JPH0365651A - Ａｐｒｔの免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、正常および変異型アデニンホスフォリボシル
トランスフェラーゼ（以下正常をＮ−ＡＰＲＴと、変異
型をＭ−ＡＰＲＴと記す、）の免疫化学的測定法に関す
る。

［従来技術］ ＡＰＲＴ遺伝子は、ヒトの１６番染色体の長腕部に位置
しており、Ｎ−ＡＰＲＴのアミノ酸配列は、１３５番目
がメチオニンであるのに対しＭ−ＡＰＲＴはスレオニン
に置き換えられている。この確認としては精製して得ら
れたＡＰＲＴをＢ　ｒＣＮ″ｒ％理することにより判明
する。正常酵素は、１３５番目がメチオニンであるため
切断されて２つの蛋白となるが、変異酵素は、メチオニ
ンが存在しないために切断されない、正常酵素は、アデ
ニンを５−ホスホリボシル−１−ピロホスフェートの存
在下でアデニンモノホスフェートに変換するが、この変
異酵素は、体内で生じたアデニンをこの酵素でアデニル
酸に代謝できないために、キサンチンオキシダーゼによ
り８−ヒドロキシアデニンを経由して生じる２、８−ジ
ヒドロキシアデニン（以下２．８−ＤＨＡと記す）が体
内に蓄積される。この２．８−ＤＨＡの過剰な体内蓄積
は、腎結石痛と腎不全を特発する。　ひどい場合は、腎
移植を必要とし、また２、８−ＤＨＡ性結石により泌尿
器管系の感染症や血尿等を引き起こす。

アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症の患
者の約８０％はＭ−ＡＰＲＴが検出され、残りの２０％
にはＮ−ＡＰＲＴもＭ−ＡＰＲＴも検出されない、正常
ではＮ−ＡＰＲＴのみが検出される。従って、Ｎ−ＡＰ
ＲＴおよびＭ−ＡＰＲＴを区別して測定することができ
れば、全ての患者の診断が正確にできる。腎障害あるい
は腎感染症の原因を診断することや治療法を選択する上
できわめて重要と考えられる。Ｎ−ＡＰＲＴの存在を確
認する方法は、従来、さきに述べたアデニンを５−ホス
ホリボシル−１−ピロホスフェートの存在下でアデニン
モノホスフェートに変換する酵素活件測定法に限定され
ていた。またＭ−ＡＰＲＴの測定のためにはこの方法は
無効で、従来、患者細胞を生きたまま培養して６−メチ
ルプリンまたは２．６−ジヒドロキシアデニンに対する
抵抗性を調べる方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　３４．１
６４（１９８５）参照）しか無かった。このため間接的
に、血中や尿中の２．８−ＤＨＡを高速液体クロマトグ
ラフィー法（ｐ１２ｄｌａｔｒ、、　Ｐａｅｄｏｌ、　
　Ｖｏｌ、１５．２３３（１９８０）参照）やイソタコ
フオーレシス法（ＰｕｒｉｎｅＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ　
ｉｎ　Ｍａｎ　Ｉｔ、　７６Ｂ、　　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　３０４　（１９７７）
参照）により測定し、その欠損症を診断することが知ら
れている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、これらの方法は、操作が煩雑でありしか
も組織あるいは血清、血球中のＭ−ＡＰＲＴの濃度を定
量するのは不可能であった。

また前述の間接的な２．８−Ｄ）［Ａの測定は煩雑であ
り長時間を必要とするため、検体を迅速かつ大量に測定
するのには不向きであり、また疑陽性が多く生ずるため
ルーチン検査に供する事はできなかった。しかも、直接
的にＭ−ＡＰＲＴを測定することも不可能であった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の発明者らはこれらの問題を解決するため、鋭Ｘ
努力し、固相ペプ千ド台底法によりＮ−ＡＰＲＴおよび
Ｍ−ＡＰＲＴの１２５番目から１４５番目までを台底し
た。これを免疫源としてマクスに免疫し、Ｎ−ＡＰＲＴ
のみ、およびＭ−ＡＰＲＴにのみ結合するモノクローナ
ル抗体をそれぞれ作製した。更に、発明者らは、ＡＰＲ
Ｔの精製を行い、得られた酵素をマウスに免疫した。

細胞融合法によりＡ　Ｐ　Ｒ’！’に反応するクローン
を検索した結果、このＡＰＲ’ｌ’に特異的な抗体を産
生ずるクローン細胞を得ることができた。これらの抗体
を用いることにより、高感度でかつ迅速、簡便な免疫化
学的測定法を開発することができ、本発明を完成するに
至ったものである８本発明における測定対象は、検体に
含まれるＮ−ＡＰＲＴおよびＭ　−Ａ　Ｐ　Ｒ，Ｔであ
る。検体の種類は、限定されないが、例えば血漿、血清
、血球抽出液、尿、全血液抽出液などである。

まず本発明に用いる材料の入手あるいはその方法は以下
の通りである。

（ＡＰＲＴの精製） 本発明に用いるＮ−ＡＰＲＴあるいはＭ−ＡＰＲＴは、
ヒト赤血球を破砕抽出することにより得ることができる
。それは洗浄した赤血球を凍結融解によりホモゲナイズ
し、超音波破砕し、超遠心機で遠心しその上清をイオン
交換、ＧＭＰ−アガロースによるアフィニティークロマ
トグラフィーおよびゲルパーミエイションクロマトグラ
フィーを行うことにより分子Ｊ１１３６０００の画分を
分取し、目的のＡＰＲＴを得ることができる。

（台底ペプチドの作製） 本発明の測定対象であるところのＮ−ＡＰＲＴ及びＭ−
ＡＰＲＴの１２５番目から１４５番目の一次配列は以下
の通りである。

（ＡＰＲＴのペプチド配列） ’　”Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾１
ａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−’　”Ｓ＆１ｅｔ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−＾１ａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−’　”Ｌｅｕ （Ｍ−ＡＰＲＴのへブチド配列） ’　”Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾１
ａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−’　”Ｔｈｒ−Ｔｂｒ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−人１ａ−Ｃｙｓ−０１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−ａｉｙ−＾ｒｇ−１４Ｓｌｅｇ このペプチドを合成するには固相合成法を採用すること
ができる。まずｐ−ヒドロキシルベンジル樹脂にＬｅｕ
を結合させ、順次Ｃ末端より保護アミノ酸を反応させ合
成していくものである。ｆｋ終的には保護基及びＣ末端
を樹脂から除去しイオン交換クロマトグラフィーにより
精製することにより得ることかできる。　（詳しくは「
ベアチド合成の基礎と実験Ｊ　〈丸善■、１９８５年）
参照）また自動合成装置により製造することもできる。

（「続生化学実験講座２タンパク質下」　（東京化学同
人、１９８７年）参照）本発明を実施するにあたっては
、前記方法により製造されたペプチドは、免疫活性を高
めるため又は高分子タンパクに結合させるために必要に
応じて修飾剤、例えば無水酢酸、チオグリコール酸で、
アセチル化、アルキル化、チオール化など化学的修飾し
たものを使用することもできる。

免疫原としては一般的には高分子タンパク、例えば、ヘ
モシアニン、アルブミン、ＩｇＧなどに結合させたもの
を用いるものである。その結合法は一般的に水溶液中で
行なわれるのが通例であり本発明においてもこの方法を
利用するものである。

（これについては例えば「酵素免疫測定法」　（タンパ
ク質核酸酵素増補版、共立出版、１９８８）参照）一般
的には水溶性カルボジイミドやベンゾキノン、ゲルター
ルアルデヒドなどを縮合剤としてｐＨ５，０〜１０．０
で蛋白濃度０゜５〜５．０ｍｇ／ｍｌで縮合剤を０．０
１〜５．０ｍｇ／ｍｌを加え室温〜３７℃で反応させ１
〜４時間後にセファデックスＧ−５０カラムで脱塩する
ことにより免疫原を得るものである。

（抗体の作製） 本発明に使用するためのポリクローナル抗体は、前記方
法により調製されたＮ−ＡＰＲＴおよびＭ−ＡＰＲＴを
ウサギ、山羊、馬、モｌレモット、ニワトリなどの温血
動物に体重ｉｋｇあたり０．　３〜２ｍｇを１〜数回背
中皮下、フ・ソトパット、大腿筋などにアジュバントと
ともに注射し、その血清より得ることができる。又、モ
ノクローナル抗体は、前記の方法により精製されたＮ−
ＡＰＲＴおよびＭ−ＡＰＲＴあるいはヘモシアニンに結
合させた台底ペプチドをマウス１匹あたり０．０１〜０
．５ｍｇフロインドアジュバントとともに注射し、抗体
価が高くなった状態で牌臓を摘出し、その牌細胞をポリ
エチレングリコールによりマウスミエローマ細胞と融合
させ、その細胞より当該抗体を産生するＭ−ＡＰＲＴに
特異的に反応する細胞を選択し、モノクローン細胞とし
て増殖させ、これをマウス腹腔中あるいは培養液中で大
量細胞培養することにより製造することができる（モノ
クローナル抗体とがん、■サイエンスフォーラム、１９
８５年参照）。

本発明における免疫化学的測定法としては、放射免疫測
定法、酵素免疫測定法、免疫比濁法、及び免疫凝集法で
あり、これらのいづれの方法を採、用してもＮ−ＡＰＲ
ＴおよびＭ−ＡＰＲＴの選択的な定量を充分行なうこと
ができる０本発明で測定されるＮ−ＡＰＲＴおよびＭ−
ＡＰＲＴは分子量３８０００であり、標識を用いる免疫
化学測定法ではサンドイツチ法により定量するものであ
る。

この方法は、マイクロタイタープレートやポリスチレン
ビーズに本発明で得られた抗体を０．００１〜Ｏ，ｔｍ
ｇ／ｍｌの濃度で４℃−夜装置し固定化し、生理食塩水
で洗浄し、２％ＢＳＡ甫液でボストコートして、固定化
抗体を得るものである。

本発明における酵素免疫測定法では該固定化抗体とは異
なる抗原決定基を認識する抗体と酵素を化学的に結合さ
せた酵素標識抗体とＭ−ＡＰＲＴを含む検体とを反応さ
せ、同時にあるいは１ｏ分〜３時間後に該固定化同相を
反応させるものである。実務の際の反応温度は４℃〜４
０’Ｃであり、好ましくは２５〜３８℃である。洗浄後
、同相に結合した抗体結合酵素の量を酵素基質を加え活
性を測定することにより検体のＭ−ＡＲＴの量を定量す
ることができる。本方法において用いることのできる酵
素は、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどであ
る５、：の際基質は、用いる酵素に適しｔ・ものを用い
ることは言うまでもない。

例えば、ＡＢＴＳ、ルミ、ノール−Ｈ２Ｏ２（パーオキ
シダーゼ用）、ｐ−ニトロフ美ニルホスフェート、メチ
ルウンベリフェリルホ又フェート（アルカリホスファタ
ーゼ用）、ｐ−二１〜ロフェニルーβ−０−ガラクトー
ス、メチルウンベリフェリル−β−０−ガラクトース（
β−ガラクトシダーゼ用〉などを挙げるどを挙げること
ができる。酵素反応させ、測定は４℃から４０℃で加温
しながらレート法あるいは１分へ一１８時間反応させ、
生じた発色、蛍光あるいは、発光の測定により行なうも
のである。本方法における抗体の組合せは同相に抗Ｍ　
−Ａ　Ｐ　Ｒ，Ｔ抗体を結合させ、標識抗体にポリクロ
ーナル抗体もしくはモノクローナル抗体を使用する、　
この時標識側の抗体は正常のＡＰＲＴと交差反応性を有
してもよい。

また本発明の免疫化学的測定法の放射免疫測定法は上記
酵素標識のかわりに１２５工などの放射同位元素を標識
し、行なうものである２本方法の実施の際の測定操作は
前記酵素免疫測定法の場合と全く同じである。

一般的には１／′福インチのポリスチレンビーズや直径
１ｃｍのポリス手しンチュープに得られた特異的な抗体
を結合させた固相を調製し、使用するものである９例え
ば力ｌ；。・ボキシメチル化された同相の場合、０１〜
］、　ｎｔ　ｇの抗体溶液（ｐＨ５〜７）に水溶性カル
ボジイミドを加え１〜５時間反応させることより調製さ
れる。また抗体の放射ｎｔ識は、既に市販されているポ
ルトンハンター試薬により容易に調製することができる
。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かし
た抗体溶液にこのポルトンハンター試薬を加え１〜２時
間後にＧ−２５の脱塩カラム等を用いて未反応のポルト
ンハンター試薬を除去するのみで調製することができる
。この他、　クロラミンＴ法やヨードジン法などを採用
することにより容易に１１６　Ｉの放射標識を行なうこ
とができる。免疫反応を行なうにあたっては先に述べた
抗体固定固相にサンプルを加え、４℃〜４　（１’Ｃ好
ましくは２０〜３８°Ｃで１〜１８時間反応させるもの
である。この後、生理食塩水あるいは蒸留水で洗浄を行
い、放射標識抗体をこの固相に加ｊ、４℃〜４０℃好ま
しくは２０〜３８℃で１〜１８時間反応させ、生理食塩
水あるいは蒸留水で洗浄を行い、その放射能活性を計測
するものである。測定にはシンチレーションカウンター
を使用するものである。

また本発明は、イソルミノールやアクリジンエステルな
どをラベルした化学発光測定法、フルオッセインやロー
ダミンをラベルした蛍光免疫測定法で行なうこともでき
る。この際、ラベル体の標識は活性化エステル法やイソ
シアネート法を採用することにより容易に行なうことが
できる（ｒ酵素免疫測定法Ｊ　（医学書院、１９８７年
）参照〉６また、本発明の免疫化学的測定法の免疫ｗｆ
、Ｘ法は抗Ｍ−ＡＰＲＴ抗体を廂球や人工粒子（例えば
ラテックス、ゼラチン粒子）に結合させ、　　Ｍ−ＡＰ
ＲＴペプチドとに、　Ｌ　Ｈの様な高分子の結合物と検
体の抗原とを競争的に反応させ、生じた凝集像によりそ
のその濃度を判定するものである。血球や粒子への抗体
の結合はタンニン酸処理法やゲルタールアルデヒド法に
より行なうことができる（「免疫学実験入門」　（学会
出版センター、１９８１年）参照）、その反応は室温で
１〜５時間放置することにより行い、生じた血球や粒子
の凝集像をパターンアナライザ・・−や目視で判定する
ものである。

更に１本発明の免疫化学的測定法の免疫比濁法は前述の
免疫凝集法で示した凝集を光学的散乱により測定するも
のである０例えば、波長を５５０ｎｍにセットした分光
光度計に抗体感作粒子と高分子化ペプチド抗原とサンプ
ルを混和し直ちにその吸光度変化を測定することにより
行なうことができる。

［作用１ 本発明は、ヒト血清あるいは尿に含まれるＭ−ＡＰＲＴ
を特異抗体を用いて測定されるや［実施例］ 実施例１．１ Ｎ−ＡＰＲＴの精製 抗凝固剤を含むヒト血液５０００ｍｌを４℃で１３００
０ｇ２０分間遠心し白血球及び皿漿を除去した。得られ
た赤血球は２回生理食塩水で洗浄し、１０１００Ｏの５
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７、０にｗＡ濁溶血させ、更に凍
結融解を２回繰り返して完全に溶血させた、これを２０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０で透析した０次にこの溶液
を同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＲイオン交換カラム（
４ｘｌＯＯｃｍ）にチャージし、０から０．　５Ｍの塩
化カリウムのりニア−グラジェントで溶出した。ここで
ＡＰＲＴ活性を測定し活性フラクションを分取した。２
０．９％になるように硫酸アモニウムを徐々に加え１時
間後に４００００ｇ１０分遠心した。これを１０ｍＭ）
リス−塩酸緩衝液、５ｍＭ　　塩化マグネシウム溶液（
ｐＨ７，５）１００ｍｌで溶かし、更にこの液を５ｍＭ
塩化マグネシウム、０．１ｍＭ　　Ｓ−ホスフォリボシ
ル−１−ピロホスフェートを含む１０ｍＭコハク酸緩衝
液（ｐＨ５，２）で透析した。

この溶液を予め前記の透析液と同じ緩衝液で平衡化した
ＣＭ全セルースカラムにチャージしそのまま溶出させた
。バス分画をプールした後、濃縮し１０ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液、５ｍＭ　　塩化マグネシウム、０．１ｍＭ５
−ホスフォリボシル−■−ピロホスフェート（ｐＨ７，
５）で透析した。この溶液２ｍｌを予め上記の透析外液
と同じ緩衝液で平衡化したＡｃＡ４４カラムでゲルろ過
した。

分子量約１０万〜２０万の活性を示す分画をプールし目
的の酵素１０　ｍ　ｇ　’ｅ精製した。

実施例１．２ Ｍ−ＡＰＲＴの！前装 抗凝固剤を含むＡＰＲＴ活性のないヒト血液５０００ｍ
ｌを実施例１．１と同様に精製し同じフラクションの位
置のタンパクをプールし、目的の酵素ｔ　Ｏｍｇを精製
した。

実施例１．３ Ｍ−ＡＰＲＴのペプチドフラグメントの合成Ｂｏａ−１
、ｅｕ−ＯＣＨｚ−樹脂１．　０ｇ＜０．　７　　ｍＭ
／ｇ樹脂）をアプライド社の自動ペプチド合成器にセッ
トし次の順序でアミノ基を保護したアミノ酸を反応させ
た。

Ａｒｇ、　Ｏｌｙ、　Ｌｅｕ、　Ｌｅｕ、　　Ｇｌｕ、
　Ｃｙｓ、　Ａｌａ、　Ａｌａ。

＾ｓｎ、　Ｔｈｒ、　Ｔｈｒ、　Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ、　
Ｔｈｒ、　　＾Ｉａ、　Ｌｅｕ。

Ｌｅｕ、　　＾ｓｐ、　　Ａｓｐ、Ｖａｌこの装置では
保護基の離脱は３０％のトリフルオロ酢酸により行なわ
れた。全ての保護アミノ酸を反応させた後、樹脂よりの
合成ペプチドの離脱は０℃でフッ化水素溶液を反応させ
ることにより行なった。ここで得られたペプチドは吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
更に分子篩クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥
した。得られたペプチドは１００ｍｇであり一部はアミ
ノ酸分析によりその純度を検定した。

その結果は以下のとうりである。

実施例２ ペプチドとかぶとかにヘモシアニンとの結合物の調製 実施例１で得られたペプチド１ｍｇを１０ｍＭリンｖｉ
Ｗ衝液（ｐＨ６，０）２ｍｌに溶かしこれと１％かぶと
かにヘモシアニン（以下、ＫＬＨと記す）１ｍｌに混和
し、水溶性カルボジイミド１０ｍｇを加える。３時間室
温で攪拌し沈−ａ物を除いた後、予め２０ｍＭリン酸緩
衝化生理食塩水（ｐＨ７，０＞（以下ＰＢＳと記す）で
平衡化したセファデックスＧ−５０のカラムにチャージ
しそのボイド分画を分取した。ここでは目的の結合物は
３ｍｇ得られた。

実施例３．１ モルモット抗体の調製 実施例　１．１及び１．２で調製したＮ−ＡＰＲＴある
いはＭ＝ＡＰＲＴ１ｍｇを含む１ｍｌのＰＢＳを１ｍｌ
のフロイント完全アジュバントと混合し、モルモットの
皮下に各々注射した。

次に３週間後、上記結合物を同様に注射した。更に４週
間後に再度同量の免疫原を注射し、その１力月後に同量
の免疫原をフットバットに注射した。

最後の注射の１週間後に全採血し、抗血清を得た。

実施例３．２ 抗Ｍ−ＡＰＲＴマウス抗体の調製 実施例２で調製したペプチドとＫＬＨとの結合物０．５
ｍｇを含む０．１．ｍｌのＰＢＳｏ、１ｍｌのフロイン
ト完全アジュバントと混合し、マウスの腹腔内に注射し
た。２週間後に同量の免疫原を注射した。更に２週問お
きに２回免疫した。

最後の免疫から１週間後にｐＩ臓を摘出し、無菌的に得
られたこの膵臓細胞をマウスミエローマｍ胞（Ｐ２Ｏ３
）とポリエチレングリ−コールの存在下で融合させ、ハ
イブリドーマ細胞を得た。これを増殖させた後、限界翰
釈法によりペプチドに対する抗体を産生ずるモノクロー
ン細胞を確立した。

この細胞をマウス１１１１！腔内で増殖させ、モノクロ
ーナル抗体を含む腹水を得た。

またＮ−ＡＰＲＴあるいはＭ−ＡＰＲＴに対する抗体を
得るため実施例１．　１で調製したＮ−ＡＰＲ，ＴＯ，
８ｍｇを含む０．１．ｍｌのＰＢＳを０．１ｍｌのフロ
イント完全アジュバントと混合し、マウスの腹腔内に注
射！５、同様にモノクローナル抗体を得た。

実施例４．１ 抗体とパーオキシダーゼとの結合物の調製ホースラディ
シュパーオキシダーゼ（以下ＰＯＤと記す、ベーリンガ
ー社）５ｍｇを５０ｍＭ炭酸水素ナトリウウム水溶液（
ｐＨ８，０）１ｍｌに溶かし、０Ｍ８３５ｍｇを含むジ
メチルホルムアミド溶液１００　　を混和した。室温２
時間攪拌後、予め実施例２で作製したＭ−ＡＰＲＴ特異
モノクローナル抗体のＦ　（ａｂ’　＞２を０．　１Ｍ
の２−メルカプトエチルアミンで還元し脱塩したＦａｂ
２ｍｇを添加し３時間室温に放置した。

この反応液を予めＰＢＳで平衡化したセファクリルＡｃ
Ａ３４カラムにチャージし、溶出しＰＯＤと抗体の結合
物１ｍｇを得た。

実施例４．２ 抗Ｍ−ＡＰＲＴ特異モノクローナル抗体の１２６■Ｉ＃
Ｉ識体の調製 １２６Ｉ標識ポルトンハンター試薬１００μＣ１（ＮＥ
Ｎ社製）を４℃に冷却し１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，
５に溶かした実施例２．２で調製した抗Ｍ−ＡＰＲＴモ
ノクローナル抗体１ｍｇを添加し、２時間攪拌した。こ
の反応液を予めＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムにチャージし溶出し１２６　■標識化抗体０
．８ｍｇを得た。

実施例４，３ Ｍ−ＡＰＲＴのペプチドフラグメントの１２６１１％識
体の調製 １２５■Ｉ！に識ポルトンハンター試薬１００μＣ１（
ＮＥＮ社製）を４℃に冷却し１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ
６，５に溶かした実施例１．　２で調製したＭ−ＡＰＲ
Ｔのペプチドフラグメント１ｍｇを添加し、３時間撹拌
り、た、この反応液を予めＰＢＳで平衡化したセファデ
ックスＧ−５０カラムにチャージし溶出し＋２６■Ｉｌ
ｌ識化ペプチド０．７ｍｇを得た。

実施例５．１ ＥＬＴＳＡ法によるＭ−ＡＰＲＴの測定実施例２で得ら
れた抗Ｍ−ＡＰＲＴモルモットＩｇＧのＰＢＳ　（１０
ｕｇ／ｍｌ）を９６穴のマイクロプレート（ＣＯＡ、　
Ｓ　Ｔ　Ｅ　Ｒ社製）に５０μｌ／穴ずつ分注し、４℃
で一夜放置した。このマイクロプレートを生理食塩水で
２回洗浄した後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液２００μ
ｍを各　六に分注し、４℃にて一夜放置した９　以後の
洗浄は全て０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで行
なった。

このプレートを３回洗浄し、検体あるいはスタンダード
抗原、５０μｌを加え室温で１時間攪はんした６　３回
洗浄し実施例３．１で調製された抗Ｍ−ＡＰＲＴ特異モ
ノクローナル抗体とＰＯＤとの結合物２５μｍ　（５０
００倍希釈）を加え室温１時間反応させた。３回の洗浄
の後、０．１％のＡＢＴＳと１ｍＭのＨ２０ｅを含む基
質液１００μｍを多穴に分注し、室温で３０分反応させ
た後、タイターチックマルチレコーダーを用いて４１５
ｎｍにおける吸光度を測定した０図１にその定量曲線を
示す。

実施例５．２ 放射免疫測定法によるＭ−ＡＰＲＴの測定実施例２．２
で得られた抗ＡＰＲＴマウスモノクローナル抗体を含む
腹水を硫安沈澱によりＩｇＧ分画とし更にゲルろ過によ
りモノクローナルＩｇＧを得た。このＩｇＧのＰＢＳ溶
液（１０μｇ／ｍ　ｔ　）に直径１／４イン千のポリス
チレンビーズ１０００個を完全に浸し、４℃で一夜放置
した。このポリスチレンビーズを生理食塩水で２回洗浄
した後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に浸し、４℃にて
一夜放置した。以後の洗浄は全て生理食塩水で行なった
。このビーズを試験管にとり、検体あるいはスタンダー
ド抗原、２０μｌおよび実施例３．２で調製された抗Ｍ
−ＡＰＲＴ抗体の１２Ｓｉ標識体４００　（希釈して０
．１μＣｉとした〉を加え、室温で反応させた。１時間
後、洗浄を３回行い、シンチレーションカウンターでこ
のビーズの放射量を計測した。その時の定量曲線を図２
に示す。

実施例５．３ 血球凝集反応によるＭ−ＡＰＲＴの測定ニワトリ赤血球
をＰＢＳで３回洗浄した。この４ｍｌ溶液にタンニン酸
溶液（０，０２５ｍｇ／ｍｌＰＢｓ）２０ｍｌを加え３
７℃、６０分加温した。ＰＢＳで３回洗浄し、この４ｍ
ｌ溶液に抗Ｍ−ＡＰＲＴマウス抗体（２ｍｇ／ｍｌＰＢ
ｓ）１０ｍｌを加え３７℃、３時間加温した。ＰＢＳで
３回洗浄し１％ヤギ血清を含むＰＢＳに懸濁し、１％血
球溶液とした。検体もしくはスタンダードを９６穴のタ
イタープレートに２ＸＮ希釈で実施例２で得られた高分
子結合物とともに加え（２５）、抗体感作血球（１％）
２５μｌを各ウェルに添加した。攪はん後、３時間室温
に放置し、その凝集像を判定した。

希釈倍率と凝集パターン １／８　１／１６１／３２１／６４　１／１２８１／２
５８未感作血球 感作血球　　　千　　十　　千　　十　　±−ＡＰＲＴ 原液５００ｎｇ／■１−−　−　−　　士　　＋Ｏｎｇ
／ｍｌ＋　　＋　　　＋　　＋　　　＋　　　＋実施例
５．４ ラテックス凝集法によるＭ−ＡＰＲＴの測定５μｍのラ
テックス粒子５０ｕｌ（１０％溶液）と実施例２．２で
得られた抗Ｍ−ＡＰＲＴモノクローナル■ｇＧのＰＢＳ
溶液（５００μｇ／ｍ１）１０００μｌを混和し、室温
で一夜撹拌した。この液を１００１００００ｒｐ分遠心
し上清を除去しＰＢ８４ｍｌで分散させ１００１０００
０ｒｐ分遠心し洗浄した。この操作を３回繰り返し、最
後に２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に分散させた。

この分散粒子５００μｌに実施例２で調製したＫＬＨ−
ペプチド結合物の溶液５００μｌと抗原を含む検体もし
くは標準Ｍ−ＡＰＲＴ５０μｌを混和し５分後の波長５
５０ｎｍの吸光度変化を調べた０図３はその抗原濃度と
吸光度変化を示す６［発明の効果］ 水沫に従えば欠損症の患者の血清あるいは尿に含まれる
変異型アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを高
感度かつ迅速に検出され、大量に検体を短時間に測定で
きる。

【図面の簡単な説明】

図１はＥＬＩＳＡ法によるＭ−ＡＰＲＴの定量曲線であ
り、１詞２は放射免疫測定法によるＭ−ＡＰＲＴの定量
曲線であり、図３はラテックス粒子を用いたＭ−ＡＰＲ
Ｔの定量曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（
   以下ＡＰＲＴと記す）の正常（Ｎ−ＡＰＲＴ）および変
   異酵素（Ｍ−ＡＰＲＴ）に対する特異的抗体を用いるＮ
   −ＡＰＲＴおよびＭ−ＡＰＲＴの免疫化学的測定法。 （２）抗Ｎ−ＡＰＲＴおよび抗Ｍ−ＡＰＲＴ抗体がモノ
   クローナル抗体である請求項（１）記載の方法。 （３）抗Ｎ−ＡＰＲＴおよび抗Ｍ−ＡＰＲＴ抗体がポリ
   クローナル抗体である請求項（１）記載の方法。 （４）モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体
   である請求項（２）記載の方法。（５）免疫化学的測定
   法が酵素免疫測定法である請求項（１）記載の方法。 （６）免疫化学的測定法が放射免疫測定法である請求項
   （１）記載の方法。 （７）免疫化学的測定法が免疫凝集測定法である請求項
   （１）記載の方法。 （８）免疫化学的測定法が免疫比濁測定法である請求項
   （１）記載の方法。