JPH04108389A - 酵母において機能する大腸菌由来上流制御配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母菌は大腸菌と共に遺伝解析が進んでおり分子遺伝学
的な情報も近年急速に蓄積されている。

加えて発酵生産が容易且つ経済的であり、また発酵生産
に関するノウハウも豊富であることから、遺伝子工学を
利用した物質生産の宿主として広く用いられている。生
産させようとする物質の遺伝子を酵母菌体内で発現させ
るためには、一般に酵母由来の強力な活性を持つプロモ
ーターが用いられる。なぜなら効率の良い物質生産のた
めには、遺伝子の効率の良い転写が必要不可欠であるか
らである。このような理由から、例えば細胞質全蛋白質
の数％を占めることが知られている解糖系の酵素の遺伝
子（ＰＧＫ、ＧＡＰＤＨなど）のプロモーターなどがよ
く用いられている。また外来遺伝子産物が酵母菌体内で
非常に不安定であったりまた毒性を示すなどの理由から
、制御可能なプロモーターが好ましい場合にはＧＡＬＩ
　、　ＰＨ０５、ＣＵＰＩ　、　ＡＤＨ２なども用いら
れている。

これらの酵母プロモーターは機能的には少なくとも２つ
の領域から成り立っていることが知られている。１つは
いわゆるＴＡＴＡ配列と転写開始点から成り立つ領域で
あり（以下ＴＡＴＡＳＩ域と記す）、１つはそれよりも
さらに上流に存在する上流制御配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ
　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　；　ＬＩ
ＲＳ）である。ＵＲ３は一般に上流活性化配列（Ｕｐｓ
　ｔｒｅａｍＡｃｔｉｖａｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
　；　ＵＡＳ）と上流抑制配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ　Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　；　ＵＩＳ）
から成り立っており、酵母においては、これらの制御配
列の組み合わせにより転写を制御することによって遺伝
子産物の合成が制御されている。またＵＲ３はそれが本
来機能している組み合わせ以外のＴＡＴＡ領域と組み合
わせた場合にも機能することが分がっており、更にＵＡ
Ｓ及びＵＩＳはその機能がＴＡＴＡｅｉ域に対する方向
に依存しないことが知られている。加えて、プロモータ
ーの強さは主にＬＩＡＳの強さを反映していると考えら
れている。この制御形式は外来の遺伝子を発現させる際
にも必然的に成立していると考えられる。

これらの事実から、異なる遺伝子のＵＲ３を組み合わせ
る、もしくは異なる遺伝子のＵＲ３とＴＡＴＡ領域を組
み合わせることにより、外来遺伝子を効率良く発現でき
る新規なプロモーターの開発が期待できる。このような
戦略でＢｉｔｔｅｒ等（Ｇｅｎｅ。

聾ｐ１９３−２０７．１９８８）はＧＡＬＩのＵＲ３を
ＧＡＰＤＨのプロモーターと組み合わせることにより、
ガラクトースにより制御可能で且つＧＡＬＬプロモータ
ーよりも強力な転写活性を持つハイブリッドプロモータ
ーを開発し、これを用いることによりインターフェロン
を効率良く生産させる系を開発したことを報告している
。また同じような試みとしてＡＤＨ２の制御領域とＧＡ
ＰＤＨのプロモーターを組み合わせることによりアルコ
ールで制御可能でＡｔ））１２プロモーターよりも強力
な転写活性を持つハイブリッドプロモーター（Ｃｏｕｓ
ｅｎら、Ｇｅｎｅ、　６１．　ｐ２６５−２７５１１９
８７）、またＰＨ０５の制御領域をＧＡＰＤＨプロモー
ターと組み合わせることにより培養液中のリン酸の濃度
により制御可能でＰＨ０５プロモーターよりも強力な転
写活性を持つハイブリッドプロモーター（Ｈｉｎｎｅｎ
ら、Ｙｅａｒｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ、ＢｕＨｅｒｗｏｒｔｈ社、１９８９刊）の開発な
どが報告されている。しかしながら、これらで用いられ
ているＧＡＰＤＨプロモーターはＧＡＰＤＨのＵＡＳを
含んでいるが、上記ハイブリッドプロモーターの強さは
ＧＡＰＤＨのそれを越えるものではなかった。

以上のように酵母におけるもっとも強い活性を持つプロ
モーターは解糖系の酵素のものであると考えられている
が、これらを組み合わせることにより、天然のプロモー
ター活性を凌駕するものが作られたという報告はまだな
い。

［発明が解決しようとする課題］ したがって本発明は、解糖系遺伝子プロモーター系を基
礎とし、それらと組み合わせることにより天然プロモー
ター活性を上回る活性を付与する上流制御配列を提供す
ることであり、これによって外来遺伝子の発現および遺
伝子産物の生産量を向上させる新しい上流制御配列を含
む酵母の発現系を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明においては、前記の目的を達成するため、新規な
制御配列を大腸菌に求める。本発明者等はＮｅｏ遺伝子
（アミノグルコシドホスホトランスフェラーゼ■遺伝子
）を含む制御配列検定用プラスミドを作成しており、本
発明においては、このプラスミドを利用することができ
る。なお制御配列検定用プラスミドの作成は特願平１−
４１６０４号に記載されている。このプラスミドを改良
し上流制御配列を検定できるように、ＬＩＡＳを欠失さ
せたＧＡＰＤＨプロモーター配列を導入したものを作成
する。このプラスミドに大腸菌の染色体ＤＮＡを挿入し
たものを多数作成し、これを用いて酵母を形質転換する
ことにより抗生物質Ｇ４１８耐性が付与された酵母菌形
質転換体を得た。更にそれらの中からより強い耐性を有
するものを求めることにより、酵母で機能しうる制御配
列を有する大腸菌由来のＤＮＡ断片を得ることができる
。

本発明はまず、酵母中で機能することができる大腸菌由
来の上流制御配列を提供する。

本発明はまた、前記大腸菌由来上流制御配列と酵母上流
制御配列とを含んで成り酵母において機能することがで
きるハイブリッド上流制御配列を提供する。

本発明はさらに、前記大腸菌由来上流制御配列と酵母プ
ロモーターのＴＡＴｌＳｆｆ域とを含んで成り酵母にお
いて機能することができるハイブリッドプロモーターを
提供する。

本発明はさらに、前記大腸菌由来上流制御配列と酵母プ
ロモーターとを含んで成り酵母において機能することが
できるハイブリッドプロモーターを提供する。

本発明はさらに、酵母プロモーターのＴＡＴＡ領域、翻
訳開始コドンを含む構造遺伝子及び酵母複製起点を含ん
で成る、上流制御配列検定用プラスミドを提供する。

〔具体的な説明〕

未知の制御配列をスクリーニングし、その機能を検定す
るためには以下に記すような条件を満たす系である必要
がある。まず酵母遺伝子のプロモーター配列にはそれぞ
れ固有の上流制御配列が存在する。そのため上流制御配
列を検定するためにはその固有の制御配列を除いたプロ
モーター配列を持つ必要がある。例えばＧＡＬＬ−ＧＡ
ＬＩＯの制御配列を検定するときには、ＣＹＣＩの上流
制御配列の除かれたプロモーターと組み合わせることに
よって検定される。

また簡便に検定を行なうために、発現量を比較的簡便に
調べることのできる遺伝子の上流に検定しようとする配
列を導入することが望ましい。このような遺伝子の例と
しては、従来からガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）
がよく用いられている。

加えてプラスミドでの組み換え操作により、検定しよう
とする配列を上記のような組み合わせを満たす形で導入
するためには、プラスミドが酵母、大腸菌の両者で複製
可能であるシャトルヘクターであることが望ましい。

上のような諸条件を満たすプラスミドの例として、本発
明においては特願平１−４１６０４号に記載されている
Ｎｅｏ遺伝子を用いた検定系を利用する。Ｎｅｏ遺伝子
の本来の翻訳開始コドンの上流に存在する余分なＡＴＧ
コドンの数を１にしたＮｅｏＤ遺伝子を用いることによ
り、比較的強力なプロモーター配列を検定することがで
きる。またこの遺伝子は、強力なプロモーターによって
発現させたときのみ、酵母に耐性を付与することができ
ることが明らかになっている。そこで本発明においては
酵母のＧＡＰＤ）Ｉ遺伝子のプロモーターを利用し、そ
れが持つ本来の上流制御配列を欠如させたプロモーター
配列を作成し、ＮｅｏＤ遺伝子を持つｐＪＤＢ−Ｎｅｏ
Ｄ−ＡＴＥに挿入することによって、Ｇ４１８耐性を調
べることにより簡便に上流制御配列をスクリーニング、
検定できるプラスミド、ｐＸＸＮ７Ｌ−ＮｅｏＤＡＴＥ
を作成する。その作成法の１例を実施例１及び第１図に
記載する。

このプラスミドはＧＡＰＤ）Ｉプロモーター断片の上流
に、Ｈ４ｎｄｌｌｌとＢｇｌＩＩのサイトを持っている
ために、検定しようとする配列を、このサイトを利用す
ることにより、簡便に挿入することが可能である。また
このプラスミドにより形質転換された酵母は、０．２５
■／ｄという低濃度のＧ４１８に対しても耐性を示さな
い。

本発明はまず、酵母において機能する大腸菌上流制御配
列を提供する。本発明が提供する上流制御配列ＵＰＳは
、大腸菌染色体ＤＮＡより得たものである。大腸菌染色
体ＤＮＡからこのような配列を切りだすためには、認識
配列の短い制限酵素を利用するか、又は超音波によりＤ
ＮＡを寸断する方法などが考えられるが、本発明におい
てはマンガンイオン存在下でのＤＮａｓｅｒの非特異的
な２本鎖切断、または認識配列が４塩基対である５ａｕ
３ＡＩによるＤＮＡの完全分解によって制御配列を得る
。

実施例２に染色体ＤＮＡからの切り出しの方法を、そし
て実施例３にはランダムに切りだされたＤＮＡより、本
発明の上流制御配列をスクリーニングする方法を具体的
に記載する。

本発明が提供する上流制御配列は、既に塩基配列の決定
されたものとは異り本発明によって始めて得られるもの
である。その塩基配列決定の詳細を実施例４に記載する
。また本発明が既に酵母で見いだされている制御配列と
も異なることは、本発明の上流制御配列がいずれも約１
５０塩基対の長い配列を機能発揮するために必要として
いる点、そしてさらには酵母の遺伝子バンクからも似た
配列を見いだせない点にある。

一方本発明の提供する制御配列が既に報告されている酵
母の上流制御配列に共通する機能的特徴、例えばプロモ
ーターの種類を選ばずに機能し、そしてプロモーター配
列に対しての方向性が要求されないなどの特徴を持って
いることは、この配列が上流制御機能を持っているとい
うことの証拠であり、これらのことを具体的に実施例５
に記載する。

本発明はまた、酵母中で機能し得る大腸菌の上流制御配
列と酵母のプロモーターとから成るハイブリッドプロモ
ーターを提供する。例えば、実施例５には、本発明の大
腸菌由来の上流制御配列が酵母へり旧プロモーターとの
組合わせにおいて機能し、且つプロモーターに対してい
ずれの方向に挿入されても機能することが示される。本
発明の上流制御配列との組合わせにおいて機能し得る酵
母プロモーターとしては、前記のＡＤＨ？プロモーター
の他に、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫプロモーター
、ＰＹＫプロモーター、ＥＮＯＩプロモーター等が挙げ
られる。

本発明はまた、本発明の上流制御配列と酵母プロモータ
ーのＴＡＴＡＳｉ域とから成るパイプリットプロモータ
ーを提供する、この場合のＴＡＴＡｆｉＩ域としては、
ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫプロモーターＡＤＨＩ
プロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＥＮＯＩプロモー
ター、ＴＢＩプロモーター等のそれぞれのＴＡＴＡＳｉ
域が挙げられる。このタイプのハイブリッドプロモータ
ーが有効であることは、実施例１により作成された上流
配列検定用プラスミドに実施例２により調製された大腸
菌由来の上流配列が挿入された場合にＮｅｏ遺伝子が多
量に発現されることが実施例３により確認されたことか
らも明らかである。

本発明はまた、本発明の大腸菌由来上流制御配列と酵母
の上流制御配列とから成るハイブリッド制御配列を提供
する。すなわち、本発明の提供する上流制御配列の最も
有効な機能は、酵母の制御配列と組み合わされたときに
発揮される。酵母遺伝子の中で最も強力な制御配列の一
つと考えられるＰＧＫ遺伝子の持つ上流制御配列と本発
明の上流制御配列、例えばＤＮ２−１８上流配列が組み
合わされたときに、これらの酵母の制御配列の機能は更
に強化される。このことは実施例６に具体的に記載され
た実験によって明らかである。また実施例６において、
前記上流制御機能がセントロメアブラスミドにおいても
発揮されることが明らかとなった。本発明の大腸菌上流
制御配列との組み合わせによってハイブリット上流配列
を構成し得る酵母上流制御配列としては、前記のＰＧＫ
プロモーターの上流制御配列のほかに、ＡＤＨＩプロモ
ータＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈプロモーター、ＥＮＯＩプロモ
ーター、ＰＹＫプロモーター等のそれぞれの上流配列、
特に各プロモーターのＵＡＳが挙げられる。

上記のごとく本発明の上流制御配列、ハイブリッド上流
制御配列、ハイブリッドプロモーター等を用いて外来遺
伝子を強力に発現させることができる。例えば、５ＮＩ
−１０及びＤＮ２−１８のごとき本発明の上流制御配列
はＧＡＰＤＨプロモーター断片と組み合わされた場合に
おいては、完全なＧＡＰＤＨプロモーターを超える強力
な活性を示す。これらの制御配列を用いて多量の外来遺
伝子産物を酵母に作らせることが可能になるが、その１
例として、ヒト血清アルブミンを作らせた例を実施例７
に記載する。この場合においては、本発明の提供する制
御配列が酵母染色体に組み込まれた場合においても有効
に機能していることが明らかとなった。

本発明はさらに、種々の上流制御配列をスクリニングす
るのに有用な、上流制御配列検定用プラスミドを提供す
る。この検定用プラスミドは、酵母プロモーターのＴ　
Ａ　Ｔ　Ａ　ｊＪ域及び翻訳開始コドンを含む構造遺伝
子を有し、ＴＡＴＡｊｌ域の上流に被検制御配列を挿入
することにより該被検配列の上流制御領域としての能力
を検定することができる。

この場合、翻訳開始コドンから上流の構造を異にし、そ
れによって潜在的発現力を異にする複数の検定用プラス
ミドを用意しておくことにより種々の能力を有する被検
断片を検定することができ便利である。この検定用ベク
ターはさらに酵母用の複製起点及び選択マーカーを有す
るほか、大腸菌において操作するための大腸菌用複製起
点及び選択マーカーを有するシャトルベクターであるこ
とが好ましい。上記のＴＡＴＡＳＩ域としては例えば、
ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨ
Ｉプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＥＮＯＩプロモ
ーター、ＴＢＩプロモーター等のそれぞれのＴＡＴＡ領
域を使用することができ、また、前記構造遺伝子として
は、その発現生成物の測定が容易なもの、例えばネオマ
イシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子
、クロラムフェニコール、トランスフェラーゼ、β−ガ
ラクタダマゼ等を用いることができる。

〔発明の効果〕 本発明の上流制御配列を用いることにより、非常に強力
なハイブリッドプロモーター配列を得ることが可能とな
る。ハイブリッドプロモーターは、２１Ｍ１由来のプラ
スミドやセントロメアを複製起点として持つプラスミド
に導入したときのみならず、もっとも安定に形質が保持
される染色体に導入したときにも、外来遺伝子産物を大
量に、酵母を利用して生産することが可能になる。この
ような例としてヒト血清アルブミンを大量に発現させる
ことが可能になった。

またこの上流制御配列は、解糖系遺伝子の上流制御配列
以外にも組み合わせることが可能であり、例えばＧＡＬ
Ｉの上流制御配列などと組み合わせた場合にはガラクト
ースの添加で制御可能な高発現系を作ることもできる。

また例えばＰＨ０５，ＣＵＰＩ。

ＡＤＨ２などの上流制御配列と組み合わせることも可能
であり、それらの場合にはそれぞれの制御配列の制御機
構によって発現を制御できる高発現系を構築することが
可能となる。

次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

以下の実施例において共通する操作条件は次の通りであ
る。

１）ＥｘｏＩ［［ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレア
ーゼを用いた欠失変異処理 プラスミド５１１ｇを適当な制限酵素で消化し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤ
ＮＡを回収した。ＤＮＡを５０Ｉ！！のＥｘ。

■緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ。、１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール）に溶解した。もう−本の
チューブに５０ＪのＭＢ緩衝液（４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，５：ｌ　、１００ｍＭ　ＮａＣｌ。

２１ＭＺｎＣｌ２．１０％グリセロール）を入れ水中に
おいた。ＤＮＡ液に１８０ユニツトのＥｘｏ　■ヌクレ
アーゼを加え、３７゛Ｃに保温し、酵素添加後３０秒ご
とに５ｕＩをサンプリングし、ＭＢ緩衝液の入ったチュ
ーブに移した。サンプリング終了後、氷上のチューブを
６５°Ｃ１５分保温し、次に３７°Ｃに冷やし、５０ユ
ニツトのマングビーンヌクレアーゼを加え、そして３７
°Ｃにて、３０分保温した。反応後、この液をＴＥで飽
和させたフェノールで抽出し、エタノール沈殿でＤＮＡ
を回収した。

２）制限酵素処理 制限酵素処理はメーカーの推奨する反応条件にて行なっ
た。

３　）　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理 例えば１１００ｎの断片と２０ｎｇの大腸菌の複製開始
点を含む断片を、１０１１！の反応液（５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣｌｐＨ１，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０
ｍＭ　ＤＴＴ、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ）　　となるように混
合し、３５０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、１６
゛Ｃで１時間から一晩保温した。

４）培地組成 大腸菌はＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス
、０．５％塩化ナトリウム）を用いて培養εた。アンピ
シリンを加える場合には５０ｎ／ｍｌ！の濃度になるよ
うに加えた。また寒天培地の場合には１、５％となるよ
うに加えた。

酵母を培養するためのＹＰＤ培地の組成は２％ポリペプ
トン、１％酵母エキス及び２％ブドウ糖であり、寒天培
地の場合はこれに寒天を２％となるように加えた。また
ロイシンを含まないＳＤ培地の組成は以下のものである
。ＳＤ培地の組成は２０／ｆｇ／ｍアデニン硫酸塩、２
０ｔｔｇ／ｒｒｄｌアルギニン塩酸塩、２０ｎ／−メチ
オニン、２０Ｊｒｇ／戚ヒスチジン塩酸塩、２０　ｔｒ
ｇ　／　ｄ　）リプトファン、２０．ｉ／ｍｌウラシル
、３０ｕｇ／ｒｔｄｌイソロイシン、３０ｔｒｇ／ｒａ
ｉｌリジン塩酸塩、３０ｔｔｇ／ｌｄチロシン、５０Ｊ
ｔｇ／ｄフェニルアラニン、１５０ｘ／ｄバリン、０．
１５％アミノ酸不含イーストニトロゲンベース、０．５
％塩酸アンモニウム及び２％デキストロースであり、ま
た寒天培地の場合にはこれに２％の寒天を加えた。

５）ＲＮＡの調製法とノーザンハイブリダイゼイション
の方法 コロニーを５ｍｌのＳＤ培地に接種し、３０°Ｃで２日
間振盪培養した。この培養液の一部（２Ｘ１０’細胞）
を５０ｄのＳＤ培地に接種し、３０°Ｃで２４時間振盪
培養した。この培養液のうち２０ｄをとり３０００ｒｐ
ｍ　、５分間の遠心により集菌した。菌体を１ｍの１Ｍ
ソルビトールに再懸濁し、再度３０００ｒｐｍ、５分間
の遠心により集菌した。菌体を４００■／ｄザイモリア
一ゼ／ＬＭソルビトール１戚に再懸濁し、３０℃に３０
分静置した後、７０００ｒｐｍ、５分間の遠心により集
菌した。得られたスフェロプラストを７５０１ｌ１０）
ＴＬＥＳ液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、０．
ＩＭＬｉＣｌ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、１％ＳＯ５）
に再懸濁させ３００ＩのＴＬＥ飽和フェノールを加え、
ポルテックスミキシングを行なった。次に、１５０００
ｒｐｍで１０分遠心し、得られた水層をさらに２回ＴＬ
Ｅ飽和フェノールで抽出し、最後に、得られた水層６０
０Ｉに２００　ｊｌｌの８ＭＬｉＣ１を加えよく混合し
た後、４°Ｃで一夜静宜した。１５０００ｒｐｒｒｌで
１０分遠心しＲＮＡ沈殿を回収し、３００Ｉｊ１の滅菌
水に溶解させ、１００ｕｌの８ＭＬｉＣｌを加え、よく
混合した後、４°Ｃで２時間静置した。１５０００ｒｐ
ｍで１０分遠心しＲＮＡ沈殿を回収し、これを３００４
の滅菌水に溶解させ、３０ハの３Ｍ酢酸ナトリウム液（
ｐＨ５，２）を加え、さらに７５０　ｕｌのエタノール
を加え、−８０°Ｃで２時間静置した。　１５０００ｒ
ｐｍで１０分遠心すること番こより、ＲＮＡ沈殿を回収
し、これを７０％エタノールで洗った後、減圧乾燥させ
た。適当量の水に溶かし、これをＲＮＡサンプルとした
。

２／／ｇのＲＮＡを５０％ホルムアミド、２Ｍホルムア
ルデヒド、Ｉ　ＸＭＯＰＳ緩衝液（ｌＯＸＭＯＰ’４衝
液；０、２　Ｍ　ＭＯＰＳ、　０．０５Ｍ酢酸ナトリウ
ム、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７，０に調
整したもの）の組成になるようにし、６５°Ｃ５分間処
理後、１／１０量の０．０１％ブロモフェノールブルー
液（５０％グリセロールで調整したもの）を加え、これ
を１．１％アガロースゲル（Ｉ　ＸＭＯＰＳ緩衝液、２
Ｍホルムアルデヒドで調整したもの）電気泳動により分
離した。泳動後、メーカーの推奨する方法に従いＲＮＡ
をＨｙｂｏｎｄ−Ｎ門フィルター（アマンヤム・ジャパ
ン社）に移行させ、ｔＪ　Ｖ照射によりＲＮＡをフィル
ターに固定し７た。

このフィルターを、ホルムアミドを５０％含むハイブリ
ダイゼイション液にいれ、４２°Ｃで２時間保温した後
、プローブをＩ　Ｘ　１１０６ｃｐ　／ｍｌ含む同溶液
に移し、４２°Ｃで一夜保温した。なおプローブは、酵
母閑のホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫと略す）の
構造遺伝子の一部を、ＤＮＡポリメラーゼを用いたラン
ダムプライム法により、α−３２ＰｄＣＴＰにより標識
したものを用いた。フィルターを０、ｌＸ５ＳＣ及びＯ
１１％ＳＤＳで６０°Ｃで洗った後、残存する放射能は
、Ｘ−ＡＲフィルムを露光させることにより検出した。

検出の終了したフィルターは、プローブ除去液（５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、５　Ｘデンハ
ルト液、０．５％ＳＤＳ、１００Ｉ！Ｉ／蔵サケ精巣熱
変性ＤＮＡ、５０％ホルムアミド）に移し８０°Ｃで１
５分間保温した。

この操作を再度行った後、フィルターをＯ，ｌＸ５ＳＣ
で洗い、ハイブリダイゼイション液に移した。４２°Ｃ
で２時間保温した後、プローブをＩ　ＸＸ１０６ｃｐ／
ｄ含む同溶液に移し、４２°Ｃで一夜保温した。なおプ
ローブは、ネオマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡと相補鎖
を作る配列（５’　−ＴＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡ
ＡＧＣＧＧＣ）を化学合成し、その５′末端をγ３２Ｐ
−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したも
のを用いた。フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％５Ｌｌ
Ｓで６０°Ｃにおいて洗った後、残存する放射能を、Ｘ
−ＡＲフィルムに露光させることにより検出した。

ＧＡＰＤＨプロモーターを持つプラスミドｐＸＸをＸｂ
ａ　Ｉとｓｐｈ　Ｉで消化し、Ｅｘｏ　ｍヌクレアーゼ
及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作成法
により欠失変異処理を施した。なおｐＸＸの作成法は、
特願平１−３２８２６４に詳細に記載されている。欠失
変異処理したプラスミドをＴ４　ＤＮＡリガーゼにより
環状化させた後、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株を形質転換
し、得られたアンピシリン耐性コロニのＤＮＡを調べ、
欠失変異の生じたプラスミドを持つコロニーを選別した
。これらのコロニーから一本鎖ＤＮＡを調整し、シーケ
ナーゼシークエンジングキント（［Ｊ１３５１３ｉｏｃ
ｈｅｍ社）を用いてメーカーの推奨する方法にしたがっ
て配列決定を行い、欠失した領域を同定した。このよう
にして上流側ｊＢ　’ｐＨ域を含む−１０６０から−３
６１までの塩基対を欠失したプラスミドｐＸＸＮ７を得
た。なおここでの塩基対の位置はＧＡＰＤＨ遺伝子のコ
ーディング配列の開始コドン、ＡＴＧのＡを＋１として
表している。

プラスミドｐＸＸＮ７を旧ｎｄｌｌｒで消化して、３ｋ
ｂのフラグメントを得た。この断片と下に記載する配列
を持つリンカ−とを用い、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより
環状化反応を行った。

リンカ−の配列 ＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＧ
ＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧへ上記反応液を用いて大腸菌ＸＬ
Ｉ−Ｂｌｕｅ株を形質転換させ、得られたアンピシリン
耐性コロニーのＤＮＡを調べ、リンカ−の挿入したプラ
スミドを持つコロニーを選別した。これらのコロニーか
ら、−重鎖ＤＮＡを調整し、シーケナーゼシークエンシ
ングキットを用い、メーカーの推奨する方法に従って配
列決定を行い、リンカ−が正しい方向に挿入されている
ものを選び、プラスミドｐＸＸＮ７Ｌを得た。

制御配列検定プラスミドｐＪＤＢ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥを
旧ｎｄ■とＸｈｏ　Ｉで消化し、７ｋｂの断片をアガロ
ース電気泳動で分離した。ｐＪＤＢ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥ
の作成法は、特願平１−４１６０４に詳細に記載されて
いる。この断片をＧｅｎｅＣ１ｅａｎキット（８１０１
０１社）を用いて回収・精製した。一方ｐＸＸＮ７Ｌも
、ＨｉｎｄｌｌとＸｈｏ　Ｉで消化し、０．４ｋｂの断
片をアガロース電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＣ１ｅａｎ
キットを用いて精製・回収した。

ｐＪＤＢ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥ由来の断片２０ｎｇとｐＸ
ＸＮ７由来の断片１１００ｎをＴ４リガーゼにより環状
化し、環状化したＤＮＡを用いて大腸菌５Ｃ５Ｉを形質
転換した。

得られアンピシリン耐性のコロニーのＤＮＡを調べ、ｐ
ＪＤＢ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥにｐＸＸＮ７の０．４ｋｂ断
片が挿入されているものを選別した。このようにして、
上流制御配列検定プラスミドｐＸＸＮ７Ｌ−ＮｅｏＤ−
ＡＴＥを得た。このプラスミドを含有する大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　５Ｃ５Ｉ／ｐＸＸＮ７Ｌ−
ＮｅｏＤ−ＡＴＥは、工業技術院微性物工業技術研究所
に微工研菌寄第＋ｔｇｇｒ号（ＦＥＲＭＰ−ＪＩｇｇ’
７　）として寄託されている。

大腸菌５Ｃ３Ｉ株の染色体ＤＮＡ　１２．２１！ｇを、
５ａｕ３ＡＩ４０単位で３７°Ｃにて５時間反応するこ
とにより完全消化した。生じた断片はフェノール抽出及
びエタノール沈殿法により回収した。一方プラスミドｐ
ＸＸＮ７Ｌ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥをＢｇｌ　ＩＩで完全消
化し、ウシ小腸アルカリフォスファターゼにより脱リン
酸化した後、フェノール抽出、エタノール沈殿法により
回収した。このようにして得られた５ａｕ３ＡＩ断片１
１００ｎとＢｇｌｌＩ断片５０ｎｇを用いてＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼにより環状化反応を行い、この反応液を用い
て大腸菌ＳＣＳ　１株を形質転換させ、１．７５　Ｘ　
１０５のアンピシリン耐性株を得た。これらの株を混合
し、培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。このように
して５ａｕ３ＡＩライブラリーＤＮＡを得た。

大腸菌ＳＣ５１株の染色体ＤＮＡ　４８．８４を５００
　ｔｄの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ　ＭｎＣＩｚ、０．８ｎｇ　ＤＮａｓｅｌ
中で、３７”Ｃにて１０分間反応させた。これに５０ｕ
の０．５Ｍ　ＥＤＴＡを加えることにより反応を停止さ
せた。

フェノール抽出、エタノール沈殿法によりＤ　Ｎ　Ａを
回収し、マング・ビーンヌクレアーゼ処理をした。フェ
ノール抽出及びエタノール沈殿法によりＤＮＡを回収し
、１７０ＩＪ１ＯＴＥ中に回収した。ここに２０１！！
の１０倍濃度の大腸菌ＤＮＡリガーゼ緩衝液［０，２Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、４０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１００ｍＭ（ＮＨ４）　２ＳＯ４、ＩＭＫＣＩ　
、１０ｍＭβ−ＮＡＤ　）と２０ユニ・ノドの大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、１４°Ｃで２時間反応させた。こ
こに２ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩと２０ｄの１ｍ
Ｍヌクレオチド混合液（１ｍＭｄＡＴＰ、　１　ｍＭ　
ｄＴＴＰ、１ｍＭ　ｄＧＴＰ、ＩｍＭ　ｄＣＴＰ）を加
え、１４”Ｃ２時間反応させた後、室温でさらに１時間
反応させた。次にフェノール／クロロホルムにより抽出
後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤ
ＮＡを１０ｍのＴＥに溶解し、ＤＮＡ濃度を定量した。

１１．８ｑのＤＮＡが回収された。

このＤＮＡ全量を１．１８■のＢｇｌ　Ｉ［リンカ−と
全量３６ｄの溶液中でＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結
反応をさせた。７０°ＣＩＯ分の熱処理により酵素を失
活させた後、４１１１のＩＭＮａＣｌと５０単位のＢｇ
ｌＩＩを加え、完全消化した。ベツド体積１戚のセファ
クリル８２００カラムによりゲルろ過を行ないボイド体
積付近に溶出されたＤＮＡを回収した。このＤＮＡの一
部（３００ｎｇ）　と、前記のように処理したρＸＸＮ
７ＮｅｏＤ−ＡＴεのＢｇｌ　２１断片５０ｎｇを用い
てＴ４　ＤＮＡリガーゼにより環状化反応を行い、この
反応液を用いて大腸菌ＳＣ５１株を形質転換し、１．６
４　Ｘ　１０’のアンピシリン耐性株を得た。これらの
株を混合し、培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。こ
のようにして口Ｎａ５ｅｌライブラリーＤＮＡを得た。

ライブラリーＤＮＡ　２０ｇを用いて酵母Ａｌ２２株を
形質転換した。形質転換の方法は、Ｌｉ５ＣＮを用いる
常法で行った。形質転換株の選択はロイシンを含まない
ＳＤ寒天培地で行った。コロニーの大きさが直径約２ｍ
ｍとなった時点で、コロニーをＲｅｐｌｉＰｌａｔｅ（
ＦＭＣｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、８ｍｇ／ｄ
　Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天培地に移した。この培地上
で更に成育する株を選んだ。

成育が見られたコロニーを新しいＧ４１Ｂを含む寒天培
地上に移し、コロニー単離を行った。この培地で比較的
成育の早いコロニーを更に選択した。

このようにして５ａｕ３Ａ　ＩライブラリーＤＮＡを基
に得られたコロニーのＳＮ１株、ＳＮ２株及びＳＡ１株
、並びにＤＮａｓｅＩライブラリーＤＮＡを基にして得
られたコロニーの、ＤＮＩ株及びＤＮ２株を得た。ＳＮ
１株及びＤＮ２株をそれぞれＧ４１８を含むＹＰＤ液体
培地で培養し、全ＤＮＡを調製した。

このＤＮＡを用いて大腸菌５ＣＳＩ株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性コロニーを選択した。

得られた大腸菌コロニーのプラスミドＤＮＡを調製し制
限酵素地図を作成した。制限酵素地図を比較することに
よりＳＮ１株からはｐｓＮｌ−１０，ｐＳＮ１−１２　
、　ｐｓＮｌ−１５など５種類の、ＤＮ２株からはｐＤ
Ｎ２−１８など４種類のそれぞれ異なったプラスミドが
単離できた。同様に、ＳＮ２株からはｐＳＮ２−５ｐＳ
Ｎ２−１等が、ＳＡＩ株からはｐｓＡｌ−１等が、また
ＤＮＩ株からはｐＤＮｌ−２，ｐＤＮｌ−７等が単離さ
れた。

これらのプラスミドを用い、再度酵母ＡＨ２２株を形質
転換し、ロイシンを含まないＳＤ寒天培地で形質転換体
を選択した。形成されたコロニーを８■／ｄ　Ｇ４１８
を含むＹＰＤ寒天培地に移し、この培地上で成育できる
か否かを調べた。その結果ＤＮ２株由来のプラスミドで
はｐＤＮ２−１８により、そしてＳＮ１株由来のプラス
ミドではｐｓＮｌ−１０，ｐｓＮ１１２又はｐｓＮｌ−
１５により形質転換した酵母が６４１８耐性の形質を得
ていた。同様に、上記のＳＮ２株、ＳＡＩ株及びＤＮＩ
株から単離されたプラスミドにより形質転換された酵母
もＧ４１８耐性の形質を得ていた。

これらの耐性が確かめられた酵母を、Ｇ４１８を０．５
■／ｄ含むＹＰＤ液体培地で培養し、常法に従いＲＮＡ
を調製した。こうして調製したＲＮＡノーザンハイブリ
ダイゼイション法により分析した。この結果を第２図に
示す。この結果から、ｐＤＮ２−１８の形質転換株及び
ｐｓＮｌ−１０形質転換株でＮｅｏＤ　ｍＲＮＡが効率
良く発現していることが明らかである。

ｐＸＸＮ７Ｌ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥはそのままでは酵母に
６４１８耐性を付与できず、またこのプラスミドによっ
て形質転換された酵母からは、ＮｅｏＤ　ｍＲＮＡはノ
ーザンハイブリダイゼイションによって検出できないこ
とから、ｐＤＮ２−１８及びｐｓＮｌ−１０が上のよう
な形質を酵母に付与すると言う性質が、これらに挿入さ
れた大腸菌染色体ＤＮＡによって付与されたものである
ことは明らかである。つまりこれらの大腸菌染色体ＤＮ
Ａ断片はＵＡＳ活性を持っていると言える。このように
して上流制御配列を持ったプラスミドｐｓＮ１−１０及
びｐＤＮ２−１８を得た。プラスミドｐｓＮ１−１０を
含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＳＣ
ＳＩ／ｐｓＮ１−１０は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１１６８０号（ＦＥＲＭ　ｐ−１１６
２ρ）として寄託されており、同様にプラスミドｐＤＮ
２−１８を含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ　５Ｃ５Ｉ／ｐＤＮ２−１８は微工研菌寄第１１
ｂ７７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１＆７ヌ）として寄託され
ている。

ｐｓＮｌ−１０を旧ｎｄＩ［［とＸｈｏ　Ｉで消化し、
大腸菌ＤＮＡ断片とＧＡＰＤＨプロモーター断片を含む
０．６５ｋｂの断片を得た。この断片５０ｎｇと旧ｎｄ
Ｉ［［とＸｈｏ　Ｉで消化したｐＴ３Ｔ７Ｕ１８−　Ｘ
、２０ｎｇとをＴ４　ＤＮＡリガーゼによって環状化さ
せた。これを用いて大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株を形質転
換してアンピシリン耐性コロニーヲ得た。このコロニー
から１本鎖ファージＤＮＡを調製しそれの塩基配列の決
定を行った。決定された塩基配列のうち大腸菌ＤＮＡ断
片部分を第３図に示す。この断片が大腸菌のものである
ことはこの断片をプローブに行ったサザンハイプリダイ
ゼイションによってこの断片が大腸菌染色体ＤＮＡのみ
に結合し、酵母染色体ＤＮＡに結合しないことから確か
められた。またこの塩基配列を基に、遺伝子バンク（Ｇ
ＥＮＢＡＮＫ；Ｒ５８，Ｏ）を検索したが、致する配列
が見いだされなかったことからこの配列が新規ＤＮＡで
あることは明らかである。

一方ｐＤＮ２−１８についても同様の分析を行った。

ｐＤＮ２−１８を旧ｎｄＩ［［とＸｈｏ　Ｉで消化し、
大腸菌ＤＮＡ断片とＧＡＰＤＨプロモーター断片を含む
０．６５ｋｂの断片を得た。この断片５０ｎｇと旧ｎｄ
ｎ［とＸｈｏ　Ｔで消化したｐＴ３Ｔ７Ｕ１８−Ｘ、２
０ＢをＴ４　ＤＮＡリガーゼによって環状化させた。こ
れを用いて大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株を形質転換しアン
ピシリン耐性コロニーを得た。

なお、プラスミドｐＴ３Ｔ７Ｕ１Ｂ−Ｘの作成方法は参
考例３に記載する。このコロニーから１本鎖ファージＤ
ＮＡを調製しそれの塩基配列の決定を行った。

決定された塩基配列のうち大腸菌ＤＮＡ断片部分を第４
図に示す。この断片が大腸菌のものであることはこの断
片をプローブに行ったサザンハイプリダイゼーションに
よってこの断片が大腸菌染色体ＤＮＡのみに結合し、酵
母染色体ＤＮＡに結合しないことから確かめられた。ま
たこの塩基配列を基に、遺伝子バンク（ＧＥＮＢＡＮＫ
；Ｒ５Ｂ、Ｏ）を検索したが、一致する配列が見いださ
れなかったことからこの配列が新規ＤＮＡであることは
明らかである。

上流制御配列としての機能を検定するため↓こ検定用プ
ラスミ）”ｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥを次のように
して作成した。ＡＤＨＩ遺伝子のプロモーター配列を持
つプラスミドｐＤＥ６−１０（Ｘｈｏ）　（特願６３−
２６８３０２　：微工研寄第１０３１１号）をＴａｑ　
ＩとＸｈｏ　Ｉで消化し、２４６ｂｐの断片を得た。こ
の断片とＡｃｃ　ＩとＸｈｏ　Ｉで切断したｐＴ３Ｔ７
Ｌ１１８−ＸをＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼによっ”’Ｃ環状
化させることによりｐＡＸ−３７を得た。プラスミｌ”
ｐＡＸ３７を旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、３ｋｂの断片を得
た。この断片と下に記載する配列を持つＢｇｌ　Ｕリン
カ−とを用いてＴ４　ＤＮＡリガーゼにより環状化反応
を行った。

リンカ−の配列 ＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＧ
ＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡ上記反応液を用いて大腸菌ＬＸ
Ｉ−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性コロニーのＤ入Ａを調べ、リンカ−の挿入したプラス
ミドを持つコロニーを選別した。これらのコロニーから
、重鎖ＤＮＡを調整し、シーケナーゼシークエンシング
キソトを用い、メーカーの推奨する方法にしたがって配
列決定を行い、リンカ−が正しい方向に挿入されている
ものを選び、プラスミドｐＡＸ−３７Ｌを得た。ｐＡＸ
−３７Ｌを旧ｎｄＩ［ＩとＸｈｏ　Ｉで切断することに
よって得られる約２５０ｂｐの断片と、ｐＪＤＢ−Ｎｅ
ｏＤＡＴＥをＨｉｎｄＩ［ｌとＸｈｏ　Ｉで切断して得
られる約７ｋｂの断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼにより
環状化させることにより、ｐＡＸＬ−ＮｅｏＤ−ＡＴＥ
を得た。

一方プラスミドｐＭｃ１５８７（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙｌｏｏ、　２９３−３０８．１９
８３）をＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで消
化し、ＢａｍＨＩ　−５ａｌ　Ｉ　　６．２ｋｂの断片
を得た。

この断片をＢａｍＨＩと５ａＩＩで切断したｐＴ７Ｔ３
［１１９（ファルマシア社）とＴ４　ＤＮＡリガーゼに
より連結して環状化することによりプラスミドｐＬａｃ
ＢＳを得た。ｐＬａｃＢＳをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで
消化して得られた断片とＬａｃＺ遺伝子に開始コドンを
付与するための下記のリンカ−をＴ４　ＤＮＡリガーゼ
によって連結、環状化させることによってプラスミドｐ
ＬａｃＢＳ−χを得た。

ＡＡＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＧＡＧＣ
ＴＣＴＡＣＣＴＡＴＡＧＣＴＡＧこのｐＬａｃＢＳ−χ
をＸｈｏ　ＩとＤｒａ　Ｉで切断することにより、Ｌａ
ｃＺ遺伝子を含む３．２ｋｂの断片を得ることができた
。この断片とＳｍａ　ＩとＸｈｏ　Ｉで切断したρＴ７
Ｔ３Ｕ１８　（７７１１７９７社）をＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼにより結合、環状化させることによりｐＬａｃＺＣ
−３７を得た。ｐＬａｃＺＣ−３７をＤｒａ　Ｉ　、Ｘ
ｈｏ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩで切断して得られた３、２ｋ
ｂ断片と、　ｐＡＸＬ−ＮｅｏＤ−八ＴＥをｘｌｌｏ　
Ｉ　、　ＢａｍＨＩで切断することによって得られる７
ｋｂの断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼによって結合、環状
化させることによりｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥを得
た。

（その２）　　　の　　と　　　　の限第３図に示した
様にｐｓＮｌ−１０は２５５塩基対よりなる大腸菌染色
体由来のＤＮＡ断片を持っていた。

この断片が、制限酵素地図から、５８塩基対、２８塩基
対、１６４塩基対の３つの５ａｕ３ＡＩ断片から成り立
っていることは明らかである。このいずれの断片がＵＡ
Ｓ機能を持っているのかを、それぞれの断片をｐＡＸＬ
−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥの８ｇｌｌｌサイトに挿入し、挿
入したプラスミドを酵母に導入し、導入された酵母の作
るβ−ガラクトシダーゼの活性を測定することによって
調べた。以下にその方法を詳細に記す。

塩基配列決定用に作成したｐｓＮｌ−１０のＨｉｎｄＩ
［ＩＸｈｏ　Ｉ断片が挿入されたプラスミドを５ａｕ３
ＡＩで切断し、５８．２８．１６４塩基対の断片を得た
。一方プラスミドｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥをＢｇ
ｌ　ｎで消化し、ウシ小腸アルカリフォスファターゼに
より脱リン酸化した後、フェノール抽出、エタノール沈
殿法により回収した。このようにして得られた５ａｕ３
ＡＩ断片と、ｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥのＢｇｌ　
Ｔｌ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結、環状化
し、ｐｓＮｌ−１０（５８）、　ｐｓＮｌｌｏ（１６４
）、　ｐｓＮｌ−１０（２８）を得た。これらはそれぞ
れ５８、１６４．２８塩基対の５ａｕ３ＡＩ断片が挿入
されているプラスミドである。このプラスミドを用いて
酵母ＤＣ５株を形質転換し、ロイシンを含まないＳＤ寒
天培地で形質転換体を選択した。

得られた形質転換体を５−のＳＤ液体培地で２日間３０
°Ｃにおいて培養した。培養後細胞を遠心により集め、
１００１１１のＺバッファー（リン酸二ナトリウム・７
水塩８．５５ｇ、リン酸−ナトリウム・１水塩２．７５
ｇ、塩化カリウム０．３７５ｇ、硫酸マグネシウム・７
水塩０．１２３ｇ、　２−メルカプトエタノール１．３
５ｄを水に溶かし全量をｉｆにする）に再懸濁した。そ
こに１００ｍのガラス・ビーズ（直径０、４　ｔｒｍ　
）を加え、ポルテックスミキシングを２分間行った。そ
こに１００ＩのＺバッファーを加え軽く混合した後、遠
心をした。遠心後、上清を取ることにより細胞抽出液を
得た。

１−のＺバッファーに細胞抽出液を加え、そこに１００
ｄの４■／ｄの０−ニトロフェニル−γＤ−ガラクトピ
ラノシド溶液を加え、混合した後、２８°Ｃで反応を行
わせた。適当な時間に１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加える
ことによって、反応を停止させ、反応液の００４２０を
測定した。また細胞抽出液の蛋白濃度を、Ｂｊｏ−Ｒａ
ｄ社のプロティンアッセイ液を用いて計測した。β−ガ
ラクトシダーゼの活性値は以下の計算式で算出した。

算出された活性値を第６図に示した。この図から１６４
塩基対の断片がＵＡＳ活性を持つことが明らかである。

ｐｓＮｌ−１０（１６４）はｐｓＮｌ−１０と同様にＴ
ＡＴＡ配列に対しては同じ向きで挿入されていることが
、塩基配列を決定することによって明らかになった。そ
こで逆向きに挿入したものを作成し、ＵＡＳ活性がある
か否かを調べた。逆向きに挿入されたプラスミドはｐＳ
Ｎ　１−１０　（１６４Ｒ）で、第６図に示すように、
形質転換体にβ−ガラクトシダーゼを作らせる能力があ
ることは明らかである。つまり逆向きでも活性が喪失し
ないという、ＵＡＳの特徴をこの１６４塩基対の断片が
持っていると言える。

一方ｐＤＮ２−１８は両端にＢｇｌＩ［リンカ−を持っ
た１５３塩基対の大腸菌染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片
を持っていた。このＢｇｌＩＩ断片を、ｐＤＮ２−１８
をＢｇｌ■で切断することにより得た。この断片とアル
カリフォスファターゼで処理したｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ
−ＡＴＥのＢｇｌ　ＩＩ断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼ
により連結、環状化させ、ＴＡＴＡ配列に対して、異な
った方向に挿入された２種類のプラスミドを得た。ｐＤ
Ｎ２−１８と同じ方向のものをｐＤＮ２−１８５．逆向
きのものをｐＤＮ２−１８Ｒと名付けた。これらを酵母
ＤＣ５株に導入し、得られた形質転換体の細胞質のβ−
ガラクトシダーゼの活性を測定した。第７図から明らか
なように、ＴＡＴＡ配列に対してどちらの方向に位置し
ても活性が検出された。このことからＤＮ２−１８＃ｆ
ｉ片はＵＡＳの特徴を持っていることは明らかである。

ｎａｉｌユ　解　系　伝　のＵＡＳと組みムわせた検定 〜Ｂ） 酵母のＰＧＫ遺伝子のプロモーター領域を持つプラスミ
ドｐＰＧＫＮｌ　（作成方法は参考例１に記載する）を
トロｄｌで切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ■（［ｌｅ
ｎｏｗ断片）で平滑末端化した後、セルフライゲーショ
ンさせた。得られたプラスミドをＮｈｅｌとχｈｏｌで
切断し、プロモーターを含む約１．５ｋｂの断片を得た
。この断片とＸｂａ　Ｉとχｈｏｌで切断したｐＴ３Ｔ
７Ｕ１８−χと連結環状化反応を行わせ、プラスミドｐ
ＮＸを得た。これをＳａｌ　ＩとＳｐｈ　Ｉで切断し、
Ｅｘｏ　ｍヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼ
を用いた欠失変異作成法により、欠失変異処理を施した
。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより環状化させた後、大腸菌
χＬｌ−Ｂｌｕｅ株を形質転換させ、得られたアンピシ
リン耐性コロニーのＤＮＡを調べ、欠失変異の生したプ
ラスミドを持つコロニーを選んだ。これらのコロニーか
ら、−本領ＤＮＡを調製し、シーケナーゼシークエンシ
ングキットを用い、メーカーの推奨する方法にしたがっ
て配列決定を行い、欠失した領域を同定し、ｐＮＸ２を
得た。

プラスミドｐＮＸ２を旧ｎｄｌＩＩとＲｓａ　Ｉで切断
し、約２３０塩基対の断片を得た。この断片をＳｍａ　
ＩとＨｉｎｄ　ｍで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　
ＩＩ　−ＫＳ　十（ＢｇＩ）　（参考例３にこのプラス
ミドの作製法を記載する。）と連結環状化反応を行わせ
、プラスミドｐＵＡＳ−ＰＧＫを得た。このプラスミド
にはＫｉｎｇｓｍａｎ等（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　４３３５−４３４３．１９８
６）が報告しているＰＧＫのＵＡＳが含まれている。プ
ラスミドｐＵＡＳＰＧＫを旧ｎｄｌｌＴとＢｇｌＩｌで
切断し、約２５０塩基対の断片を得た。この断片を旧ｎ
ｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで切断したρＡＸＬ−ＬａｃＺＣ
−３１５と連結、環状化させることにより、プラスミド
ｐＰＧＫ　・ＡＸ−ＬａｃＺＣを得た。

プラスミドｐＤＮ２−１８をＢｇｌ　ＩＩで切断し、１
５３塩基対のＢｇｌＩＩ断片を得た。この断片とアルカ
リフォスファターゼ処理をしたｐＰＧＫ　−ＡＸ−Ｌａ
ｃＺＣのＢｇｌ■断片との連結環状化反応をＴ４ＤＮＡ
ｉＪガーゼを用いて行い、プラスミドｐＰＧＫ　−ＤＮ
Ｓを得た。ｐＰＧＫ・ＤＮＳはＰＧＫのＵＡＳとＤＮ２
−１８とのハイブリットＵＡＳであり、ＤＮ２−１８断
片は、ＴＡＴＡ領域に対して、順向き（実施例５、その
２を参照のこと）に挿入されていることを塩基配列を決
定することにより確認した。

このプラスミドを用いて酵母ＤＣ５株を形質転換し、得
られた形質転換体を培養し、作られたβガラクトシダー
ゼの活性を測定した。その結果を第８図に示す。ＵＡＳ
単独よりもＵＡＳを組み合わせることにより活性が上昇
していることは明らかである。

びＢ） ｐＤＮ２−１８及びｐｓＮｌ−１０を旧ｎｄｎｌと５ａ
ｌｌで切断し、約１．８ｋｂの断片を得た。この断片と
組み込み型プラスミドｐＲｓ３０５（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ
及び旧ｅｔｅｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２、１９−２
７．１９８９）を旧ｎｄｌＩ［とＳａｌ　ｌで切断した
５、５ｋｂの断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより連結
し、環状化させることにより、ｐＤＮ２−１８−３０５
、ｐｓＮｌｌｏ−３０５を得た。

Ｈ３Ａ３ＡプラスミドであるｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｌ３Ａ
−Ａ（微工研菌寄第１０３０７号）（特開平２−１１．
７３８４）をＸｈｏｌと５ｐｈｌで切断し、ｌ５Ａ−Ａ
遺伝子とへ〇旧転写り−ミネーター領域を含む約２．２
ｋｂの断片を得た。

一方プラスミドｐＤＮ２−１８３０５及びｐｓＮｌ−１
０−３０５をそれぞれＸｈｏ　Ｉとｓｐｈ　Ｉで切断し
、約６ｋｂの断片を得、これらの断片とＨ３Ａ遺伝子を
含む上記断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結、環
状化させることにより、組み込み型Ｈ３Ａ３Ａプラスミ
ド、ｐＤＮ２−１８−ＩＳＡ及びｐｓＮｌ−１０−ＩＳ
Ａを得た。

ｐＤＮ２−１８およびｐｓＮｌ−１０はＣ１ａ　Ｉによ
って切断され、直鎖型になったものを用いて、酵母ＡＨ
２２株を形質転換した。ロイシンを含まないＳＤ寒天培
地上で生育してくる形質転換体を選んだ。ＩＳＡの発現
は形質転換体をまずＳＤ液体培地で２日間培養し、１：
１００の割合でＹＰＤ液体培地に接種した後、更に２４
時間培養を行い、ＹＰＤ培地中に分泌されたＩＳＡを調
べることによって確かめられた。培養後培養液０．５　
ｄを取り、遠心によって細胞を取り除いた。得られた培
養上清に等量のエタノールを加えてよく混合した後、０
°Ｃに１時間静置することによりＩＳＡを沈殿させた。

沈殿物を遠心によって集め、それを５Ｏ５−ＰＡＧＥに
より分析した。ＡＤＨプロモーターの制御のもとに、Ｉ
　ＳＡを発現させ得るプラスミドを酵母ＡＨ２２株旧８
４部位に組み込ませた株、ＨＩＳ２３株の生産するＩＳ
Ａをコントロールに取った。その結果を第９図に示す。

第９図から明らかなように、ハイブリッドプロモーター
を持つｐＤＮ２４８−Ｉｓ八及びｐｓＮｌ−１０−ｌ５
Ａによって形質転換された酵母は、コントロールよりも
大量のＩＳＡを生産していることは明らかである。

蓑考■玉　　　ＰＧＫ　　　　の　　とそのブロモ作成 酵母Ａ）１２２株の染色体ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩで部分
分解して得られた断片を用いてＥＭ肛３　（Ｓ　ｔｒａ
　ｔａｇｅｎｅ社）をヘクターとして作成したラムダフ
ァージライフラリ−を用い、ＰＧＫ遺伝子の翻訳領域の
アミノ末端から９残基から１８残基までに相当する塩基
配列を持つプローブ （５’　　−ＧＴＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡ
ＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴ−３’　　）でてプラークハイ
ブリダイゼーションを行うことにより、ＰＧＫ遺伝子を
持ったファージクローンＰＧＫＩを得た。

ＰＧＫＩを旧ｎｄｌｌｌで消化し２．９５ｋｂの断片を
得た。この断片をｐＵｃ１９の旧ｎｄｌｌ［サイトにサ
ブクローニングすることにより、プラスミドｐＵｃ−Ｐ
ＧＫを得た。

ｐｔｌｃ−ＰＧにを５ａｌｌとＳａｃ　Ｉで切断し、２
ｋｂのプロモーター領域を含む断片を得た。この断片を
ｐＳＶＰＬのＳａｌ　ＩとＳａｃ　Ｉサイトの間にサブ
クローニングすることによりｐＳＶ−ＰＧＫを得た。ｐ
ＳＶ−ＰＧＫをＫｐｎ　ｌと５ａｌｌで切断して得られ
た２ｋｂの断片をｐＵｃ１１９ＸのＫｐｎ　Ｉと５ａｉ
ｌサイトの間ニニサブクロニングすることによりｐＰ（
、に−ＰＲＯＴを得た。

ｐＰＧＫ−ＰＲＯＴをＥｃｏＲＶとＫｐｎ　Ｉで切断し
、　Ｅｘｏ　［１ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレ
アーゼを用いた欠失変異作成法により、欠失変異処理を
施した。Ｔ４リガーゼにより環状化させた後、大腸菌Ｘ
ＬＩ−Ｂｌｕｅ株を形質転換させ、得られたアンピシリ
ン耐性コロニーのＤＮＡを調べ、欠失変異の生じたプラ
スミドを持つコロニーを選別した。これらのコロニーか
ら、−本領ＤＮＡを調整し、シーケナーゼシｉクエンシ
ングキットを用い、メーカーの推奨する方法にしたがっ
て配列決定を行い、欠失した領域を同定した。その結果
ＰＧＫ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡを＋１として
表した場合、−１０塩基までを欠失したプロモーター配
列を持つｐＰＧＫＮｌを得た。

プラスミドｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥを旧ｎｄｌＩ
［とＳａｌ　Ｉで切断し、３．５ｋｂの断片を得た。こ
の断片をセントロメアプラスミドであるｐＲｓ３１５　
（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ及び旧ｅｔｅｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　１２２．　ｐ１９−２７．１９８９）のマルチク
ローニングサイト領域にある旧ｎｄｌ［［及びＸｈ。

ＩサイトにサブクローニングすることによりｐＡＸＬＬ
ａｃＺＣ−３１５を得た。

プラスミドｐＴ７Ｔ３０１ＢをＥｃｏＲｌで切断し、５
　’　−ＡＡＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣの配列を持つリンカ
−と共に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて再環状化させ
た。これを用いて大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株を形質転換
し、アンピシリン耐性となったコロニーのＤＮＡを調べ
、ＥｃｏＲＩで切断されず、Ｘｈｏ　Ｉで切断されるプ
ラスミドを持つコロニーを選ぶことにより、ｐＴ３Ｔ７
Ｕ１８−χを得た。

プラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｕ　ＫＳ　＋　（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）をＸｂａ　Ｉで切断した後、６
５°Ｃ１５分処理することにより酵素を失活させた。そ
こに１ｍＭヌクレオチド混合液（１ｍＭ　ｄＡＴＰ、　
１　ｍＭ　ｄＴＴＰ、　１　ｍＭ　ｄＴＴＰ、　１　ｍ
ＭｄＣＴＰ　）を５０ｕＭとなるように加え、０．５ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗ断片）を加
え・３７°Ｃ。

１５分処理することにより、Ｘｂａ　Ｉサイトを平滑末
端化した。フェノール・クロロホルムで抽出した後、エ
タノール沈殿により回収した。この得られた断片と、ｐ
Ｂｇｌ　ＩＩリンカ−（５′−ｐ−ＣＡＧＡＴＣＴＧ）
を結合、環状化させた後、大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株を
形質転換し、アンピシリン耐性となったコロニーを得た
。コロニーのＤＮＡを調べ、Ｂｇｌ　ＩＩで切断され、
Ｘｂａ　Ｉで切断されないものを選ぶことにより、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｕ　−ＫＳ　＋　（Ｂｇｌ　）を
得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、上流制御配列検定用プラスミドｐＸＸＬＮ７
ＮｅｏＤ−ＡＴＥの作成過程を示す。 第２図は、大腸菌染色体から得られた種々のＤＮＡ断片
に由来するｍＲＮＡとＮｅｏ遺伝子又はＰＧに遺伝子プ
ローブとのハイブリダイゼーションの結果を示す。 第３図は、大腸菌染色体由来の上流制御配列を含むＤＮ
Ａ断片５ＮＩ−１０の塩基配列を示す。この塩基配列の
内筒８７位のＧから第２５０位のＣまでの部分が上流活
性化作用を示す。 第４図は、大腸菌染色体由来の上流制御（活性化）配列
ＤＮ２−１８の塩基配列を示す。 第５図Ａ、Ｂ、及びＣは上流制御配列検定用プラスミド
ｐＡＸＬ−ＬａｃＺＣ−ＡＴＥの作成過程を示す。 第６図は、第３図に示す配列５ＮＩ−１０中の３個の部
分配列の上流活性化作用を比較したグラフである。 第７図は、第４図に示す上流制御配列ＤＮ２４８が順方
向（Ｓ）及び逆方向（Ｒ）のいずれで挿入されても上流
活性化作用を有することを示すグラフである。 第８図は、本発明の大腸菌由来上流制御配列と酵母プロ
モーターの上流制御配列とから成るハイブリッド上流制
御配列が順、逆いずれの方向で挿入されても上流活性化
作用を有することを示すグラフである。 第９図は、本発明のハイブリッドプロモーターのもとて
のヒト血清アルブミンの発現を示す電気泳動図である。 第１０図Ａ−Ｃは、プラスミドｐＰ（、Ｋ　−ＤＮＳの
作成の過程を示す。 第１１図Ａ及びＢはプラスミドｐＤＮ２−１８−Ｈ５へ
及びｐＤＮｌ−１０−ＩＳＡの作成の過程を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵母中で機能することができる大腸菌由来の上流制
   御配列。 ２、上流活性化配列である請求項１に記載の上流制御配
   列。 ３、第３図に示す塩基配列の内第８７位のＧから第２５
   ０位のＣまでの配列、又は第４図に示す塩基配列を含ん
   で成る請求項１に記載の上流制御配列。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載の上流制御配列
   と酵母上流制御配列とを含んで成るハイブリッド上流制
   御配列。 ５、前記の酵母上流制御配列がＧＡＰＤＨプロモーター
   、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＰＹＫ
   プロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、ＴＰＩプロモー
   ター又はＦＢＡプロモーターの上流活性化配列である請
   求項４に記載のハイブリッド上流制御配列。 ６、請求項１〜３のいずれか１項に記載の上流制御配列
   と酵母プロモーターのＴＡＴＡ領域とを含んで成り酵母
   において機能することができるハイブリッドプロモータ
   ー。 ７、前記酵母プロモーターのＴＡＴＡ領域がＧＡＰＤＨ
   プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨＩプロモー
   ター、ＰＹＫプロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、Ｔ
   ＰＩプロモーター又はＦＢＡプロモーターのＴＡＴＡ領
   域である請求項６に記載のハイブリッドプロモーター。 ８、請求項１〜３のいずれか１項に記載の上流制御配列
   と酵母プロモーターとから成り酵母が機能することがで
   きるハイブリッドプロモーター。 ９、前記酵母プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーター、
   ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＰＹＫプ
   ロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、ＴＰＩプロモータ
   ー又はＦＢＡプロモーターである請求項８に記載のハイ
   ブリッドプロモーター。 １０、酵母プロモーターのＴＡＴＡ領域、翻訳開始コド
   ンを含む構造遺伝子及び酵母複製起点を含んで成る、上
   流制御配列検定用プラスミド。 １１、前記酵母プロモーターのＴＡＴＡ領域がＧＡＰＤ
   Ｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨＩプロモ
   ーター、ＰＹＫプロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、
   ＴＰＩプロモーター又はＦＢＡプロモーターのＴＡＴＡ
   領域であり、そして前記構造遺伝子がネオマイシン耐性
   遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子である請求
   項１０に記載のプラスミド。