JPH0392760A - 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 - Google Patents
非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
試薬に関し、詳しくは固相と血清検体を接触せしめて検
体中の抗体を測定する方法および測定試薬において、該
接触に伴って起こる非特異吸着を排除して検出感度を向
上させた測定方法及び測定試薬に関する。
用いる免疫学的測定において、固相に対する抗体の非特
異な吸着によって測定結果に誤差がもたらされることは
しばしば経験されるところであり、例えば、下記文献1
〉〜4)がある。
f VirologicalMethods, 4,
(1982) 241. 248(イー.ジェー.シ
リトー:ジェー.オブビロロジカル メソッド 4 ,
(1982) 241248) 2)沢田高志等:臨床と研究,62巻1号(1.985
)311−318頁 3)沢田高志等:臨床と研究,63巻11号(1986
)3818−3822頁 4) 特開昭64 − 54356号公報即ち、1〉に
よれば長期保存した血清検体において、また2L 3)
によれば加熱非働化した血清検体において、それぞれ検
体中に変性あるいは凝集したIg G (変性抗体と呼
ぶ)が生威し、これが固相に非特異な吸着をして測定結
果に誤差がもたらされることが記載されている。1)で
はカオリン添加の前処理により、また2), 3)では
性能のよいカップ洗浄機を使用したり、カノトオフ値を
適正に設定することによりそれぞれ変性抗体の非特異吸
着による測定誤差を排除することができると述べられて
いる。一方4)によれば測定のために加えられる標識さ
れた抗体(標識抗体と呼ぶ)が固相に非特異な吸着をし
て測定結果に誤差がもたらされることが記載されており
、pH 8.0〜9.5の緩衝液中で固相に標識抗体を
反応させることにより標識抗体の非特異吸着による測定
誤差を抑制することができると述べられている。
異吸着と標識抗体の非特異吸着とは共に固相に対する抗
体の吸着である点では同様のものとみられるが、実際の
測定操作の中では全く別の現象として処理される必要が
ある。即ち、変性抗体と標識抗体とは物質として別異で
あるほかに、前者の非特異吸着は固相法による測定にお
いて固相に検体血清が添加された時点での反応(第一反
応と呼ばれる)で起こり、後者の非特異吸着は第一反応
が完全に停止され引き続いて標識抗体が添加された時点
での反応(第二反応と呼ばれる)で起こる。従って前者
の非特異吸着に対する排除処理は後者の非特異吸着に対
する抑制処理、例えば文献4)記載の技術とは別個の技
術であり、かつそれから容易に推考される技術でもない
。変性抗体の非特異吸着の排除処理については文献1)
〜3)記載の技術があるが、これらよりもさらに簡便か
つ正確な技術が求められる。本発明はこれを課題として
なされた。
果、固相に血清検体を添加するにあたり、該添加をpH
9〜10の条件下で行うことにより、変性抗体の固相へ
の非特異吸着を排除することかできることを見出し、本
発明を完威した。
体を測定する測定方法において、該添加をpll9〜1
0の条件下で行うことを特徴とする測定方法を提供する
ものであり、更に本発明は、固相に血清検体を添加して
検体中の抗体を測定する測定試薬において、該添加の条
件のためにpI−19〜10の緩衝液が必須の構或或分
となることを特徴とする測定試薬をも提供するものであ
る。
ものではない。即ち、本発明は血清検体、特にヒト血清
検体に含まれる変性抗体の非特異吸着を問題としてとり
あげ、それに対する解決手段を提供するものであるから
、測定抗体自体はいかなる抗体であってもよい。
、あるいは血液であってもよい。
ップあるいはガラスビーズ等を用いればよい。固相表面
は常法により抗原をコートしておく。
学的測定法を利用するものであり、例えば酵素免疫測定
法、放射免疫測定法、受身凝集法等を利用することがで
きる。これらの方法における通常の手順自体はすでに一
般に公知であり、本発明に利用される。従って、例えば
酵素免疫測定法を利用する場合について本発明測定方法
を説明すれば以下のごとくである。
標識抗体、基質であり、他に緩衝液、希釈液、停止液、
標準抗体等が使用される。まず固相を抗原でコートし、
ここに検体血清をそのまま又は正常ウサギ血清で希釈し
て添加し、よく洗浄後酵素標識抗体を添加し、よく洗浄
後基質を添加し、反応を停止後基質の分解量を測定する
。ここで、本発明の特徴は検体血清を添加ずるときにp
H9〜10の条件下でこれが行われる点にある。該条件
のために酸またはアルカリを加えてpl+を調整すれば
よいが、通常は緩衝液の添加によってなされる。
用意される試薬であるが、p1{9〜10の緩衝液は必
須の威分てあり、他にいくつかの使用威分を任意に選択
して加え、組み合わせてセットとしたものでもよい。緩
衝液の種類はpH9〜10に緩衝能を持つものであれば
いずれであってもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を使用することができる。緩
衝液の濃度は通常は0.05〜0.1 M程度であるが
、ケースに応して決定すればよい。また緩衝液を該緩衝
液の威分固体の形で提供し、同時に水を加えて溶解し所
定の緩衝液とすることは可能であり、これは実質的に本
発明に含まれる。
胞白血病ウィルス抗体(HTLV− 1抗体)の測定に
応用したところ非常に良い結果を得ることができた。
るいは加熱非働化した検体血清中の変性抗体の非特異吸
着が排除される。従って本発明の作用は該排除による検
出感度の向上にある。
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
p1{8.0)にて1μ9/In1の濃度に調整し、マ
イクロタイクーウェルに100 Iilずつ分注し、4
゜C下に一晩放置ずる。ウェルを華溜水で洗浄し、各ウ
エルに0.1 Mホウ酸緩衝液でpl+ 9.5に調整
した正常ウサギ血清を第1反応用溶液として100 I
l1ずつ加える。ここに検体血清20dずつ加え、37
゜Cにて60分間インキュヘート(i ncuba t
e)ずる(第1反応)。ウェル内を0.01%ツイーン
(Tween) 20を含む生理食塩水にて洗浄後、各
ウェルにアルカリフォスファクーゼ標識抗ヒトグロプリ
ン抗体を100pずつ加え、37゜Cにて60分間イン
キユベートする(第2反応)。ウエル内を0.01%ツ
イーン20を含む生理食塩水にて洗浄後、各ウェルに基
質液(4mg/m/のp−ニトロフェニルフォスフェー
ト)を100〃ずつ加え、37゜Cにて30分間インキ
ユベートする(第3反応)。各ウェルにI N NaO
tl液を100 IJlずつ加えて反応を停止した後、
反応液につき波長405nmにおける吸光値を測定する
。カットオフ値は00 405nmにおける吸光値で0
.08とし、これ以上の吸光値を示した時+1TLI−
1抗体陽性、これ未満の吸光値を示した時 HTLV
−1抗体陰性と判定した。
゜Cにて30分間加熱非働化することにより、非特異的
反応を呈する様になった検体(非働化非特異検体l,2
)と、IITLV− 1抗体陽性コン1・ロールとして
、HTLV− 1キャリアーの血清を用いた。
ITLν−■に対する免疫学的反応性における陽否を判
定した。ただし、実施例1記載における第1反応用溶液
として各々pl+調整した下記(a)〜(C)を使用し
た。
pH6.5, 7.0, 7.5に各々緩衝化した正常
ウサギ血清) (b) 0.05M}リス塩酸緩衝化第1反応用溶液
(pH 8.0, 8.5に各々緩衝化した正常ウサギ
血清) (C) 0.1 Mホウ酸緩衝化第1反応用溶液(p
l+9.0, 9.5, 10。0に各々緩衝化した正
常ウザギ血清) ハ)結果 結果を図1に示す。
応用溶液のpl+が6.5〜8.5の時カットオフ値以
上の吸光値を示して陽性(偽陽性)と判定されたが、p
o 9.0〜10.0の時にはカットオフ値以下の吸光
値を示しており、陰性と判定された。陽性コントロール
は、各pHの第1反応用溶液を用いてもカッl・オフ値
以上の吸光値を示しており、陰性化することはなかった
。これらの結果は、第1反応用溶液のpl1を9.0〜
10.0に上昇させることにより、非特異的な反応のみ
がより有効に除去されることを示すものである。
第1反応用溶液としてホウ酸緩衝化第1反応用溶液を用
いたが、グリシン水酸化ナトリウム緩衝化第1反応用溶
液、ヘロナール塩酸緩衝化第1反応用溶液、炭酸重炭酸
緩衝化第1I 1 反応用溶液を用いた時も同様の結果を得た。
1TLV−1抗体陽性コントロールとして、HTLVI
キャリアーの血清を用いた。
ITLV−Tに対ずる免疫学的反応性における陽否を判
定した。ただし、実施例1記載における第1反応用溶液
として実験例I記載におけるpl+ 8.0とpH9.
5の第1反応用溶液を使用した。
溶液を用いた時には、4検体(4.4%)が力,トオフ
値以上の吸光値を示し陽性(偽陽性)と判定されたが、
pH 9.5の第1反応用溶液を用いた時には全てカッ
トオフ値以下の1 2 吸光値を示し、非特異的な反応により偽陽性と判定され
る例はなかった。また陽性コントロールの吸光値はpl
+9.5の第1反応用溶液を用いた時にpl+ 8.0
の第1反応用溶液を用いた時よりもやや低い吸光値を示
したが、大差はなかった。
l+を9.5に上昇させた第1反応用溶液を用いること
により、非特異反応を有効に除去できることを示すもの
である。
結果を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、固相に血清検体を添加して検体中の抗体を測定する
測定方法において、該添加をpH9〜10の条件下で行
うことを特徴とする測定方法。 2、抗体が成人T細胞白血病ウィルス抗体(HTLV−
I抗体)である請求項1記載の測定方法。 3、固相に血清検体を添加して検体中の抗体を測定する
測定試薬において、該添加の条件のためにpH9〜10
の緩衝液が必須の構成成分となることを特徴とする測定
試薬。
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