保持時間約
21.5分の主要ピーク画分を集めて一括凍結乾燥し、ポリ
ペプチド−２粉末を約10 mgを得た。
【００２７】実施例２：モノクローナル抗体の取得 （１）抗原液の調整 0.4 % SDS/0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4) 0.5ml に溶解
させたポリペプチドー２の３mgにpH 7.4 の0.1 Mリン酸
緩衝液0.5 mlに溶解したウシ血清アルブミン(BSA ) 2.5
mgを加え、更に20 mM グルタールアルデヒド0.5 mlを
加え、室温で30分間撹拌した。リン酸緩衝生理食塩液に
対して充分透析した後、遠心分離し、上清を IGF-II/BS
A コンジュゲートとした。
させたポリペプチドー２の３mgにpH 7.4 の0.1 Mリン酸
緩衝液0.5 mlに溶解したウシ血清アルブミン(BSA ) 2.5
mgを加え、更に20 mM グルタールアルデヒド0.5 mlを
加え、室温で30分間撹拌した。リン酸緩衝生理食塩液に
対して充分透析した後、遠心分離し、上清を IGF-II/BS
A コンジュゲートとした。
【００２８】（２）免疫法 IGF-II/BSA コンジュゲート0.3 mgを等容量のフロイン
ド完全アジュバンド (FCA, DIFCO LABOLATORIES)と充分
乳化させ、BALB/c系雌マウス（日本チャールズリバー株
式会社、7ー8 週令）３匹に皮下投与して免疫した（抗原
100 μg/匹）。更に３週間後、ペプチド−２ 0.3mgを等
容量のフロインド不完全アジュバンド(FICA, DIFCO LAB
OLARORIES) と充分乳化させ、皮下投与（抗原0.1mg/
匹）して追加免疫した。追加免疫は２週間毎に行ない、
各免疫の７日後に採血して血清中の抗体価を測定した。
最終免疫は、抗体価の高い２匹を選び、ペプチド−２/B
SAコンジュゲート0.1 mg含有生理食塩液（0.5 ml）を腹
腔内投与により行なった。最終免疫３日後に脾臓を摘出
して細胞融合に用いた。
ド完全アジュバンド (FCA, DIFCO LABOLATORIES)と充分
乳化させ、BALB/c系雌マウス（日本チャールズリバー株
式会社、7ー8 週令）３匹に皮下投与して免疫した（抗原
100 μg/匹）。更に３週間後、ペプチド−２ 0.3mgを等
容量のフロインド不完全アジュバンド(FICA, DIFCO LAB
OLARORIES) と充分乳化させ、皮下投与（抗原0.1mg/
匹）して追加免疫した。追加免疫は２週間毎に行ない、
各免疫の７日後に採血して血清中の抗体価を測定した。
最終免疫は、抗体価の高い２匹を選び、ペプチド−２/B
SAコンジュゲート0.1 mg含有生理食塩液（0.5 ml）を腹
腔内投与により行なった。最終免疫３日後に脾臓を摘出
して細胞融合に用いた。
【００２９】（３）細胞融合 マウスから脾臓を無菌的に摘出し、血清無添加 PRMI 16
40（日水製薬株式会社）で洗浄後、数箇所に割を入れ
た。スライドグラスのフロスト部分を用いて押しだした
脾細胞を Tris・NH4Ｃｌ溶液で洗浄して赤血球を除去
し、細胞融合用脾細胞を調整した。得られた脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞 P 3×63 Ag 8U1を5:1（脾細胞：ミ
エローマ、細胞数）の割合で混合し、培地を充分除いた
後、1 mlの50%ポリエチレングリコール1500中で37℃に
て２分間インキュベートして細胞融合を行なった。この
細胞を血清無添加 PRMI 培地で洗浄し、HAT (1 × 10-4
M hypoxantine, 4 × 10-7 M aminopterin, 1.6 × 10
-5 M thymidine) 添加10 %牛胎児血清／PRMI 1640培地
に浮遊させた。更に105 cell/wellずつ添加し、37℃で7
% CO2の条件下で培養した。得られたハイブリドーマ２
Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５およびＩＤ９を含むハイブリ
ドーマの集団は、更に次に述べる抗体価を測定し候補を
絞り、モノクローナル化を行った。
40（日水製薬株式会社）で洗浄後、数箇所に割を入れ
た。スライドグラスのフロスト部分を用いて押しだした
脾細胞を Tris・NH4Ｃｌ溶液で洗浄して赤血球を除去
し、細胞融合用脾細胞を調整した。得られた脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞 P 3×63 Ag 8U1を5:1（脾細胞：ミ
エローマ、細胞数）の割合で混合し、培地を充分除いた
後、1 mlの50%ポリエチレングリコール1500中で37℃に
て２分間インキュベートして細胞融合を行なった。この
細胞を血清無添加 PRMI 培地で洗浄し、HAT (1 × 10-4
M hypoxantine, 4 × 10-7 M aminopterin, 1.6 × 10
-5 M thymidine) 添加10 %牛胎児血清／PRMI 1640培地
に浮遊させた。更に105 cell/wellずつ添加し、37℃で7
% CO2の条件下で培養した。得られたハイブリドーマ２
Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５およびＩＤ９を含むハイブリ
ドーマの集団は、更に次に述べる抗体価を測定し候補を
絞り、モノクローナル化を行った。
【００３０】（４）抗体価の測定 マウス免疫期間中の抗体価測定およびスクリーニングは
下記の酵素抗体法 (ELISA)手順に従って行なった。96穴
式平板プレート（バイオテック社製）の各ウエルに10
μg/mlのIGF-II含有25 mM炭酸バッファー(pH 9.0) 0.05
mlを加えて、4 ℃にて一晩静置し、抗原を吸着させ
た。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBSで３回洗浄した後
0.5 % BSA/0.05 % Tween 20/PBS を0.1 mlずつ各ウエル
に注入し、37℃で 3時間静置した。各ウエルを0.05 % T
ween 20/PBSで３回洗浄し、0.5 % BSA/0.05 % Tween 20
/PBSで連続的に段階希釈した抗血清或いは培養上清を0.
05 ml/well加えて、29℃にて90分間静置して抗原抗体反
応を行なった。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBSで３回
洗浄し、0.5 % BSA/0.05 % Tween 20/PBS で2000倍希釈
したホースラデッシュパーオキシダーゼ(HRP) 標識抗マ
ウスIgG ヤギ抗体（フナコシ社）を0.05 ml/well加え
て、29℃にて 1時間静置した。再度各ウエルを0.05 % T
ween 20/PBSで３回洗浄後、基質溶液 (ABTS,ZYMED)を0.
05 ml/well 加え、405 nmの吸収波長にて比色測定し
た。
下記の酵素抗体法 (ELISA)手順に従って行なった。96穴
式平板プレート（バイオテック社製）の各ウエルに10
μg/mlのIGF-II含有25 mM炭酸バッファー(pH 9.0) 0.05
mlを加えて、4 ℃にて一晩静置し、抗原を吸着させ
た。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBSで３回洗浄した後
0.5 % BSA/0.05 % Tween 20/PBS を0.1 mlずつ各ウエル
に注入し、37℃で 3時間静置した。各ウエルを0.05 % T
ween 20/PBSで３回洗浄し、0.5 % BSA/0.05 % Tween 20
/PBSで連続的に段階希釈した抗血清或いは培養上清を0.
05 ml/well加えて、29℃にて90分間静置して抗原抗体反
応を行なった。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBSで３回
洗浄し、0.5 % BSA/0.05 % Tween 20/PBS で2000倍希釈
したホースラデッシュパーオキシダーゼ(HRP) 標識抗マ
ウスIgG ヤギ抗体（フナコシ社）を0.05 ml/well加え
て、29℃にて 1時間静置した。再度各ウエルを0.05 % T
ween 20/PBSで３回洗浄後、基質溶液 (ABTS,ZYMED)を0.
05 ml/well 加え、405 nmの吸収波長にて比色測定し
た。
【００３１】（５）抗体産生細胞の選択 前記（３）で得られたハイブリドーマ集団を、細胞融合
7日後に培養上清の抗体価を ELISAで測定し、抗体産生
の認められたウエルの細胞を限界希釈法にて一次クロー
ニングを行なった。その後、二次クローニングによって
単クローンのハイブリドーマを得た。それぞれを、ハイ
ブリドーマ２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９と
名付けた。モノクローナル抗体２Ｈ１１を産生するハイ
ブリドーマ２Ｈ１１、モノクローナル抗体２Ｂ１１を産
生するハイブリドーマ２Ｂ１１、モノクローナル抗体Ｉ
Ｄ５を産生するハイブリドーマＩＤ５およびモノクロー
ナル抗体ＩＤ９を産生するハイブリドーマ９は通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（それぞれ受託番号：FERM BP-32752、受託番号：FERM
BP-3274Ｉ、受託番号：FERM BP-3276および受託番号：F
ERM BP-3277）。
7日後に培養上清の抗体価を ELISAで測定し、抗体産生
の認められたウエルの細胞を限界希釈法にて一次クロー
ニングを行なった。その後、二次クローニングによって
単クローンのハイブリドーマを得た。それぞれを、ハイ
ブリドーマ２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９と
名付けた。モノクローナル抗体２Ｈ１１を産生するハイ
ブリドーマ２Ｈ１１、モノクローナル抗体２Ｂ１１を産
生するハイブリドーマ２Ｂ１１、モノクローナル抗体Ｉ
Ｄ５を産生するハイブリドーマＩＤ５およびモノクロー
ナル抗体ＩＤ９を産生するハイブリドーマ９は通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（それぞれ受託番号：FERM BP-32752、受託番号：FERM
BP-3274Ｉ、受託番号：FERM BP-3276および受託番号：F
ERM BP-3277）。
【００３２】実施例３：モノクローナル抗体のクラス、
サブクラスの決定 実施例２で得られたハイブリドーマより産生されるモノ
クローナル抗体のサブクラスは ELISAにより決定した。
IGF-IIを ELISA用プレートに固相化し、ハイブリドーマ
培養上清を反応させ、更にマウスイムノグロブリンの各
クラスおよびサブクラス（ＩｇＧ（Ｆｃ）、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ、 ＩｇＧ３、 ＩｇＡおよびＩｇ
Ｍ）に対する特異抗原の HRP標識抗体 (The Binding Si
te Limited) を反応させた。陰性対照試料としてミエロ
ーマ P3U1 の培養上清を同時に測定し、陰性対照試料の
2倍以上の吸光度を示す場合を陽性とした。その結果を
表−１に示す。得られた各モノクローナル抗体は、Ｉｇ
Ｇ１クラスに属する抗体であった。
サブクラスの決定 実施例２で得られたハイブリドーマより産生されるモノ
クローナル抗体のサブクラスは ELISAにより決定した。
IGF-IIを ELISA用プレートに固相化し、ハイブリドーマ
培養上清を反応させ、更にマウスイムノグロブリンの各
クラスおよびサブクラス（ＩｇＧ（Ｆｃ）、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ、 ＩｇＧ３、 ＩｇＡおよびＩｇ
Ｍ）に対する特異抗原の HRP標識抗体 (The Binding Si
te Limited) を反応させた。陰性対照試料としてミエロ
ーマ P3U1 の培養上清を同時に測定し、陰性対照試料の
2倍以上の吸光度を示す場合を陽性とした。その結果を
表−１に示す。得られた各モノクローナル抗体は、Ｉｇ
Ｇ１クラスに属する抗体であった。
【００３３】
【表１】
【００３４】実施例４：腹水型モノクローナル抗体の調
製および精製 腹水型モノクローナル抗体を得るため、15から20週令の
BALB/c系マウス（日本チャールズリバー社）にプリスタ
ン (2,6,10,14-tetra-methyl-pentadecane, 和光純薬工
業社）0.5 ml を腹腔内投与し、約３週間後に確立した
ハイブリドーマ２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ
９の 5 × 106細胞を腹腔内に移植した。２から３週間
後、貯留した腹水を採取した。この腹水をプロテインＡ
カラム (PROSEP-A‘ HIGH CAPACITY', BIOPROCESSING
社）を用いたアフィニテイ ークロマトグラフィーによっ
て精製した。各腹水20 mlを２倍容量の1.0 M Glycine・N
aOH/0.15 M NaCl (pH 8.0)で希釈し、これを PROSEP-A
カラム (φ 1.0 × 7.5 cm) に通して抗体を吸着させ、
カラムを約70 ml0.1 M Glycine・NaOH/0.15 M NaCl で洗
浄した後、抗体を0.1 Mクエン酸バッファー(pH 3.5)で
溶出した。各溶出液は限外ろ過膜 YM 30（アミコン社
製）で濃縮した後、4 ℃で PBSに対して充分透析した。
ここで得られた腹水型モノクローナル抗体２Ｈ１１、２
Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９を使用し、以後の実施例を
行なった。
製および精製 腹水型モノクローナル抗体を得るため、15から20週令の
BALB/c系マウス（日本チャールズリバー社）にプリスタ
ン (2,6,10,14-tetra-methyl-pentadecane, 和光純薬工
業社）0.5 ml を腹腔内投与し、約３週間後に確立した
ハイブリドーマ２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ
９の 5 × 106細胞を腹腔内に移植した。２から３週間
後、貯留した腹水を採取した。この腹水をプロテインＡ
カラム (PROSEP-A‘ HIGH CAPACITY', BIOPROCESSING
社）を用いたアフィニテイ ークロマトグラフィーによっ
て精製した。各腹水20 mlを２倍容量の1.0 M Glycine・N
aOH/0.15 M NaCl (pH 8.0)で希釈し、これを PROSEP-A
カラム (φ 1.0 × 7.5 cm) に通して抗体を吸着させ、
カラムを約70 ml0.1 M Glycine・NaOH/0.15 M NaCl で洗
浄した後、抗体を0.1 Mクエン酸バッファー(pH 3.5)で
溶出した。各溶出液は限外ろ過膜 YM 30（アミコン社
製）で濃縮した後、4 ℃で PBSに対して充分透析した。
ここで得られた腹水型モノクローナル抗体２Ｈ１１、２
Ｂ１１、ＩＤ５またはＩＤ９を使用し、以後の実施例を
行なった。
【００３５】実施例５：モノクローナル抗体のIGF-IIに
対する反応特異性 実施例２に示したELISAに準じて、固定化抗原にIGF-II
(J.gen.Virol. 68, 2599 (1987))または組換えIGF-I
（東洋紡株式会社）を用い、実施例３に示した各精製モ
ノクローナル抗体を10 μg/mlの濃度から３倍ずつ段階
的に希釈して、抗原と反応させた。更に、HRP 標識抗マ
ウスIgGヤギ抗体を反応させた後、プレートの HRP活性
を測定した。陽性コントロールとしてIGF-Iに対して反
応交叉性が有ることが知られている市販の抗IGF-IIモノ
クローナル抗体（天野製薬）を用いた。但し、96穴平板
プレートはコースター社製を用いた。第３図に結果を示
した。モノクローナル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５
またはＩＤ９はIGF-IIと反応するが、IGF-Iとは全く反
応しない。市販のモノクローナル抗体（表中市販と表示
した。）は、IGF-IIおよびIGF-I両方に反応した。
対する反応特異性 実施例２に示したELISAに準じて、固定化抗原にIGF-II
(J.gen.Virol. 68, 2599 (1987))または組換えIGF-I
（東洋紡株式会社）を用い、実施例３に示した各精製モ
ノクローナル抗体を10 μg/mlの濃度から３倍ずつ段階
的に希釈して、抗原と反応させた。更に、HRP 標識抗マ
ウスIgGヤギ抗体を反応させた後、プレートの HRP活性
を測定した。陽性コントロールとしてIGF-Iに対して反
応交叉性が有ることが知られている市販の抗IGF-IIモノ
クローナル抗体（天野製薬）を用いた。但し、96穴平板
プレートはコースター社製を用いた。第３図に結果を示
した。モノクローナル抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５
またはＩＤ９はIGF-IIと反応するが、IGF-Iとは全く反
応しない。市販のモノクローナル抗体（表中市販と表示
した。）は、IGF-IIおよびIGF-I両方に反応した。
【００３６】実施例６：エピトープの決定 （１）ペプシン消化によるIGF-II由来ペプチド断片の調
製 IGF-IIのペプシンによる消化は Smithらの方法 (J. Bio
l. Chem., 264, 9314(1989)) にほぼ準拠して行った。1
00 μgのIGF-II粉末を250 μlの 0.01 N HClに溶かし、
これに 5μg のペプシン（シグマ社）を加え室温で48時
間反応させた。反応液中のペプチド断片はＨＰＬＣによ
り分離・精製し、各ペプチド断片を含む溶出液を凍結乾
燥した。
製 IGF-IIのペプシンによる消化は Smithらの方法 (J. Bio
l. Chem., 264, 9314(1989)) にほぼ準拠して行った。1
00 μgのIGF-II粉末を250 μlの 0.01 N HClに溶かし、
これに 5μg のペプシン（シグマ社）を加え室温で48時
間反応させた。反応液中のペプチド断片はＨＰＬＣによ
り分離・精製し、各ペプチド断片を含む溶出液を凍結乾
燥した。
【００３７】ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラ
ム：カプセルパックＣ18 SG 120 ( φ4.6 × 250 mm、
資生堂社製) 溶媒Ａ：0.1 % トリフルオロ酢酸含有水 溶媒Ｂ：0.1 % トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル 流速：1.00 ml/min 、 検出：ＵＶ 210 nm 溶出条件：0.1%トリフルオロ酢酸中５%から35%までのア
セトニトリル直線濃度勾配（90分） 本条件下での溶出パターンを第４図に示した。図に示し
たピーク１から４を各モノクローナル抗体のエピトープ
決定に使用した。各ピークに相当するペプチド断片が I
GF-IIのどこのアミノ酸配列に相当するのかはアミノ酸
配列分析（アプライドバイオシステムズ社、Protein Se
quencer 470A）およびアミノ酸組成分析により決定し
た。
ム：カプセルパックＣ18 SG 120 ( φ4.6 × 250 mm、
資生堂社製) 溶媒Ａ：0.1 % トリフルオロ酢酸含有水 溶媒Ｂ：0.1 % トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル 流速：1.00 ml/min 、 検出：ＵＶ 210 nm 溶出条件：0.1%トリフルオロ酢酸中５%から35%までのア
セトニトリル直線濃度勾配（90分） 本条件下での溶出パターンを第４図に示した。図に示し
たピーク１から４を各モノクローナル抗体のエピトープ
決定に使用した。各ピークに相当するペプチド断片が I
GF-IIのどこのアミノ酸配列に相当するのかはアミノ酸
配列分析（アプライドバイオシステムズ社、Protein Se
quencer 470A）およびアミノ酸組成分析により決定し
た。
【００３８】以下に各々のペプチドのアミノ酸配列を示
す。
す。
【化１】 ピーク１：(NH2-)Phe-Ser-Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Se
r-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly(-COOH)
r-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly(-COOH)
【００３９】
【化２】 ピーク２：(NH2-)Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Thr-Leu(-C
OOH)
OOH)
【００４０】
【化３】
【００４１】
【化４】
【００４２】（２）各ペプチド断片を抗原とした ELISA
による測定 実施例３にほぼ準拠して行った。上に示した各ペプチド
を96穴平板プレート上に固定し、これに1.1 μg/mlの
各抗体を加え抗原と反応させた。更に、これにHRP標識
抗マウス IgGヤギ抗体を反応させた後、プレート上のHR
P活性を測定した。表−２に吸光度（Ｏ. Ｄ. ）の値と
して示した。また参考として、抗体として市販の抗IGF-
IIモノクローナル抗体（天野製薬）、抗原としてIGF-II
およびIGF-Iを実施例と同様に行ない表−２に合わせて
示してある。
による測定 実施例３にほぼ準拠して行った。上に示した各ペプチド
を96穴平板プレート上に固定し、これに1.1 μg/mlの
各抗体を加え抗原と反応させた。更に、これにHRP標識
抗マウス IgGヤギ抗体を反応させた後、プレート上のHR
P活性を測定した。表−２に吸光度（Ｏ. Ｄ. ）の値と
して示した。また参考として、抗体として市販の抗IGF-
IIモノクローナル抗体（天野製薬）、抗原としてIGF-II
およびIGF-Iを実施例と同様に行ない表−２に合わせて
示してある。
【００４３】この結果は，モノクローナル抗体２Ｈ１１
の持つIGF-IIに対するエピトープが、IGF-IIの28番目の
Pheから41番目のGlyまでの配列部分にあることを示し
ている。本発明で得られた各モノクローナル抗体はIGF-
IIと反応し、IGF-Iとは反応しない。市販の抗IGF-IIモ
ノクローナル抗体（表中AMANO と表示）は、IGF-IIおよ
びIGF-I両方に反応する。
の持つIGF-IIに対するエピトープが、IGF-IIの28番目の
Pheから41番目のGlyまでの配列部分にあることを示し
ている。本発明で得られた各モノクローナル抗体はIGF-
IIと反応し、IGF-Iとは反応しない。市販の抗IGF-IIモ
ノクローナル抗体（表中AMANO と表示）は、IGF-IIおよ
びIGF-I両方に反応する。
【００４４】
【表２】
【００４５】実施例７：IGF-IIの特異的定量法 （１）サンドイッチELISA 抗IGF-IIモノクローナル抗体 (ＩＤ９) 6.25 mgを10 mM
炭酸バッファー(pH9.5)に対して充分透析した。HRP（ベ
ーリンガーマンハイム社)4.0 mg を水1.0 mlに溶かし、
これに0.1 M過ヨウ素酸ナトリウム溶液0.2 mlを加えて
室温で20分間反応させた後、1 mM酢酸バッファー(pH 4.
4)に対し４℃一晩透析した。透析液(1.40 ml)に0.2 Mの
炭酸ナトリウム溶液を加えてpHを約９に調整し、この溶
液1.05 mlを抗体の透析液に加えて撹拌下室温で２時間
反応させた。反応液に水素化シアノホウ素ナトリウム５
mgを加え、室温で２時間静置して反応により形成され
たシッフ塩基を還元した。次いで0.2 M Tris・HCl/0.1 M
モノエタノールアミン1.0mlを加え、さらに室温で90分
静置した。反応液を 4℃でPBSに対して充分に透析し、
透析液を HRP標識抗体溶液とした。
炭酸バッファー(pH9.5)に対して充分透析した。HRP（ベ
ーリンガーマンハイム社)4.0 mg を水1.0 mlに溶かし、
これに0.1 M過ヨウ素酸ナトリウム溶液0.2 mlを加えて
室温で20分間反応させた後、1 mM酢酸バッファー(pH 4.
4)に対し４℃一晩透析した。透析液(1.40 ml)に0.2 Mの
炭酸ナトリウム溶液を加えてpHを約９に調整し、この溶
液1.05 mlを抗体の透析液に加えて撹拌下室温で２時間
反応させた。反応液に水素化シアノホウ素ナトリウム５
mgを加え、室温で２時間静置して反応により形成され
たシッフ塩基を還元した。次いで0.2 M Tris・HCl/0.1 M
モノエタノールアミン1.0mlを加え、さらに室温で90分
静置した。反応液を 4℃でPBSに対して充分に透析し、
透析液を HRP標識抗体溶液とした。
【００４６】定量の方法は実施例３に示したものとほぼ
同様である。まず96穴平板プレート(コースター社）上
に抗 IGF-II 抗体 (２Ｂ１１) を固相化し、これに種々
の濃度のIGF-II、IGF-I（東洋紡株式会社）またはイン
スリン（シグマ社）を反応させ、更に上記に示したHRP
標識抗IGF-II抗体を反応させた後、プレート上のHRP活
性を測定した。結果を表−３に示した。得られたモノク
ローナル抗体は、IGF-IIと特異的に反応し、定量的に測
定ができた。
同様である。まず96穴平板プレート(コースター社）上
に抗 IGF-II 抗体 (２Ｂ１１) を固相化し、これに種々
の濃度のIGF-II、IGF-I（東洋紡株式会社）またはイン
スリン（シグマ社）を反応させ、更に上記に示したHRP
標識抗IGF-II抗体を反応させた後、プレート上のHRP活
性を測定した。結果を表−３に示した。得られたモノク
ローナル抗体は、IGF-IIと特異的に反応し、定量的に測
定ができた。
【００４７】
【表３】
【００４８】（２）競合ELISA HRP-標識IGF-IIの調製は既に報告のあるマレイミド法
(J. Biochem., Vol. 92,1413-1424 (1982))に従って行
った。西洋ワサビペルオキシダーゼ(3.3 mg)を0.3 mlの
リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）の溶解し、これに0.
75 mgのN-(4-アセチルメルカプト無水コハク酸を75 μ
lのジメチルホルムアミドの溶解した溶液を加え、30℃
で１時間撹拌下、インキュベ−ションした。生成した沈
殿を遠心で除去し、上清を0.1 Mのリン酸ナトリウム緩
衝液（pH 6.0）を用いたSephadex G-25 カラム（1.0cm
×38cm）によりゲルろ過した。目的の蛋白質を含むフラ
クションを集め、ダイアフロ−メンブロンYM-30（アミ
コン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、マレイミド
標識HRPを得た。上記マレイミド標識HRPとIGF-IIを結合
させるために以下に示すような方法によりIGF-IIにチオ
−ル基を導入した。IGF-I（0.8 mg）を0.6 mlの0.1 Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）に溶かし、これに2.0
mgのS-アセチルメルカプト無水コハク酸を35 μｌのジ
メチルホルムアミドに溶かした溶液を加え、30℃で30分
間インキュベーションした。この溶液に40 μｌの０．
１M EDTA、200 μｌの0.1M Tris・HCl (pH 7.0)と200 μ
ｌの1.0 Mヒドロキシアミン／塩酸を加え、室温で４分
間インキュベーションした。反応混合液を5 mM EDTAを
含む0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）をもちい
たSephadex G-25カラム（1.0 cm×４１ cm)によりゲル
ろ過した。目的の蛋白質を含むフラクションを集め、ダ
イアフローメンブランYM-5（アミコン社製）を用いた限
外ろ過により0.5 mlまで濃縮した。この溶液に上記マレ
イミド標識HRPを入れ、４℃で20分間インキュベート
後、70μｌの0.1Mエチルマレイミドを加え、０．１Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）を用いた上記と同じカ
ラムによりゲルろ過した。目的の蛋白質を含むフラクシ
ョンを集め、ダイアフローメンブランYM-30を用いた限
外ろ過により濃縮した。約1 mlまで濃縮後、内液をPBS
標識IGF-II（1.1 ml）を得た。
(J. Biochem., Vol. 92,1413-1424 (1982))に従って行
った。西洋ワサビペルオキシダーゼ(3.3 mg)を0.3 mlの
リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）の溶解し、これに0.
75 mgのN-(4-アセチルメルカプト無水コハク酸を75 μ
lのジメチルホルムアミドの溶解した溶液を加え、30℃
で１時間撹拌下、インキュベ−ションした。生成した沈
殿を遠心で除去し、上清を0.1 Mのリン酸ナトリウム緩
衝液（pH 6.0）を用いたSephadex G-25 カラム（1.0cm
×38cm）によりゲルろ過した。目的の蛋白質を含むフラ
クションを集め、ダイアフロ−メンブロンYM-30（アミ
コン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、マレイミド
標識HRPを得た。上記マレイミド標識HRPとIGF-IIを結合
させるために以下に示すような方法によりIGF-IIにチオ
−ル基を導入した。IGF-I（0.8 mg）を0.6 mlの0.1 Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）に溶かし、これに2.0
mgのS-アセチルメルカプト無水コハク酸を35 μｌのジ
メチルホルムアミドに溶かした溶液を加え、30℃で30分
間インキュベーションした。この溶液に40 μｌの０．
１M EDTA、200 μｌの0.1M Tris・HCl (pH 7.0)と200 μ
ｌの1.0 Mヒドロキシアミン／塩酸を加え、室温で４分
間インキュベーションした。反応混合液を5 mM EDTAを
含む0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）をもちい
たSephadex G-25カラム（1.0 cm×４１ cm)によりゲル
ろ過した。目的の蛋白質を含むフラクションを集め、ダ
イアフローメンブランYM-5（アミコン社製）を用いた限
外ろ過により0.5 mlまで濃縮した。この溶液に上記マレ
イミド標識HRPを入れ、４℃で20分間インキュベート
後、70μｌの0.1Mエチルマレイミドを加え、０．１Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）を用いた上記と同じカ
ラムによりゲルろ過した。目的の蛋白質を含むフラクシ
ョンを集め、ダイアフローメンブランYM-30を用いた限
外ろ過により濃縮した。約1 mlまで濃縮後、内液をPBS
標識IGF-II（1.1 ml）を得た。
【００４９】IGF-II濃度の定量は以下のように行った。
96-穴マイクロプレート（コースター社製）の各ウエル
に各2.5 μg/mlの４種抗体（２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ
５、ＩＤ９）のPBS混合溶液を0.05 ml加え、４℃にて一
晩静置した。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBS で洗浄
し、0.1 ml の0.05 % BSA/0.02 % Tween 20/PBS を加
え、37℃にて３時間静置した。0.05 % Tween20/PBS に
て３回洗浄後、0.1 % PBS・0.02 % Tween 20/PBS にて10
0,000倍希釈した上記調製 HRP 標識IGF-IIを各ウエル当
たり 0.025 ml と種々の濃度のIGF-IIを 0.025 ml 加え
た。これを４℃で一晩インキュベ−ションし、各ウエル
を0.05 % Tween 20/PBS にて３回洗浄後、各ウエルのHR
P活性を測定した。結果を図−５に示した。得られたモ
ノクローナル抗体は、IGF-IIと特異的に反応し、定量的
に測定できた。
96-穴マイクロプレート（コースター社製）の各ウエル
に各2.5 μg/mlの４種抗体（２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ
５、ＩＤ９）のPBS混合溶液を0.05 ml加え、４℃にて一
晩静置した。各ウエルを0.05 % Tween 20/PBS で洗浄
し、0.1 ml の0.05 % BSA/0.02 % Tween 20/PBS を加
え、37℃にて３時間静置した。0.05 % Tween20/PBS に
て３回洗浄後、0.1 % PBS・0.02 % Tween 20/PBS にて10
0,000倍希釈した上記調製 HRP 標識IGF-IIを各ウエル当
たり 0.025 ml と種々の濃度のIGF-IIを 0.025 ml 加え
た。これを４℃で一晩インキュベ−ションし、各ウエル
を0.05 % Tween 20/PBS にて３回洗浄後、各ウエルのHR
P活性を測定した。結果を図−５に示した。得られたモ
ノクローナル抗体は、IGF-IIと特異的に反応し、定量的
に測定できた。
【００５０】実施例８：ウエスタンブロッティング分析 （１）抗IGF-IIモノクローナル抗体（２Ｈ１１）結合樹
脂の調製 抗IGF-IIモノクローナル抗体２Ｈ１１(4.5 ml)を５ ml
の0.25 M リン酸ナトリウム緩衝液(PH 8.0)に溶かし
た。この溶液に、予め100 mlの水で充分に洗浄しておい
た４ mlのFormyl-cellulofine（生化学工業社製）を加
え、室温にて２時間撹拌した。次いで、10 mg の水素
化ジアノホウ素ナトリウム粉末を加え、更に室温で３時
間撹拌した。ろ過後、抗体結合樹脂を100 mlの水で洗浄
した。得られた樹脂を10 mgの水素化シアノホウ素ナト
リウム粉末を加え、室温にて３時間静置した。ろ過後、
樹脂を100 ml 濃度水で洗浄して目的の抗体２Ｈ１１結
合樹脂を得た。
脂の調製 抗IGF-IIモノクローナル抗体２Ｈ１１(4.5 ml)を５ ml
の0.25 M リン酸ナトリウム緩衝液(PH 8.0)に溶かし
た。この溶液に、予め100 mlの水で充分に洗浄しておい
た４ mlのFormyl-cellulofine（生化学工業社製）を加
え、室温にて２時間撹拌した。次いで、10 mg の水素
化ジアノホウ素ナトリウム粉末を加え、更に室温で３時
間撹拌した。ろ過後、抗体結合樹脂を100 mlの水で洗浄
した。得られた樹脂を10 mgの水素化シアノホウ素ナト
リウム粉末を加え、室温にて３時間静置した。ろ過後、
樹脂を100 ml 濃度水で洗浄して目的の抗体２Ｈ１１結
合樹脂を得た。
【００５１】（２）ウエスタンブロッティング用血清由
来試料の調製 健常成人あるいは血糖降下症を併発した胃癌患者の血清
300 μlと1,200 μlの87.5 %エタノール/2 N 塩酸をポ
ロプロピレン容器中で混合した。混合液を室温で45分間
インキュベーションし、４℃で15,000 rpm にて１０分
間遠心分離した。上清の1.2 mlを別の容器にとり、２ M
の炭酸水素アンモニウムで中和した。エタノールを減圧
下に留去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を１ ml
の0.02% Tween 20 を含む PBS に溶かし、これに上
記の抗体（２Ｈ１１）結合樹脂(50μl)を加えてボルテ
ックスミキサーにて室温で３時間インキュベーションし
た。IGF-IIの吸着した樹脂を１ M NaCl と0.04 % Twee
n 20を含むPBSで一度、次いで水で洗浄した。樹脂上の
抗原／抗体複合体から可溶化し回収するために、樹脂を
Laemmli サンプルバッファー(Nature, Vol. 227, 680-
685(1970))で処理した。目的の血清由来IGF-IIはこの上
清に溶けている。
来試料の調製 健常成人あるいは血糖降下症を併発した胃癌患者の血清
300 μlと1,200 μlの87.5 %エタノール/2 N 塩酸をポ
ロプロピレン容器中で混合した。混合液を室温で45分間
インキュベーションし、４℃で15,000 rpm にて１０分
間遠心分離した。上清の1.2 mlを別の容器にとり、２ M
の炭酸水素アンモニウムで中和した。エタノールを減圧
下に留去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を１ ml
の0.02% Tween 20 を含む PBS に溶かし、これに上
記の抗体（２Ｈ１１）結合樹脂(50μl)を加えてボルテ
ックスミキサーにて室温で３時間インキュベーションし
た。IGF-IIの吸着した樹脂を１ M NaCl と0.04 % Twee
n 20を含むPBSで一度、次いで水で洗浄した。樹脂上の
抗原／抗体複合体から可溶化し回収するために、樹脂を
Laemmli サンプルバッファー(Nature, Vol. 227, 680-
685(1970))で処理した。目的の血清由来IGF-IIはこの上
清に溶けている。
【００５２】（３）ウエスタンブロッティング用IGF-II
産生腫瘍組織由来試料の調製 IGF-II産生腫瘍組織の塊（湿重量、156 mg）をポリプロ
ピレン容器に入れ、1.5 mlの70 % エタノール／２ N 塩
酸中でポリトロン（KINEMATICA社製）にてホモジナイズ
した。ホモジネートを室温で45分間インキュベーション
後、４℃、15,000 rpmで10分間遠心分離した。最終的
に、上記と全く同様の手順により目的の腫瘍組織由来IG
F-IIを得た。
産生腫瘍組織由来試料の調製 IGF-II産生腫瘍組織の塊（湿重量、156 mg）をポリプロ
ピレン容器に入れ、1.5 mlの70 % エタノール／２ N 塩
酸中でポリトロン（KINEMATICA社製）にてホモジナイズ
した。ホモジネートを室温で45分間インキュベーション
後、４℃、15,000 rpmで10分間遠心分離した。最終的
に、上記と全く同様の手順により目的の腫瘍組織由来IG
F-IIを得た。
【００５３】（４）ドデシル硫酸ナトリウム/ポリアク
リルアミドゲル電気泳動、膜転写、検出 標準IGF-II,IGF-I血清由来IGF-IIおよび腫瘍組織由来IG
F-IIをLaemmliのドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリ
ルアミド電気泳動（以後SDS-PAGEと略す）システム(Nat
ure, Vol. 227, 680-685(1970))に供した。SDS-PAGEは
２−メルカプトエタノールを用いずに、16 % のポリア
クリルアミドのスラブゲルを使って、25mA の定電流で
行った。電気泳動後、ゲル上の蛋白質を Mini Trans-Bl
ot 装置（バイオラッド社製）を用いて10 % メタノール
含有10 mM CAPS 緩衝液（pH 11）中、50 V 定電流にて
１時間通電することにより、PVDF膜（"Pro Blott"， A
pplied Biosystems 社製）に転写した。膜状の非特異
的結合は膜を5 % スキムミルクと0.05 % Tween 20 含
有PBS 中に４℃で16時間浸すことによりブロックした。
膜をまず1 μg/ml の抗体 ２Ｈ１１と0.05 % Tween 20
含有 PBS で次いで 5,000 倍に希釈したHRP結合抗
マウス IgG ヤギ IgG (Amarsham 社製）と0.05 % Tw
een 20含有同緩衝液でそれぞれ室温下、１時間処理し
た。膜上の IGF-IIの検出は ECL Western Blotting De
tectionKit (Amersham 社製）を用い、そのマニュアル
に従って行った。結果を図−６に示した。標準IGF-II、
血清由来IGF-IIは充分検出可能であったが、過剰量のIG
F-Iは検出されなかった。更に、これらの結果はこのシ
ステムが通常型のIGF-II(7.5 KD)のみならず、腫瘍によ
る血糖降下症患者でその存在が報告されている大分子量
型のIGF-II(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 3169-31
72(1985))の検出や分析に効果的であることを示してい
る。
リルアミドゲル電気泳動、膜転写、検出 標準IGF-II,IGF-I血清由来IGF-IIおよび腫瘍組織由来IG
F-IIをLaemmliのドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリ
ルアミド電気泳動（以後SDS-PAGEと略す）システム(Nat
ure, Vol. 227, 680-685(1970))に供した。SDS-PAGEは
２−メルカプトエタノールを用いずに、16 % のポリア
クリルアミドのスラブゲルを使って、25mA の定電流で
行った。電気泳動後、ゲル上の蛋白質を Mini Trans-Bl
ot 装置（バイオラッド社製）を用いて10 % メタノール
含有10 mM CAPS 緩衝液（pH 11）中、50 V 定電流にて
１時間通電することにより、PVDF膜（"Pro Blott"， A
pplied Biosystems 社製）に転写した。膜状の非特異
的結合は膜を5 % スキムミルクと0.05 % Tween 20 含
有PBS 中に４℃で16時間浸すことによりブロックした。
膜をまず1 μg/ml の抗体 ２Ｈ１１と0.05 % Tween 20
含有 PBS で次いで 5,000 倍に希釈したHRP結合抗
マウス IgG ヤギ IgG (Amarsham 社製）と0.05 % Tw
een 20含有同緩衝液でそれぞれ室温下、１時間処理し
た。膜上の IGF-IIの検出は ECL Western Blotting De
tectionKit (Amersham 社製）を用い、そのマニュアル
に従って行った。結果を図−６に示した。標準IGF-II、
血清由来IGF-IIは充分検出可能であったが、過剰量のIG
F-Iは検出されなかった。更に、これらの結果はこのシ
ステムが通常型のIGF-II(7.5 KD)のみならず、腫瘍によ
る血糖降下症患者でその存在が報告されている大分子量
型のIGF-II(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 3169-31
72(1985))の検出や分析に効果的であることを示してい
る。
【００５４】
【発明の効果】認識部位が異なり、かつきわめて特異性
の高い複数の抗ヒトIGF-IIモノクローナル抗体を創製
し、これら複数の抗体の組み合わせによりELISA 法が可
能となり、ひいてはヒトIGF-IIの正確な定量ができる。
またこのような有用な抗体は、ヒトIGF-II血中濃度測定
の為の診断薬、ヒトIGF-IIのウエスタンブロッティング
分析などの各種分析およびヒトIGF-IIの精製などにも利
用することができる。
の高い複数の抗ヒトIGF-IIモノクローナル抗体を創製
し、これら複数の抗体の組み合わせによりELISA 法が可
能となり、ひいてはヒトIGF-IIの正確な定量ができる。
またこのような有用な抗体は、ヒトIGF-II血中濃度測定
の為の診断薬、ヒトIGF-IIのウエスタンブロッティング
分析などの各種分析およびヒトIGF-IIの精製などにも利
用することができる。
【００５５】
【図１】は、発現用組換え体ウイルス取得用プラスミド
の構築図である。
の構築図である。
【図２】は、第１図に続く発現用組換え体ウイルス取得
用プラスミドの構築図である。
用プラスミドの構築図である。
【図３】は、各抗体の反応特異性を示す図である。
【図４】は、ペプシン消化によるヒトIGF-II由来ペプチ
ド断片のＨＰＬＣ溶出図である。
ド断片のＨＰＬＣ溶出図である。
【図５】は、競合ELISAによるIGF-II測定標準曲線であ
る。
る。
【図６】は、ヒト由来サンプルにおけるウエスタンブロ
ッティング分析によるIGF-II検出結果である。
ッティング分析によるIGF-II検出結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】ヒトインスリン様成長因子IIを認識する
が、ヒトインスリン様成長因子Iは認識しないモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項２】アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（−ＣＯＯＨ）を認識することを特徴とする請求項１記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】請求項２記載のモノクローナル抗体とは認
識特性が異なる、請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）で表されるポリ
ペプチドを抗原としてほ乳類を免疫し、免疫されたほ乳
類の抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマ
を製し、さらに単クローン化したハイブリドーマを選択
取得し、これを培養し、抗体を得ることを特徴とするイ
ムノグロブリンＩｇＧに属し、ヒトインスリン様成長因
子IIを認識するが、ヒトインスリン様成長因子Iは認識
しないモノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項５】アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）で表されるポリ
ペプチドを抗原として得られ、ヒトインスリン様成長因
子IIを認識するが、ヒトインスリン様成長因子Iは認識
しないことを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項６】アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）で表されるポリ
ペプチドを抗原としてほ乳類を免疫し、免疫されたほ乳
類の抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマ
を製し、さらに単クローン化したハイブリドーマであ
り、請求項１または請求項２記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ２Ｈ１１。 - 【請求項７】アミノ酸配列：（ＮＨ2 −）Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（−ＣＯＯＨ）で表されるポリ
ペプチドを抗原としてほ乳類を免疫し、免疫されたほ乳
類の抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマ
を製し、さらに単クローン化したハイブリドーマであ
り、請求項１または請求項３記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ２Ｂ１１、ハイブリドーマＩ
Ｄ５、またはハイブリドーマＩＤ９。 - 【請求項８】ハイブリドーマ２Ｈ１１
- 【請求項９】ハイブリドーマ２Ｂ１１
- 【請求項１０】ハイブリドーマＩＤ５
- 【請求項１１】ハイブリドーマＩＤ９
- 【請求項１２】請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いてヒトインスリン様成長因子IIを特異的に検出する免
疫化学的方法。 - 【請求項１３】ハイブリドーマ２Ｈ１１、ハイブリドー
マ２Ｂ１１、ハイブリドーマＩＤ５およびハイブリドー
マＩＤ９から選ばれるハイブリドーマにより産生される
モノクローナル抗体を用いてヒト成長因子IIを特異的に
検出する免疫化学的方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33104691A JP3213359B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-12-16 | 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41828490 | 1990-12-21 | ||
| JP3-250138 | 1991-06-27 | ||
| JP2-418284 | 1991-06-27 | ||
| JP25013891 | 1991-06-27 | ||
| JP33104691A JP3213359B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-12-16 | 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05252987A true JPH05252987A (ja) | 1993-10-05 |
| JP3213359B2 JP3213359B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=27333905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33104691A Expired - Lifetime JP3213359B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-12-16 | 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3213359B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0713096A1 (en) * | 1994-11-15 | 1996-05-22 | Daiichi Radioisotope Laboratories, Ltd. | Immunoassay and kit for insulin-like growth factors |
| WO2000007021A1 (fr) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| JP2011523405A (ja) * | 2008-05-09 | 2011-08-11 | ダイアックス コーポレーション | Ｉｇｆ−ｉｉ／ｉｇｆ−ｉｉｅ結合タンパク質 |
| JP2012505900A (ja) * | 2008-10-14 | 2012-03-08 | ダイアクス コーポレーション | 全身性強皮症に伴う肺線維症の治療および予防のためのｉｇｆ−ｉｉ／ｉｇｆ−ｉｉｅ結合タンパク質の使用 |
-
1991
- 1991-12-16 JP JP33104691A patent/JP3213359B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0713096A1 (en) * | 1994-11-15 | 1996-05-22 | Daiichi Radioisotope Laboratories, Ltd. | Immunoassay and kit for insulin-like growth factors |
| WO2000007021A1 (fr) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| US6607891B1 (en) | 1998-07-31 | 2003-08-19 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method of assaying insulin-like growth factor |
| JP2011523405A (ja) * | 2008-05-09 | 2011-08-11 | ダイアックス コーポレーション | Ｉｇｆ−ｉｉ／ｉｇｆ−ｉｉｅ結合タンパク質 |
| JP2012505900A (ja) * | 2008-10-14 | 2012-03-08 | ダイアクス コーポレーション | 全身性強皮症に伴う肺線維症の治療および予防のためのｉｇｆ−ｉｉ／ｉｇｆ−ｉｉｅ結合タンパク質の使用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3213359B2 (ja) | 2001-10-02 |
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