JP2003130880A - 異常型プリオン免疫測定用試薬及びキット並びにそれを用いた異常型プリオンの免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 時間のかかる電気泳動操作や遠心分離操作を
行うことなく、高感度に異常型プリオンを検出すること
ができる免疫測定法を提供すること。 【解決手段】 磁性粒子に、変性剤処理した異常型プリ
オンと抗原抗体反応する第１抗体を不動化して成る異常
型プリオン免疫測定用試薬、並びに異常型プリオンを含
んでいるかもしれない試料を界面活性剤、コラゲナーゼ
及び蛋白質分解酵素で処理する工程と、次いで遠心分離
操作を経ることなく、得られた生成物を変性剤で処理す
る工程と、得られた生成物を上記試薬を用いて免疫測定
することを含む、異常型プリオンの測定方法を提供し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、異常型プリオン免
疫測定用試薬及びキット並びにそれを用いた異常型プリ
オンの免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】異常型プリオンは、狂牛病に代表される
プリオン病の原因となるタンパク質である。異常型プリ
オンは、蛋白質分解酵素に耐性を有しているため、経口
摂取しても消化酵素による分解を受けずに動物体内に侵
入し得る。一旦動物体内に侵入すると、脳、脊髄、眼球
などの特定部位において新たに生産される正常型プリオ
ンを異常型プリオンに変えてしまう働きをし、この結
果、これらの特定部位において異常型プリオンが蓄積す
る。脳に異常型プリオンが蓄積すると、脳がスポンジ状
になり、動物は死に至る。近年、ウシの異常型プリオン
をヒトが経口摂取することにより、ヒトもプリオン病に
罹患することがわかり、大きな問題となっている。ウシ
からヒトへの感染を完全に防止するためには、ウシが狂
牛病に感染しているか否かを屠殺される全てのウシにつ
いて検査し、陰性のものだけを食用に供することが求め
られる。

【０００３】従来より、異常型プリオンは、ＥＬＩＳＡ
やウェスタンブロットのような免疫測定により検出され
ている。異常型プリオンは、正常型プリオンとアミノ酸
配列の一次構造が同じなので、正常型プリオンと交差反
応しない抗異常型プリオン抗体を作製することは容易で
はなく、従来法では、異常型プリオンがプロテインアー
ゼＫに耐性であるが正常型プリオンはプロテインアーゼ
Ｋに分解される性質を利用して、脳組織等の被検試料を
プロテインアーゼＫで処理することにより、正常型プリ
オンを分解、除去した後に免疫測定を行っている。さら
に、異常型プリオンは、凝集する性質があり、抗プリオ
ン抗体によって認識されるエピトープが露出していな
い。このため、プロテインＫによる処理後、免疫測定の
前にグアニジンチオシアン酸のような変性剤で処理して
凝集状態を解除し、エピトープを露出させてから免疫測
定を行っている。

【０００４】従来行われているウェスタンブロット法
は、電気泳動を行う必要があり、煩雑で時間がかかるの
で、多数のウシを短時間に検査しようとするためには適
していない。また、ＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＬＩ
ＳＡによる場合は、必要な感度を達成するために、プロ
テインアーゼＫ処理後の組織をグアニジンチオシアン酸
で変性処理する前に、SDSによる一次変性処理及びメタ
ノール処理（蛋白質濃縮操作）を行う必要があり、メタ
ノール処理の前及びグアニジンチオシアン酸処理の前に
それぞれ遠心分離を行う必要がある。遠心分離操作は時
間がかかるので、多数のウシを短時間に検査しようとす
るためには適していない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、時間のかかる電気泳動操作や遠心分離操作を行うこ
となく、高感度に異常型プリオンを検出することができ
る免疫測定法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【０００６】本願発明者らは、鋭意研究の結果、磁性粒
子を固相としたサンドイッチ法により、電気泳動操作や
遠心分離操作を行うことなく高感度に異常型プリオンを
免疫測定することができることを見出し、本発明を完成
した。

【０００７】すなわち、本発明は、磁性粒子に、変性剤
処理した異常型プリオンと抗原抗体反応する第１抗体又
はその抗原結合性フラグメントを不動化して成る異常型
プリオン免疫測定用試薬を提供する。また、本発明は、
前記本発明の試薬と、前記第１抗体又はその抗原結合性
フラグメントに捕捉された、変性剤処理した異常型プリ
オンと抗原抗体反応する第２抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントとを少なくとも含む、異常型プリオン免疫測
定用キットを提供する。さらに、本発明は、表面にプロ
テインＧが結合された磁性粒子と、変性剤処理した異常
型プリオンと抗原抗体反応する第１抗体と、前記第１抗
体に捕捉された、変性剤処理した異常型プリオンと抗原
抗体反応する第２抗体又はその抗原結合性フラグメント
とを少なくとも含む、異常型プリオン免疫測定用キット
を提供する。さらに、本発明は、異常型プリオンを含ん
でいるかもしれない試料を界面活性剤、コラゲナーゼ及
び蛋白質分解酵素で処理する工程と、次いで遠心分離操
作を経ることなく、得られた生成物を変性剤で処理する
工程と、得られた生成物を上記本発明の試薬と反応させ
る工程と、磁性ビーズを洗浄し、磁力により磁性ビーズ
を集める工程と、前記第１抗体又はその抗原結合性フラ
グメントに捕捉された、変性剤処理した異常型プリオン
と抗原抗体反応する第２抗体又はその抗原結合性フラグ
メントを反応させる工程と、磁性ビーズを洗浄し、磁力
により磁性ビーズを集める工程と、磁性ビーズに結合し
た第２抗体又はその抗原結合性フラグメントを測定する
工程とを含む、異常型プリオンの測定方法を提供する。
さらに、本発明は、異常型プリオンを含んでいるかもし
れない試料を界面活性剤、コラゲナーゼ及び蛋白質分解
酵素で処理する工程と、次いで遠心分離操作を経ること
なく、得られた生成物を変性剤で処理する工程と、得ら
れた生成物と、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗
体反応する第１抗体と、表面にプロテインＧが結合され
た磁性粒子とを反応させる工程と、磁性ビーズを洗浄
し、磁力により磁性ビーズを集める工程と、前記第１抗
体に捕捉された、変性剤処理した異常型プリオンと抗原
抗体反応する第２抗体又はその抗原結合性フラグメント
を反応させる工程と、磁性ビーズを洗浄し、磁力により
磁性ビーズを集める工程と、磁性ビーズに結合した第２
抗体又はその抗原結合性フラグメントを測定する工程と
を含む、異常型プリオンの測定方法を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】上記の通り、本発明の磁性粒子
に、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体反応する
第１抗体又はその抗原結合性フラグメントを不動化して
成るものである。

【０００９】磁性粒子としては、表面に抗体を結合する
ことができ、磁性を有する粒子であれば特に限定される
ものではない。免疫測定の固相に磁性粒子を用いること
自体は公知であり、従来より免疫測定に用いられてい
る、例えばフェライトで被覆したラテックス又はポリマ
ー粒子等を好適に用いることができる。また、抗体の結
合を容易にするために、免疫グロブリンのＦｃ領域と結
合する性質を有するプロテインＧを表面に結合した免疫
測定用磁性粒子が知られており、このような免疫測定用
磁性粒子を好適に用いることができる。磁性粒子の粒径
は、特に限定されないが通常、１μｍないし６μｍ程
度、好ましくは２μｍ〜４μｍ程度である。これらの条
件を満足する免疫測定用磁性粒子は市販されており、市
販品を好ましく利用することができる。

【００１０】磁性粒子の表面には、変性剤処理した異常
型プリオンと抗原抗体反応する第１抗体又はその抗原結
合性フラグメントが不動化される。ここで、「変性剤」
とは、凝集状態にある異常型プリオンの内部にあるエピ
トープ部分を露出させることができる薬剤であり、好ま
しい例としては、グアニジン若しくはその酸付加塩又は
グアニジンチオシアン酸若しくはその塩を挙げることが
できる。第１抗体は、異常型プリオン又は正常型プリオ
ンを免疫原として動物に投与する常法により容易に作製
することができる。なお、異常型プリオンと正常型プリ
オンは、一次アミノ酸配列が完全に同一又はほぼ完全に
同一であるので、抗正常型プリオン抗体は、通常、変性
剤処理した異常型プリオンと抗原抗体反応する。免疫原
として用いるプリオンは、検査に供する動物種由来のプ
リオンであることが好ましいが、プリオンのアミノ酸配
列は種を越えてよく保存されているので、検査に供する
動物のプリオンと交差反応する抗体の産生を誘起できる
ものであれば、他種動物のプリオンを免疫原として用い
てもよい。例えば、マウス由来プリオンを免疫原として
用いて誘起された抗マウスプリオン抗体は、マウスのみ
ならずウシ、ヒツジ、ハムスター等のプリオンと交差反
応するし、ウシ由来プリオンを免疫原として用いて誘起
された抗ウシプリオン抗体は、ウシのみならず、ヒトを
含む霊長類、ヒツジ、ウサギ、ミンク、マウス、ハムス
ター等と交差反応する。また、免疫原は、大腸菌等を宿
主として遺伝子工学的手法により生産した組換え型プリ
オンであってもよい。第１抗体は、ポリクローナル抗体
でもモノクローナル抗体でもよいが、精度及び再現性を
高める観点からモノクローナル抗体が好ましい。また、
第１抗体に代えて、第１抗体のFabフラグメントやF(a
b')₂フラグメントのような抗原結合性フラグメントを用
いることもできる。ただし、磁性粒子表面に結合された
プロテインＧに第１抗体を結合させる場合には、抗体の
Fc領域が必要となるので、Fc領域を欠く抗原結合性フラ
グメントを用いることはできない。

【００１１】磁性粒子の表面に担持する抗体の量は、正
確な免疫測定が可能な量であれば特に限定されないが、
通常、１〜５重量％の磁性粒子の懸濁液に、抗体の重量
換算で１０〜１００μｇ／ｍｌ程度の濃度になるように
抗体又はその抗原結合性フラグメントを添加し、放置す
ることにより磁性粒子に担持される程度の量が好まし
い。また、磁性粒子表面上への抗体の結合は、磁性粒子
懸濁液に抗体又はその抗原結合性フラグメント（通常、
溶液の形態にある）を添加し、室温で３０分間ないし２
時間程度放置することにより達成することができる。な
お、磁性粒子の表面にプロテインＧが結合されている場
合には、予めプロテインＧに第１抗体を結合したものを
調製し、これを試料と反応させてもよいし、免疫測定時
に、被検試料と共に第１抗体を添加することにより、第
１抗体をその場で磁性粒子に結合してもよい。免疫測定
時に第１抗体をその場で結合させる場合、第１抗体が磁
性粒子上に先ず不動化されてそれに変性剤処理した異常
型プリオンが結合する場合と、第１抗体と変性剤処理し
た異常型プリオンが先ず結合し、生成された抗原抗体複
合物の第１抗体のＦｃ領域がプロテインＧに結合する場
合とが同時に生じると考えられるが、これらの場合も本
発明の試薬及び方法に包含されるものと解釈する。

【００１２】次に、上記本発明の異常型プリオン免疫測
定用試薬を用いた、異常型プリオンの免疫測定方法につ
いて説明する。

【００１３】本発明の免疫測定方法に供される試料は、
異常型プリオンを含むかもしれないいずれのものであっ
てもよく、好ましい例として、脳、脊髄、眼球、回腸遠
位部等の組織を挙げることができるが、これらに限定さ
れるものではなく、これらと接触した可能性のある他の
部位の組織や、器具、環境等であってもよい。また、試
料は、いずれの動物種由来のものであってもよく、通
常、ウシ、ヒツジ、ヒト、ネコ、マウス等、プリオン病
に罹ることがわかっている動物種に由来するが、これら
以外の動物種であってもよい。

【００１４】本発明の第１工程では、試料を界面活性
剤、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素で処理する。この
工程は、単一工程で行うことも、２工程以上に任意に分
けて行うことも可能であるが、界面活性剤処理、コラゲ
ナーゼ処理、蛋白質分解酵素処理を別々にこの順序で行
うことが好ましい。

【００１５】界面活性剤処理は、試料組織をバラバラに
するために行うものであり、この目的に用いることがで
きるいずれの界面活性剤も採用することができる。界面
活性剤は、両イオン性、陽イオン性、陰イオン性、非イ
オン性のいずれの界面活性剤でも良いが、両イオン性界
面活性剤が好ましい。また、試料組織は、界面活性剤と
共にすりつぶして組織乳剤の形態にすることが好まし
い。使用する界面活性剤の量は、特に限定されないが、
通常、２〜８重量％程度の界面活性剤を用いて５〜２０
重量％程度の濃度の組織乳剤を調製することが好まし
い。界面活性剤処理の条件は特に限定されないが、通
常、２０〜１００℃、好ましくは５５〜７５℃で、１５
〜２４０分間、好ましくは３０〜９０分間程度が適当で
ある。

【００１６】コラゲナーゼ処理は、試料組織中に含まれ
るコラーゲンを分解してプリオンが蛋白質分解酵素と接
触しやすくするために行うものである。コラゲナーゼの
使用量は特に限定されないが、試料組織１００ｍｇ当た
り、通常、0.2〜2 mg程度が適当である。また、コラゲ
ナーゼ処理の条件は特に限定されないが、通常、コラゲ
ナーゼの至適温度又はその近傍（±３℃程度）で、１時
間〜４時間程度が好ましい。なお、コラゲナーゼ処理と
同時に、又はコラゲナーゼ処理に続いて、DNase処理を
行って試料中のDNAを分解することが好ましい。DNaseの
使用量は、特に限定されないが、試料組織１００ｍｇ当
たり、通常、20μｇ〜80μｇ程度が適当である。また、
DNase処理を独立して行う場合の処理条件は、上記コラ
ゲナーゼ処理の条件と同様でよい。

【００１７】蛋白質分解酵素処理は、正常型プリオンを
分解するために行うものであり、正常型プリオンを分解
することができるいずれの蛋白質分解酵素も用いること
が可能である。好ましい蛋白質分解酵素としてプロテイ
ンアーゼＫを挙げることができる。蛋白質分解酵素の使
用量は、特に限定されないが、試料組織１００ｍｇ当た
り、通常、20μｇ〜80μｇ程度が適当である。また、蛋
白質分解酵素処理の条件は特に限定されないが、通常、
蛋白質分解酵素の至適温度又はその近傍（±３℃程度）
で、１５分間〜１時間程度が好ましい。蛋白質分解酵素
処理を行うことにより、正常型プリオンは分解される
が、異常型プリオンは蛋白質分解酵素に対して耐性を有
しているので分解されず、後の免疫測定工程において測
定可能である。 蛋白質酵素処理工程後、後の工程で変
性剤処理した異常型プリオンが分解されることを防止す
るために、用いた蛋白質分解酵素の阻害剤を添加して蛋
白質分解酵素を失活させておくことが好ましい。

【００１８】次に、得られた生成物を変性剤で処理し、
凝集を解いてエピトープを露出させる。変性剤として
は、上記したグアニジン若しくはその酸付加塩又はグア
ニジンチオシアン酸若しくはその塩が好ましいが、これ
らに限定されるものではない。変性剤処理における変性
剤の濃度は、特に限定されないが、最終濃度で１〜６
Ｍ、さらに好ましくは４〜６Ｍ程度である。また、処理
条件は、特に限定されないが、通常、２０〜８０℃、好
ましくは５５〜７５℃で、１５〜９０分間、好ましくは
１５〜３０分間程度が適当である。なお、次の免疫測定
に入る前に、変性剤の濃度が0.2〜0.8Ｍ程度になるよう
に希釈し、免疫測定に使用される抗体又はその抗原結合
性フラグメントが変性しないようにすることが好まし
い。

【００１９】本発明の方法では、上記蛋白質分解酵素処
理工程と変性剤処理工程との間に、遠心分離操作を含む
工程が入らない。従って、試料調製にかかる時間を従来
法よりも大幅に短縮することができ、多数の検体につい
て短時間に検査を行わなければならない場合等にとりわ
け有利である。

【００２０】次いで、上記のようにして調製した試料
を、免疫測定に供する。免疫測定の第１工程では、試料
と、第１抗体又はその抗原結合性フラグメントを不動化
した磁性粒子とを接触させる。これは、上記のようにし
て調製した試料溶液に、第１抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントを不動化した磁性粒子を添加することによっ
て行うことができるし、緩衝液のような反応媒体に試料
及び第１抗体又はその抗原結合性フラグメントを不動化
した磁性粒子を添加して混合することによっても行うこ
とができる。反応液中の磁性粒子の最終濃度は、特に限
定されないが、通常、１〜５重量％程度が適当であり、
また、試料の最終濃度は、出発物質として用いた組織の
重量に換算して０．１〜１０重量％程度が適当である。
磁性粒子の表面にプロテインＧが結合されており、磁性
粒子と、第１抗体と、試料とをこの段階で反応させる場
合には、反応液中の第１抗体の最終濃度は、特に限定さ
れないが、１０〜１００μｇ／ｍｌ程度が適当である。
免疫反応の温度は、特に限定されず、４℃〜３７℃程度
で行うことができ、室温で行うことが便利である。反応
時間は、温度にもよるが、室温で行う場合、特に限定さ
れないが、３０分間ないし２時間程度でよい。この工程
により、試料中存在する変性剤処理異常型プリオン（抗
原）が第１抗体又はその抗原結合性フラグメントに結合
され、ひいては磁性ビーズに結合される。

【００２１】次いで、反応後の磁性ビーズを洗浄する。
洗浄は、リン酸緩衝液のような緩衝液中にビーズを懸濁
し、磁力によってビーズを集めることによって容易に行
うことができる。洗浄液は、0.5〜２重量％程度の界面
活性剤を含んでいることが好ましい。

【００２２】続く第３工程で、ビーズと第２抗体又はそ
の抗原結合性フラグメントとを反応させる。第２抗体
も、第１抗体と同様、被検試料である、変性剤処理した
異常型プリオンと抗原抗体反応するものであり、第１抗
体について上記した説明をそのまま第２抗体の説明とし
て適用できる。もっとも、第１抗体及び第２抗体の両者
共にモノクローナル抗体を用いる場合には、抗原をサン
ドイッチする必要があるので、第１抗体及び第２抗体の
両者が同時に抗原に結合できる抗体の組合せを選択する
必要がある。この選択は、既知濃度の標準試料を用いて
実際に免疫測定を行い、正確な免疫測定が可能か否かを
調べるというルーチンな実験により容易に行うことがで
きる。また、第２抗体又はその抗原結合性フラグメント
は、後の工程で測定する必要があるので、第２抗体又は
その抗原結合性フラグメントを標識しておくことが好ま
しい。抗体又はその抗原結合性フラグメントの標識は、
免疫測定の分野において周知であり、酵素標識、蛍光標
識、ビオチン標識、放射標識等の周知の標識を常法によ
り抗体に結合することができる。また、感度を上げるた
めに、第２抗体はポリクローナル抗体とすることも好ま
しい。

【００２３】反応液中の第２抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントの最終濃度は、特に限定されないが、抗体の
重量として、通常、0.2〜１μｇ／ｍｌ程度が適当であ
る。また、免疫反応の温度は、特に限定されず、４℃〜
３７℃程度で行うことができ、室温で行うことが便利で
ある。反応時間は、温度にもよるが、室温で行う場合、
特に限定されないが、３０分間ないし２時間程度でよ
い。この工程により、第１抗体又はその抗原結合性フラ
グメントを介して磁性ビーズに結合されている試料中の
変性剤処理異常型プリオン（抗原）に第２抗体又はその
抗原結合性フラグメントが結合され、第１及び第２抗体
又はその抗原結合性フラグメントにより抗原がサンドイ
ッチされる。

【００２４】次に反応後のビーズを上記と同様に洗浄
し、ビーズを回収する。

【００２５】次いで、ビーズに結合された第２抗体又は
その抗原結合性フラグメントを測定する。なお、本明細
書において、「測定」は、検出と定量の両者を包含する
意味で用いており、検出のみを行う場合も定量まで行う
場合も本発明の免疫測定方法の範囲に含まれる。第２抗
体又はその抗原結合性フラグメントの測定は、第２抗体
又はその抗原結合性フラグメントが標識されている場合
には、この標識を測定することにより容易に行うことが
できる。標識の測定方法自体は免疫測定の分野において
周知であり、用いた標識に応じて常法により容易に行う
ことができる。第２抗体が標識されていない場合には、
第２抗体を誘導した動物の免疫グロブリンに結合する、
標識した第３抗体を第２抗体に結合させ、洗浄後、第３
抗体の標識を測定することにより第２抗体を測定するこ
とができる。

【００２６】種々の既知濃度の試料を用いて上記の免疫
測定を行うことにより検量線を作成することができ、こ
の検量線に基づいて未知の試料中の異常型プリオンを定
量することができる。

【００２７】本願発明者らは、種々の抗プリオンモノク
ローナル抗体を作出し、種々検討した結果、上記本発明
の免疫測定方法において、極めて高感度、高精度に異常
型プリオンを測定することができる２種類のモノクロー
ナル抗体の作出に成功した。すなわち、モノクローナル
抗体(mAb)44B1及び72-5である。これらのモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは、生命工学工業技術
研究所に寄託されており、受託番号は、それぞれFERM P
-18515及びFERM P-18516である。これらのモノクローナ
ル抗体を作出した方法は、下記具体例に詳述する。な
お、mAb 44B1及びmAb 72-5は、いずれか一方を第１抗体
として、他方を第２抗体として用いることにより、極め
て高感度、高精度な免疫測定を行うことができる。mAb
44B1を第１抗体として用いることがより好ましく、ま
た、mAb 44B1を第１抗体として用い、第２抗体としてポ
リクローナル抗体を用いても高感度、高精度な免疫測定
を行うことが可能である。

【００２８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２９】実施例１ モノクローナル抗体44B1及び
72-5の作出並びに対応エピトープの決定 (1) モノクローナル抗体の作出 C57BL/Jマウスから常法により染色体ＤＮＡを抽出し、
これを鋳型として用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲに用い
たプライマーは、MPrP5(aaggatccgaaaaagcggccaaagcctg
ga)及びMPrP3(gagaattcagctggatcttctcccgtcgt)であっ
た。これにより、マウスプリオン(PrP)の第２３番目〜
第２３０番目のアミノ酸配列(23-230a.a.)（２３０番目
のアミノ酸のコドンの次に停止コドンを挿入）をコード
する遺伝子領域を増幅した（配列番号１）。得られた増
幅断片を原核細胞発現ベクターpRSTEB（Invitrogen社）
およびpET22b（Novagen社）に組み込み、大腸菌にて組
換えPrP（rPrP）を発現させた(rPr23-231P（停止コドン
を含む）)。マウスrPr23-231Pは、常法に基づき、銅イ
オンアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーによ
り精製した。精製rPr23-231Pを免疫原とした。

【００３０】一方、プリオン感染マウス脳から分別遠心
法によりマウス異常型プリオン(PrPSc)を精製した。精
製は、Bolton, D. C.ら（Archives of Biochemistry an
d Biophysics, vol. 258, 579-590, 1987）の方法に従
い行った。。得られた精製マウスPrPScも免疫原として
用いた。

【００３１】得られた免疫原（濃度1.0 mg/ml）を等量
のフロイント完全アジュバントと混和し、PrP遺伝子欠
損マウス（Yokoyama et al., Journal of Biological C
hemistry, vol. 276, 11265-11271, 2001)に0.2 mg/ml
づつ頚部皮下に接種した。免疫は２週間ごとに計３回行
った。最終免疫3日後に脾臓を摘出し、細胞を分散させ
た後に、ポリエチレングリコール法によりP3U1ミエロー
マ細胞との細胞融合を行った。なお、動物から抗血清も
回収し、ポリクローナル抗体B-103を得た。

【００３２】抗PrP体産生細胞のスクリーニングは、pRS
ETBおよびpET22bにて発現させたマウスrPrPを抗原とし
たELISA法により行った。マウスrPrPを吸着させたELISA
プレートにハイブリドーマの培養上清を加えて反応させ
た後に洗浄し、続いてぺルオキシダーゼ標識抗マウス免
疫グロブリンロバ血清（Amersham Farmacia社）を反応
させた。ウェルを洗浄後に、ぺルオキシダーゼ基質を加
えて、波長405 nmにおける吸光度を測定した。ＥＬＩＳ
Ａの結果が陽性であったハイブリドーマの培養上清から
モノクローナル抗体を精製し、種々のモノクローナル抗
体を得た。

【００３３】これらの種々のモノクローナル抗体の種々
の組合せを用いて、後述する免疫測定を行い、特に高感
度、高精度で免疫測定が可能であったモノクローナル抗
体として、mAb 44B1及びmAb 72-5を選抜した。mAb 44B1
はrPr23-231Pを免疫原として得られたものであり、mAb
72-5は精製PrPScを免疫原として得られたものである。
これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、上記の通り生命工学工業技術研究所に寄託した。

【００３４】(2) 対応エピトープの決定 (1)のrPr23-231Pの作製方法と同様な方法により、マウ
スPrPの89-231a.a., 23-214a.a.,155-231a.a.及び23-16
7a.a.を作製した。これらの欠損変異体を抗原としたELI
SA法および免疫ブロット法によりエピトープを含むおお
まかな領域を決定した。免疫ブロットで陽性となる抗体
は連続エピトープを、陰性となる抗体は非連続エピトー
プを認識すると判定した。さらに、PrPの連続した13ア
ミノ酸配列のペプチド断片を結合させたセルロース膜
（ペプスポット膜）を使用して詳細なエピトープを決定
した。

【００３５】モノクローナル抗体のエピトープは表１に
示した。mAb 72-5はマウスPrPアミノ酸89-231から構成
される非連続エピトープを認識する。その一部はマウス
PrPアミノ酸143-151を含む。mAb 44B1はマウスPrPアミ
ノ酸155-231から構成される非連続エピトープを認識し
た。

【００３６】

【表１】表１ モノクローナル抗体のエピトープ

【００３７】実施例２ 免疫測定 (1) 試料の調製 試料組織としてプリオン感染マウス脳及び、陰性対照と
して非感染マウス脳を用いた。マウス脳を、4%両イオン
性界面活性剤(「Zwittergent 3-12」 (3-ドデシル-ジメ
チルアンモニオ-プロパン-1-スルフォネート、Calbioch
em-Novabiochem社製)、100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100
mM Tris (pH 7.5)を含む緩衝液中ですりつぶすし混和す
ることにより、１０重量％の脳組織を含む組織乳剤を調
製した。組織100 mgに対してコラゲナーゼ0.5 mg、DNas
e I 40μｇを加えて37℃、2時間処理した。組織100 mg
に対してプロテインアーゼK 40μｇを加えて37℃、30分
間処理した。プロテインアーゼK阻害剤であるペファブ
ロック（Roche社製）を最終濃度1 mMになるよう加え
た。グアニジンチオシアン酸を最終濃度５ Mになるよう
加え、PrPSc凝集体を変性させた（６５℃,１５分間）。
グアニジンチオシアン酸の濃度が0.4 M以下になるよう
に緩衝液で乳剤を希釈した。

【００３８】(2) 免疫測定 (1)で得られた被験試料にプロテインG結合磁性ビーズ
（Dynal社）と第１抗体であるmAb 44B1を加え、室温で
１時間撹拌した。プロテインG結合磁性ビーズの反応液
中の最終濃度は２重量％、mAb 44B1の反応液中の最終濃
度は100μｇ/mlであった。磁性ビーズを1％Triton X-10
0（商品名）を含むリン酸緩衝液で3回洗浄し、磁力をか
けてビーズを集めた。第２抗体としてビオチン化mAb 72
-5又はビオチン化ポリクローナル抗体B-103を使用し、
室温で一時間反応させた。第２抗体の反応液中の最終濃
度は、1μｇ/mlであった。磁性ビーズを1％ TritonX-10
0（商品名）を含むリン酸緩衝液で3回洗浄し、磁力をか
けてビーズを集めた。次いで、ぺルオキシダーゼ標識ス
トレプトアビジン（Pierce社）（最終濃度：2mg/ml）と
室温で30分間反応させた。磁性ビーズを1％ TritonX-10
0（商品名）を含むリン酸緩衝液で3回洗浄し、磁力をか
けてビーズを集めた。ぺルオキシダーゼ基質(100μｇ/m
lのABTS及び0.04%過酸化水素水）を加え5分間反応させ
た。波長405nmにおける吸光度を測定した。

【００３９】免疫磁性ビーズを用いたPrPScの検出結果
は表２に示した。プリオン感染動物では陽性であった
が、プリオン非感染動物では陰性であった。従って、免
疫磁性ビーズの使用により、プリオン感染動物にのみ存
在するPrPScを特異的に検出できることが明らかとなっ
た。

【００４０】

【表２】表２ 免疫磁性ビーズによるPrPScの検出

【００４１】

【発明の効果】本発明により、時間のかかる電気泳動操
作や遠心分離操作を行うことなく、高感度に異常型プリ
オンを検出することができる免疫測定法が初めて提供さ
れた。本発明の方法では、蛋白質分解酵素処理工程と変
性剤処理工程との間に、遠心分離操作を含む工程が入ら
ず、また、電気泳動も不要である。従って、試料調製に
かかる時間を従来法よりも大幅に短縮することができ、
多数の検体について短時間に検査を行わなければならな
い場合等にとりわけ有利である。

【００４２】

【配列表】 <110> FUJIREBIO INC. <120> Reagent and kit for immunoassay of abnormal type prion, and immun oassay of abnormal prion using the same <130> 01725 <160> 3

【００４３】 <210> 1 <211> 624 <212> DNA <213> mouse <400> 1 AAA AAG CGG CCA AAG CCT GGA GGG TGG AAC ACC GGT GGA AGC CGG TAT 48 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 CCC GGG CAG GGA AGC CCT GGA GGC AAC CGT TAC CCA CCT CAG GGT GGC 96 Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly 20 25 30 ACC TGG GGG CAG CCC CAC GGT GGT GGC TGG GGA CAA CCC CAT GGG GGC 144 Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly 35 40 45 AGC TGG GGA CAA CCT CAT GGT GGT AGT TGG GGT CAG CCC CAT GGC GGT 192 Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly 50 55 60 GGA TGG GGC CAA GGA GGG GGT ACC CAT AAT CAG TGG AAC AAG CCC AGC 240 Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser 65 70 75 80 AAA CCA AAA ACC AAC CTC AAG CAT GTG GCA GGG GCT GCG GCA GCT GGG 288 Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly 85 90 95 GCA GTA GTG GGG GGC CTT GGT GGC TAC ATG CTG GGG AGC GCC ATG AGC 336 Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser 100 105 110 AGG CCC ATG ATC CAT TTT GGC AAC GAC TGG GAG GAC CGC TAC TAC CGT 384 Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg 115 120 125 GAA AAC ATG TAC CGC TAC CCT AAC CAA GTG TAC TAC AGG CCA GTG GAT 432 Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp 130 135 140 CAG TAC AGC AAC CAG AAC AAC TTC GTG CAC GAC TGC GTC AAT ATC ACC 480 Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr 145 150 155 160 ATC AAG CAG CAC ACG GTC ACC ACC ACC ACC AAG GGG GAG AAC TTC ACC 528 Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr 165 170 175 GAG ACC GAT GTG AAG ATG ATG GAG CGC GTG GTG GAG CAG ATG TGC GTC 576 Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Val 180 185 190 ACC CAG TAC CAG AAG GAG TCC CAG GCC TAT TAC GAC GGG AGA AGA TCC 624 Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser 195 200 205

【００４４】 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for PCR for amplifying 23-230a.a . of murine prion <400> 2 aaggatccga aaaagcggcc aaagcctgga 30

【００４５】 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as primer used for PCR for amplifying 23-230a.a . of murine prion <400> 3 gagaattcag ctggatcttc tcccgtcgt 29

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松井 利生 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 (72)発明者 梅谷 淳 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4H045 AA11 DA76 FA74

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 磁性粒子に、変性剤処理した異常型プリ
   オンと抗原抗体反応する第１抗体又はその抗原結合性フ
   ラグメントを不動化して成る異常型プリオン免疫測定用
   試薬。
2. 【請求項２】 前記変性剤は、グアニジン若しくはその
   酸付加塩又はグアニジンチオシアン酸若しくはその塩で
   ある請求項１記載の試薬。
3. 【請求項３】 前記磁性粒子の表面にはプロテインＧが
   結合されており、前記第１抗体の不動化は、免疫測定時
   にその場で行われたものである請求項１又は２記載の試
   薬。
4. 【請求項４】 前記第１抗体は、モノクローナル抗体44
   B1(FERM P-18515)又はモノクローナル抗体72-5(FERM P-
   18516)である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   試薬。
5. 【請求項５】 請求項１、２又は４のいずれか１項に記
   載の試薬と、前記第１抗体又はその抗原結合性フラグメ
   ントに捕捉された、変性剤処理した異常型プリオンと抗
   原抗体反応する第２抗体とを少なくとも含む、異常型プ
   リオン免疫測定用キット。
6. 【請求項６】 表面にプロテインＧが結合された磁性粒
   子と、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体反応す
   る第１抗体と、前記第１抗体に捕捉された、変性剤処理
   した異常型プリオンと抗原抗体反応する第２抗体又はそ
   の抗原結合性フラグメントとを少なくとも含む、異常型
   プリオン免疫測定用キット。
7. 【請求項７】 前記第２抗体又はその抗原結合性フラグ
   メントが標識されている請求項５又は６記載のキット。
8. 【請求項８】 前記第１抗体がモノクローナル抗体44B1
   (FERM P-18515)であり前記第２抗体がモノクローナル抗
   体72-5(FERM P-18516)若しくはポリクローナル抗体であ
   るか、又は前記第１抗体がモノクローナル抗体72-5(FER
   M P-18516)であり、前記第２抗体がモノクローナル抗体
   44B1(FERM P-18515)若しくはポリクローナル抗体である
   請求項６又は７記載のキット。
9. 【請求項９】 異常型プリオンを含んでいるかもしれな
   い試料を界面活性剤、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素
   で処理する工程と、次いで遠心分離操作を経ることな
   く、得られた生成物を変性剤で処理する工程と、得られ
   た生成物を請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の
   試薬と反応させる工程と、磁性ビーズを洗浄し、磁力に
   より磁性ビーズを集める工程と、前記第１抗体又はその
   抗原結合性フラグメントに捕捉された、変性剤処理した
   異常型プリオンと抗原抗体反応する第２抗体又はその抗
   原結合性フラグメントを反応させる工程と、磁性ビーズ
   を洗浄し、磁力により磁性ビーズを集める工程と、磁性
   ビーズに結合した第２抗体又はその抗原結合性フラグメ
   ントを測定する工程とを含む、異常型プリオンの測定方
   法。
10. 【請求項１０】 異常型プリオンを含んでいるかもしれ
    ない試料を界面活性剤、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵
    素で処理する工程と、次いで遠心分離操作を経ることな
    く、得られた生成物を変性剤で処理する工程と、得られ
    た生成物と、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体
    反応する第１抗体と、表面にプロテインＧが結合された
    磁性粒子とを反応させる工程と、磁性ビーズを洗浄し、
    磁力により磁性ビーズを集める工程と、前記第１抗体に
    捕捉された、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体
    反応する第２抗体又はその抗原結合性フラグメントを反
    応させる工程と、磁性ビーズを洗浄し、磁力により磁性
    ビーズを集める工程と、磁性ビーズに結合した第２抗体
    又はその抗原結合性フラグメントを測定する工程とを含
    む、異常型プリオンの測定方法。
11. 【請求項１１】 試料を界面活性剤、コラゲナーゼ及び
    蛋白質分解酵素で処理する工程は、界面活性剤処理、コ
    ラーゲン処理、蛋白質分解酵素処理をこの順序で逐次行
    うことにより行われる請求項９又は１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記蛋白質分解酵素がプロテインアー
    ゼＫである請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 蛋白質分解酵素処理後、該蛋白質分解
    酵素の阻害剤を添加する工程をさらに含む請求項９ない
    し１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記第２抗体又はその抗原結合性フラ
    グメントが標識されており、磁性ビーズに結合した第２
    抗体又はその抗原結合性フラグメントを測定する工程
    は、磁性ビーズに結合した該標識を測定することにより
    行われる請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 前記第１抗体がモノクローナル抗体44
    B1(FERM P-18515)であり前記第２抗体がモノクローナル
    抗体72-5(FERM P-18516)若しくはポリクローナル抗体で
    あるか、又は前記第１抗体がモノクローナル抗体72-5(F
    ERM P-18516)であり、前記第２抗体がモノクローナル抗
    体44B1(FERM P-18515)若しくはポリクローナル抗体であ
    る請求項９ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 モノクローナル抗体44B1(FERM P-1851
    5)。
17. 【請求項１７】 モノクローナル抗体72-5(FERM P-1851
    6)。