JP2971290B2 - プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ - Google Patents
プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、ヒトＣＲ
Ｐ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子
を有する新規なプラスミド、このプラスミドで形質転換
された新規な微生物、例えばエシェリチア・コリ及び該
形質転換体を培養することによるヒトＣＲＰの新規製造
法に関するものである。
関するものであり、更に詳細には、本発明は、ヒトＣＲ
Ｐ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子
を有する新規なプラスミド、このプラスミドで形質転換
された新規な微生物、例えばエシェリチア・コリ及び該
形質転換体を培養することによるヒトＣＲＰの新規製造
法に関するものである。
【０００２】本発明によってヒトＣＲＰの工業的製法が
確立され、しかもこのヒトＣＲＰは純度が非常に高いの
で、医薬はもとより診断、臨床検査の技術分野において
も、有利に利用することができる。
確立され、しかもこのヒトＣＲＰは純度が非常に高いの
で、医薬はもとより診断、臨床検査の技術分野において
も、有利に利用することができる。
【０００３】
【従来の技術】ヒトＣＲＰは、細菌感染症、組織の虚血
性障害、悪性腫瘍などに起因する本態不明の刺激物質の
刺激によって肝臓で生成され、血流を通じて炎症の場に
達し、壊死に陥った細胞膜のリン脂質と結合して補体の
活性化、血小板凝集の抑制、リンパ球諸機能の促進、貧
食細胞の機能促進などの生物学的変化をおこし、それら
を通じて炎症により生じた体内の病的産物を除去する。
性障害、悪性腫瘍などに起因する本態不明の刺激物質の
刺激によって肝臓で生成され、血流を通じて炎症の場に
達し、壊死に陥った細胞膜のリン脂質と結合して補体の
活性化、血小板凝集の抑制、リンパ球諸機能の促進、貧
食細胞の機能促進などの生物学的変化をおこし、それら
を通じて炎症により生じた体内の病的産物を除去する。
【０００４】臨床検査分野において、血中ＣＲＰ濃度の
定量は、一元免疫拡散法、毛細管法などＣＲＰを含む被
検血清に抗ＣＲＰ血清を加える方法で測定されている。
しかし、現在用いられている腹水由来の抗原はＣＲＰと
アミノ酸配列上のホモロジーの高いＳＡＰ（Ｓｅｒｕｍ
Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）をはじめ
とする血清成分を、抗原として問題のない程度まで精製
除去したものであるが、そのためには多くの精製ステッ
プが必要となり生産コストがかかる。また精製が不十分
で血清成分が混合したようなＣＲＰを抗原として動物に
免疫して得られた抗血清あるいはＩｇＧを用いて血液中
のＣＲＰを測定すると、精製で完全に除去できなかった
ＳＡＰをはじめとする血清成分に対する抗体のバックグ
ランドがあって正確に定量することが難しかった。
定量は、一元免疫拡散法、毛細管法などＣＲＰを含む被
検血清に抗ＣＲＰ血清を加える方法で測定されている。
しかし、現在用いられている腹水由来の抗原はＣＲＰと
アミノ酸配列上のホモロジーの高いＳＡＰ（Ｓｅｒｕｍ
Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）をはじめ
とする血清成分を、抗原として問題のない程度まで精製
除去したものであるが、そのためには多くの精製ステッ
プが必要となり生産コストがかかる。また精製が不十分
で血清成分が混合したようなＣＲＰを抗原として動物に
免疫して得られた抗血清あるいはＩｇＧを用いて血液中
のＣＲＰを測定すると、精製で完全に除去できなかった
ＳＡＰをはじめとする血清成分に対する抗体のバックグ
ランドがあって正確に定量することが難しかった。
【０００５】それゆえ、臨床検査分野における抗原ＣＲ
ＰとしてＳＡＰをはじめとする血清成分の残存の無い高
純度で安価なＣＲＰの出現が熱望されていた。
ＰとしてＳＡＰをはじめとする血清成分の残存の無い高
純度で安価なＣＲＰの出現が熱望されていた。
【０００６】一方、エシェリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属に属する細菌は、ＣＲＰを全く生産しない。
ｉａ）属に属する細菌は、ＣＲＰを全く生産しない。
【０００７】また、組換えＤＮＡに有用なプラスミドお
よびそれによって形質転換された微生物はよく知られて
いる。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８，１０５６（１
９７８）には、プラスミドｐＢＲ３２２にラクトースプ
ロモーターをつないだプラスミドを導入した大腸菌内で
動物タンパク質が生産されることが記載されている。
よびそれによって形質転換された微生物はよく知られて
いる。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８，１０５６（１
９７８）には、プラスミドｐＢＲ３２２にラクトースプ
ロモーターをつないだプラスミドを導入した大腸菌内で
動物タンパク質が生産されることが記載されている。
【０００８】しかし、ヒトＣＲＰ遺伝子を有するプラス
ミド及びそれによって形質転換された微生物に関して
は、全く何も記載されていないし、その創製に成功した
という報告もなされていない。
ミド及びそれによって形質転換された微生物に関して
は、全く何も記載されていないし、その創製に成功した
という報告もなされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】臨床検査分野におい
て、血液中のＣＲＰ量を定量する場合、その抗体作製に
用いる抗原ＣＲＰに微量の血清成分（特にＳＡＰ）が残
存すると、得られた抗血清は残存血清成分に対する抗体
も含むことになり、測定値にバックグランドが生じる。
従ってヒト由来の原料から抗原ＣＲＰを調製する限り、
血液中のＣＲＰ量を正確に定量できるＣＲＰ抗体の調製
が困難であった。
て、血液中のＣＲＰ量を定量する場合、その抗体作製に
用いる抗原ＣＲＰに微量の血清成分（特にＳＡＰ）が残
存すると、得られた抗血清は残存血清成分に対する抗体
も含むことになり、測定値にバックグランドが生じる。
従ってヒト由来の原料から抗原ＣＲＰを調製する限り、
血液中のＣＲＰ量を正確に定量できるＣＲＰ抗体の調製
が困難であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは遺
伝子工学的にヒトＣＲＰを調製する事によって血清成分
の存在しない高純度な抗原ＣＲＰの調製を鋭意研究した
結果、ＣＲＰを大腸菌の菌体外に分泌発現させることに
よって天然型ＣＲＰと蛋白化学的、免疫学的にまったく
同一の組換えＣＲＰを調製するのに成功した。
伝子工学的にヒトＣＲＰを調製する事によって血清成分
の存在しない高純度な抗原ＣＲＰの調製を鋭意研究した
結果、ＣＲＰを大腸菌の菌体外に分泌発現させることに
よって天然型ＣＲＰと蛋白化学的、免疫学的にまったく
同一の組換えＣＲＰを調製するのに成功した。
【００１１】すなわち、本発明者らは、ヒトＣＲＰをヒ
トプラセンタ由来の染色体ＤＮＡからＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用
いて増幅し、これを発現できるプラスミドにクローン化
しうることおよびこのプラスミドで形質転換されたエシ
ェリチア・コリが大量のヒトＣＲＰを生産すること、ま
たこの組換え型ＣＲＰは天然型と全く同一のアミノ酸配
列を持ち、天然型と同様にカルシウムイオン存在下にホ
スホリルコリンと結合すること、ホスホリルコリン固定
化カラムを用いたアフィニティ精製法を用いると１ステ
ップで抗原として最適な純度にまで精製されることを見
い出したのである。
トプラセンタ由来の染色体ＤＮＡからＰＣＲ（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用
いて増幅し、これを発現できるプラスミドにクローン化
しうることおよびこのプラスミドで形質転換されたエシ
ェリチア・コリが大量のヒトＣＲＰを生産すること、ま
たこの組換え型ＣＲＰは天然型と全く同一のアミノ酸配
列を持ち、天然型と同様にカルシウムイオン存在下にホ
スホリルコリンと結合すること、ホスホリルコリン固定
化カラムを用いたアフィニティ精製法を用いると１ステ
ップで抗原として最適な純度にまで精製されることを見
い出したのである。
【００１２】そして更に検討を行い、このようにして得
られた組換えＣＲＰを抗原として免疫し、血清成分と交
差しないＣＲＰ抗体が得られることを確認し、遂に本発
明の完成に至ったものである。
られた組換えＣＲＰを抗原として免疫し、血清成分と交
差しないＣＲＰ抗体が得られることを確認し、遂に本発
明の完成に至ったものである。
【００１３】すなわち、本発明は、ヒト染色体由来のＣ
ＲＰ遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ベクタープラスミドに
連結した組換え体プラスミドおよびヒト染色体由来のＣ
ＲＰ遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ベクタープラミドに連
結した組換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を要旨
とするものである。
ＲＰ遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ベクタープラスミドに
連結した組換え体プラスミドおよびヒト染色体由来のＣ
ＲＰ遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ベクタープラミドに連
結した組換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を要旨
とするものである。
【００１４】本発明のプラスミドを得るには、例えばＢ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７２，６１
９−６２９（１９６３）の記載の方法に従い、ヒトＣＲ
Ｐ遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有
するＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６，１７１−
１８４（１９７４）に記載の方法で制限酵素で消化し、
次いでリガーゼを用いて結合することにより調製でき
る。
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７２，６１
９−６２９（１９６３）の記載の方法に従い、ヒトＣＲ
Ｐ遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有
するＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６，１７１−
１８４（１９７４）に記載の方法で制限酵素で消化し、
次いでリガーゼを用いて結合することにより調製でき
る。
【００１５】上記のベクターとしての役割を有するＤＮ
Ａとしては、例えばエシェリチア・コリ由来のｐＢＲ３
２２などのＤＮＡがあげられる。プロモーターとしては
例えばタックプロモーター、トリプトファンプロモータ
ー、ラムダ・ピーエルプロモーター、ラムダ・ピーアー
ルプロモーター、ラクトースプロモーター、Ｔ７プロモ
ーターなどがあげられる。分泌シグナルペプチドとして
は例えば大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ、外膜
タンパク質Ａ、外膜タンパク質Ｆ、β−ラクタマーゼな
どのシグナルペプチドがあげられる。また制限酵素とし
ては、例えばＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩがあげられ、リガー
ゼとしては、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼがあげられる。
Ａとしては、例えばエシェリチア・コリ由来のｐＢＲ３
２２などのＤＮＡがあげられる。プロモーターとしては
例えばタックプロモーター、トリプトファンプロモータ
ー、ラムダ・ピーエルプロモーター、ラムダ・ピーアー
ルプロモーター、ラクトースプロモーター、Ｔ７プロモ
ーターなどがあげられる。分泌シグナルペプチドとして
は例えば大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ、外膜
タンパク質Ａ、外膜タンパク質Ｆ、β−ラクタマーゼな
どのシグナルペプチドがあげられる。また制限酵素とし
ては、例えばＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩがあげられ、リガー
ゼとしては、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼがあげられる。
【００１６】本発明に用いられるヒトＣＲＰ遺伝子とし
ては、ヒトプラセンタ由来の染色体ＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲ法で増幅することができる。この時用いる増幅用
のプライマーとしては、ヒトＣＲＰ遺伝子の塩基配列に
基づいて設計した塩基配列である。これをプラスミド・
ベクターｐＴＺ１８Ｕに導入することによりヒトＣＲＰ
を有するプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰを作製する。さらに
この遺伝子の上流に大腸菌アルカリ性ホスファターゼの
シグナルペプチドの遺伝子を化学合成して接続すること
によりｐＴＺ−ＣＲＰＳを調製する。このプラスミドを
エシェリチア・コリに形質転換し、これにヘルパーファ
ージＭ１３Ｋ０７を感染させ、その培養液から１本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。これを「蛋白質・核酸・酵素」２９，
２９４−３０６（１９８６）に記載の方法により、ＤＮ
Ａの塩基配列を決定する。塩基配列が確認されたＣＲＰ
遺伝子はｐＴＺ１８Ｕから切り出し、プラスミドｐＢＲ
３２２にトリプトファンプロモーターとプラスミドｐＭ
Ｂ９由来のｋｉｌ遺伝子とそのシャインダルガノ配列
（ＳＤ配列）導入した菌体外分泌発現ベクターｐＴＲＰ
−ｋｉｌにつないでプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉ
ｌを得る。
ては、ヒトプラセンタ由来の染色体ＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲ法で増幅することができる。この時用いる増幅用
のプライマーとしては、ヒトＣＲＰ遺伝子の塩基配列に
基づいて設計した塩基配列である。これをプラスミド・
ベクターｐＴＺ１８Ｕに導入することによりヒトＣＲＰ
を有するプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰを作製する。さらに
この遺伝子の上流に大腸菌アルカリ性ホスファターゼの
シグナルペプチドの遺伝子を化学合成して接続すること
によりｐＴＺ−ＣＲＰＳを調製する。このプラスミドを
エシェリチア・コリに形質転換し、これにヘルパーファ
ージＭ１３Ｋ０７を感染させ、その培養液から１本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。これを「蛋白質・核酸・酵素」２９，
２９４−３０６（１９８６）に記載の方法により、ＤＮ
Ａの塩基配列を決定する。塩基配列が確認されたＣＲＰ
遺伝子はｐＴＺ１８Ｕから切り出し、プラスミドｐＢＲ
３２２にトリプトファンプロモーターとプラスミドｐＭ
Ｂ９由来のｋｉｌ遺伝子とそのシャインダルガノ配列
（ＳＤ配列）導入した菌体外分泌発現ベクターｐＴＲＰ
−ｋｉｌにつないでプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉ
ｌを得る。
【００１７】次にこのプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋ
ｉｌの理化学的性質を示す。 （１）大腸菌のアルカリ性ホスファターゼのシグナルペ
プチド遺伝子をヒトＣＲＰ遺伝子の上流につなぎ、さら
にｋｉｌ遺伝子の作用によってヒトＣＲＰを菌体外（培
地中）に分泌発現できる。 （２）図１に示すごとく、下記制限酵素に対して、次の
切断感受性を示す。 制限酵素 切断部位 ＥｃｏＲＩ １ ＰｓｔＩ １ ＨｉｎｄIII １ （３）分子量は約２．５メガダルトンである。 （４）分子量が約４００キロダルトンのヒトＣＲＰ遺伝
子がプロモーターの下流に同方向に挿入されている。
ｉｌの理化学的性質を示す。 （１）大腸菌のアルカリ性ホスファターゼのシグナルペ
プチド遺伝子をヒトＣＲＰ遺伝子の上流につなぎ、さら
にｋｉｌ遺伝子の作用によってヒトＣＲＰを菌体外（培
地中）に分泌発現できる。 （２）図１に示すごとく、下記制限酵素に対して、次の
切断感受性を示す。 制限酵素 切断部位 ＥｃｏＲＩ １ ＰｓｔＩ １ ＨｉｎｄIII １ （３）分子量は約２．５メガダルトンである。 （４）分子量が約４００キロダルトンのヒトＣＲＰ遺伝
子がプロモーターの下流に同方向に挿入されている。
【００１８】本発明のエシェリチア・コリは、上記の分
子量が４００キロダルトンのヒトＣＲＰ遺伝子とその上
流のプロモーターとをベクタープラスミドに連結した組
換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリ
であり、このプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌを用
いてエシェリチア・コリを形質転換させるには、例え
ば、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３，１５９−１６２（１
９７０）の方法に従って、０℃付近の温度で塩化カルシ
ウム処理した上記のプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉ
ｌとエシェリチア・コリＮＭ５２２とを接触させること
により行えばよい。
子量が４００キロダルトンのヒトＣＲＰ遺伝子とその上
流のプロモーターとをベクタープラスミドに連結した組
換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリ
であり、このプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌを用
いてエシェリチア・コリを形質転換させるには、例え
ば、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３，１５９−１６２（１
９７０）の方法に従って、０℃付近の温度で塩化カルシ
ウム処理した上記のプラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉ
ｌとエシェリチア・コリＮＭ５２２とを接触させること
により行えばよい。
【００１９】以上のようにして形質転換されたエシェリ
チア・コリの例として、プラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−
ｋｉｌが導入されたエシェリチア・コリＮＭ５２２−ｐ
ＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌがあげられる。本菌株は、従来
未知の新菌株であって、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４２４４として寄託されてい
る。
チア・コリの例として、プラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−
ｋｉｌが導入されたエシェリチア・コリＮＭ５２２−ｐ
ＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌがあげられる。本菌株は、従来
未知の新菌株であって、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４２４４として寄託されてい
る。
【００２０】この菌株は、公知のエシェリチア・コリＮ
Ｍ５２２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，１−１９
（１９８３）を参照）と、ヒトＣＲＰ生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有してい
る。この菌株は非伝達性を伝達性に変えることがなく、
また非病原性を病原性に変えることがなく安全性が保持
されている。
Ｍ５２２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，１−１９
（１９８３）を参照）と、ヒトＣＲＰ生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有してい
る。この菌株は非伝達性を伝達性に変えることがなく、
また非病原性を病原性に変えることがなく安全性が保持
されている。
【００２１】本発明のエシェリチア・コリを培養するに
際して用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグル
コース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水分解
物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸などの
有機酸類、さらには使用する細菌が資化しうるアルコー
ル類、脂肪酸及びグリセリンなどが使用でき、窒素源と
して、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐
酸アンモニウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母
エキスなどの無機または有機物が使用できる。さらに無
機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、燐酸、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コ
バルトなどの各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン
・スティープ・リカー、ビタミン類、核酸などを使用し
てもよく、細菌の一般的な培地が使用できる。
際して用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグル
コース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水分解
物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸などの
有機酸類、さらには使用する細菌が資化しうるアルコー
ル類、脂肪酸及びグリセリンなどが使用でき、窒素源と
して、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐
酸アンモニウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母
エキスなどの無機または有機物が使用できる。さらに無
機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、燐酸、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コ
バルトなどの各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン
・スティープ・リカー、ビタミン類、核酸などを使用し
てもよく、細菌の一般的な培地が使用できる。
【００２２】これらの培地を用いて、本発明のエシェリ
チア・コリを２０−４５℃、好ましくは３５−４０℃、
最適には３７℃、ｐＨを７．０−７．４、最適には７．
２で好気的に培養すればよい。
チア・コリを２０−４５℃、好ましくは３５−４０℃、
最適には３７℃、ｐＨを７．０−７．４、最適には７．
２で好気的に培養すればよい。
【００２３】次に得られた培養物から本発明におけるヒ
トＣＲＰが採取されるが、培養物、分離生菌体、分離菌
体の処理物、粗蛋白抽出液、粗製蛋白などのあらゆる段
階で採取できる。その際の精製法としては、通常の蛋白
精製法を用いることができる。
トＣＲＰが採取されるが、培養物、分離生菌体、分離菌
体の処理物、粗蛋白抽出液、粗製蛋白などのあらゆる段
階で採取できる。その際の精製法としては、通常の蛋白
精製法を用いることができる。
【００２４】本発明によって得られるヒトＣＲＰは、次
の理化学的性質を有する。 （１）結合特異性 カルシウムイオン存在下でニューモコッカス（Ｐｎｅｕ
ｍｏｃｏｃｃｕｓ）のＣ多糖体、ホスホリルコリン、フ
ィブロネクチンなどと結合する。 （２）分子量 分子量約２３，０００の同一サブユニットが５つ結合し
たペンタマーで約１１５，０００である。
の理化学的性質を有する。 （１）結合特異性 カルシウムイオン存在下でニューモコッカス（Ｐｎｅｕ
ｍｏｃｏｃｃｕｓ）のＣ多糖体、ホスホリルコリン、フ
ィブロネクチンなどと結合する。 （２）分子量 分子量約２３，０００の同一サブユニットが５つ結合し
たペンタマーで約１１５，０００である。
【００２５】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００２６】
【実施例１】
【００２７】（ａ）ヒトＣＲＰ遺伝子のＰＣＲ増幅 ヒトプラセンタ由来の染色体ＤＮＡ〔クローンテック
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製〕を鋳型として、次の２種の
プライマーでヒトＣＲＰ遺伝子を増幅した。
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製〕を鋳型として、次の２種の
プライマーでヒトＣＲＰ遺伝子を増幅した。
【００２８】５′−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＡ
ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴ−３′ ５′−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＡＡ−３′
ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴ−３′ ５′−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＡＡ−３′
【００２９】増幅の反応組成は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３（２５℃）、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、ｄＮＴＰ各２００μＭ、プライマー各１μＭ、ヒト
染色体ＤＮＡ １μｇ、Ｔａｑポリメラーゼ〔パーキン
エルマーシータス（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴ
ＵＳ）社製〕を１００μｌ中に調製する。さらに１００
μｌのミネラルオイルでサンプルを覆って、蒸発を防
ぐ。
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３（２５℃）、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、ｄＮＴＰ各２００μＭ、プライマー各１μＭ、ヒト
染色体ＤＮＡ １μｇ、Ｔａｑポリメラーゼ〔パーキン
エルマーシータス（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴ
ＵＳ）社製〕を１００μｌ中に調製する。さらに１００
μｌのミネラルオイルでサンプルを覆って、蒸発を防
ぐ。
【００３０】反応条件は、デナチュッレーションステッ
プが９４℃ １分、アニーリングステップが５０℃ １
分、ポリメラーゼ反応ステップが７２℃ ３分である。
このインキュベーションを３０サイクル行った。
プが９４℃ １分、アニーリングステップが５０℃ １
分、ポリメラーゼ反応ステップが７２℃ ３分である。
このインキュベーションを３０サイクル行った。
【００３１】この反応液のフェノール抽出によって夾雑
蛋白質の除去を行った。さらにアガロース電気泳動で約
０．６４ｋｂのヒトＣＲＰ遺伝子の増幅が確認できた。
図２にエチジウムブロマイドで染色した結果を示す。
（Ｍ：分子量マーカー、１：組換えＣＲＰ）
蛋白質の除去を行った。さらにアガロース電気泳動で約
０．６４ｋｂのヒトＣＲＰ遺伝子の増幅が確認できた。
図２にエチジウムブロマイドで染色した結果を示す。
（Ｍ：分子量マーカー、１：組換えＣＲＰ）
【００３２】（ｂ）プラスミドｐＴＺ−ＣＲＰの調製 市販のプラスミドベクターｐＴＺ１８Ｕ、ｐＴＺ１９Ｕ
〔ユーエスビー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕１μｇに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）とＰｓｔＩ（宝酒造社製）のそれぞれ
２ユニットを、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを含むｐ
Ｈ７．５に調製したトリス緩衝液１００μｌに入れ、３
７℃で１６時間反応させた。次に６５℃で５分間加熱し
て、制限酵素を失活させ、エタノール沈澱にて、消化Ｄ
ＮＡを回収した。
〔ユーエスビー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕１μｇに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）とＰｓｔＩ（宝酒造社製）のそれぞれ
２ユニットを、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを含むｐ
Ｈ７．５に調製したトリス緩衝液１００μｌに入れ、３
７℃で１６時間反応させた。次に６５℃で５分間加熱し
て、制限酵素を失活させ、エタノール沈澱にて、消化Ｄ
ＮＡを回収した。
【００３３】次に（ａ）の方法で得られたヒトＣＲＰ遺
伝子を上記と同じ制限酵素を含む緩衝液中で３７℃、１
６時間反応させ、上記と同じ方法で回収した。こうして
得られた消化ＣＲＰ遺伝子とプラスミドＤＮＡを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い、７ｍＭ
のＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ、１ｍＭのＡＴＰを含むｐＨ７．５に調製した７０ｍ
Ｍのトリス緩衝液中で、１４℃、１６時間反応させ、消
化ＤＮＡを再結合させることによって、ヒトＣＲＰを含
むプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰを得た。このプラスミドｐ
ＴＺ−ＣＲＰを大腸菌ＤＨ５αＰ′ＩＱ（ＢＲＬ社製）
に形質転換し、得られた形質転換体にヘルパーファージ
Ｍ１３ＫＯ７を感染させて得られた培養上清から、１本
鎖ＤＮＡをふくむファージをポリエチレングリコール沈
澱にて回収した。さらにこのファージからフェノール抽
出によって１本鎖ＤＮＡを抽出精製しＡＢＩ社の３７０
ＡＤＮＡシーケンサーによってＤＮＡシーケンスを行っ
た。その結果をすでに知られているヒトＣＲＰのアミノ
酸配列と比較すると完全に一致した。
伝子を上記と同じ制限酵素を含む緩衝液中で３７℃、１
６時間反応させ、上記と同じ方法で回収した。こうして
得られた消化ＣＲＰ遺伝子とプラスミドＤＮＡを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用い、７ｍＭ
のＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ、１ｍＭのＡＴＰを含むｐＨ７．５に調製した７０ｍ
Ｍのトリス緩衝液中で、１４℃、１６時間反応させ、消
化ＤＮＡを再結合させることによって、ヒトＣＲＰを含
むプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰを得た。このプラスミドｐ
ＴＺ−ＣＲＰを大腸菌ＤＨ５αＰ′ＩＱ（ＢＲＬ社製）
に形質転換し、得られた形質転換体にヘルパーファージ
Ｍ１３ＫＯ７を感染させて得られた培養上清から、１本
鎖ＤＮＡをふくむファージをポリエチレングリコール沈
澱にて回収した。さらにこのファージからフェノール抽
出によって１本鎖ＤＮＡを抽出精製しＡＢＩ社の３７０
ＡＤＮＡシーケンサーによってＤＮＡシーケンスを行っ
た。その結果をすでに知られているヒトＣＲＰのアミノ
酸配列と比較すると完全に一致した。
【００３４】（ｃ）大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ
シグナルペプチド遺伝子の導入 大腸菌のアルカリ性ホスファターゼシグナルペプチド遺
伝子をＤＮＡ合成機（ミリジェンバイオサーチ社製８７
５０）を用いて化学合成（図３）し、ｐＴＺ−ＣＲＰ上
のヒトＣＲＰ遺伝子の上流に上記と同条件でライゲーシ
ョンし、ｐＴＺ−ＣＲＰを調製した。
シグナルペプチド遺伝子の導入 大腸菌のアルカリ性ホスファターゼシグナルペプチド遺
伝子をＤＮＡ合成機（ミリジェンバイオサーチ社製８７
５０）を用いて化学合成（図３）し、ｐＴＺ−ＣＲＰ上
のヒトＣＲＰ遺伝子の上流に上記と同条件でライゲーシ
ョンし、ｐＴＺ−ＣＲＰを調製した。
【００３５】（ｄ）プラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉ
ｌの調製 分泌発現ベクターとしてはトリプトファンプロモーター
とクローニング部位にＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ、その下流
にｋｉｌ遺伝子を持つ、ｐＴＲＰ−ｋｉｌを作製した。
この発現ベクターは誘導をかけるとクローニング部位に
挿入した遺伝子とその下流のｋｉｌ遺伝子が同じトリプ
トファンプロモーターで１本のｍＲＮＡに転写され、次
に各々のタンパク質に翻訳される。この発現ベクターの
ポリリンカー部位に上記のシグナルペプチドを持つＣＲ
Ｐ遺伝子を挿入した。
ｌの調製 分泌発現ベクターとしてはトリプトファンプロモーター
とクローニング部位にＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ、その下流
にｋｉｌ遺伝子を持つ、ｐＴＲＰ−ｋｉｌを作製した。
この発現ベクターは誘導をかけるとクローニング部位に
挿入した遺伝子とその下流のｋｉｌ遺伝子が同じトリプ
トファンプロモーターで１本のｍＲＮＡに転写され、次
に各々のタンパク質に翻訳される。この発現ベクターの
ポリリンカー部位に上記のシグナルペプチドを持つＣＲ
Ｐ遺伝子を挿入した。
【００３６】発現ベクターｐＴＲＰ−ｋｉｌ １μｇに
制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）とＰｓｔＩ（宝酒造
社製）のそれぞれ２ユニットを、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌを含むｐＨ７．５に調製したトリス緩衝液
１００μｌに入れ、３７℃で１６時間反応させた。次に
６５℃で５分間加熱して、制限酵素を失活させ、エタノ
ール沈澱にて、消化ＤＮＡを回収した。次に（ｃ）の方
法で得られたプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰＳを上記と同じ
緩衝液中でＥｃｏＲＩとＰｓｔＩを用いて３７℃、１６
時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。このゲル
からＣＲＰ遺伝子のサイズに相当するバンドを切り出
し、ジーンクリーンキット（ＢＩ０ １０１ Ｉｎ
ｃ．）で精製した。こうして得られた消化ＣＲＰ遺伝子
とプラスミドＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社製）を用い、７ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＤ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１ｍＭのＡＴＰを含むｐ
Ｈ７．５に調製した７０ｍＭのトリス緩衝液中で、１４
℃、１６時間反応させ、消化ＤＮＡを再結合させること
によって、ヒトＣＲＰ遺伝子を含むプラスミドｐＴＲＰ
ＣＲＰＳ−ｋｉｌを得た。（図４）
制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）とＰｓｔＩ（宝酒造
社製）のそれぞれ２ユニットを、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌを含むｐＨ７．５に調製したトリス緩衝液
１００μｌに入れ、３７℃で１６時間反応させた。次に
６５℃で５分間加熱して、制限酵素を失活させ、エタノ
ール沈澱にて、消化ＤＮＡを回収した。次に（ｃ）の方
法で得られたプラスミドｐＴＺ−ＣＲＰＳを上記と同じ
緩衝液中でＥｃｏＲＩとＰｓｔＩを用いて３７℃、１６
時間反応させ、アガロース電気泳動を行った。このゲル
からＣＲＰ遺伝子のサイズに相当するバンドを切り出
し、ジーンクリーンキット（ＢＩ０ １０１ Ｉｎ
ｃ．）で精製した。こうして得られた消化ＣＲＰ遺伝子
とプラスミドＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社製）を用い、７ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＤ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１ｍＭのＡＴＰを含むｐ
Ｈ７．５に調製した７０ｍＭのトリス緩衝液中で、１４
℃、１６時間反応させ、消化ＤＮＡを再結合させること
によって、ヒトＣＲＰ遺伝子を含むプラスミドｐＴＲＰ
ＣＲＰＳ−ｋｉｌを得た。（図４）
【００３７】
【実施例２】実施例１で得たプラスミドｐＴＲＰＣＲＰ
Ｓ−ｋｉｌを用いて大腸菌ＮＭ５２２への形質転換を行
った。形質転換は、プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８６，２１７２−２１７５
（１９８９）に記載のＴＳＳ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）法で行っ
た。
Ｓ−ｋｉｌを用いて大腸菌ＮＭ５２２への形質転換を行
った。形質転換は、プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８６，２１７２−２１７５
（１９８９）に記載のＴＳＳ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）法で行っ
た。
【００３８】まず、宿主菌のエシェリチア・コリＮＭ５
２２株を２０ｍｌのＬＢ培地にて培養し、遠心分離にて
集菌後、２ｍｌのＴＳＳ溶液（１０％ポリエチレングリ
コール、５％ジメチルスルフォキサイド、５０ｍＭ Ｍ
ｇ2＋を含むｐＨ６．５のＬＢ培地）に懸濁した。この
懸濁液１００μｌに（ｅ）−（ｇ）の方法で得られたプ
ラスミドを含む混合物を２０μｌ加え、０℃で３０分間
処理した。次に、２０ｍＭのグルコースを含む０．９ｍ
ｌのＴＳＳ溶液を加え、３７℃で１時間培養し、さらに
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ寒天培地
で３７℃培養後、生じたコロニーから各プラスミドの導
入されたエシェリチア・コリＮＭ５２２−ｐＴＲＰＣＲ
ＰＳ−ｋｉｌが得られた。
２２株を２０ｍｌのＬＢ培地にて培養し、遠心分離にて
集菌後、２ｍｌのＴＳＳ溶液（１０％ポリエチレングリ
コール、５％ジメチルスルフォキサイド、５０ｍＭ Ｍ
ｇ2＋を含むｐＨ６．５のＬＢ培地）に懸濁した。この
懸濁液１００μｌに（ｅ）−（ｇ）の方法で得られたプ
ラスミドを含む混合物を２０μｌ加え、０℃で３０分間
処理した。次に、２０ｍＭのグルコースを含む０．９ｍ
ｌのＴＳＳ溶液を加え、３７℃で１時間培養し、さらに
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ寒天培地
で３７℃培養後、生じたコロニーから各プラスミドの導
入されたエシェリチア・コリＮＭ５２２−ｐＴＲＰＣＲ
ＰＳ−ｋｉｌが得られた。
【００３９】
【実施例３】実施例２で構築した形質転換体、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２−ｐＴＲＰＣＲ
ＰＳ−ｋｉｌ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２４４）のコロニー
から、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む５００ｍ
ｌのＬＢ培地で３２℃で振とう培養し５時間後、対数増
殖期に入ったところで、インドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）を添加することによって誘導をかけた。誘導３時間
後に遠心分離で集菌し、培地を回収した。この培地をホ
スホリルコリンをＢＳＡを介してトヨーパールに固定化
したカラム（特開昭６２−２５８３９０、特開昭６２−
２５８３９９）を用いたアフィニティクロマトグラフィ
で精製した。精製した組換え型ヒトＣＲＰをＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動で分析したところ、天然型ＣＲ
Ｐと同一分子量の位置に泳動された。さらに組換え型Ｃ
ＲＰを電気泳動したアクリルアミドゲルを電気的にＰＶ
ＤＦ膜に転写し、天然型ＣＲＰをウサギに免疫して得ら
れた抗体を用いたウエスタンブロッティング法で染色し
たところ、天然型ＣＲＰと同一の位置に染色された。
（図５）
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２−ｐＴＲＰＣＲ
ＰＳ−ｋｉｌ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２４４）のコロニー
から、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む５００ｍ
ｌのＬＢ培地で３２℃で振とう培養し５時間後、対数増
殖期に入ったところで、インドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）を添加することによって誘導をかけた。誘導３時間
後に遠心分離で集菌し、培地を回収した。この培地をホ
スホリルコリンをＢＳＡを介してトヨーパールに固定化
したカラム（特開昭６２−２５８３９０、特開昭６２−
２５８３９９）を用いたアフィニティクロマトグラフィ
で精製した。精製した組換え型ヒトＣＲＰをＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動で分析したところ、天然型ＣＲ
Ｐと同一分子量の位置に泳動された。さらに組換え型Ｃ
ＲＰを電気泳動したアクリルアミドゲルを電気的にＰＶ
ＤＦ膜に転写し、天然型ＣＲＰをウサギに免疫して得ら
れた抗体を用いたウエスタンブロッティング法で染色し
たところ、天然型ＣＲＰと同一の位置に染色された。
（図５）
【００４０】次に組換え型ＣＲＰをプロテインシーケン
サーを用いてＮ末端から１０残基シーケンスしたとこ
ろ、天然型の配列と一致した。
サーを用いてＮ末端から１０残基シーケンスしたとこ
ろ、天然型の配列と一致した。
【００４１】
【実施例４】実施例３で調製した精製組換え型ＣＲＰを
フロイントの完全アジュバントと共にウサギに免疫して
得られた抗血清をヒト腹水から精製したＣＲＰをウサギ
に免疫して得られた抗血清と比較すると、同等のベッカ
ータイター値を示した。（下記する表１）
フロイントの完全アジュバントと共にウサギに免疫して
得られた抗血清をヒト腹水から精製したＣＲＰをウサギ
に免疫して得られた抗血清と比較すると、同等のベッカ
ータイター値を示した。（下記する表１）
【００４２】
【表１】
【００４３】これらの抗体をＣＲＰ標準血清ＣＡ−７
（ＡＴＡＢ社製）、正常ヒト血清ＣＡ−１（ＡＴＡＢ社
製）、ＣＲＰ（−）血清、ＳＡＰを用いてウエスタンブ
ロッティングで分析すると両者は全く同一の反応性を示
した。
（ＡＴＡＢ社製）、正常ヒト血清ＣＡ−１（ＡＴＡＢ社
製）、ＣＲＰ（−）血清、ＳＡＰを用いてウエスタンブ
ロッティングで分析すると両者は全く同一の反応性を示
した。
【００４４】
【発明の効果】従来、ヒト由来の蛋白質を遺伝子組換え
技術によって調製する場合、通常は大腸菌のペリプラズ
ムへ分泌させるのであるが、ＣＲＰの場合は、ペリプラ
ズムへ分泌させただけでは活性型で発現しなかったので
ある。
技術によって調製する場合、通常は大腸菌のペリプラズ
ムへ分泌させるのであるが、ＣＲＰの場合は、ペリプラ
ズムへ分泌させただけでは活性型で発現しなかったので
ある。
【００４５】しかながら、本発明にしたがってヒトＣＲ
Ｐ遺伝子の直前に大腸菌のアルカリ性ホスファターゼの
シグナルペプチド遺伝子を導入し、さらにヒトＣＲＰ遺
伝子の下流に同一プロモーターの制御下におかれるよう
にｋｉｌ遺伝子を配置したプラスミドを創製することに
よって、多量のヒトＣＲＰを菌体外に分泌生産すること
がはじめて可能となり、高純度のヒトＣＲＰの効率的生
産にはじめて成功したものである。
Ｐ遺伝子の直前に大腸菌のアルカリ性ホスファターゼの
シグナルペプチド遺伝子を導入し、さらにヒトＣＲＰ遺
伝子の下流に同一プロモーターの制御下におかれるよう
にｋｉｌ遺伝子を配置したプラスミドを創製することに
よって、多量のヒトＣＲＰを菌体外に分泌生産すること
がはじめて可能となり、高純度のヒトＣＲＰの効率的生
産にはじめて成功したものである。
【００４６】また、得られた組換え型ＣＲＰは天然型と
まったく同じアミノ酸配列を持ち、これを精製後免疫し
てえられた抗血清は天然型を免疫してえられた抗血清と
まったく同じ反応性を示すため、臨床検査用の試薬とし
て血液中のＣＲＰ量を正確に定量するための抗体を調製
するための抗原、あるいはキャリブレーターとして非常
に有用である。
まったく同じアミノ酸配列を持ち、これを精製後免疫し
てえられた抗血清は天然型を免疫してえられた抗血清と
まったく同じ反応性を示すため、臨床検査用の試薬とし
て血液中のＣＲＰ量を正確に定量するための抗体を調製
するための抗原、あるいはキャリブレーターとして非常
に有用である。
【図１】ヒトＣＲＰ発現ベクターｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋ
ｉｌの制限酵素地図である。
ｉｌの制限酵素地図である。
【図２】増幅されたヒトＣＲＰ遺伝子の電気泳動パター
ンを示す。
ンを示す。
【図３】大腸菌アルカリ性ホスファターゼシグナルペプ
チド遺伝子の化学合成図を示す。
チド遺伝子の化学合成図を示す。
【図４】本発明の係るヒトＣＲＰ発現ベクターの構築図
である。
である。
【図５】精製組換え型ヒトＣＲＰと天然型ヒトＣＲＰの
純度比較図である。
純度比較図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12P 21/02 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、次の２
種のプライマー ５′−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧ
ＧＧＴＴＴ−３′ ５′−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＡＡ−３′ を用いてＰＣＲ法で増幅してなる、分子量が約４００キ
ロダルトンのヒトＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）遺伝子の上流に大腸菌由来のアルカリ性ホ
スファターゼのシグナルペプチド遺伝子を、ヒトＣＲＰ
遺伝子の下流にプラスミドｐＭＢ９由来のｋｉｌ遺伝子
を挿入し、ベクタープラスミドに連結した組換え体プラ
スミド。 - 【請求項２】 図１の制限酵素地図で示される組換え体
プラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌ。 - 【請求項３】 ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、次の２
種のプライマー ５′−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧ
ＧＧＴＴＴ−３′ ５′−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＡＡ−３′ を用いてＰＣＲ法で増幅してなる、分子量が約４００キ
ロダルトンのヒトＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）遺伝子の上流に大腸菌由来のアルカリ性ホ
スファターゼのシグナルペプチド遺伝子を、ヒトＣＲＰ
遺伝子の下流にプラスミドｐＭＢ９由来のｋｉｌ遺伝子
を挿入し、ベクタープラスミドに連結した組換え体プラ
スミドで形質転換されたエシェリチア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）。 - 【請求項４】 図１の制限酵素地図で示される組換え体
プラスミドｐＴＲＰＣＲＰＳ−ｋｉｌで形質転換された
エシェリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）。 - 【請求項５】 請求項３〜請求項４のいずれか１項に記
載のエシェリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）を培養することを特徴とするヒトＣＲＰ（Ｃ−
ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5122209A JP2971290B2 (ja) | 1993-04-27 | 1993-04-27 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ |
| EP94400874A EP0622460B1 (en) | 1993-04-27 | 1994-04-22 | Plasmid and escherichia coli transformed with it |
| DE69432963T DE69432963T2 (de) | 1993-04-27 | 1994-04-22 | Plasmid und damit transformierte E. Coli Stämme |
| US08/621,897 US5702921A (en) | 1993-04-27 | 1996-03-26 | Expression of biologically active human C-reactive protein in escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5122209A JP2971290B2 (ja) | 1993-04-27 | 1993-04-27 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06311884A JPH06311884A (ja) | 1994-11-08 |
| JP2971290B2 true JP2971290B2 (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=14830255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5122209A Expired - Lifetime JP2971290B2 (ja) | 1993-04-27 | 1993-04-27 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5702921A (ja) |
| EP (1) | EP0622460B1 (ja) |
| JP (1) | JP2971290B2 (ja) |
| DE (1) | DE69432963T2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8013120B2 (en) | 2005-10-26 | 2011-09-06 | Stc.Unm | C-reactive protein and its use to treat systemic lupus erythematosus and related conditions |
| US9359416B2 (en) | 2010-06-11 | 2016-06-07 | Nitto Boseki Co., Ltd. | DNA encoding canine monomeric CRP and expression vector containing the DNA |
| WO2011155358A1 (ja) | 2010-06-11 | 2011-12-15 | 日東紡績株式会社 | ５量体ｃｒｐの製造方法、５量体ｃｒｐを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌｃｒｐをコードするｄｎａ及びそのｄｎａを含む発現ベクター |
| ES2566781T3 (es) | 2010-09-21 | 2016-04-15 | Ferring B.V. | Procedimiento mejorado para la producción de hormona del crecimiento humana recombinante |
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