JPH03505284A - メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造置型 この発明は、合衆国エネルギー省により裁定された契約番号ＤＥ−ＡＣＯ２−８ ２ＥＲ１２０２９のもと政府の援助により為された。政府はこの発明においであ る種の権利を有する。

発明の背景 この発明は、メチロトロフィック・バチルスの栄養要求突然変異体を用いたアミ ノ酸の製造に関するものである。

二酸化炭素よりも還元されたー炭素化合物を資化する微生物（栄養要求変異種） は多様かつ偏在している。アンソニー、「ザ・バイオケミストリー・オブ・メチ ロトローフス」、３頁（アカデミツク・プレス、ロンドン、１９８２）、ハンソ ン、Ａｄｖ、　　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌ、２６：３（１９８０）。

メタンを資化することが報告されているメチロトローフイック菌は全てダラム陰 性であり、殆ど全てエネルギー供給源としての一炭素化合物に関する偏性必要条 件を有する（アンソニー、前出、ライラテンバーブ等、「ジャーナル・オブ・ジ ェネラル・マイクロバイオロジー」、６１：２１９−２２６（１９７０））。メ タンではなくメタノールおよびメチルアミン類で育つ細菌は、幾つかの条件的お よび偏性メチロトローフを含む（アンソニー、前出、ハンソン前出）。メタンを 資化し得ない偏性メチロトローフは全てダラム陰性好気性細菌である（アンソニ ー、前出、ライラテンバーブ、前出）。メタノール、メチルアミンまたはこれら の両方を資化する分離された条件的メチロトローフのうち、ダラム陽性はごく僅 かしか存在せず、それらはバチルス、コリネバクテリウム、アルトロバクターま たはノカルディア属に配分されていた（アキバ等、Ｊ　、　Ｆ　ｅｒｍｅｎｔ、 　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、４８：３２３−３２８（１９７０）、クレメント等、Ａｂ ｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｉｆｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ ｙｍｐｏｓｉｕｒａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ　Ｃ、Ｃｏ＋ ＊ｐｏｕｎｄｓ、　６９頁（フリー・ユニバージティー・プレス、アムステルダ ム、１９８６）、ハーゼン等、「アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジーＪ 、１３５：２０５−２１０（１９８３）Ｓ工材等、Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔ ｅｃｈｎｏｌ、、５６：２４３−２５２（１９７８）。

微生物発酵による単細胞蛋白質および選択されたアミノ酸の製造は、例えばスタ ーリングによるアメリカ合衆国特許第４６５２５２７号により知られている。工 業的規模で製造されたーアミノ酸はリジンである。登板等、「トレンズ・イン・ バイオテクノロジー」、１ニア０−７４（１９８３）、登板およびタキナミ、「 プログレス・イン１７２頁（アイダ等、１９８６）参照。バチルスの種類は、ア ミノ酸を製造するための発酵プロセスにおいて使用された。登板等、前出、登板 およびタキナミ、前出。しかしながら、現在まで、５０℃を越える温度でメタノ ールにより急速に成長し得る分離されたバチルス種を用いたアミノ酸の製造は行 なわれていない。

高温での好熱性メタノール資化発酵プロセスの工業的利点については既に記載さ れている、スネデカーおよびクーニー、「アプライド・マイクロバイオロジー」 、２７：１１２−１．１１７（１９７４）。

例えば、高温の使用により冷却コストは顕著に低減化され得る。内性胞子形成種 を含むメタノール資化好熱性混合培養物は、スネデカーおよびクーニーにより選 択された。しかしながら、スネデカーおよびクーニーは、メタノールで成長し得 る純粋培養物を分離し得なかった。混合または不純培養物から適当な突然変異体 を分離することは、非常に困難または不可能である。

従って、窒素供与体、ビタミンＢＩ２並びに炭素およびエネルギー供給源として のメタノールを有する培地中５０℃で持続的成長を呈するバチルス属の１型メチ ロトロフイツク細菌を用いたアミノ酸の製造方法が要望されている。

発明の要旨 我々は、炭素およびエネルギー供給源としてのメタノール、ビタミンＢ１２およ びビオチンを含む栄養培地中５０℃で持続的成長を呈するバチルス属のＩ型メチ ロトロフィック細菌の生物学的に純粋な株を発見した。上記細菌は、約り０℃〜 約６０℃の温度で成長し、＋ 可溶性ＮＡＤ　　依存性アルコール脱水素酵素を含む。

さらに我々は、上述の生物学的に純粋な株のアミノ酸栄養要求変異種が、かなり の量のアミノ酸を製造するのに有用であることを発見した。好ましい態様におい て、バチルス属の生物学的に純粋な株Ｉ型メチロトロフィック細菌のアミノ酸栄 養要求変異種は、炭素およびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、窒素供 与体、ビタミンＢ１２およびビオチンを有する水性栄養培地中５０℃で培養され た場合に少なくとも１種のアミノ酸を製造する。

さらに好ましい態様において、この発明の細菌は、動物飼料および動物飼料補充 物質または動物飼料用の栄養補助物質として有用な多数のアミノ酸を同時に製造 することができる。続いて、この発明により製造されるアミノ酸（複数も可）は 、培養培地から分離され得る。好ましくは、アミノ酸含有培養培地は、乾燥され 、貴重な動物飼料または動物飼料補助物質として直接使用され得る。

この発明の好ましい栄養要求変異種細菌は、生物学的に純粋な株ＭＧＡ３の突然 変異体およびその形態変異体である。最も好ましくは、この発明のアミノ酸栄養 要求変異種はまた、アミノ酸類縁体に対して抵抗を示す。

二の発明の細菌を培養してアミノ酸を製造するのに好ましい栄養培地は、有効量 の燐酸供給源、硫酸供給源、カルシウム供給源および微量元素と一緒に、炭素お よびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、窒素供給源、ビタミンＢ１２お よびビオチンを含む。この発明の栄養要求変異種細菌によるアミノ酸製造は、要 求されたアミノ酸と一緒に有効量のメタノールおよび微量元素を培養培地に自動 的に送り込むことにより増強される。最も好ましくは、有効量のメタノール、微 量元素および要求されたアミノ酸を含む連続培養方法を用いることにより細胞が 高い細胞密度に成長すると、アミノ酸製造は最大化される。好ましい半連続的（ フェト−パッチ、ｆｅｄ　−ｂａｔｃｈ）または連続的培養方法では、アミノ酸 の製造は一定の細胞密度で非成長的関連性を示す。

我々は、こめ発明の方法を用いると、１型メチロトロフィック・バチルスの生物 学的純粋株の栄養要求変異種細菌が、かなりの量のリジンを排出することを観察 した。好ましい態様において、我々は、Ｌ−リジン１リツトル当たり約３−１０ グラムを排出するアミノ酸栄養要求変異種を観察した。リジン製造に使用される さらに好ましい栄養要求突然変異体は、５−２−アミノニチルーシスティン並び にトレオニンおよびメチオニンの類縁体による成長阻害に抵抗を示すホモセリン 栄養要求変異種である。最も好ましい栄養要求変異種は、５−２−アミノエチル −システィンによる阻害に対して抵抗を示し、またトリプトファン、チロシンお よびフェニルアラニン類縁体に抵抗を示すフェニルアラニンおよびチロシンを要 求する突然変異体であるホモセリン栄養要求変異種である。

この発明はまた、炭素およびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、ビタミ ンＢ１□およびビオチンを含む水性栄養培地中５０℃で持続的成長を呈するバチ ルス属のＩ型メチロトロフィック細菌の生物学的純粋株を分離し、高いアミノ酸 生産性を呈する突然変異体の製造に有効な突然変異誘発量により上記分離菌を処 理する段階を含む、バチルス属の！型メチロトロフィック細菌の生物学的純粋株 のアミノ酸製造突然変異体を得る方法に関するもの！ある。アミノ酸生産突然変 異体は、１種またはそれ以上の所望のアミノ酸または生合成中間体を含む培地に おける成長能力に基づいて選択される。

好ましい態様では、この発明の分離されたＩ型メチロトロフィック・バチルスを 、化学的突然変異原、例えばエチルメタンスルホネートもしくはＮ−メチル−Ｎ −ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニン、またはアミノ酸類縁体、例えば５−２−ア ミノエチル−し−システィン、またはこれらの両方で処理することにより、細菌 によるアミノ酸生産性を向上させる。

下記の詳細な記載および後記請求の範囲から、この発明の他の特徴および利点は 明白となるはずである。

′図面の記載 第１図は、５３℃でＭＶ培地において成長させたＭＧＡ３株の位相差顕微鏡写真 である。棒線は１０μ腹を示す。

第２図は、４５℃でＭＶ培地において成長させたＧｒ株の位相差顕微鏡写真であ る。

第３図は、５３℃で８Ｍ培地において成長させ、３７℃に変えた場合のＭＧＡ３ 株の位相差顕微鏡写真である。棒線は１０μｍを示第４図はＭＧＡ３株の成長を 示す。０．５ｇ／ｌ酵母抽出物（−ロー）、メタノール５．０ｇ／ｌ（−△−） またはメタノール５ｇ／ｌおよび０．５ｇ／ｌ酵母抽出物（−・−）を含むＭＶ 培地にＭＧＡ３株を接種した。培養物を５３℃で振り混ぜながらインキュベーシ ョンした。

第５図は、この発明の栄養要求変異種細菌によるリジンおよびアスパラギン酸の 同時製造を示す。

第６図は、半連続またはフェト−パッチ条件下における高細胞密度へのＭＧＡ３ 成長を示す。

発明の詳細な記載 この発明の好ましい態様のメチロトロフィック細菌は、下記第１表に示した特徴 を有するバチルス属の一員である。

第１表、■型メチロトロフィック・バチルスの特徴。

細胞形状　　　　　　　　　　　　　　　　かん状ダラム反応　　　　　　　　 　　　　　　　十内生胞子　　　　　　　　　　　　　　　　卵形胞子嚢　　　 　　　　　　　　　　　　　　膨れた状態胞子局在性　　　　　　　　　　　　 　　　端付近８０℃で１０分後の生存　　　　　　　　　十５３℃での胞子形成 　　　　　　　　　　　−３７℃での胞子形成　　　　　　　　　　　子連動性 　　　　　　　　　　　　　　　　＋／−成長に最適なｐＨ７ 成長に最適な温度　　　　　　　　　　　　４５−５５℃ビタミン必要条件　　 　　　　　　　　　　　Ｂ１７、ビオチン炭素およびエネルギー供給源： アセテート　　　　　　　　　　　　　　曹グルタメート α−ケトグルタレート 炭水化物からの気体 栄養寒天培地における成長 窒素供給源： 二トレート還元 ニトレート呼吸 ヘキスロース燐酸シンターゼ 加水分解： ゼラチン 澱粉 ＮａＣ１耐容性 Ｗ　　　　　　　ＤＮＡ塩基割合（モル％Ｇ＋Ｃ）　　　　　　　４４−　　　 　　　脚注：ｗ＝弱い陽性１．＝測定されず。

Ｗ　　　　　　　この明細書に記載された方法で分離されたバチルス株ＭＧＡ３ は、第１表（第１図）に示す特徴を呈した。バチルス株ＭＧＡ３は、ア十　　　 　　　メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣ−Ｃ５ ３９０７の番号が割り当てられている。さらに、上記細菌は、−最初の発酵槽強 化で見られる多形細胞を連想させた、ＭＧＡ３株培−獲物のスミアにおいて時折 見られる非常に大型かつ多態性の細胞で十　　　　　　ある異常型形態を特徴と する。ＭＧＡ３のプレートから得られたコー　　　　　　ロニーは、この形態変 異型の純粋培養物を生産した（第２図）。それ十　　　　　　はＧｒ株と命名さ れた。この株は、試験されたＭＧＡ３株の培養的および生理学的特徴の大部分を 共有していた。Ｇｒ株は５０℃でメ＋　　　　　タノールまたはマンニトールに おいて成長し、好中性であり、成長＋　　　　　するためにはビタミンＢＩ２お よびビオチンを必要とし、試験された１％　　　　全ての他の特徴においてＭＧ Ａ３と似ていた（第１図）。またＧｒ株の粗抽出物は、ヘキスロース−燐酸シン ターゼ活性を含んでいた。

複製を許容しない５３℃から３７℃に培養条件を切り換えると、Ｇｒ株は相の明 るい胞子を形成した。高温で成長させたＧｒ株の培養物は加熱不活化後生存して いなかったが、３７℃でさらに１８時間インキュベーションした培養物から得ら れた細胞は８０℃で１０分間生存していた。Ｇｒの全体的外観は、ロジャーズ等 により分離されたバチルス・スブチリスおよびバチルス・リケニホルミスのかん 状突然変異体と類似していた（「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイ オロジー」、６１：１５５−１７１（１９７０））。

この発明の細菌の主たる特徴は、それが、単一の炭素およびエネルギー供給源と してのメタノールを必要なビタミン類としてビオチンおよびビタミンＢＩ２と共 に含む水性栄養培地中少な（とも５０℃の温度で成長することである。この明細 書に記載されている「水性栄養培地」は、この発明の細菌の成長に必要な無機物 およびそれらの塩類を含む水基剤の組成物を指す。好ましい栄養培地は、有効量 の燐酸供給源、窒素供給源、硫酸供給源、カルシウムおよび微量元素を含む。こ の明細書に記載されている「微量元素」は、痕跡濃度、すなわち１パーセントの 微小フラクション（１０００ｐｐｍまたはそれ未満）であって成長に不可欠な元 素を指す。第１表で示した通り、この発明の細菌は、グルコースまたはマンニト ールを含む、メタノール以外の成長に要する若干の炭素およびエネルギー供給源 を資化し得る。しかしながら、好ましい炭素およびエネルギー供給源はメタノー ルである。

この発明における満足すべき培地は、例えば実施例１に記載された培地などの最 少塩類培地である。好ましい実施態様、例えば実施例１において、この発明の細 菌を成長させるための最少塩類培地は、硫酸アンモニウムを約２０〜約５００ｍ Ｍ、燐酸カリウムを約１０〜１２５ｍＭ、塩化カルシウムを約０．１．−１．５ ｍＭおよびマグネシウムの塩類および微量金属：鉄、銅、マンガン、亜鉛、モリ ブデン、ホウ酸塩およびコバルトを実施例４に記載された濃度で含む。

成長に必要とされるメタノールおよびビタミンＢＩ２の量は変化し得る。培地中 のメタノールの量は、約０．０５重量／容量％〜約５重量／容量％の範囲であり 得、約０，２重量／容量％〜約０．５重量／容量％の量が好ましい。培地は少な くとも０．０５重量／容量％の濃度でメタノールを含むべきである。水性培地中 のビタミンＢＩ２の量は、約０．５　μｇ／ｌ　〜１ｍｇ／ｌの範囲で変化し得 、約１μｇ／ｌ〜０．１ｍｇ／ｌの量が好ましい。細菌の最適成長は、約６．０ −８．０のｐＨ範囲内および４５−５５℃で行なわれる。ｐＨが５．５の場合成 長は行なわれない。成長には約２０μｇ／ｌ〜２０ｍｇ／ｌの量のビオチンを必 要とされる。メタノール、ビタミンＢＩ２およびビオチンを含む最少塩類培地で 成長させた場合、この発明の細菌は、約５０℃〜６０℃の温度で約０．２／時〜 約１．５／時の速度で成長し得る。

さらに、この発明のＩ型メチロトロフィック細菌は、ＮＡＤ＋依存性メタノール 脱水素酵素を生産する。この脱水素酵素は、この発明の微生物から分離された場 合６５℃で最適活性を有し、メタノ−＋ ル検知電極における封入、安い電子供与体からのＮＡＤＨ＋Ｈの製造および還元 剤を必要とする他の酵素結合反応の推進に有用であると考えられている。

この発明の細菌は、アミ゛ノ酸を製造し得る栄養要求変異種および形態学的突然 変異体、例えばＧｒ株の形成能力を特徴とする。また、上記細菌は、３７℃ない し約５０℃を越えない温度で内生胞子を生じるが、これは株の保存に重要なこと である。この明細書で記載されている「栄養要求変異種」は、最少栄養培地に存 在する炭素供給源に加えて特異的な成長因子を必要とする微生物を指す。この発 明に関して述べると、栄養要求変異種は、ここに記載されているＩ型メチロトロ フィック細菌の突然変異形態を指すもので、１種またはそれ以上のアミノ酸を成 長に必要とし、１種またはそれ以上のアミノ酸を過剰生産および排出する。この 明細書に記載されている「突然変異」は、一般に自然発生的または放射および様 々な化学物質を含む既知突然変異誘発源により誘導され得る生物体の表現型にお ける突然の遺伝性変化を意味する。この発明の栄養要求変異種は、放射、例えば 紫外線光およびＸ線および化学的突然変異誘発源を含む様々な突然変異誘発源を 用いて製造され得る。化学的突然変異誘発物質の例は、エチルメタンスルホネー ト（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−二トローＮ°−ニトロソグアニン（ＮＴＧ）お よび亜硝酸である。

また、この発明は、様々なアミノ酸を過剰生産および排出する本明細書記載のＩ 型メチロトロフィック細菌のアミノ酸類縁体耐性株の製造に関するものである。

この明細書に記載されている「アミノ酸類縁体」は、アミノ酸と構造が類似して いるが、天然アミノ酸の場合と同じ方法で生合成酵素および遺伝制御要素とは反 応しない化合物を指す。上述の構造が類似した類縁体およびそれらの関連アミノ 酸の例としては、５−メチル−ＤＬ−トリプトファン（ＭＴ）、ｐ−フルオロフ ェニルアラニン、５−フルオロ−ＤＬ−）リプトファン（Ｆ　Ｔ）、５−２−ア ミノエチル−Ｌ−システィン（ＡＢＣ）およびエチオニンがあり、各々トリプト ファン、チロシン、トリプトファン、リジンおよびメチオニンに対応する。

実施例で記載されている通り、この発明の１型メチロトロフィック細菌のアミノ 酸生産突然変異体は、ここに記載されている分離された■型メチロトロフィック 細菌を、１種またはそれ以上のアミノ酸を過剰生産する突然変異体の製造に有効 な量の突然変異誘発物質で処理することにより製造される。使用される突然変異 誘発物質の型および量は変化し得るが、ＥＭＳおよびＮＴＧを各々約１０および ５０μｇ／ｍｌの量で使用するのが好ましい。突然変異誘発処理後、処理された 細菌の分離株を、少なくともビタミンＢＩ２およびビオチンおよび１種またはそ れ以上のアミノ酸を含む培地における成長について試験する。アミノ酸排出突然 変異体の選択に適当な一培地は、実施例１記載の型の最少ビタミン培地などであ る。栄養要求変異種分離株は、１種またはそれ以上の特異的アミノ酸を含む最少 ビタミン培地のみでの成長能力により同定される。この発明の多くのアミノ酸栄 養要求変異種は実施例２で同定される。

また、この明細書に記載されている■型メチロトロフィック細菌は、別法として 、または追加的に特定アミノ酸を過剰生産する突然変異体を選択するためのアミ ノ酸類縁体で処理され得る。好ましい一実施態様では、まずアミノ酸生産突然変 異体を化学的突然変異誘発物質ＥＭＳ（１０μｇ／ｍｌ）またはＮＴＧ（５０μ ｇ／ｍｌ）で処理することにより、アミノ酸栄養要求変異種を生成させる。次い で、選択されたアミノ酸栄養要求変異種を、増量のアミノ酸類縁体ＡＥＣで処理 することにより、アミノ酸リジンを過剰生産する突然変異体を選択する。この発 明を用いることにより、既知アミノ酸の全部でなければ大部分を生産し得る本明 細書記載のバチルス属の１型メチロトロフィック細菌のアミノ酸栄養要求変異種 および／またはアミノ酸類縁体耐性突然変異体を製造し得ることが想像される。

この発明のＩ型メチロトロフィック・バチルスの栄養要求変異種および／または アミノ酸耐性突然変異体からアミノ酸を製造するため、例えば実施例４で示され た量の燐酸供給源、硫酸供給源、窒素供給源、カルンウムおよび微量元素と一緒 にビオチン、ビタミンＢ１□およびメタノールを有する水性栄養培地中で生物体 を培養する。

先に記載した通り、満足すべき培地は、最少塩類培地、例えば実施例１記載の培 地などである。アミノ酸の製造に必要とされるメタノールおよびビタミンＢＩ２ の量は変化し得る。メタノールは、約０゜０５重量／容量％〜５重量／容量％の 範囲であり得、約０．３重量／容量％〜約０．８重量／容量％の量のメタノール が好ましい。ビタミンＢ１２は約０．５．ｃｚｇ／ｌ　〜１ｍｇ／ｌの範囲であ り得、約１μｇ／ｌ〜約０．１ｍｇ／ｌの量が好ましい。最低で、少なくとも約 ０．０５重量／容量％のメタノール、０．５μｇ／ｌのビタミンＢ１２および約 ２０μｇ／ｌ〜約２０ｍｇ／ｌのビオチンがアミノ酸の突然変異的製造には必要 とされる。

好ましい実施態様では、水酸化アンモニウムによるｐＨ制御手段に結合した培地 にホスフェート、マグネシウムおよびカルシウムを供給する。多くの窒素供給源 、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが使用さ れ得る。好ましい窒素供給源は、少なくとも２０ミリモルの量で必要とされる塩 化アンモニウムまたは（ＮＨ４）２ＳＯ４である。

所望ならば、培養において製造されたアミノ酸は、抽出方法、例えばイオン交換 クロマトグラフィーを用いて分離され得る。好ましい方法では、Ｉ型メチロトロ フィック・バチルス、培養培地成分および生産されたアミノ酸を含む発酵ブロス を直接乾燥することにより、細胞、培地成分および動物飼料または動物飼料補助 物質として有用な１種またはそれ以上の過剰生産された必須アミノ酸を含む物質 を製造する。発酵ブロスは、例えばＧ、　Ｌ、　　ソロモンズ、「マテリアルズ ・アンド・メソッズ・イン・ファーメンテ−ジョン」（アカデミツク・プレス、 ニューヨーク、二ニーヨーク、１９６４）で報告された方法により乾燥され得る 。

この発明のＩ型メチロトロフィック細菌の栄養要求変異種および／またはアミノ 酸耐性突然変異体を用いることにより、アミノ酸がかなりの量で製造され得ると 考えられる。すなわち、少なくとも５グラム／１〜約１５０グラム／１、好まし くは約５０グラム／１〜約１５０グラムおよびさらに好ましくは約１００〜１５ ０ｇ／ｌの量のアミノ酸が製造され得る。この発明は２０種のアミノ酸の多（を 製造するのに有用であると考えられるが、特にリジン、フェニルアラニンおよび トリプトファンの単独または同時製造に有用である。一実施態様において、同じ くアミノ酸感受性である栄養要求変異種は、約３〜約５ｇ／ｌの割合でリジンを 製造し得る。好ましい実施態様では、同じくアミノ酸感受性である栄養要求変異 種は、８グラム／ｌ以下の割合でリジンを製造し得る。少なくとも４、Ｏｇ／ｌ のＬ−リジンおよび少な（とも１．５ｇ／ｌのＬ−アスパラギン酸の同時製造も また達成され得る。好ましい一実施態様では、４．５ｇ／ｌのＬ−リジンおよび ２．０ｇ／ｌのＬ−アスパラギン酸の同時製造が達成される。

実施例１で記載したタイプの最少塩類培地で培養した場合、この発明の■型メチ ロトロフィック株は、乾燥重量にして５０グラム／１以下の細胞密度で成長し得 る。好ましくは、４５℃ないし５５℃の温度でビタミンＢＩ２、ビオチンおよび メタノールを含む最少塩類培地における細胞成長は、少なくとも１５０ｇ／ｌ（ 乾燥重量）およびメタノール１グラム当たり細胞０．６グラム以下であり得る。

メタノール１グラ°ム当たり細胞約０．５３グラムの細胞収率を有する３０−５ ０ｇ／ｌ（乾燥重量）の細胞密度が観察された。

この発明の栄養要求変異種はバッチ培養で成長させた場合にアミノ酸を製造し得 る。しかしながら、必要とされるアミノ酸と共にメタノールおよび微量元素をフ ェト−バッチまたは半連続的に供給すると、アミノ酸製造が促進される。さらに 、この発明の栄養要求変異種によるアミノ酸製造は、必要とされるアミノ酸と共 に微量元素を自動的に供給する連続培養方法を用いることにより促進され得る。

さらに、バッチ供給または連続培養へのホスフェート、マグネシウムおよびカル シウム供給は、ｐＨ制御と結びつけられ得る。栄養要求変異種によるアミノ酸の 製造は、純粋酸素を連続的に加えると同時にメタノールおよび微量元素を培養培 地へ連続的に加えることにより、この発明の細菌を最高細胞密度に成長させた場 合に最大化される。

実施例Ｉ Ｍ　Ｇ　Ａ　３株の分離及び特性表示 Ａ、方法と操作 成育及び胞子形成培地：最少塩培地（ＭＳ）は、１リツトルの蒸留水中に、Ｋ　 ｔＨＰ　Ｏ−、３，８ｇ：ＮａＨｔＰ　Ｏ４・Ｈｔｏ、２．８ｇ：（Ｎ　Ｈ４） ｚＳＯ，，３，ｓｇ；Ｍｇ５ｏ、・７Ｈｚ０，０．５ｇ；Ｆｅ５０．−７１ｈ０ ．２ｍｇ：Ｃｕ５Ｏ，−５Ｈｚ０．４０μｇ；ＨｓＢＯｓ；３０μｇ；Ｍｎ５Ｏ ，・４Ｈｔ０．２００　μｇ；　Ｚ　ｎＳ　Ｏ４・７　Ｈｔｏ、２００　μｇ； Ｎａ＊ＭｏＯ＋＋　４０　μｇ；ｃａｃ１ｔ・２Ｈｔ０，５．３μｇ；ＣｏＣ１ ｔ・６Ｈｚ０．４０８ｇ、を含有した。本培地のｐＨをオートクレーブ処理する 前に７．０に調整した。リン酸塩は、ＭＳ培地を連続培養に用いる場合、５０％ に減少した。

最少ビタミン培養（ＭＶ）は、ＭＳ培地にチアミン・ＨＣ（１，Ｄ−パントテン 酸カルシウム、リボフラビン及びニコチン酸アミドを各５０μ９・ｇ−１、ビオ チンと葉酸を各２０μ９・Ｑ−’としてＢｌｌを１μ？・１２−１加えたもので あった。

酵母水培地（ＭＹ）は、酵母エキス０．５９・ｆｆ−’を加えたＭＳ培地。

であった。

全ての培地（ＭＶ及びＭＹ）は、特にことわらない限り、０４％（ｖ／ｖ）メタ ノールを含んだ。普培地（ＮＢ）は１０００１１１２に蒸留水中にビーフェキス ３９とペプトン５９を含有した。Ｊビタミン培地（Ｊ　Ｖ）は、リットル当りペ プトン（５９）と酵母エキス（１５９）、及びＭＶ培地と同一濃度のビタミンを 含んだ。胚子形成培地（ＳＭ）は、３部のＮＢと４部のＭＶ培地から構成された 。全固体培地は、二倍の強さの培地成分と同量の３％バクト（ｂａｃｔｏ）寒天 をオートクレーブ処理後、混合することにより調製した。

栄養強化：淡水沼地土壌を蒸留水に懸濁し、９０°Ｃで２０分間加熱した。この 懸濁液の一部を、５３℃でのバッチ培養で扱う発酵槽用の接種材料として用いた 。生育が容器内で明白と′なったとき、培地ポンプを稼動して流速を徐々に増加 して栄養強化用の連続性培養を行なった。

連続培養：２つの１ｅオムニ（Ｏｍｎｉ）−培養発酵槽（バーチス社、ガージナ ー、二ニーヨーク）を連続培養に用いた。メータリング（ｍｅｔｅｒ　ｉ　ｎｇ ）ポンプ（アイスマチック・ミニ、シカゴ、イリノイ）で容器に未滅菌のＭＳ培 地を供給し、流量を１時間当り０．１と０．５容量の間に調整した。セパレート メータリングポンプでメタノールを流出物中、約２９・、２−１の残留濃度を保 つ速度で供給した。メタノールの濃度はガスクロマトグラフィで測定した。ｐＨ を１０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加によりｐＨ６，８に自動的に調節した （コントローラー・モデル５６５６−００．コール・バーマー・インスツルーメ ント・フンバニイ、シカゴ・イリノイ）。温度は５３℃と５６℃の間に保った。

空気を２ｖ／ｖ／ｍで散布し、三枚平羽根タービンインペラを６０ＯＲＰＭで操 作した。

分離及び純培養：発酵槽からの試料を周期的にＭＹ及びＭＶ寒天上に画線して５ ３°Ｃでインキュベートした。これらのプレートから得た分離コロニーを同一条 件で生育した。コロニーを、２３！１２のＭＶ培地を１８ｍｍ試験管に接種し、 そして試験管を旋回水浴振盪機中５３℃でインキュベートすることにより、メタ ノールでの生育について試験した。このメタノール最少ブロス中の生育を伴う試 験管を次の精製用にＭＶ寒天上に接種した。

形態学的特性　ダラム染色（ｓｔｒａｉｎ）、胞子染色（ｓｔｒａｉｎ）及びポ リ−β−ヒドロキシブチラード染色（ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）をトーチ、マニュア ル・オブ・プレート・フォア・ジェネラル・バクテリオロジイ　２１−３３頁（ アメリカン・ソサエティ・フォア・マイクロバイオロジイ、１９８１）に記載さ れるように行った。ダラム染色は、上記ガーガーセンにより記載されたように実 施したＫＯＨ試験で証明した。

細胞径はＭＹ寒天上５０’Ｃで１８時間生育した細胞で測定した。

特性試験：ＡＰＩウサギＣＨ及びウサキＥストリップ系（シャーウッド・メディ カル、プレインヴコー、二ニーヨーク）を用いて４９物質の標準発酵検査と９の 追加生物学的測定をそれぞれ行なった。２セツトのストリップ５接種するのに用 いた培養株は、ＪＶ寒天培地上と５Ｍ寒天培地上で５５℃で１８時間生育させた 。試験ストリップは系で与えられた指示に従って接種し読み取った。硝酸塩還元 、ＮａＣＱ’ｆｒ’ｌ性、チロシン分解及びリゾチーム耐性をゴートン等、ザ・ ジーナス・バチルス・ハンドブック、Ｎｏ、４２７（ワシントン、ディーシー、 デパートメント・オブ・アゲ、１９７３）によって記載されたように行なったか 、以下の通り変更した。硝酸塩から亜硝酸塩への還元、ＮａＣＱ耐性及びリゾチ ーム耐性はＪＶ培地中、チロシン（５９・Ｑ−１）及び０．５％メタノールで試 験した。窒素源として硝酸塩の適性を試験するため、硝酸カリウム（５９・ρ− １）をＭＶ培地中、硫酸アンモニウムと置き換えた。

加水分解活性：０，５％（ｖ／ｖ）メタノールを含むＭＶ寒天プレートは、可溶 性澱粉（３９・Ｆ’）、果実ペクチン（サート・ブランド、１０ｇ・ｇ−１及び ゼラチン（シグマ・タイプＩ、４ｇ・Ｑ−Ｉ）をブレトを混釈する前にＭＶ培地 に加えることにより調製し、加水分解活性を調べた。カゼイン含有プレートは、 ＩＱの半分の強さのＭＶ培地に１５９の脱脂乾燥ミルク（カーネイション・カン バニイ）を加えて調製した。これらプレートでの加水分解は、ラス牛ン及びレッ ケヴアリアー、ＣＲＣハンドブック・オブ・マイクロバイオロジイ、７３４−７ ３５頁（ＣＲＣブレス、１９７１）に記載されたように検定したジピコリン酸抽 出及び決定ニ ジピコリン酸（Ｄ　Ｐ　Ａ）は、細胞懸濁液の５１１Ｑ試料を２０分間オートク レーブ処理することにより抽出した。次いで試料を冷却し、１膚ρのＩＮ酢酸で 酸性とし、１時間放置し、次いで１２，０ＯＯｘ９で１０分間遠心分離した。上 清フラクション中の大量のＤＰＡを、センセン等、サイエンス、１２７：２６− ２７（１９５８）により記載された比色分析により決定した。胞子ノウ及び胞細 計数は、ベトロフーハウザー血球計算板を使用して視覚的に測定した。

熱及びクロロホルム耐性：培養菌の一部を８０’Ｃに加熱し、次いで８０’Ｃで １０分間保った。生存数及び熱安定数を、ＭＹ寒天上に加熱及び未加熱培養株の 適当希釈物をプレートすることにより測定した。胞子懸濁液はＭＹ中、５０°Ｃ １８時間及び３７°Ｃ１Ｂ時間生育°　した培養菌から調製した。培養菌を１２ ．０００９で遠心分離し、蒸留水中での遠心分離と蒸留水中への再懸濁によって 洗浄した。胞子懸濁液を６５°Ｃで１０分間滅菌した。次いでこの懸濁液の一部 を８０℃で１０分加熱した。胞子計数はＭＸ７寒天上に希釈物をプレートし、プ レートを５０°Ｃで４８時間インキ二ヘートすることにより測定した。

クロロホルム５μＱを１ｊＩ１２の培養菌を含む試験管（１３ｍｍＸ　１００ｍ ｍ）に加えた。懸濁液をヴオルテノクス（ｖｏｒｔｅｘ）混合機で混合後、試験 管を、上記のように希釈及びプレートする前に３７℃で１０分間インキニベート した。

生育試験二種々の物質に対する生育反応を、アル；−ル０．５％（Ｖ／ｖ）、シ ョ糖、有機酸及びメチル置換アミン各０．３％（ｖ／ｖ）並びにホルムアルデヒ ド０．０３％（Ｗ／Ｖ）を含むＭＶ培地中で測定した。生育に関するｐＨの影響 は、ＨＣＱ又はＮａ（１２を添加してｐＨを調整したＭＶ培地中で測定した。生 育速度は、約２０ＯＲＰＭで稼動させた旋回振盪機（二ニー・プランスウイノク ・モデルＧ−７）上の三重バッフルフラスコ内の培養菌の生育によって決定した 。生育は、スペクトル光度計又はクレット・ユニット（＃６６フイルター）を用 いて６５０ｎｍでの濁り測定によって測定した。１吸光度単位は０、４２ｇ・１ ２−１の乾燥細胞重量に対応した。

抗生物質感受性：０．２ｔｎ（ｌ容量の半指数期培養菌を０，５％（ｖ／ｖ）メ タノールを含むＭＶ寒天プレート上に塗布した。プレートを５５°Ｃで１時間イ ンキニベートして表面を乾燥させた。次いで抗生物質含有ディスク（ディフコ・ ラボラトリイズ、デトロイト、ミシガン）を表面上に無菌的に置き、プレートを ４８時間５５℃にもどした。感受性を試験するために用いた抗生物質ディスクは 、ゲンタマイシン１０ＩＣ９、スルファジアジン３００　ｚｃｇ、テトラサイク リン３０ｗｃｇ、アンピシリン１０１Ｃ９、リフアンピン５　ｙｃｇ、クロロマ イセチン３０ｔｘｃｇ、エリスロマイシン５　ｍｃｇ及びペニシリンＧＩＯ単位 を含有したメタノール酸化：バチルス株ＭＧＡ３の培養菌を、メタノール（４９ ・１２−１）又はマンニトール（３９・ｅ−１）を含む液体ＭＶ培地中、５０℃ で半指数期まで生育した。細胞を４℃で１２，０ＯＯＸｆで８分間遠心分離する ことにより集め、水冷０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７中で遠心分離することによ り洗浄し、水冷０．０５ＭＩＪン酸緩衝液に懸濁した。メタノール酸化は、ロウ ツ酸素電極（ロウツ・ブロス１．ボッティジャム、イングランド）を用いて測定 した。酸素消費はｏ、０５Ｍリン酸緩衝液中に細胞（３，７−７，３ｘ９・３ｊ ｆ２−’）の懸濁液を置くことにより電極で測定した。内因性酸素消費の速度が 確立したのち、メタノール１．０９・Ｑ−’を電極に加えてメタノール依存性酸 素消費の速度を測定した。

粗製抽出物及び酵素アッセイ：細胞を半指数期で集め、５０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液 、ｐＨに再び懸濁し、１５．０００ｐｓｉに操作したフレンチ加圧室（Ｆｒｅｎ ｃｈ　　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　　ｃｅｌｌ）を通して２つに***させた。

細胞残がいを１２．０００ｇで遠心分離して除き、上清区分を粗製抽出物として 用いた。ヘキスロースリン酸合成酵素を、コックス及びザットマン：バイオケミ カル・ジャーナル、１４１．６０５−６０８（１９７４）による方法により分析 しくこれを引用して明細書記載の一部とする）、ヒドロキシピルビン酸エステル 還元酵素をラージ及びファイル、バイオケミカル・ジャーナル、８７：３８７（ １９６３）による方法により分析したくこれを引用して明細書記載の一部とする ）。蛋白濃度をクラーク及びスウィツアー、エクスベリメンタル・バイオケミス トリイ（第２版、フリーマン・プレス、１９７７）の方法（これを引用して明細 書記載の一部とする）により、ビニ−レット試薬で測定した。ウシ血清アルブミ ンを標準として用いた。

ＤＮＡ塩基組成： ＤＮＡ塩基組成は、標準としてエセリシア・コリＤ　Ｎ　Ａを含む０．１２Ｍリ ン酸ナトリウムｐＨｅ、ｓ中、温度の機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として吸光度の 濃色シフトを測定することにより決定した。マンテル及びマーマー、メソーズ・ エンザイモル、１２．１９５−２０６（１９６８）。

Ｂ、結果 栄養強化及び分離：　５３−５６℃でのメタノール利用混合培養の増殖は迅速で 豊富であった。連続培養が確立したとき、希釈速度は洗浄することなく　（ｗｉ ｔｈｏｕｔ　　ｗａｓｈｏｕｔ）　１時間当り０．４５まで上げることができた 。スミアは胞子形成細菌を含む圧倒的なグラム陽性形及びいくつかの非常に大き な多形態性細胞を含む種々の形態学的型を明らかにした。しかしながら、メタノ ール最少培地にもどしたとき生育しなかった細菌のみは、すくに栄養強化容器か ら分離できた。上に記載された分離操作を用いて多くの分離物をスクリーニング したのち、ＭＶ培地中５３℃で迅速に生育するものが見い出され、又、株名称Ｍ ＧＡ３が得られた。

細胞及びコロニイ形態学：ＭＧＡ３株の細胞は、丸い末端の杆状形（０，８−１ ，ＯＸ２．５−４．５μ貫）であった（第１図）。若い培養菌はダラム陽性に染 色し、全ての培養菌はＫＯＨ陰性であった。■−型ペアの細胞が培養菌中にしば しば存在した。空胞は全く見られず、ポリ−β−ヒドロキシブチラードはスダン ブラックＢ染色では検出できなかった。ＭＶ寒天上に生じたコロニーは、無色、 半透明、円形、凸状で金縁を有していた。画線培養では種々の大きさのコロニー が生成し、全てのコロニーは、アミノ酸、グルコース、酵母エキス又は少量の普 通ブロスを加えたＭＶ寒天上で、添加しなかったＭＶ寒天上でよりも大きく生育 した。色素は生成しなかった。

内生胞子：胞子は卵形で０．８−１．ＯＸｌ、ＩＸｌ、２μａであり、それるの 位置は大端部で、胞子ノウはふくれていた（第３図）ｃ　Ｍ〜７寒天上５３°Ｃ て生育した大部分の培養菌は、屈折性内生胞子を含まず、室温で保存すると速や かに生存度を失うことが認められた。これらの培養菌は、新鮮培地に接種した場 合、生育しなかった。しかしながら、内生胞子を含む培養菌は、８０°Ｃて１０ 分間加熱後でさえ、新鮮培地で生育した。Ｍ　Ｇ　Ａ　３株は５０−５．５°Ｃ でよ（生育したが、はとんどの細胞は内生胞子を生成することなく溶解した。内 生胞子は、５０−５５°Ｃで１８時間インキュベートし、そしてさらに３７°Ｃ で１８時間インキュベートした培養菌中に形成することが認められた。培養菌を これらの条件下で生育した場合、５４％の細胞が屈折性内生胞子を含有し、クロ ロホルム耐性コロニー形成単位は、生存細胞数（２，７Ｘ１０−’細胞・Ｒｆｆ 一つの１０％に等しかった。又、メタノール添加培地（ＭＹ、ＳＭ）は最少培地 （ＭＶ）よりも多くの内生胞子を生成することも認められた。普通寒天又は硫酸 マグ不ンウム（５１９・Ｑ−１）添加普通寒天は良好な胞子形成培地としては機 能しなかった。

熱耐性（トレランス）：ＭＧＡ３の指数期培養菌は５０℃で生育し、１ｘＱ当り 含有する３、　Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠：）Ｃ’エニー成単位（ＣＦ　Ｕ）は８０°Ｃ １ｏ分の加熱により完全に無くｔっだ。５３℃で１８時間生育して３７℃で１８ 時間さらにインキュベートした培養菌からの殺菌した胞子懸濁液は、メタノール 塩培地（Ｍ　Ｖ　）上に置いたとき７．３７Ｘ１０’ＣＦＵを含有した。同じ懸 濁液は、８００Ｃて１０分加熱後、３．５ｘ１０’ＣＦＵを含有した。

ジピコリン酸ニジピコリン酸は増殖性細菌には存在しないが内生胞子中に大量に 存在する化合物である。ＭＶ培地に３７°Ｃで生育したメチロフィルス・メチロ トロフスの培養菌とＭＶで５０℃で次いで３７℃に変えて生育したＭＧＡ３株の 培養菌を、それぞれ７０哩（湿ａ重りの細胞プレートの源とした。各細胞プレー トを抽出してジピコリン酸を分析した。メチロフィルス・メチロトロフスの細胞 は検出可能なジピコリン酸を含有しなかったが、ＭＧＡ３の細胞は０．１８９＋ ｙのジピコリン酸を含有した。

生育：ＭＧＡ３株は、Ｊ培地、バチルスの特殊の培養基を必要とする（ｆａｓｔ ｉｄｉｏｕｓ）種を生育するのに用いた天然培地「グレガーセン、ニール、ジェ イ、アプル、マイクロハイロル　バイオチクノル、５：１２３−１２３（１９７ ８）、これを引用して明細書記載の一部とする］によく生育し、普通ブロス又は 普通寒天にほとんど生育しなかった。微生物はメタノールまたはマンニトールを 含むＭＵ培地中で急速に発育する。この培地中に存在するビタミンのうち、ビタ ミンＢｉｔだけが発育を刺激し、ビタミンＢ１．とビオチンの両方が発育に必須 である。培地が炭素およびエネルギー源としてグルコースを含むときは、ＭＧＡ ３株の発育は遅い。マルトース、リボース、アセタート、グルコナートおよびア ルファーケトグルタラードはほとんど利用されず、ガラクトースによる発育はわ ずかであるか、またははっきりしない。ラクトース、スクロース、キシロース、 ホーラード、スクシナート、グリセロール、エタノール、ｎ−プロパツール、ｎ −ブタノール、ホルムアルテヒド、メチルアミン、ジエチルアミン、またはトリ メチルアミンは利用されない。

ＭはＡＰｉ高速高速Ｃステストわれた４９種の基質（リホース、Ｄ　−クルコー ス、マンニトール、マルトース、Ｄ−タガトース、Ｄ−アラビトール、および５ −ケト−グルコナート）のうち７種だけから生産される。気体はつぎに記載の基 質からは発生しない：グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ− アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、ベーターメチ ル−キシロシド、ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ソル ボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、ソルビトール、アルファー メチル−Ｄ−マンノシド、アルファーメチル−Ｄ−グルコナート、Ｎ−アセチル −グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオ ース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、トレハロース、インスリン、 メレントース、Ｄ−ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、β −ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−フコース、Ｌ−フ コース、Ｄ−アラビトール、グルコナート、または２−ケト−グルコナート。

ＭＧＡ３株は１％ＮａＣ］を含むＪｖブロスては発育するが、５％ＮａＣｌを含 むブロスで発育しない。

メタノール上での発育：ＭＶ培地中での８種のビタミン成分のうち、ビタミンＢ ｌ、とビオチンだけがメタノール上ｙｔｃＡｊ株の発育に必要である。もしビタ ミンＢ　ＩｆがＭＶ培地がら除がれた場合は、ＭＧＡ３株の発育はおこらない。

硝酸塩も窒素源として利用されない。

メタノール中でＭＧＡ３株の発育はｐＨ７，０−７，５において最適である。ｐ Ｈ５，５では発育しない。最適発育温度そ５０”Ｃがら５３°Ｃの間であること が判明した。微生物はＭＹ培地中３０℃と６１℃にて発育した。２５℃および６ ５℃では発育しなかった。

第１表　ＭＶ培地中バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ＭＧ　Ａ　３株の発育速度 に対する温度の影響 ５０　　　　　　　　　　　　０．５１５３　　　　　　　　　　　　　０．４ ３ＭＧＡ３株の世代時間は５０℃にてＭＶ培地中１．４時間である。メタノール 上での発育は酵母抽出液のような複合栄養混合物をわずか添加することにより刺 激される。世代時間はこれらの培地中ではおよそ１時間減少する。

生化学的特徴 ＭＧＡ３のメタノール増殖培養物から調製した粗細胞抽出物はヒドロキシビルハ ートレダクターゼ活性を欠いているが多量のへキスｏ−ｘ−ｅ−、ｔスフアート シンターゼ活性を有している。ヘキスロース−６−ホスフアートシンターゼの特 異的活性は使用した蛋白のｍｇ・９当たりホルムアルデヒド６．２７−３．７２ μｍである。

ＭＧＡ３株はカタラーゼまたはチロシン分解酵素を産生じない。デンプン、ゼラ チンおよびペクチンは加水分解しないが、発育はカゼイン含有平板上で阻害され る。ＡＰＩ高速高速ステストトクロームオキシダーゼ、ウレアーゼおよびアセト インの存在を示している。

β−ガラクトシダーセ、リジン　デカルボキシターセ、オルニチンデカルボキシ ダーゼ、シトラード利用性、フェニルアラニン脱アミノ化、インドールに対する 高速Ｅテストは陰性であった。硝酸塩は亜硝酸塩に還元されなかった。

炭素およびエネルギー源としてメタノールまたはマンニトールによる発育細胞懸 濁液によるメタノール酸化を５０°Ｃおよび３７℃で測定した。炭素およびエネ ルギー源としてメタノールにより発育した細胞は３７℃にて、５．８Ｘ１０−’ ミリモルｍｉｎ−Ｉ−ｍｇ−１の速度でメタノール酸化する。炭素およびエネル ギー源としてマンニトールにより発育した細胞は５０℃にて、６．５Ｘ１０−５ ミリモルｍｉｎ−ｍｇ”の速度でメタノールを酸化する。

抗生物質感受性：ＭＧＡ３株はすべての被験抗生物質に対して感受性を示した。

ＤＮＡ塩基組成：ＭＧＡ３株から分離されたＤＮＡはＧ＋Ｃで塩基含有４４モル パーセントを示す。

Ａ、栄養要求変異株の生産 アミノ酸栄養要求およびリジン産生株を２種の環境分離物、バチルスＭＧＡ３お よびＮ０Ａ２から誘導した。バチルスＭＧＡ３は上記実施例１と同様にして、連 続培養物から分離した。Ｎ０Ａ２は、同様の方法ではあるが、ＭＶ培地、メタノ ール２　（Ｖ／Ｖ）を含む３７℃のパンチ培養を採用し、殺菌した湿地黒泥土（ ｂｏｇ　ｍｕｃｋ）に接種した。Ｎ０Ａ２は実施例１に記載と同様のＭＧＡ３０ 種関連特性を示した。通常、アミノ酸栄養要求およびアナログ耐性変異株の両方 を誘発する標準突然変異誘発はエチルメタンスルホナー）　（ＥＭＳ）またはＮ −メチル−Ｎ−二トローＮ′−二トロソグアニン（ＮＴＧ）による処理をした。

突然変異処理細胞はカザミノ酸（ＣＡＡ　０１２％）を添加したＭＶ培地中で遅 い対数期（ＯＤ２．５）まで増殖した。培地（２，５ｍ１）は同量の新鮮培地と 一緒にし、下記の量の化学的突然変異誘発物質を添加した：ｍ１当たり　　　　 　分　　　　　　　　　℃ＮＴＧ　　　５０μｇ　　　　　　　１０−１５　　 　　’　　５０ＥＭＳ　　　　１０−２０μ］　　　　２０−２５　　　　　３ ７ついて希釈し、カザミノ酸（０，２−０，４％）、被験アミノ酸（６０ｍｇ／ ］）のいずわがまたは両方を含む培地中て成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）させる。

６時間増殖後、この培地を３部の炭素無含有培地で希釈し、３７℃にて１８時間 インキュベートする。胞子を遠心分離し、二度洗浄し、胞子セ濁液を４°Ｃにて 保存する。胞子懸濁液の適当な希釈液をアミノ酸含有寒天上で平板培養し、５０ °Ｃにて３６時間インキュベートする。コロニーはアミノ酸含有培地、最小培地 にレプリカ培養し、−夜５０°Ｃにてインキュベートする。１個またはそれ以上 の発育用アミノ酸を要求すると見られるコロニーを個々のアミノ酸およびアミノ 酸の混合物の成長につき検討し、特異的アミノ酸要求を決定する。リジン、トリ プトファン、フェニルアラニンおよび他のアミノ酸の産生に重要な突然変異株を 産生ずる突然変異誘発処理は下記の表に概括する。

栄養要求株の生産： 尖体　　　見付　　　透茜週　　虻　　　新変異株Ｇｒ　　　　　０７／２２／ ８８　　ＮＴＧ　　　５０　　１０　７／３０−１３０−１５（ｈｓｅ−）　　 １２１０８／８７　　ＥＭｓ　　　１０　　１５　５１２（ｈｓｅ−）ＡＴＣＣ Ｎｏ、５３９０８：：５５　　０７／２２／８８　　ＮＴＧ　　　５０　　１０ 　１０／１２−］１（ｌｅｕ−）１０／１２−２４（ｔｙｒ−） １０／１２−２４（ｔｒｙ−） １１１０１／８８　　Ｎ　Ｔ　Ｇ　　　５０　　１０　１１／２５−１（ｔｙｒ −ｐｈｅ−）１２／９−１（ｔｙｒ−ｐｈｅ−） １１／２６−１（ｔｙｒ−ｐｈｅ−） ＮＯＡ２　０８／１１／８８　　ＮＴＧ　　　５０　　１０　　ｇ／１４−４（ ｈｓｅ−）８／１６−５（ｈｓｅ−） ９／３ｌ−４（ｐｈｅ−） ９／３ｌ−４（＋）ｈｅ−） １．１１０１／８８　　Ｎ　Ｔ　Ｇ　　　５０　　１０　１１／１Ｏ−１２（ｐ ｈｅ−ｔｙｒ−）＊：ＮＴＧ　μｇ／ｍｌ　；　ＥＭＳ　　μｌ／ｍｌＢ、栄養 要求の立証 各栄養要求単離物のアミノ酸要求はＭＶブロス培地に添加したアミノ酸に対する その発育応答により立証した。

実施例３−アナログ耐性 リシンアナログ　５−２−アミノエチル−１−ンステイン（ＡＥＣ）をＭＧＡ３ およびＮ０Ａ２の栄養要求および不栄養要求株のうちからリジン過剰生産変異株 の効果的な選択に使用した。ＡＥＣ２ｇ／］の量に抵抗性を示す変異株は、ＡＥ Ｃおよびメチオニン、スレオニン、およびイソロイシン（２５０−５００ｍｇ／ ｌ）を含むＭＶ培地に突然変異誘発株を平板培養する段階的方法（５段階で２ｇ ／］のＡＥＣ抵抗性になるように；およそ０．２５ｇ／Ｉの発育数）で生産した 。各段階において、培地は５０°Ｃにて３日間インキュベートした。得られた耐 性単離物を所定の耐性濃度に達するか、さらに突然変異誘発を要求するまでの高 濃度のＡＥＣを含有する培地上で処理する。ＡＥＣの耐性増大とリジン産生増加 は高い相関関係を有する。、原始栄養株Ｍ　Ｇ　Ａ　３　　＃　５５を上記の方 法で選択したが、抵抗性はＡＥＣ２ｇ／ｌであり、リシン０．１２ｇ／ｌを産生 じた。リジン生産量はリジン経路に無関係の栄養要求マーカーの導入により改善 され、例えば、１．１／２５−１　　（ｔ　ｒｙ−ｐｈｅ→および１２／９−１ 　　（ｔ　ｙ　ｒ−ａ　］　ａつは各々リジンを０．　６および０．８ｇ／ｌ生 産した。８／　１４−４　（ｈ　ｓ　ｅ−）のようなホモセリン無含有突然変異 株は、高ＡＥＣ耐性でなくても、はぼ同量のリジンを生産した。しかし、ＡＥＣ のより高濃度（６００−１５００ｍｇ／］）に対して抵抗性を有する変異株を選 択することにより、生産量をおよそ２倍にすることができる。

実施例４−リジン過剰生産 リジンはバイオケミカル・ジャーナル第６７巻筒４１６−４２３頁（１９５７年 ）に記載の操作−引用してこの明細書の記載とする−により培養土清液に、酸性 ニンヒドリン測定方法を用いて測定した。ニンヒドリン試薬は氷酢酸６４ｍ１． ０．６Ｍ燐酸１６ｍ１およびニンヒドリン（シグマ＃Ｎ　　４８７６　）　　１ 　ｇを混合して調製した。培養試料をエビンドルフ遠心分離機の高速度回転で２ 分間遠心分離した。培養土清液（，０５ｍ１）をニンヒドリン試薬（５５３ｍ１ ）と５ｍｌのね１：ふた式パイレンクス管中にて混合した。リジンの標準溶液を 同様に処理した。管を１００°Ｃの水浴中で１時間加熱し、氷酢酸（１，４ｍ１ ）を冷却した管に添加した。吸光度を４４０ｎｍにて、回帰分析によりリジン濃 度をコンピューター化するベックマンＤＵ−７０分光光度計で読み取った。測定 結果は日ごとに高い直線性および再現性を示した。別法として、アミノ酸を〇− フタルアルデヒド（ＯＰＡ）によるプレーカラム誘導体を用いるＨＰＬＣおよび ０ＰＡ−アミノ酸誘導体の蛍光度測定により測定した。培養土清液はメタノール で５０−５００倍に希釈し、ついで、高速にて２−５分間遠心分離し、沈澱した 蛋白を除去した。試料（２５μＬ）を０−フタルアルデヒド（ピアス＃２６０１ ５）（５０μＭＬ）と混合し、５Ｈ粒径Ｃ−１８逆相カラム（アルチク＃２８０ ６６）上に注入した。ＯＰＡアミノ酸分離は流速１ｍＬ／分および５０ｍＭ燐酸 カリウム（ｐＨ６，８）中非直線勾配置０−５０％アセトニトリルを用いて行っ た。

［振とうフラスコスクリーニング法］ 存在し得るリジンプロデューサーをスクリーニングするため、ＭＧＡ３またはＮ ０Ａ２変異体を１０ｇ／リットルに、ＨＰｏ、、３２ｇ／リットル（ＮＨ，）、 Ｓｏ、、１０ｇ／リットルＣａ　Ｃｏ、、０゜２ｇ／リットルＭ　ｇ　Ｃ（ｈ・ ６Ｈ，０，２０ｇ／リットルメタノール、後記濃度の微量金属、ビタミン類（ビ オチン５０μｇ／リットルおよびＢ＋ｔｌＯμｇ／リットル）および成長に必要 なアミノ酸類２００ｍｇ／リットルを含む培地で成長させた。株を、バッフルを 備え、メタノール蒸発防止用のミルクフィルターディスクと２ミルのテフロン膜 で覆った２５０ｍＩ２の振とうフラスコ中、上記培地２５ｍ１２中で培養した。

培養は１−４％の接種物で開始し、空気振とう器中、回転速度３００ｒｐｍ、５ ０℃で成長させた。メタノール濃度は１２時間毎に試料をとり出し、細胞を遠心 して分離し、上清をガスクロマトグラフに注入して測定した。濃度が２００ｍＭ 未満になるとメタノールをフラスコに加えた。実験は通常２４−４８時間行なっ た。リジンの生成はニンヒドリンまたはＨＰＬＣて測定した。数種の変異体をス クリーニングした結果を第２表に示す。これらの結果は、メタノールを供給しな がら５す・ノトルの撹拌タンク反応器で行なったリジン生産とよい相関性を示し た。

第２表 株　　　　振とうフラスコ　　反応器 リジン（ｇ／ｆｆ）　　　　リジン（ｇ／１２）ＮＯＡ２８／１４−４　　　　 　０．９６　　　　２．２ＮＯＡ２　Ｒ２０，６００，５Ｏ ＮＯ＾２８／１６−５　Ｎｏ、　ｌ　　　２．６　　　　　ＮＤ’Ｎ０Ａ２８／ １６−５ＮＯ，３２，８４，５Ｇｒ　７／３０−１５　Ｉｔｓ、　ｌ　　　４． １　　　　　４．０Ｇｒ　７／３０−１５　Ｎｏ、　２　　７．０　　　　　７ ．　ＯＭＧＡ：（１１／２５−Ｉ　　　　　Ｑ、　５８　　　　ＮＤＭＧＡ３１ ２／９−１　　　　　０．１１　　　　０．８ＮＯＡ２　ｇ／１６−５　　　　 　７．８　　　　８．０：撹拌反応器中でのリジン産生； 硫酸またはりん酸制限最低塩培地を用いてこの発明の適当な変異株を通気撹拌反 応器中で培養してリジンを過剰産生させた。硫酸制限を使用する場合、塩化アン モニウムが硫酸アンモニウムを置換し、微量金属はすべて塩化物として用いた。

成長に必要な硫酸塩は硫酸カリウムとして供給した。リジンプロデューサーの成 長に必要なアミノ酸は、純アミノ酸またはアミノ酸加水分解物を供給することに より目的とする細胞密度に達するに必要な濃度で供給した。細胞は、下記濃度範 囲の栄養物を用いて０．５−１最大値の成長率で培養することができる。硫酸ア ンモニウム２０−５００　ｍＭ、　Ｗ酸塩０．１−５００ｍＭ、メタ／−ル２０ −８００ｍＭ、りん酸塩１０−１２５ｍＭ、マグネシウム０．５−２０　ｍＭ、 　７ンガン２−１００μＭ、鉄１０−８００μＭ、カルシウム０．１−１．５ｍ Ｍ、塩素イオ７０−８０ｍＭ、亜鉛１−２０ｔｔλ１１コバルト０．１−２０ａ Ｍ１銅０１−２０μＭ１モリブテン酸０．２２−４０Ｊｔ、はう酸０．４−８μ Ｍ、ビタミ７Ｂ＋２０．３ｇｇ　−ｃ−’　−１ｒｒ＋ｇ　−４−１およびビオ チン２０μｇ−ρ−’　　２０　ｍ　ｇ　−１２−’ａ　ａ応益のｐＨは、水酸 化アンモニウムを添加して７１に維持した。溶解酸素濃度は、撹拌速度もしくは 通気速度の調節、または純酸素の添加により１０％レベルに維持した。発泡は、 ノリコンベース消泡剤（ＳＡＧ−４７１）の自動添加により制御した。メタノー ル濃度は、ガスクロマトグラフィーで監視し、反応器にメタノールを周期的に加 えて５０−６００ｍＭに維持した。リジン産生はおおむね非成長随伴的であり、 スレオニンがリジン産生阻害を示した。産生リジン量は、りん酸または硫酸制限 を用いたときにほぼ同一であった。Ｇｒ７／３Ｏ−１５Ｎｏ、１生物を反応型中 硫酸制限で培養すると、４０時間培養で合計４．０ｇ−ρ−゛″細胞乾燥重量が リジン７．０ｇ−Ｑ−’を産生じた。

実施例５［１種より多いアミノ酸の同時過剰産生］実施例４記載の培地を用いて 適当な変異体をりん酸または硫酸制限条件で培養することにより、２種のアミノ 酸の同時過剰産生をもたらすことができる。実施例４記載の反応器法を用いて、 変異体Ｎ０Ａ２・８／１６　　ｐＮｏ、３がリジンとアスパラキン酸両者を同時 産生した。培養４０時間後、反応器中に３．５ｇ−１２−’乾燥細胞重量、４． ５ｇ−Ｑ−’す／ンおよび２ｇ−Ｑ−’アスパラギン酸が含まれていた。

実施例６［高細胞密度に至る成長の達成法コＭＧＡ３の高細胞密度に至る成長は 、下記培地栄養供給システムを用いて達成した。培地には、３．０９ｇ’Ｉ２− ’に、ＨＰＯ，，０，９ｇ−１２−’ＮａＨ，ＰＯ，，２ｇ−（−’　（ＮＨ４ ）２ＳＯ４，２０ｍｇ−Ｑ−’ビオチン、０．２　ｇ　−（１−’Ｍｇ　ＣＱｔ 　・６Ｈｚ０．　１　ｍｇ　−（１−’　ヒ９　ミンＢＩ！、３．９８ｍｇ−ｆ ２”ＦｅＣｆ２ｔ・４Ｈｔ０，７．３６ｍｇ　−Ｑ−’ＣａＣ（ｌｘ・２Ｈｖ○ 、９．９ｍｇ−（１−’ＭｎＣＱｘ・４Ｈ！○、１３６μｇ／リットル１ｎｃＱ ｔ、５４．４　ｕ　ｇ／リットルｃ　ｕ　ＣＱｔ　・２Ｈ２０，８０４μｇ−（ −ＩＣＯＣρｔ’２Ｈｔｏ、９６．８μｇ’（！−’Ｎａ２Ｍ。

Ｏ４・２Ｈ２０，５９，６μｇ−Ｑ−’ＨｓＢｏ３．３２ｇ−１２弓メタノール および２５０ｍｇ−（１−’酵母抽出物が含有されていた。栄養素の濃度は、実 施例４に記載したのと同様に変化し得る。細胞培養は、作業容量１１す７トルて １４リットル発酵器中５０°Ｃで行なった。

撹拌速度は９００−１５００ｒｐｍとした。ｐＨは、８Ｎ水酸化アンモニウムの 添加により７．１に維持した。水酸化アンモニウムは窒素源の役もした。りん酸 、マグネシウムおよびカルシウムレベルは、１０・１：０，１りん酸：マグネシ ウム：カルシウム液（ＩＭＫＨ，ＰＯ２、ＯＩＭＭｇＣＩ２ｔ・６Ｈｔ○、０． 　ＯＩ　ＭＣａ　Ｃ（！！　・２Ｈ２０）の自動供給により維持した。りん酸／ マグネシウム／カルシウムミックスの供給は、ｐＨ調節器にポンプをつないで、 ｐＨ調節のため水酸化アンモニウムを添加するとき常にりん酸／マグネシウム／ カルシウムミックスか供給されるようにして行なった。水酸化アンモニウム（８ Ｎ）対りん酸・マグネシウム・カルシウム供給物（ＩＭりん酸、０．１Ｍマグネ ンウム、０．０１カルシウム）の比率は１・２になるように調節した。これは窒 素、りん酸、マグネシウム、カルシウムのバランスを適当に維持した。通気速度 は００５−２ｖｖとした。溶解酸素濃度は電位プローブで監視し、溶解酸素レベ ルを純酸素強化通気により３０％に維持した。使用した純酸素ｌｌは溶解酸素プ ローブに結合したマスフローコントローラーニヨり監視制御した。発泡は、シリ コンベース消泡剤（ＳＡＧ−４７１）の自動添加により液面コントローラーを用 いて制御した。廃ガス（２Ｍ化炭素、酸素、窒素、アルゴン、メタノール、アン モニア、水）は、マススペクトルで監視した。メタノールレベルは、ツアオ、オ ースチン、「オンラインメタノールセンサーを用いるメタノール濃度制御」、ア メリカン・ケミカル・ソサイアティ・ナショナル・ミーティング、トロント、オ ンタリオ、カナダ（］、９９８８６６月記載のシリコンチュービングプローブを ガスクロマトグラフのフレームイオン検出器に連結してなるオンラインメタノー ルセンサーで連続的に監視した。カスクロマトグラフからの信号を比率制御器を 用いてメタ／−ル供給ポンプ（ワタソン・マーロー）の自動操作に用いた。培養 物へのメタノール供給量はロードセルを用いて監視した。メタノールには下記濃 度の所要微量金属を含ませた。１．０９ｇ　”２−’Ｆｅ５０．−７ＨｔＯ，０ ，３９ｇ　”Ｑ−’ＭｎＣＱｔ−４ＨｔＯ１２２ｍｇ−５−’Ｚｎ５Ｏ，−７Ｈ ，Ｏ５１９ｍｇ−１２−’ＣｏＣＬ・６Ｈ，０１１９ｍｇ−ｆｆ−’Ｎａ、Ｍｏ ０ａ・２Ｈ，０，１９ｍｇ　−（１−’ＣｕＳ０６・５　Ｈ、Ｏ，この培地と上 記供給ストラテジーにより、生物は５０　ｇ−、Ｑ−’細胞乾燥重量（第６図） まで成長し得た。

ＦＩＧ、　　１ ＦＩＧ、　　２ ＦＩＧ、　　３ 時間（時間） ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 ｌ−１１、ａｓｓ、＋ｎ＊ｗ＊ｐ（７，’ＵＳ　９０１０１９０８２国際調査報 告 ｕｓ　９００１９０１ｉ＋ ＳＡ　　３６２７８

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．有効量の窒素源、ビタミンＢ１２，ピオチン及び炭素源と少なくとも一つの アミノ酸又はアミノ酸混合物を生成するためのエネルギー源としてメタノールを 含む水性普通培地中、５０℃で持続した成育を示す、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）属のタイプＩＣ１資化性細菌の生物学的に純粋な株のアミノ酸自家栄養株を 培養することを含む、アミノ酸の製造法。
2. ２．該細菌、アミノ酸及び培地成分を含む水性培養液をさらに乾燥してアミノ酸 含有生成物を得る、請求項１の方法。
3. ３．該乾燥生成物を動物飼料又は動物飼料添加物用に用いる、請求項２の方法。
4. ４．該培養物から該アミノ酸をさらに分離することを含む、請求項１の方法。
5. ５．該自家栄養株が生物学的に純粋なＭＧＡ３株及びその形態学的変異菌の変異 株である、請求項１の方法。
6. ６．該水性普通培地が有効量のリン酸源、硫酸源及び微量成分を含む、請求項１ の方法。
7. ７．該水性普通培地が有効量のリン酸源、硫酸源、カルシウム源及び微量成分を 含む、請求項１の方法。
8. ８．該自家栄養株が少なくとも３ｇ／ｌのアミノ酸を生成する、請求項１の方法 。
9. ９．該自家栄養株が約５から約１５０ｇ／ｌのアミノ酸を生成する、請求項１の 方法。
10. １０．該アミノ酸自家栄養株がさらにアミノ酸類似体耐性である、請求項１の方 法。
11. １１．該自家栄養株が相当量のリジン、トリプトファン又はフェニルアラニン或 いはこれらの混合物を分泌する、請求項１の方法。
12. １２．該生物学的に純粋な株が８ｇ／ｌまでのＬ−リジンを分泌する、請求項１ の方法。
13. １３．該生物学的に純粋な株バチルスの乾燥重量５０グラム細胞までの生育を示 す、請求項１の方法。
14. １４．該株が約２０−５０ｇ／ｌの細胞密度まで生育する、請求項９の方法。
15. １５．該培地が少なくとも５０ｍＭメタノールを含む、請求項１の方法。
16. １６．該窒素源が硫酸アンモニウムである、請求項１の方法。
17. １７．該自家栄養株が同時にリジンとアスパラギン酸を生成する、請求項１の方 法。
18. １８．該自家栄養株が約４．５ｇ／ｌまでのＬ−リジンと約２７ｇ／ｌまでのＬ −アスパラギン酸を生成する、請求項１７の方法。
19. １９．メタノールと微量成分を、バッチ培養で生育している自家栄養株に要求さ れるアミノ酸と共に自動的に供給する、請求項７の方法。
20. ２０．該微量成分を該メタノールと連続的に供給する、請求項７の方方法。
21. ２１．マグネシウム及びカルシウムリン酸塩の該培地への添加がｐＨ調整と結び 付く、請求項７の方法。
22. ２２．メタノール、微量成分及びアミノ酸を半連続工程中、成育している自家栄 養株に連続的に供給する、請求項７の方法。
23. ２３．メタノール、微量成分及びアミノ酸を連続工程中、成育している自家栄養 株に連続的に供給する、請求項７の方法。
24. ２４．水酸化アンモニウム及び微量物質の連続的供給の結果、５０グラム／リッ トルの乾燥細胞量となる、請求項１の方法。
25. ２５．株が炭素源及びエネルギー源としてのメタノール、ビタミンＢ１２及びビ オチンを含む普通培地中５０℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイプＩＣ １資化性細菌の生物学的に純粋な株。
26. ２６．該株が、変異誘発でアミノ酸自家栄養株を容易に生成するＭＧＡ３及びそ の形態学的変異歯並びにアミノ酸類似体耐性変異株である、請求項２５の生物学 的に純粋な株。
27. ２７．該株が、窒素源を含む培地で生育したとき、相当量の少なくとも一つのア ミノ酸を分泌する、請求項２６の生物学的に純粋な株。
28. ２８．該窒素源が水酸化アンモニウムである、請求項２７の生物学的に純粋な株 。
29. ２９．該培地が少なくとも０．１ｇ／ｌのビタミンＢ１２を含む、請求項２５の 生物学的に純粋な株。
30. ３０．該細菌が該培地中、約５０グラム乾燥重重／ｌまでの細胞密度に生育する 、請求項２５の生物学的に純粋な株。
31. ３１．該株が６０℃で成育を示す、請求項２５の生物学的に純粋な株。
32. ３２．該株が、約４５℃から約５５℃の温度で、約０．２ｈｒ−１から約１．５ ｈｒ−１の速度のメタノールで生育可能である、請求項２５の生物学的に純粋な 株。
33. ３３．該株がＳ−アミノエチル−Ｌ−システインによる生育阻害に対し耐性でリ ジンを分泌する、請求項２５の生物学的に純粋な株。
34. ３４．該株がさらに可能性ＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼを生成す る、請求項２５の生物学的に純粋な株。
35. ３５．該株がホモセリン自家栄養株である、請求項２５の生物学的に純粋な株。
36. ３６．該株がトリプトファンアミノ酸類似体耐性の、ホモセリン、チロシン、フ ェニルアラニン自家栄養株である、請求項２５の生物学的に純粋な株。
37. ３７．バチルス属のタイプＩＣ１資化性細菌の突然変異原付与自家栄養株を、窒 素源、ビタミンＢ１２、ビオチン及び炭素源とエネルギー源としてのメタノール 並びに必要なアミノ酸を含有する水性普通培地中、５０℃で培養しリジンを生成 することを含む、リジンの製造法。
38. ３８．該自家栄養株がＳ−２−アミノエチルシステイン耐性のホモセリン自家栄 養株である、請求項３７の方法。
39. ３９．該培養細胞が少なくとも約３ｇ／ｌのＬ−リジンを生成する、請求項３７ の方法。
40. ４０．（ａ）炭素源とエネルギー源としてのメタノール、ビタミンＢ１２及びビ オチンを含む水性普通培地中、５０℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイ プＩＣ１資化性細菌の生物学的に純粋な株を分離すること、及び （ｂ）該分離細菌をかなりの量の、アミノ酸生成変異株を生成するのに有効な変 異誘発剤で処理すること を含む、バチルス属のタイプＩＣ１資化性細菌の生物学的に純粋な株のアミノ酸 生成変異株の分離方法。
41. ４１．さらに、ビタミンＢ１２及び少なくとも一つの必要なアミノ酸を含む培地 での成育によりアミノ酸生成変異株を選別することを含む、請求項４０の方法。
42. ４２．該細菌が化学的変異誘発に付される、請求項４０の方法。
43. ４３．該変異株が該細菌のアミノ酸自家栄養株である、請求項４０の方法。
44. ４４．該変異誘発剤がメタンスルホン酸エチル又はＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ −ニトロソグアニンである、請求項４０の方法。
45. ４５．段階（ｂ）の該自家栄養株をアミノ酸類似体で攻撃してアミノ酸生成を増 加させる次の段階を含む、請求項４０の方法。
46. ４６．該アミノ酸類似体がＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システインである、請求 項４０の方法。
47. ４７．生成された該アミノ酸がりジンである、請求項４０の方法。
48. ４８．該変異株がアミノ酸類似体耐性である、請求項４０の方法。
49. ４９．該細菌により生成された該アミノ酸がりジンである、請求項３９の方法。
50. ５０．（ａ）炭素源とエネルギー源としてのメタノール、ビタミンＢ１２及びビ オチンを含む水性普通培地中、５０℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイ プＩＣ１資化性細菌の生物学的に純粋な株を分離すること、及び （ｂ）該分離細菌をかなりの量の、該細菌のアミノ酸自家栄養株を生成するのに 有効な変異誘発剤で処理すること、（ｃ）少なくとも一つの必要なアミノ酸を含 んでいる最少ビタミン培地での成育に関し、該処理された細菌の分離物を試験す ることを含む、バチルス属のタイプＩＣ１資化性細菌の生物学的に純粋な株のア ミノ酸生成変異株の分離方法。