CZ283356B6

CZ283356B6 - Způsob čištění inzulinu a/nebo inzulinových derivátů chromatografií

Info

Publication number: CZ283356B6
Application number: CS912717A
Authority: CZ
Inventors: Rainer Dr. Dickhardt; Bernhard Dr. Unger; Leonard Dr. Häfner
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1998-03-18
Also published as: AU637255B2; DE4028120C2; KR920006372A; US5245008A; EP0474213A1; CA2050644C; PL168114B1; HRP940716A2; EP0474213B1; FI914150A0; IL99384A0; NO913476L; NO180681C; KR100191699B1; RU2037500C1; LT3329B; DE59106519D1; ES2078405T3; JPH04230699A; LV10105A

Abstract

Způsob čištění inzulínů a inzulinových derivátů chromatografií ve vodných pufrovaných rozpouštědlech, která obsahují s vodou mísitelná organická rozpouštědla, na lipofilně modifikovaném silikagelu, přičemž vodná, pufrovaná rozpouštědla obsahují obojetné iony, nebo hodnota pH směsi rozpouštědel leží v blízkosti isoelektrického bodu čištěného inzulinu nebo derivátu inzulinu a jsou přítomné obojetné iony.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu čištění inzulínu a/nebo inzulínových derivátů chromatografií ve vodných pufrovaných rozpouštědlech, která obsahují s vodou mísitelná organická rozpouštědla, na lipofilně modifikovaném silikagelu.

Dosavadní stav techniky

Z analytických dělicích postupů je čištění inzulínu nebo inzulínových derivátů na lipofilně modifikovaných silikagelech známé a mnoho let se ve vysokotlaké kapalinové chromatografii (HPLC) úspěšně používá (WS Welinder et al., J. chrom., 361, (1986) 357-367). V analytickém měřítku se proteinová množství v pg-rozsahu nanáší na sloupec z ocele, ze skla nebo ze synthetické hmoty plněný modifikovaným silikagelem a potom se proudící kapalinovou směsí eluuje (zpravidla kyselé, vodné roztoky pufrů s konstantní nebo proměnnou koncentrací organických rozpouštědel). Obsah proteinů činí při tom mnohem méně než 30 pg/ml objemu sloupce.

Dosavadní čisticí postupy používají často v laboratoři používaná, relativně toxická rozpouštědla (acetonitril) a korosivní, drahé pufřové komponenty, například tetraalkylamoniové sole, alkylsulfonáty, hexafluoraceton, trifluoracetát (E. P. Kroeff et al., J. Chrom., 461, (1989), 45-61). Tyto rozpouštěcí prostředky nevedou u směsí silněji znečistěných látkami podobnými inzulínu k uspokojivému preparativnímu dělení vzhledem na kvalitu, výtěžek hlavní komponenty a celkového zpětného získání (J. Rivier, R. McClintock, J. Chrom., 268 (1983) 112-119; Peter et al., J. Chrom. 408 (1987) 43-52).

Inzulíny z dřívějších chemických přeměn, jako například ze silně kyselých esterových štěpení nebo enzymatických (trans-) peptidisačních procesů, krystalisačních čištění aj. obsahují zpravidla průvodní látky s podobnými vlastnostmi. Nechají se čistit volbou určité hodnoty pH chromatografií na iontoměničích, když jsou dostatečné rozdíly elektrického náboje (US 4 129 560). Nevýhoda této methody spočívá ve zřeďovacím efektu a tím ve ztrátách cenných látek v přebytcích při zpracování sraženin, v relativně dlouhé době cyklu nebo v tom, že je malé zpětné získání, a tím malé výtěžky.

Preparativního dělení je možno principiálně dosáhnout zvětšením obsahu sloupce, zatížení a průchodu elučního prostředku. Množství potřebných organických rozpouštědel je například u sloupců s průměry >20 cm v měřítku m³. Rozpouštědla používaná k analytické HPLC (například acetonitril, DMF, methanol, dioxan atd.) jsou toxická, takže používání těchto method v preparativní míře produkce vyžaduje nákladná ochranná opatření.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je vyvinout způsob chromatografického čištění inzulínů a inzulínových derivátů, při kterém by zůstala zachována biologická aktivita inzulínů, dosáhlo se vysoké čistoty jedním chromatografickým postupem, krátkodobých cyklů, životnosti sloupce více než 50 chromatografických cyklů, regenerace stracionemí silikagelové fáze bez časově náročných vytěsňovacích postupů a použití netoxických rozpouštědel tak, aby byla možná preparativní míra produkce.

- 1 CZ 283356 B6

Nyní byl nalezen způsob čištění inzulínu a/nebo inzulínových derivátů chromatografíí ve vodných pufrovaných rozpouštědlech, obsahujících s vodou mísitelná organická rozpouštědla, na lipofilně modifikovaném silikagelu, jehož podstata spočívá v tom, že v pufrovaných rozpouštědlech a/nebo směsi rozpouštědel jsou rozpuštěné obojetné ionty, přičemž hodnota pH směsi rozpouštědel leží až do 1 pH jednotky pod nebo nad isoelektrickým bodem čištěného inzulínu nebo derivátu inzulínu.

Výhodně leží hodnota pH směsi rozpouštědel až do 0,5 pH jednotky pod nebo nad isoelektrickým bodem ajako obojetné ionty se použijí α-aminokyseliny, betainy, glycin, kyselina glutamová nebo glycinbetain.

Překvapivě přítomnost obojetných iontů při chromatografíí při hodnotě pH rozpouštědla, která leží v blízkosti isoelektrického bodu čištěného inzulínu nebo derivátů inzulínu a přítomnost obojetných iontů, působí nejen dobré dělení požadovaného produktu a nečistot, ale i dobré oddělení proteinů od stacionární fáze (lipofilně modifikovaný silikagel). Dosažené dělení dovoluje čistit inzulínové roztoky silně znečištěné komponentami podobnými inzulínu, jako například oddělování A21-des-amidoinzulinu od inzulínu a inzulínových derivátů. Dále se dobrým oddělením proteinů od pevné fáze umožňuje dlouhá životnost sloupců a vysoký stupeň získávání inzulínu.

Při způsobu podle vynálezu se mohou použít všechny druhy inzulínu, např. inzulíny zvířecího nebo lidského původu, inzulínové přední frakce, jako např. proinzuliny nebo preproinzuliny, nebo rekombinantní inzulíny nebo deriváty inzulínu, které se exprimují od geneticky modifikovaných mikroorganismů. Dále se také mohou nasazovat deriváty inzulínu, které jsou vyrobené například chemickou nebo enzymatickou derivatisací, například Des-Phe-B 1-inzulin, inzulin-^-ketensulfonát, diarginininzulin (B31, B32), monoarginininzulin nebo difenylalanininzulin (B31, B32) (US 4 601 852).

Výhodně se používají deriváty inzulínu vzorce I

(I) ve kterém

R³⁰ značí zbytek geneticky kodovatelné L-aminokyseliny,

X značí hydroxyskupinu nebo zbytek geneticky kodovatelné L-aminokyseliny, přičemž její popřípadě přítomná koncová karboxylová funkce může být volná, jako esterová funkce, jako amidová funkce, jako lakton nebo redukovaná na CH₂OH, n značí celé číslo 0 až 10,

Y značí vodíkový atom nebo zbytek L-fenylalaninu a

-2CZ 283356 B6

A- a B-řetězce jsou řetězce zvířecího nebo lidského inzulínu.

Obzvláště výhodně se čistí deriváty inzulínu obecného vzorce I, ve kterém _r3° značí zbytek L-alaninu nebo L-threoninu a

X značí jeden nebo několik zbytků L-aminokyselin ze skupiny zahrnující L-arginin, L-lysin a L-fenylalanin.

Inzulín a inzulínové deriváty se mohou používat jak v poměrně nečistém stavu, tak také v předčištěné formě (např. chromatografií na gelu). Inzulín je po několikanásobné krystalisaci i po chromatografií na gelu ještě znečištěn průvodními látkami podobnými inzulínu o velmi podobné molekulové hmotnosti, které se při vhodně voleném pH ve svém náboji navzájem a od inzulínu liší, ale tvoří s inzulínem komplexy (US 4 129 560). Příklady takových látek jsou desamidoinzuliny, arginininzulin a diarginininzulin, inzulin-ethylester a jiné.

Pod lipofilně modifikovaným silikagelem se rozumí silikagel, na který je nanesena hydrofobní matrice. Příklady pro hydrofobní matrici jsou alkany s délkou řetězce 3 až 20 atomů uhlíku. Zvlášť výhodné lipofilně modifikované silikagelové materiály jsou například:

-^(R) Nucleosil, firma Macherey a Nagel:

sférické anesférické materiály různé velikosti zrn až do 45 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm modifikované C8 popřípadě Cl8

-^(R) Lichroprep, firma Měrek: sférické a nesférické materiály různé velikosti zrn až 40 pm, vzdálenost pórů 0,006 pm 0,025 pm, C8 - Cl8 modifikované C8

-^(R) Lichrospher select B, firma Měrek:

sférický materiál velikosti zrn až 25 pm, C8-modifikovaný

-^(R) Waters Prep, C18-modifikovaný, 50 - 105 pm, nesférický, vzdálenost pórů 0,01 pm

-^(R) Zorbax Pro 10, firma DuPont:

C8-modifikovaný, 10 pm, sférický, vzdálenost pórů 0,01 pm

-^(R) Kromasil, firma EKA Nobel:

C4-, C8-C18-modifikovaný, až 16 pm, sférický, vzdálenost pórů 0,01; 0,015 nebo 0,02 pm.

Obojetné ionty jsou sloučeniny, které mohou přijímat a také odštěpovat protony, tj. tvořit v kyselém roztoku kationty a v alkalickém roztoku anionty, jako například a-aminokyseliny, betain nebo deriváty betainu. Výhodné obojetné ionty jsou glycin, glutamin nebo betain (N-trimethyl-glycin). Zvlášť výhodný je glycin.

Isoelektrickým bodem (IEB) inzulínu nebo derivátů inzulínu je taková hodnota pH roztoku inzulínu, ve které počet kationických nábojů a anionických nábojů rozpuštěného inzulínu se rovná nule. Například IEB vepřového inzulínu leží mezi pH 5,3 a 5,4 (H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, sv. II/A, The Proteins, str. 636). Pojmem v blízkosti isoelektrického bodu se míní zejména hodnoty pH, které leží ca. o 1 pH jednotku nad nebo pod IEB čištěného inzulínu. Zvlášť výhodné jsou hodnoty pH, které leží až do 0,5 pH jednotky nad nebo pod IEB.

Eluční prostředky obsahují pufrovací látku, aby se hodnota pH elučního prostředku udržovala konstantní. Vhodné pufrovací látky jsou známé z literatury, například fosfáty, soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin, jako citrát sodný nebo octan draselný, citrát amonný, octan amonný, síran amonný nebo chlorid amonný.

Dále eluční prostředky obsahují s vodou mísitelná organická rozpouštědla jako například alkoholy, ketony, methylacetát, dioxan, dimethylsulfoxid nebo acetonitril. Výhodné jsou alkoholy jako n-propanol nebo isopropanol, methanol, ethanol nebo methylacetát.

Koncentrace s vodou mísitelných organických rozpouštědel leží mezi 1 a 90 %, výhodně 10 a 60%, zvlášť výhodně mezi 10 a 35%. Koncentrace pufrovací látky leží mezi 1 mmol/1 a 2 mol na litr, vztaženo na vodu jako rozpouštědlo, výhodně mezi 25 mmol/1 a 1 mol/1. Koncentrace obojetných iontů může kolísat v širokém rozsahu. Výhodná množství leží mezi 10 mmol/1 a 1 mol/1, vztaženo na vodu jako rozpouštědlo, zejména mezi 20 mmol/1 a 500 mmol/1.

Teplota během chromatografie leží mezi 0 °C a 50 °C, výhodně mezi 15 a 30 °C, zvlášť výhodně mezi 15 a20°C. Provozní tlak během chromatografie je konstantní. Chromatografie se může provádět různým tlakem, například se chromatografie může provádět při tlaku 5 až 400 . 10⁵ Pa, zejména při 20 až 100.10⁵ Pa.

Zatížení sloupců, chromatografie aeluce inzulínu a derivátů inzulínu se provádí známými, obvyklými, technickými methodami. Zatížení sloupce čištěným roztokem inzulínu se výhodně provádí vodným, alkoholickým nebo čistě vodným roztokem pufru. Roztok inzulínu má podíl proteinu, který je mezi 1 a 10 %, výhodně kolem 3 %.

Eluce inzulínu se způsobem podle vynálezu provádí při konstantní koncentraci pufrovací látky (isokraticky) nebo změnou podílu s vodou mísitelného organického rozpouštědla u pufru. Změna podílu organického rozpouštědla se provádí tím způsobem, že koncentrace použitého organického rozpouštědla v závislosti na elučním objemu stoupá a to výhodně lineárně.

Oddělování inzulínu z eluátů po chromatografii se provádí srážením zinkem nebo krystalisací. Při tom se roztok může nejdříve pomocí vakuové destilace zbavit rozpouštědla a jeho koncentrace redukovat zředěním vodou. V každém případě by měla koncentrace rozpouštědla před srážením nebo před krystalisací být kolem 10 % nebo níže, aby se obsah proteinu v přebytku udržoval na <50 mg/1. Vznikající čisté inzulínové sraženiny se nechají izolovat dekantací, odstředěním nebo filtrací a suší se.

Způsob podle vynálezu se hodí nejen k analytické chromatografii ale i k preparativní chromatografii, zejména když se způsob podle vynálezu provádí v preparativním zařízení pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii.

Pod pojmem preparativní chromatografie se rozumí čisticí postup s cílem získat čisté produkty a ne pouze k analyzování. Množství čistých produktů může kolísat v širokých hranicích, například od 1 mg do 50 kg, výhodně mezi 50 mg a 15 kg.

V následujících příkladech se způsob podle vynálezu popisuje v jednotlivostech. Procentické údaje se vztahují na hmotnost, pokud není uvedeno jinak.

-4 CZ 283356 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pufr A: 0,2 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,05 M citran sodný, pH 5,5, čistě vodný

Pufr B: 0,1 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,05 M citran sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

Sorbens: Nucleosil Cl8, 15-25 pm sférický, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. Machery aNagel, Duřen

Rozměry sloupce: 40 mm x 250 mm

Zatížení sloupce se provede 3,5 g lidského inzulínu (LI) získaného štěpením lidského inzulinB30-di-terc.butyl-ester/etheru kyselinou trifluoroctovou, s podílem proteinu 79,1%. Eluce inzulínu se provádí tím, že se roztok pufru A a B smísí pomocí vysokotlakého čerpadla a míchacího zařízení, takže se připraví propanolový gradient 14 až 20 %. Eluce inzulínu se provádí při asi 17,5 % propanolu po 23 minutách, když se čerpá 46 ml/min.

Po frakcionaci a isolaci krystalovaného lidského inzulínu (LI) se získá produkt s 97 % proteinu v 88,5% výtěžku v hlavní frakci a 7,5% výtěžek vedlejší frakce s 85,7 % proteinového podílu. Celkový zisk činí tak 96,0 % předloženého inzulínu.

Příklad 2

Pufr A: 0,1 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M citran sodný, pH 5,5, čistě vodný

Pufr B: 0,05 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M citran sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

Sorbens: Nucleosil C18-P, 15-25 pm sférický, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. Macherey a Nagel

Rozměry sloupce: 40 mm x 250 mm

Sloupec se pomocí vysokotlakého čerpadla zatíží 7,0 g lidského inzulínu (LI) (86,1 % podílu proteinu) z esterového štěpení lidského inzulin-di-terc.butyl-ester/etheru ve formě 3% roztoku v 0,1 M pufru glycin/HCl, pH 2,8. Potom se provede eluce roztoky shora popsaných pufrů pod tlakem v n-propanolovém gradientu. Během 60 minut stoupá koncentrace propanolu ze 14 na 17,5 %. Po frakcionaci a krystalisaci shora popsaným způsobem se získá produkt s 98,7 % podílu proteinu. Výtěžek čištěného lidského inzulínu leží kolem 91 % nasazeného inzulínu.

Příklad 3

Pufr A: 0,1 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, čistě vodný

Pufr B: 0,05 M síran amonnný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

- 5 CZ 283356 B6

Sorbens: Lichrospher Select B, C8,15-25 pm, vzdálenost pórů 0,006 pm, fina. Měrek

Rozměry sloupce: 50 mm x 250 mm

Sloupec se zatíží roztokem 10 g reakční směsi zpřeamidace vepřového inzulínu trypsinem, rozpuštěné ve 200 ml 0,1 M pufru glycin/HCl, pH 2,8. Během 120 minut se při toku 40 ml/min. a zvýšení koncentrace propanolu ze 14 na 30 % odděleně eluují jednotlivé proteinové komponenty. Po krystalisaci popřípadě srážení a sušení se jako hlavní frakce získá lidský inzulin-B30di-terc.butylthreoninester/ether s čistotou >97 % s výtěžkem 93 %, vztaženo na nasazený inzulín.

Příklad 4

Pufr A: 0,1 M chlorid sodný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, čistě vodný

Pufr B: 0,05 M chlorid sodný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

Sorbens: Zorbax Pro 10, C8, 10 pm, fma. DuPont.

Rozměry sloupce: 5 cm x 25 cm

7,5 g LI ze štěpení lidského inzulin-B30-di-terc.butylthreoninester/etheru kyselinou trifluoroctovou ve 100 ml 0,1 M roztoku glycin/HCl se čerpá na sloupec a při toku 80 ml/min se eluuje. Koncentrace pufru B během 60 minut stoupá z 18 na 25 %. Doba retence (Rt) činí zde ca. 37 minut. Z hlavní frakce se nechá po krystalisaci a sušení isolovat 96,8 % LI z násady o čistotě >97 %, vedlejší frakce obsahuje 2,2 % LI s čistotou <50 %.

Příklad 5

Pufr A: 0,2 M síran sodný, 0,1 M glycin, 0,03 M octan amonný, pH 5,5, 10 % methylacetátu

PufrB: 0,05 M síranu sodného, 0,1 M glycinu, 0,03 M octan amonný, pH 5,5, 20% methylacetátu

Sorbens: Kromasil C8, 13 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. EKA Nobel

Rozměry sloupce: 5 cm x 25 cm

8g hovězího inzulínu pro litr objemu sloupce se pomocí 0,1 M pufru glycin/HCl nanese na sloupec, ekvilibrovaný při 30 % pufru B. Během 90 minut koncentrace pufru B stoupá na 80 % (= 18 % methylacetátu). Hovězí inzulín eluuje po 65 minutách s čistotou >97,5 % v hlavní frakci (63,5 % výtěžku) a po zředění vodou se sráží chloridem zinečnatým. Celkový zisk činí 92,5 %.

Příklad 6

Pufr A: 0,1 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, 5 % n-propanol

Pufr B: 0,05 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

-6CZ 283356 B6

Sorbens: Kromasil C8, 13 μιη, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. EKA Nobel

Rozměry sloupce: 5 cm x 25 cm

Zatížení sloupce je 4 g (= 8 g/1) lidského inzulínu ze štěpení lidského inzulin-B30-di-terc. butylthreoninester/etheru kyselinou trifluoroctovou s čistotou ca. 92 %. V gradientu z 18 na 25 % pufru B během 90 minut eluuje lidský inzulín po 45 minutách s čistotou >97 % v hlavní frakci (výtěžek 91,8 %) a 80,5 % ve vedlejší frakci (výtěžek 4,7 %).

Příklad 7

Pufr A: 0,1 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,026 M octan sodný, pH 5,5, 10 % n-propanol

Pufr B: 0,05 síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M octan sodný, pH 5,5, voda/n-propanol v poměru 1:1

Sorbens: Kromasil C8, 13pm, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. EKA Nobel

Rozměry sloupce: 10 cm x 40 cm

Na sloupec se dá 18 g vepřového inzulínu v 1,8 1 0,1 M pufru glycin/HCl, pH 3,0, s 5% n-propanolu. Gradient proběhne z 9% pufru B (=13,6% n-propanolu) na 11% pufru B (= 14,4% n-propanolu) v 70 minutách. Vepřový inzulín eluuje po 50 minutách s obsahem proteinu >98 % v hlavní frakci (89 % výtěžku). Celkový zisk činí 96,8 % násady.

Příklad 8

Pufr A: 0,2 M chlorid amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M citran sodný, 5 % n-propanol, pH 5,5

Pufr B: jako pufr A, avšak přídavek 50 % n-propanolu

Sorbens: Kromasil C8, 13 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. EKA Nobel, Švédsko

Rozměry sloupce: 50 mm x 250 mm g genovou technikou vyrobeného lidského inzulínu (89,5 % po dílu proteinu) se rozpustí v 0,1 M glycinovém pufru, pH 3,0, jako 2% proteinový roztok a vysokotlakým čerpadlem se čerpá na sloupec. Eluce proběhne lineárním gradientem z 13 % na 16% n-propanolu během 70 minut při toku 80 ml/min. Po frakcionaci a krystalisaci se získá v hlavní frakci lidský inzulín s obsahem proteinu 98 % s výtěžkem 93 %. Celkový zisk leží kolem 98 % vztaženo na násadu.

Příklad 9

Pufr A: 0,2 M síran amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M citran amonný, 5 % ethanol, pH 5,5

Pufr B: jako pufr A, ale přídavek 50 % ethanolu

Sorbens: Kromasil C8, 10 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm, fma. EKA Nobel, Švédsko

-7CZ 283356 B6

Rozměiy sloupce: 50 mm x 250 mm

Ve 250 ml glycinového pufru, pH 3,0 se rozpustí 4,5 g genovou technikou vyrobeného lidského inzulínu (86,2 % proteinového podílu) a pak se čerpá na sloupec. K chromatografii proteinu se dvěma vysokotlakými čerpadly vyrobí lineární gradient z obou pufřů A a B. Eluce se provádí po 100 minutách při koncentraci ethanolu 33% a konstantním toku 80 ml/min. Po frakcionaci a krystalisaci se získá v hlavní frakci lidský inzulín s obsahem proteinu 96 % při celkovém zisku 93 % vztaženo na vsazený produkt.

Příklad 10

Pufr A: 0,2 M chlorid amonný, 0,1 M glycin, 0,025 M citran sodný, 10 % methylacetát, pH 5,5

Pufr B: stejná koncentrace solí jako v pufru A, ale 20 % methylacetátu

Pro chromatografii se 4,6 g surového lidského inzulínu pocházejícího ze zpracování genovou technikou vyrobeného inzulínu rozpustí ve 200 ml vodného glycinového pufru a pak se čerpá na HPLC-sloupec 50 x 250 mm. Sloupcový materiál se předtím vzájemným smícháním pufru A a B pomocí dvou vysokotlakých čerpadel ekvilibruje na methylacetátovou koncentraci 13 % methylacetátu. Po podání se provádí eluce lidského inzulínu lineárním gradientem z 13 % na 17 % methylacetátu během 90 minut. Isolace hlavního produktu se provádí krystalisaci z elučního roztoku. Při tom se získá 3,8 g lidského inzulínu s podílem proteinu 96 %. Celkový zisk, vztaženo na výchozí materiál, činí při tom 90 %.

Příklad 11

Pufr A: 0,2 M síran amonný, 0,1 M betain, 0,05 M kyselina citrónová, pH 5,5 s louhem sodným, čistě vodný

Pufr B: 0,1 M síran amonný, 0,1 M betain, 0,05 M kyselina citrónová, pH 5,5 s louhem sodným, voda/iso-propanol v poměru 1:1

Sorbens: Nucleosil Cl8, 15 - 25 pm sférický, vzdálenost pórů 0,01 pm

Sloupec: 40 mm x 250 mm

Tok: 45 ml/min

Sloupec se pomocí vysokotlakého čerpadla zatíží 3 g (79 % podíl proteinu) lidského inzulínu z esterového štěpení lidský inzulin-di-terc.butyl-ester/etheru ve formě 3% roztoku v 0,1 M pufru betain/HCl, pH 3,0. Potom se shora jmenovaným systémem pufřů při 44 % pufru B isokraticky eluuje. Doba retence činí ca. 35 minut. Po frakcionaci se v hlavní frakci získá 98,1 % lidského inzulínu s 80,5 % výtěžku. Celkový zisk činí 90,5 %.

Příklad 12

Pufr A: 0,1 M síran amonný, 0,1 M kyselina glutaminová, 0,05 M kyselina citrónová, pH 5,45 s louhem sodným, čistě vodný

-8CZ 283356 B6

Pufr B: 0,1 M síran amonný, 0,1 M kyselina glutaminová, 0,05 M kyselina citrónová, pH 5,5 s louhem sodným, voda/n-propanol 1:1

Sorbens: Nucleosil C18-P, 15-25 pm sférický, vzdálenost pórů 0,01 μπι

Sloupec: 50 mm x 250 mm

Tok: 60 ml/min

Sloupec se zatíží 6 g (73 % podíl proteinu) lidského inzulínu z esterového štěpení lidského inzulin-di-terc.butyl-ester/ etheru ve formě 3% roztoku v 0,1 M kyselině octové, pH 3,0. Potom se v gradientu eluuje shora jmenovaným systémem pufrů při 25 % - 28 % pufru B. Doba retence činí ca. 25 minut. Po frakcionaci se v hlavní frakci získá 98,6 % lidského inzulínu s 65 % výtěžkem. Celkový zisk činí 88,5 %.

Příklad 13

Pufr A: 0,15 M síran amonný, 0,10 M triethylamin, pH 6,5 s kyselinou sírovou, čistě vodný

Pufr B: 0,08 M síran amonný, 0,05 M triethylamin, pH 6,5 s kyselinou sírovou, voda/2-propanol 1:1

Sorbens: Nucleosil C18-P, 15-25 μιη sférický, vzdálenost pórů 0,01 pm

Sloupec: 50 mm x 250 mm

Tok: 60 ml/min

Po zatížení sloupce 5 g lidského inzulínu ze štěpení kyselinou trifluoroctovou lidského inzulindi-terc.butyl-threoninester/ether, v 3% roztoku se eluuje mezi 32 a 42 % pufru B. Doba retence činí 40 minut. Po frakcionaci a krystalisaci se získá 72 % v hlavní frakci s čistotou 92,7 %. Celkový zisk je kolem 76 % nasazeného množství.

Příklad 14

Pufr A: 0,1 M kyselina citrónová, 0,2 M síran amonný, pH 2,5 s kyselinou chlorovodíkovou, čistě vodný

Pufr B: 0,1 M kyselina citrónová, 0,1 M síran amonný, pH 2,5 s kyselinou chlorovodíkovou, voda/n-propanol 1:1

Sorbens: Nucleosil Cl8, fina. Macherey a Nagel

Sloupec: 40 x 250 mm

Tok: 45 ml/min

Po zatížení sloupce 3 g lidského inzulínu ze štěpení kyselinou trifluoroctovou lidského inzulindi-terc.butyl-threonin ester/etheru ve formě 3% roztoku v 0,1 M glycinovém pufru pH 3,0 se eluuje mezi 34 a 35 % pufru B. Doba retence činí 45 minut. Po frakcionaci, krystalisaci a sušení

-9CZ 283356 B6 se isoluje 57 % vsazeného množství v hlavní frakci s čistotou 94,8 % a 16 % ve vedlejší frakci (čistota 84 %).

Příklad 15

Pufr A: 0,1 M kyselina citrónová, 0,2 M síran amonný, pH 3,5 s kyselinou chlorovodíkovou, čistě vodný

Pufr B: 0,1 M kyselina citrónová, 0,1 M síran amonný, pH 3,5 s kyselinou chlorovodíkovou, voda/n-propanol 1:1

Sorbens: Nucleosil Cl8, fina. Macharey aNagel

Sloupec: 40 x 250 mm

Tok: 45 ml/min

Zatížení sloupce se provede jako v příkladu 14. Doba retence je ca. 40 minut. Po frakcionaci, krystalisaci a sušení se získá 51 % vsazeného lidského inzulínu s čistotou 97,5 % v hlavní frakci a 4 % ve vedlejší frakci (68 % čistoty).

Příklad 16

Pufr A: 0,1 M Tris, 0,1 M glycin, 0,1 M chlorid amonný, pH 8,5 s kyselinou chlorovodíkovou, čistě vodný

Pufr B: 0,1 M Tris, 0,1 M glycin, 0,1 M chlorid amonný, pH 8,5 s kyselinou chlorovodíkovou, voda/n-propanol 1:1

Sorbens: Kromasil C8, 13 μπι, vzdálenost póru 0,01 pm

Sloupec: 50 mm x 250 mm

Tok: 60 ml/min

Sloupec ekvilibrovaný na 33 % pufru B se zatíží 6 g lidského inzulínu ze štěpení kyselinou trifluoroctovou (viz příklad 14) ve formě 3% roztoku v 0,1 M Tris-pufru, pH 8,5. Eluce se provede ca. po 35 minutách. Po frakcionaci a krystalisaci se získá hlavní frakce 96,6 % lidský inzulín s výtěžkem 86 %. Celkový zisk je kolem 95 %.

Příklad 17

Pufr A: 0,1 M chlorid amonný, 0,025 M kyselina citrónová, pH 5,5 s amoniakem, 5 obj.% npropanol

Pufr B: 0,1 M chlorid amonný, 0,025 M kyselina citrónová pH 5,5 s amoniakem, 50 obj.% npropanol

Sorbens: Kromasil C8, 13 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm

-10CZ 283356 B6

Sloupec: 50 mm x 250 mm

Tok: 60 ml/min

Sloupec se jak již popsáno zatíží 6 g lidského inzulínu ze štěpení kyselinou trifluoroctovou (viz příklad 14). Během gradientu z 21 % na 25 % pufru B v 60 minutách se inzulín s dobou retence 40 minut eluuje. Hlavní frakce obsahuje 91 % vsazeného produktu s čistotou 97,5 %. Celkový zisk je kolem 96 %.

Příklad 18

Pufr A: 0,1 M chlorid draselný, 0,025 M kyselina citrónová, pH 5,5 s louhem draselným, 5 obj.% n-propanol

Pufr B: 0,1 M chlorid draselný, 0,025 M kyselina citrónová, pH 5,5 s louhem draselným, 50 obj.% n-propanol

Sorbens: Kromasil C8, 13 pm, vzdálenost pórů 0,01 pm

Sloupec: 50 mm x 250 mm

Tok: 60 ml/min

Zatížení a gradient jako v příkladu 17. Eluce se provádí po 35 minutách. Hlavní frakce obsahuje 90 % nasazeného množství lidského inzulínu s čistotou 96,5 %. Celkový zisk kolem 93 %.

Příklady 19 až 24

V příkladech 19 až 24 se chromatografie provede za stejných podmínek jako v příkladu 14. Pouze pufry popřípadě množství obojetných iontů se mění.

Příklad 19

Pufr A: 0,15 M síran amonný, 0,1 M triethylamin, pH 7,0 s kyselinou sírovou

Pufr B: 0,08 M síran amonný, 0,05 M triethylamin, pH 7,0 s kyselinou sírovou

Výsledek: 95,2 % čistoty hlavní frakce, 67 % výtěžku v hlavní frakci.

Příklad 20

Pufr jako v příkladu 16 ale bez 0,1 M glycinu

Výsledek: 96,1 % čistoty v hlavní frakci, 65 % výtěžku v hlavní frakci a 25 % ve vedlejší frakci.

- 11 CZ 283356 B6

Příklad 21

Pufr jako v příkladu 15, navíc s 0,1 M glycinu

Výsledek: 96 % čistoty v hlavní frakci, 66 % výtěžku v hlavní frakci a 6 % ve vedlejší frakci.

Příklad 22

Pufr A: 0,1 M chlorid amonný, 0,025 M kyselina citrónová, pH 4,5 s amoniakem, 5 obj.% npropanol, 0,1 M glycinbetain

Pufr B: jako pufr A ale navíc 50 % n-propanol

Výsledek: 98,1 % čistoty v hlavní frakci, 88 % výtěžku v hlavní frakci a 6 % ve vedlejší frakci.

Příklad 23

Pufr jako v příkladu 22, ale pH 5,4 a 0,1 M glycinu místo glycinbetainu

Výsledek: 97,9 % čistoty v hlavní frakci, 92 % výtěžku v hlavní frakci a 8 % ve vedlejší frakci.

Příklad 24

Pufr jako v příkladu 13, ale pH 6,0 a navíc 0,1 M glycinu

Výsledek: 94,3 % čistoty v hlavní frakci, 77 % výtěžku v hlavní frakci a 13 % ve vedlejší frakci.

Příklad 25

V tabulce 1 je přehled o výtěžcích a čistotě inzulínů v závislosti na hodnotě pH a/nebo obojetných iontů v elučním prostředku.

Tabulka 1

Hodnota	Obojetný	Čistota	Výtěžky Příklad
PH	ion	hlavní	hlavní vedlejší č.
		frakce	frakce frakce

2,5	-	94,8	57	16	14
3,5	-	97,5	51	4	15
6,5	-	92,7	72	4	13
7,0	-	95,2	67	-	19
8,5	-	96,1	65	25	20
5,5		97,5	91	5	17
5,5	-	96,5	90	3	18

- 12 CZ 283356 B6

Tabulka 1 (pokračování)
Hodnota Obojetný	Čistota	Výtěžky Příklad
pH ion	hlavní	hlavní vedlejší č.
	frakce	frakce frakce

3,5	Gly	96,0	66	6	21
4,5	Glycinbetain	98,1	88	6	22
5,4	Gly	97,9	92	8	23
5,5	Gly	98,0	93	5	8
6,0	Gly	94,3	77	13	24
8,5	Gly	96,6	86	9	16

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob čištění inzulínu a/nebo inzulínových derivátů chromatografií ve vodných pufrovaných rozpouštědlech, obsahujících s vodou mísítelná organická rozpouštědla, na lipofilně modifikovaném silikagelu, vyznačující se tím, že v pufrovaných rozpouštědlech a/nebo směsi rozpouštědel jsou rozpuštěné obojetné ionty, přičemž hodnota pH směsi rozpouštědel leží až do 1 pH jednotky pod nebo nad isoelektrickým bodem čištěného inzulínu nebo derivátu inzulínu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hodnota pH směsi rozpou štědel leží až do 0,5 pH jednotky pod nebo nad isoelektrickým bodem.

3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se jako obojetné ionty použijí α-aminokyseliny nebo betainy.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se jako obojetný iont použije glycin, kyselina glutamová nebo glycinbetain.

5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž4, vyznačující se tím, že se čistí deriváty inzulínu obecného vzorce I ve kterém

R³⁰ značí zbytek geneticky kodovatelné L-aminokyseliny, (I)

- 13 CZ 283356 B6

Y značí vodíkový atom nebo zbytek L-fenylalaninu a

A- a B-řetězce jsou řetězce zvířecího nebo lidského inzulínu.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se čistí deriváty inzulínu obecného vzorce 1, ve kterém

R³⁰ značí zbytek L-alaninu nebo L-threoninu a