JPH04221400A

JPH04221400A - ゼラチン誘導体およびその用途

Info

Publication number: JPH04221400A
Application number: JP2333719A
Authority: JP
Inventors: Masayoshi Kojima; 政芳小島; Hiroyuki Komazawa; 宏幸駒澤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1992-08-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のト
リペプチドを必須単位として有するゼラチン誘導体およ
びその塩、並びにそれを有効成分とする動物細胞の接着
阻害剤及び血小板の凝集・粘着抑制剤に関するものであ
る。

［従来の技術］フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の接着に関与する
タンパク質であり、血小板凝集やガン転移にも関与して
いると考えられている。これらの相互作用は一連の細胞
表面のレセプターにより仲介され、フィブロネクチンは
分子量約２５万の巨大分子であるにもかかわらず、これ
らのレセプターがそのアルギニン−グリシン−アスパラ
ギン酸（以下、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐと略す）配列を
特異的に認識することが明らかにされ、レセプターとの
相互作用に重要なものであることが報告されている（ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３０９巻、３０頁、１９
８４年）。以来、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する
オリゴあるいはポリペプチドを用いる研究が進められて
いる。

例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する種々の鎖
状および環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻
害する方法（高分子学会予稿集（ＰｏｌｙｍｅｒＰｒｅ
ｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ）、第３８巻、３１４９頁、
１９８９年、特開平２−１７４７９７号）、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ配列を有するペプチドを細胞移動抑制剤と
して用いる方法（特開平２−４７１６号）、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐを固定化したＰＭＭＡ膜を細胞接着膜とし
て用いる方法（高分子学会予稿集（ＰｏｌｙｍｅｒＰｒ
ｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ）、第３７巻、７０５頁、
１９８８年）が報告されている。さらに、ポリマーにＡ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを必須構成単位とするペプチドを
共有結合させ動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基
体として用いる方法（特開平１−３０９６８２号、特開
平１−３０５９６０号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護
剤として用いる方法が開示されている（特開昭６４−６
２１７号）。また、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有す
るオリゴペプチドあるいはその繰り返し構造を有するポ
リペプチドを用いて、ガン転移を抑制する方法が知られ
ている（（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．
）第１１巻、２３頁、１９８９年、同誌、第１１巻、２
２６頁、１９８９年、（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ．）第６０巻、７２２頁、１９８９年）。

ゼラチンは動物の骨、軟骨、皮膚、ケン、筋膜などを水
で煮沸して抽出した水溶性タンパクでありコラーゲンと
同じアミノ酸組成を示す。ゼラチン中のアスパラギン酸
およびグルタミン酸残基は側鎖にカルボキシル基を有し
、リジンおよびヒドロキシリジン残基はε−アミノ基を
有している。

また、ゼラチンのアミノ基は容易に二塩基酸およびその
誘導体好ましくは二塩基酸無水物、あるいは多塩基酸お
よびその誘導体好ましくは多塩基酸無水物によってカル
ボキシル化することが出来る。

しかし、ゼラチンの誘導体としてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐを必須単位とするオリゴペプチドあるいはその繰り返
し構造を有するポリペプチドを導入した化合物は知られ
ておらず、導入した場合にはレセプターとの結合能の増
強および血液中での安定化が期待できる。

［発明が解決しようとする課題］本発明の目的は、新規なゼラチン誘導体およびそれを有
効成分とする動物細胞の接着阻害剤並びに血小板凝集・
粘着抑制剤を提供することである。

［課題を解決するための手段］本発明は、ゼラチンの側鎖にアミド結合、エステル結合
、エーテル結合、ウレタン結合のいずれかを介し、下記
一般式［Ｉ］で表される接着性ペプチドを必須単位とし
て有するゼラチン誘導体およびその塩を提供するもので
ある。

一般式［Ｉ］［　］は存在するかあるいは存在しなくともよく存在す
る場合はＸ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，Ｐ
ｒｏから選択されるアミノ酸又はペプチドを示し、Ｚは
−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。Ｒ１、Ｒ２のいずれか一
方は、水素又は炭素数が１−９の直鎖または分岐のアル
キル基、または炭素数が６−９のアリール基であり、置
換基を有していてもよい。他方は、水素又は炭素数が１
−９の直鎖または分岐のアルキレン基、または炭素数が
６−９のアリーレン基であり、置換基を有していてもよ
い。ｎは１−５の整数を示す。

Ｒ１及びＲ２の置換基としては、カルボニル基、カルボ
キシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルホニル基、
ハロゲン原子、アリール基、ニトロ基、ニトリル基、不
飽和基の２重結合・３重結合等があげられ、同一鎖に２
つ以上有していてもよい。

本発明はさらに上記ゼラチン誘導体またはその塩を有効
成分とする動物細胞の接着阻害剤並びに血小板凝集・粘
着抑制剤を提供するものである。

本発明は、カルボキシル化ゼラチンまたはゼラチン（以
下、これらを単に「ゼラチン」という）に、アルギニン
−グリシン−アスパラギン酸を必須単位として有する接
着性ペプチドを共有結合してなるゼラチン誘導体である
。ゼラチン誘導体の分子量は好ましくは２０万以下、特
に３０００−１０万の範囲で、室温で水溶性であること
が好ましい。

カルボキシル化剤として、無水コハク酸、無水マレイン
酸、無水フタル酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸
、ピロメリット酸無水物、トリメリット酸無水物が挙げ
られる。本発明に係わる接着性ペプチドに用いられるア
ミノ酸はＬ体、Ｄ体どちらでもよいが、好ましくはＬ体
である。

本発明のゼラチン誘導体の塩としては、例えば、塩酸塩
、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との
塩や、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロメタ
ンスルホン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩等
が挙げられる。

ペプチド合成法としては特に限定されないが、液相法、
固相法、および自動合成装置による合成方法が挙げられ
る。これらの合成方法の詳細については、生化学実験講
座“タンパク質の化学ＩＶ”２０７−４９５（日本生化
学全編、東京化学同人）、“続生化学実験講座タンパク
質の化学（下）”（日本生化学全編、東京化学同人）、
泉屋ら編“ペプチド合成の基礎と実験”（丸善）に記載
されている。また、市販されている合成ペプチドを利用
することも可能である。

ゼラチンおよびカルボキシル化ゼラチンと接着性ペプチ
ドの結合には、臭化シアン、酸アジド、水溶性カルボジ
イミド等を利用したアミド結合合成方法が挙げられる。

本発明のゼラチン誘導体は、細胞接着性蛋白質のコア配
列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を有し、
該コア配列を介して細胞接着性蛋白質と同様の機序で細
胞に接着する。そのため、細胞接着性蛋白質のアゴニス
トまたはアンタゴニストとして種々の生物活性を示し、
免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血管中で起こる癌細
胞による血小板凝集抑制作用、神経疾患治癒作用などの
広範な生物活性が認められている。

従って、本発明のゼラチン誘導体は、その少なくとも一
種を、場合により慣用の担体または医薬用助剤とともに
、癌転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集
・粘着抑制剤として患者に投与することが可能である。

特に、動物細胞接着阻害剤または血小板凝集・粘着抑制
剤としての使用が好ましい。その投与量は、０．２μｇ
／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇの範囲で、症状、年齢、体重
等に基づいて決定される。

本発明のゼラチン誘導体は、ペプチド系医薬に一般に使
用されている投与方法、即ち非経口投与方法、例えば静
脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するの
が好ましい。そのような注射用製剤を製造する場合、本
発明のゼラチン誘導体を例えば、後記実施例で示すよう
にＰＢＳまたは生理食塩水に溶解して、注射用製剤とし
てもよく、あるいは０．１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した
後、凍結乾燥製剤としてもよい。この様な製剤には、グ
リシンやアルブミン等の慣用の安定剤を添加してもよい
。さらに、本発明のゼラチン誘導体は、例えばリポソー
ム中に包容したマイクロカプセル剤とすれば、経口投与
することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻スプレー剤
等の形にすれば、消化管以外の粘膜からも吸収させるこ
とが可能である。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を更に説明するが本発明はこれ
らに限定されるものではない。

製造例１　接着性ペプチドの固相法による合成Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ方式によるペプチド合成装置を用いて合成
を行なった。αアミノ基の保護にはＢｏｃ基を用い、樹
脂から切出した後分取用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグ
ラフィー）で精製し、単一ピークを示す接着性合成ペプ
チドを得た。

接着性合成ペプチド製造例２ペプチド−５Ｈ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ）−ＮＨ２ペプチド−５を逐次延長法により液相
法で合成した。

（１）Ｂｏｃ　Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２の合成Ｂ
ｏｃ　Ｓｅｒｅ（Ｂｚｌ）ＯＨ　５９ｇ（０．２ｍｏｌ
）をＣＨ２Ｃｌ２　４００ｍｌに溶解しＤＣＣ　４１．
２ｇ（０．２ｍｏｌ）を氷冷下に加えた。この溶液に、
ＧｌｙＮＨ２．ＨＣｌ２２．１ｇをＣＨ２Ｃｌ２４００
ｍｌに溶かしてから、Ｎ−メチルモルホリン２０．２ｇ
で氷冷下中和した溶液を添加した。氷冷下３時間攪拌し
てから、さらに室温で終夜攪拌した。沈澱物をろ別して
から減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ３水
溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄
し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してから減圧乾固して白色粉末
５８．３ｇ（収率８３％）を得た。

（２）Ｂｏｃ　Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｇ
ｌｙＮＨ２の合成Ｂｏｃ　Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ
２　５６．２ｇ（０．１６ｍｏｌ）にＴＦＡ／ＣＨ２Ｃ
ｌ２＝１／１　４００ｍｌを加え室温で１時間攪拌した
後、ＴＦＡとＣＨ２Ｃｌ２を減圧濃縮した。これを酢酸
エチルに溶解しＮａＨＣＯ３水溶液で中和した後ＮａＣ
ｌ大溶液で洗浄した。Ｎａ２Ｏ４で乾燥してから酢酸エ
テルを減圧留去した。

この化合物と、ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）ＯＨ５１．７
ｇ（０．１６ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２　８００ｍｌに溶
解し、ＤＣＣ３３ｇ（０．１６ｍｏｌ）を氷冷下加え３
時間攪拌してから、さらに室温で終夜攪拌した。減圧下
ＣＨ２Ｃｌ２を留去してから酢酸エチルに溶解した。Ｎ
ａＨＣＯ３水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶
液の順に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してから減圧乾固
して白色粉末７１．２ｇ（収率８０％）を得た。

（３）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ
）ＧｌｙＮＨ２の合成ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ
（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　６６．７ｇ（０．１２ｍｏｌ
）にＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１　４００ｍｌを加え
て室温で１時間攪拌した後、ＴＦＡとＣＨ２Ｃｌ２を減
圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ３水
溶液で中和した後、ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ２
ＳＯ４で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。

この化合物とＢｏｃＧｌｙ５１．７ｇ（０．１２ｍｏｌ
）をＣＨ２Ｃｌ２７００ｍｌに溶解し、ＤＣＣ２４．７
ｇ（０．１２ｍｏｌ）を氷冷下加え３時間攪拌してから
、さらに室温で終夜攪拌した。ＤＣｕｒｅａをろ別して
から減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ３水
溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄
し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してから減圧乾固して白色粉末
６１．８ｇ（収率８４％）を得た。

（４）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ
）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２の合成ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｇｌ
ｙＮＨ２　６１．３ｇ（０．１ｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ
２Ｃｌ２＝１：１　４００ｍｌを加えて室温で１時間攪
拌した後、ＴＦＡとＣＨ２Ｃｌ２を減圧濃縮した。これ
を酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ３水溶液で中和した後
ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してか
ら酢酸エチルを減圧留去した。

この化合物とＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）（Ｍｔｓはメシチ
レン−２−スルホニル基を示す）４５．６ｇ（０．１ｍ
ｏｌ）をＤＭＦ８００ｍｌに溶解し、ＤＣＣ２２．５ｇ
（０．１ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１４ｇ（０．１ｍｏｌ）を
氷冷下加え３時間攪拌してから、さらに室温で終夜攪拌
した。ＤＣｕｒｅａをろ別してから、減圧濃縮し酢酸エ
チルに溶解した。ＮａＨＣＯ３水溶液、１Ｍクエン酸水
溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾
燥してから減圧乾固して白色粉末４２．８ｇ（収率４５
％）を得た。

（５）ペプチド−５　保護体の脱保護ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅ
ｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　５ｇ（５．３ｍｍｏｌ）の
ＴＦＡ溶液に、１Ｍトリフルオロメタンスルホン酸−チ
オアニソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液を氷冷下加
えて１時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基
の脱保護を行った。反応液をエーテル中に投入しオイル
状の沈殿物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、
陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４０
０Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体
２．１７ｇ（収率８６％）が得られた。

アミノ酸分析（ｎｍｏｌ／５０μｌ）Ａｒｇ　４．９８７７，Ｇｌｙ　１０．３９１６，Ａｓｐ　５．０１９９，Ｓｅｒ　４．８８９１，マススペクトル　Ｍ−　４０４合成例１　ゼラチン−ＲＧＤＳの合成ゼラチンの側鎖カルボキシル基とペプチドのＮ−末端を
アミドで結合し細胞接着性ペプチドフラグメントを有す
るゼラチン誘導体を合成した。ゼラチン０．７２ｇをｐ
Ｈ７．４のリン酸バッファーに溶解し、０℃に保ちなが
ら水溶性ＤＣＣ〔１−エチル−３，３−（ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド〕１２８ｍｇの２．６ｍ
ｌリン酸バッファー溶液を加えて、１．５時間反応させ
た。ついで、８ｍｌのリン酸バッファーに溶解した接着
性ペプチドアルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セ
リン（ＲＧＤＳ）（国産化学工業製）４００ｍｇを添加
し４℃で一晩反応させた。反応溶液を、Ｖｉｓｋｉｎｇ
ｔｕｂｅに入れ、イオン交換水、ついで純水に対して透
析し低分子量成分を除いて精製、凍結乾燥した。

収量０．５０ｇ構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析
により行なった。アミノ酸分析の結果を用いて下記に示
す式に従って接着性ペプチドの導入率を計算した。

導入率＝（原料ゼラチン１０００残基に対する反応化合
物中のＡｒｇの相対数）−（原料ゼラチン１０００残基
中のＡｒｇ数）原料ゼラチンのアミノ酸分析結果（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　４８．１Ｇｌｙ　３３３．５Ａｓｐ　４２．５Ｓｅｒ　２７．８ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（アミノ酸１０
００残基中）Ａｒｇ　７５．３Ｇｌｙ　３６１．２Ａｓｐ　６７．５Ｓｅｒ　４７．８従ってアルギニン残基数より計算してＲＧＤＳフラグメ
ントの導入率は約２７％であった。（以下同様に導入率
を計算した）ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５４
ｃｍ−１合成例２　スクシニル化ゼラチン−ＲＧＤＳの合成分子量１５，０００のゼラチン２０．０ｇを５％ＮａＨ
ＣＯ３溶液１００ｍｌに溶解、これに無水コハク酸３．
４０ｇ、４−ジメチルアミノピリジン２．００ｇを加え
室温で一昼夜かくはんした。反応終了後溶液を大過剰の
アセトンに投入して、スクシニル化ゼラチンを再沈殿さ
せた。沈殿を集め更に大量のメタノールで洗浄した後、
エーテルで洗浄し真空乾燥させた。収量２１．００ｇスクシニル化によりゼラチンの側鎖に存在するε−アミ
ノ基をカルボキシル基に変換した。ペプチドの結合スキ
ームは合成例１と同様である。スクシニル化ゼラチン０
．５６ｇをｐＨ７．４のリン酸バッファーに溶解し、０
℃に保ちながら水溶性ＤＣＣ（１−エチル−３，３−（
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）１２８ｍ
ｇの２．６ｍｌリン酸バッファー溶液を加えて、１．５
時間反応させた。ついで、８ｍｌのリン酸バッファーに
溶解したＲＧＤＳ４００ｍｇを添加し４℃で一晩反応さ
せた。

反応溶液を、Ｖｉｓｋｉｎｇ　ｔｕｂｅに入れイオン交
換水、ついで純水に対して透析し低分子量成分を除いて
精製、凍結乾燥した。収量　０．４０ｇ構造の確認は、
ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。

スクシニル化ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（
アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　８９．２Ｇｌｙ　３７６．２Ａｓｐ　８３．７Ｓｅｒ　６５．７アルギニン残基数より計算して、ＲＧＤＳフラグメント
の導入率は約４０％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５０
ｃｍ−１合成例３　マレイル化ゼラチン−ＲＧＤＳ分子量１５，
０００のゼラチン２０．００ｇと３．６７ｇの無水マレ
イン酸を合成例２と同様に反応させ、マレイル化ゼラチ
ン２０．１０ｇを得た。

マレイル化ゼラチン０．５６ｇをｐＨ７．４のリン酸バ
ッファーに溶解し、合成例２と同様にしてＲＧＤＳフラ
グメントを共有結合させた。収量０．４２ｇ構造の確認
は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。

マレイル化ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（ア
ミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　７８．５Ｇｌｙ　３６０．４Ａｓｐ　７１．２Ｓｅｒ　５０．５アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳフラグメントの導入率は約
３０％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６４８
ｃｍ−１合成例４　フタロイル化ゼラチン−ＲＧＤＳ分子量１５
，０００のゼラチン２０．００ｇと５．０３ｇの無水フ
タル酸を合成例２と同様に反応させ、フタロイル化ゼラ
チン２２．３１ｇを得た。

フタロイル化ゼラチン０．５６ｇをｐＨ７．４のリン酸
バッファーに溶解し、合成例２と同様にしてＲＧＤＳフ
ラグメントを共有結合させた。収量０．４４ｇ構造の確
認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。

フタロイル化ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（
アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　８３．９Ｇｌｙ　３７１．８Ａｓｐ　７５．５Ｓｅｒ　５７．８アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳフラグメントの導入率は約
３６％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５０
ｃｍ−１合成例５　イタコニル化ゼラチン−ＲＧＤＳ分子量１５
，０００のゼラチン２０．００ｇと３３．８１の無水イ
タコン酸を合成例２と同様に反応させ、イタコニル化ゼ
ラチン２１．７９ｇを得た。

イタコニル化ゼラチン０．５６ｇをｐＨ７．４のリン酸
バッファーに溶解し、合成例２と同様にしてＲＧＤＳフ
ラグメントを共有結合させた。収量０．４４ｇ構造の確
認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。

イタコニル化ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（
アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　８２．３Ｇｌｙ　３６８．９Ａｓｐ　７６．１ｓｅｒ　５３．９アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳフラグメントの導入率は約
３４％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５５
ｃｍ−１合成例６　トリメリチル化ゼラチン−ＲＧＤＳ分子量１
５，０００のゼラチン２０．００ｇと６．５２ｇのトリ
メリト酸無水物を合成例２と同様に反応させトリメリチ
ル化ゼラチン２３．６９ｇを得た。

トリメリチル化ゼラチン０．５６ｇをｐＨ７．４のリン
酸バッファーに溶解し、合成例２と同様にしてＲＧＤＳ
フラグメントを共有結合させた。収量０．５０ｇ構造の
確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。

トリメリチル化ゼラチン−ＲＧＤＳのアミノ酸分析結果
（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　８６．８Ｇｌｙ３７１．６ＡｓＰ８０．３Ｓｅｒ５９．５アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳフラグメントの導入率は約
３９％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５２
ｃｍ−１合成例７ゼラチン−ＧＲＧＤＳ接着性ペプチドフラグメントとしてＧＲＧＤＳを用い、
合成例１と同様にしてゼラチン−ＧＲＧＤＳを合成した
。構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なっ
た。

ゼラチン−ＧＲＧＤＳのアミノ酸分析結果（アミノ酸１
０００残基中）Ａｒｇ７６．１Ｇｌｙ３９２．７Ａｓｐ６７．５Ｓｅｒ■ アミノ酸分析の結果ＧＲＧＤＳフラグメントの導入率は
約２８％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６４６
ｃｍ−１合成例８スクシニル化ゼラチン−ＧＲＧＤＳ接着性ペプ
チドフラグメントとしてＧＲＧＤＳ４６０ｍｇを用い、
合成例２と同様にしてスクシニル化ゼラチン−ＧＲＧＤ
Ｓを合成した。構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析
により行なった。

スクシニル化ゼラチン−ＧＲＧＤＳのアミノ酸分析結果
（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ８５．２Ｇｌｙ４０１．５Ａｓｐ１１１．４Ｓｅｒ５９．６アミノ酸分析の結果ＧＲＧＤＳフラグメントの導入率は
約３７％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５０
ｃｍ−１合成例９スクシニル化ゼラチン−ＲＧＤ接着性ペプチド
フラグメントとして合成ＲＧＤ４６０ｍｇを用い、合成
例３と同様にしてスクシニル化ゼラチン−ＲＧＤを合成
した。構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行
なった。

スクシニル化ゼラチン−ＲＧＤのアミノ酸分析結果（ア
ミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ８０．６Ｇｌｙ３６３．８Ａｓｐ７２．７アミノ酸分析の結果ＲＧＤフラグメントの導入率は約３
２％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５２
ｃｍ−１合成例１０スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）２接着性
ペプチドフラグメントとして（ＲＧＤ）２を４６０ｍｇ
用い、合成例４と同様にしてスクシニル化ゼラチン−（
ＲＧＤ）２を合成した。構造の確認は、ＩＲおよびアミ
ノ酸分析により行なった。

スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）２のアミノ酸分析結
果（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ１１８．１Ｇｌｙ３９８．８Ａｓｐ１０９．３アミノ酸分析の結果（ＲＧＤ）２フラグメントの導入率
は約２８％であった。

ＩＲアミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５５ｃ
ｍ−１合成例１１スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）３接着性
ペプチドフラグメントとして（ＲＧＤ）３を４６０ｍｇ
用い、合成例５と同様にしてスクシニル化ゼラチン−（
ＲＧＤ）３を合成した。構造の確認は、ＩＲおよびアミ
ノ酸分析により行なった。

スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）３のアミノ酸分析結
果（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ１３２．０Ｇｌｙ４１０．９Ａｓｐ１２０．１アミノ酸分析の結果（ＲＧＤ）３フラグメントの導入率
は約２４％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６４８
ｃｍ−１合成例１２スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）５接着性
ペプチドフラグメントとして（ＲＧＤ）５を４６０ｍｇ
用い、合成例６と同様にしてスクシニル化ゼラチン−（
ＲＧＤ）５を合成した。構造の確認は、ＩＲおよびアミ
ノ酸分析により行なった。

スクシニル化ゼラチン−（ＲＧＤ）５のアミノ酸分析結
果（アミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　２３２．８Ｇｌｙ　５０６．３Ａｓｐ　２０７．７アミノ酸分析の結果（ＲＧＤ）５フラグメントの導入率
は約１９％であった。

ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５４
ｃｍ−１合成例１３ゼラチン−ＲＧＤＳＧ−ＮＨ２の合成接着性ペプチドフラグメントとしてペプチド−５（ＲＧ
ＤＳＧ−ＮＨ２）４６０ｍｇを用い、合成例１と同様に
してゼラチン−ＲＧＤＳＧ−ＮＨ２を合成した。

収量０．３６ｇ構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行った。

アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳＧ−ＮＨ２フラグメントの
導入数は約３３個であった。

ゼラチン−ＲＧＤＳＧ−ＮＨ２のアミノ酸分析結果（ア
ミノ酸１０００残基中）Ａｒｇ　８１．３Ｇｌｙ　４０２．４Ａｓｐ　７４．６Ｓｅｒ　５７．８ＩＲ：アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動１６５８
ｃｍ−１試験例１『細胞接着阻害活性の測定』本発明のゼラチン誘導体が細胞のフィブロネクチンやビ
トロネクチンに対する接着を阻害する活性測定方法を以
下に示す。ここで用いられた競争法は基本的に生化学分
野では広く用いられているものであり、例えば『Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ』８２　８０３
〜８３１頁（１９８１）、特開平１−３０９６８２、同
２−１７４７９７に開示されている。

実験方法１、吸着プレートの作製市販のフィブロネクチン（ヒト由来：生化学工業（株）
より購入）あるいはビトロネクチン（ヒト由来：フナコ
シ（株）より購入）をＰＢＳ（ＮａＨ２ＰＯ４０．００
５Ｍ＋ＮａＣｌ　０．０７Ｍ）で各々１．０μｌ／ｍｌ
、２．０μｌ／ｍｌに希釈しその希釈液０．５ｍｌを２
４ウェルのプラスチックプレートにいれ、３７℃で一晩
保温しコーティングした。次に非特異吸着を防ぐ目的で
牛血清アルブミン（ＢＳＡ１％）を加え３７℃、１時間
保温し、その後通常の洗浄操作（ＰＢＳ）を行い充分に
水きりして吸着プレートを作製した。

２、接着阻害実験凍結乾燥により得たゼラチン誘導体をＤｕｌｂｅｃｃｏ
ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（以
下ＤＭＥＭと略する）を用い０、０．２５、０．５、１
．０、１．５ｍｇ／ｍｌの各濃度のゼラチン誘導体溶液
とした。この溶液０．２５ｍｌを上記方法で作成したプ
レートにいれ、そこへ血管内皮細胞（４×１０６ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌ）懸濁液を０．２５ｍｌ加え３７℃で一時間
保温し細胞を接着させた。ＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、
未接着の細胞を除いた後、０．０２５％ＥＤＴＡトリプ
シン溶液で接着した細胞を剥離し、２％トリパンブルー
で染色して細胞数を計測した。結果を下記表−１及び表
−２に示す。

試験例２『血小板凝集阻害活性試験』本発明のゼラチン誘導体のＩＮＶＩＴＲＯ系での血小板
凝集阻害作用をヒト多血小板血漿を用いて検定した。以
下にその実験方法を示す。

実験方法新鮮なヒト血液に１／９量の３．８％クエン酸ナトリウ
ムを加え遠心（１０００ｒｐｍ、１０分）し、上層を多
血小板血漿として分取した。この血漿２００μｌに、凍
結乾燥により得たゼラチン誘導体を生理食塩水に０〜１
．５ｍｇ／ｍｌの種々の濃度に溶解したゼラチン誘導体
溶液２５μｌを加え、３分間３７℃でインキュベートし
たのち、５０μＭＡＤＰ（アデノシン二リン酸）溶液あ
るいは２００μｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を２５μｌ加
えて凝集の程度をアグリゴメーターを用いて透過度を測
定することにより検定した。結果を表−３に示す。

凝集阻害率（１−Ｔ／Ｔ０）×１００％Ｔ０＝ゼラチン
誘導体非添加時の透過度Ｔ＝ゼラチン誘導体添加時の透
過度１、明細書第３頁３〜４行の“アルギニン−グリシン−
アスパラギン酸”を「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」と訂正
する。

２、明細書第３頁１５〜１６行の“アルギニン−グリシ
ン−アスパラギン酸（以下、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐと
略す）”を「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」と訂正する。

３、明細書第５頁７行の“ケン”を「腱」と訂正する。

４、明細書第７頁９〜１０行の“スルホニル基”を「ス
ルホ基」と訂正する。

５、明細書第７頁１１行の“ニトリル基”を「シアノ基
」と訂正する。

６、明細書第７頁１９行の“アルギニン−グリシン−ア
スパラギン酸”を「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」と訂正す
る。

７、明細書第８頁７〜８行の“トリメリット酸無水物”
を「トリメリット酸無水物等」と訂正する。

８、明細書第９頁１１〜１２行の“アルギニン−グリシ
ン−アスパラギン酸”を「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」と
訂正する。

１０、明細書第１２頁４行の“Ｓｅｒｅ”を「Ｓｅｒ」
と訂正する。

１１、明細書第１３頁１行の“（ＯＢｚＩ）ＯＨを「（
ＯＢｚＩ）」と訂正する。

１２、明細書第１５頁９行の“４００”を「４００；」
と訂正する。

１３、明細書第１５頁１７行の“Ｍ＋”を「Ｍ＋：」と
訂正する。

１４、明細書第１６頁８行の“アルギニン−グリシン−
アスパラギン酸−セリン（ＲＧＤＳ）（”を「Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ；」と訂正する。

１５、明細書第１８頁２行の、“かくはん”を「攪拌」
と訂正する。

１６、明細書第２９頁１２行の“３７℃、”を「３７℃
で」と訂正する。

１７、明細書第２９頁１６行の“Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ”
を「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ」と訂正する。

１８、明細書第３３頁９〜１２行の“この血漿２００μ
ｌに、凍結乾燥のより得たゼラチン誘導体を生理食塩水
に０〜１．５ｍｇ／ｍｌの種々の濃度に溶解したゼラチ
ン誘導体溶液２５μｌを加え”を以下の通り訂正する。

「凍結乾燥のより得たゼラチン誘導体を０〜１．５ｍｇ
／ｍｌの種々の濃度となる様に生理食塩水に溶解した。

この溶液２５μｌを血漿２００に加え」

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゼラチンの側鎖にアミド結合、エステル結
合、エーテル結合、ウレタン結合のいずれかを介し、下記一
般式［Ｉ］で表される接着性ペプチドを必須単位として
有するゼラチン誘導体またはその塩。一般式［Ｉ］［　］は存在するかあるいは存在しなくともよく、存在
する場合はＸ、ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，
Ｐｒｏから選択されるアミノ酸又はペプチドを示し、Ｚ
は−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。Ｒ１、Ｒ２のいずれか
一方は、水素又は炭素数が１−９の直鎖または分岐のア
ルキル基、または炭素数が６−９のアリール基であり、
置換基を有していてもよい。他方は、水素又は炭素数が
１−９の直鎖または分岐のアルキレン基、または炭素数
が６−９のアリーレン基であり、置換基を有していても
よい。ｎは１−５の整数を示す。
【請求項２】分子量が約３，０００−１００，０００の
範囲である請求項１記載のゼラチン誘導体またはその塩
。
【請求項３】請求項１または２記載のゼラチン誘導体ま
たはその塩を有効成分とする動物細胞の接着阻害剤。
【請求項４】請求項１または２記載のゼラチン誘導体ま
たはその塩を有効成分とする血小板凝集・粘着抑制剤。