JP3129773B2 - D−リボースの製造法 - Google Patents
D−リボースの製造法Info
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- JP3129773B2 JP3129773B2 JP18720891A JP18720891A JP3129773B2 JP 3129773 B2 JP3129773 B2 JP 3129773B2 JP 18720891 A JP18720891 A JP 18720891A JP 18720891 A JP18720891 A JP 18720891A JP 3129773 B2 JP3129773 B2 JP 3129773B2
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Description
【0001】本発明は、発酵によってD−グルコースか
らD−リボースを産生する方法に関する。
らD−リボースを産生する方法に関する。
【0002】D−リボースは、ビタミンB2 産生に関し
て極めて重要な物質であり、従ってD−リボース産生の
ためのより安価で、より効率的な工業的方法の開発が強
く望まれている。
て極めて重要な物質であり、従ってD−リボース産生の
ためのより安価で、より効率的な工業的方法の開発が強
く望まれている。
【0003】D−リボースの産生のための多くの発酵法
が知られている。しかし、既知の発酵法は、収率の点で
D−リボース産生のための工業的方法として十分満足し
うるものではない。
が知られている。しかし、既知の発酵法は、収率の点で
D−リボース産生のための工業的方法として十分満足し
うるものではない。
【0004】本発明によればより高い収率でD−リボー
スを産生することが可能である。本発明の発明者らは、
トランスケトラーゼを欠損し、高いD−リボース耐性お
よび高いD−グルコノキナーゼ活性を有するバチルス属
のバクテリアの変異株が著しく高いD−リボース蓄積能
を有することを発見した。本発明は、この発見に基いて
完成されたものである。
スを産生することが可能である。本発明の発明者らは、
トランスケトラーゼを欠損し、高いD−リボース耐性お
よび高いD−グルコノキナーゼ活性を有するバチルス属
のバクテリアの変異株が著しく高いD−リボース蓄積能
を有することを発見した。本発明は、この発見に基いて
完成されたものである。
【0005】本発明は、トランスケトラーゼを欠損し、
高いD−リボース耐性および高いD−グルコノキナーゼ
活性を有し、D−グルコースからD−リボースを産生す
る能力を有するバチルス属に属する微生物をD−グルコ
ースの存在下にて培地中で培養し、得られたD−リボー
スを培養液から回収することを特徴とするD−リボース
の製造法に関するものである。
高いD−リボース耐性および高いD−グルコノキナーゼ
活性を有し、D−グルコースからD−リボースを産生す
る能力を有するバチルス属に属する微生物をD−グルコ
ースの存在下にて培地中で培養し、得られたD−リボー
スを培養液から回収することを特徴とするD−リボース
の製造法に関するものである。
【0006】本明細書において、トランスケトラーゼの
欠損は、Journal of Biological
Chemistry 223, 1009(195
6)、Archives of Biochemist
ry and Biophysics 74巻、306
ページ(1958)及び同74巻、315ページ(19
58)、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形(NADH)の酸化量を340nmに
おいて分光光度計(コントロンK.K.)で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法(実施例4参
照)で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が0.01単位/mg−タンパクを越えないという
ことを意味する。
欠損は、Journal of Biological
Chemistry 223, 1009(195
6)、Archives of Biochemist
ry and Biophysics 74巻、306
ページ(1958)及び同74巻、315ページ(19
58)、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形(NADH)の酸化量を340nmに
おいて分光光度計(コントロンK.K.)で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法(実施例4参
照)で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が0.01単位/mg−タンパクを越えないという
ことを意味する。
【0007】<トランスケトラーゼ活性の分析方法> 1. 反応液A(0.555ml): D−リボース−5−フォスフェート20μモル、NAD
H 0.375μモル、D−リボース−5−ホスフェー
トケトール−イソメラーゼ及びD−リブロース−5−ホ
スフェート−3−エピメラーゼを各々0.5単位、アル
ファーグリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ(酵素コード
1.1.1.8.)0.33単位、十分なトリオースホ
スフェートイソメラーゼ(酵素コード5.3.1.
1.)(Sigma Chemical Co.,Lt
d.)及びトリス−塩酸緩衝液60μモル(pH7.
5)。
H 0.375μモル、D−リボース−5−ホスフェー
トケトール−イソメラーゼ及びD−リブロース−5−ホ
スフェート−3−エピメラーゼを各々0.5単位、アル
ファーグリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ(酵素コード
1.1.1.8.)0.33単位、十分なトリオースホ
スフェートイソメラーゼ(酵素コード5.3.1.
1.)(Sigma Chemical Co.,Lt
d.)及びトリス−塩酸緩衝液60μモル(pH7.
5)。
【0008】2. 反応液B(0.425ml):MgCl
2 10μモル、チアミンピロリン酸0.215μモル
及びトリス塩酸緩衝液(pH7.5)40μモル。
2 10μモル、チアミンピロリン酸0.215μモル
及びトリス塩酸緩衝液(pH7.5)40μモル。
【0009】各反応液を30℃、10分間インキュベー
トし、反応液を混合した(総量は、1ml)。340n
mにおける吸光度の変化を分光光度計モデルUVIKO
N810(コントロンK.K.)で測定し、NADHの
酸化速度が直線になった後、前記の無細胞抽出液20μ
lを反応液に加えた。NADHの酸化速度が直線になっ
た後、340nmにおける吸光度の変化をそのプロット
から計算した。酵素活性の1単位は1分間あたりのNA
DH 1μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義し
た。
トし、反応液を混合した(総量は、1ml)。340n
mにおける吸光度の変化を分光光度計モデルUVIKO
N810(コントロンK.K.)で測定し、NADHの
酸化速度が直線になった後、前記の無細胞抽出液20μ
lを反応液に加えた。NADHの酸化速度が直線になっ
た後、340nmにおける吸光度の変化をそのプロット
から計算した。酵素活性の1単位は1分間あたりのNA
DH 1μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義し
た。
【0010】本明細書において、高いグルコノキナーゼ
活性とは、Biochim.Biophys.Act
a.798, 88−95(1984)に記載されてい
る方法にもとづいた、以下に示す方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸(以後NAD
Pと言う)の酸化型の還元量を測定し、酵素活性が、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は0.01単
位/mg−タンパクより少なくないことを示す。
活性とは、Biochim.Biophys.Act
a.798, 88−95(1984)に記載されてい
る方法にもとづいた、以下に示す方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸(以後NAD
Pと言う)の酸化型の還元量を測定し、酵素活性が、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は0.01単
位/mg−タンパクより少なくないことを示す。
【0011】<グルコノキナーゼ活性の分析方法> 反応混合物(0.5ml)は、トリス−塩酸緩衝液(p
H8.0)100μモル、MgCl2 6.6μモル、
アデノシン 三リン酸3.2μモル、NADP0.4μ
モル、グルコン酸ナトリウム1.0μモル、無細胞抽出
液20μl及び基準6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ
ーゼ(酵素コード1.1.1.44,Sigma Ch
emical Co.,Led.)0.005単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。340n
mにおける吸光度の変化を室温下、分光光度計UVIK
ON モデル810を用いて測定した。酵素活性の1単
位は、1分あたりに、NADP 1μモルの還元を触媒
する酵素の量として定義した。
H8.0)100μモル、MgCl2 6.6μモル、
アデノシン 三リン酸3.2μモル、NADP0.4μ
モル、グルコン酸ナトリウム1.0μモル、無細胞抽出
液20μl及び基準6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ
ーゼ(酵素コード1.1.1.44,Sigma Ch
emical Co.,Led.)0.005単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。340n
mにおける吸光度の変化を室温下、分光光度計UVIK
ON モデル810を用いて測定した。酵素活性の1単
位は、1分あたりに、NADP 1μモルの還元を触媒
する酵素の量として定義した。
【0012】本明細書において、前記無細胞抽出液中で
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Agric・B
iol.Chem.43, 271−278(197
9)に記載の方法に従って測定した。NADPの還元量
は、340nmにおいて分光光度計UVIKON モデ
ル810を用いて測定した。
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Agric・B
iol.Chem.43, 271−278(197
9)に記載の方法に従って測定した。NADPの還元量
は、340nmにおいて分光光度計UVIKON モデ
ル810を用いて測定した。
【0013】 <グルコースデヒドロゲナーゼの分析方法> 分析混合液(0.5ml)は、D−グルコース 50μ
モル、NADP 2μモル、トリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)0.3mモル、MnSO4 5nモルおよび無
細胞抽出液20μlを含む。反応を基質の添加によって
開始させた。酵素活性の1単位は、1分あたりにNAD
P 1μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
モル、NADP 2μモル、トリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)0.3mモル、MnSO4 5nモルおよび無
細胞抽出液20μlを含む。反応を基質の添加によって
開始させた。酵素活性の1単位は、1分あたりにNAD
P 1μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
【0014】本明細書において高いD−リボース耐性
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、3
6.5℃、280rpm.でインキュベートした時、そ
れらはD−リボース70g/l以上の存在下で良好な発
育を示すことを意味する(590nmでの吸光度(O
D)は約5.0より高い)。 D−グルコース 10.0% D−ソルビトール 0.2 D−リボース 7.0 または 9.0 モラテイン(Molatein) 0.07 コーンスティープリカー 0.5 (NH4)2SO4 0.55 (NH4)2HPO4 0.2 KH2PO4 0.01 K2HPO4 0.03 L−フェニルアラニン 0.00025 L−トリプトファン 0.00025 FeSO4・7H2O 0.00032 MnSO4・6H2O 0.00019 CaCO3 4.0
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、3
6.5℃、280rpm.でインキュベートした時、そ
れらはD−リボース70g/l以上の存在下で良好な発
育を示すことを意味する(590nmでの吸光度(O
D)は約5.0より高い)。 D−グルコース 10.0% D−ソルビトール 0.2 D−リボース 7.0 または 9.0 モラテイン(Molatein) 0.07 コーンスティープリカー 0.5 (NH4)2SO4 0.55 (NH4)2HPO4 0.2 KH2PO4 0.01 K2HPO4 0.03 L−フェニルアラニン 0.00025 L−トリプトファン 0.00025 FeSO4・7H2O 0.00032 MnSO4・6H2O 0.00019 CaCO3 4.0
【0015】本発明で用いる微生物は、トランスケトラ
ーゼを欠損し、高いD−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、X−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をN−メチル−
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス(Bacillus brevis)、バチルス
セレウス(Bacillus cereus)、バチル
ス サーキュランス(Bacillus circul
ans)、バチルス コアギュランス(Bacillu
s cougulans)、バチルス リケニホルミス
(Bacillus licheniformis)、
バチルス メガテリウム(Bacillus mega
terium)、バチルス メセントリクス(Baci
llus mesentricus)、バチルス プミ
ルス(Bacillus pumilus)、バチルス
サプチリス(Bacillus subtilis)
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
ーゼを欠損し、高いD−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、X−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をN−メチル−
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス(Bacillus brevis)、バチルス
セレウス(Bacillus cereus)、バチル
ス サーキュランス(Bacillus circul
ans)、バチルス コアギュランス(Bacillu
s cougulans)、バチルス リケニホルミス
(Bacillus licheniformis)、
バチルス メガテリウム(Bacillus mega
terium)、バチルス メセントリクス(Baci
llus mesentricus)、バチルス プミ
ルス(Bacillus pumilus)、バチルス
サプチリス(Bacillus subtilis)
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
【0016】本発明において最も好ましく用いられる変
異株の例としてはバチルス プミルスRC15,RE5
及びRX13などが挙げられる。これらの微生物は各々
以下の寄託番号で日本工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。 バチルス プミルス RC15 FERM-BP No. 2834(1
990年3月29日) バチルス プミルス RE5 FERM-BP No. 2833(1
990年3月29日) バチルス プミルス RX13 FERM-BP No. 2835(1
990年3月29日)
異株の例としてはバチルス プミルスRC15,RE5
及びRX13などが挙げられる。これらの微生物は各々
以下の寄託番号で日本工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。 バチルス プミルス RC15 FERM-BP No. 2834(1
990年3月29日) バチルス プミルス RE5 FERM-BP No. 2833(1
990年3月29日) バチルス プミルス RX13 FERM-BP No. 2835(1
990年3月29日)
【0017】これらの変異株は、高いD−リボース耐性
を有する。例えば、これらの変異株は、70g/l以
上、好ましくは120g/l以上の濃度のD−リボース
を含む培地中で成育しうる能力を有している。
を有する。例えば、これらの変異株は、70g/l以
上、好ましくは120g/l以上の濃度のD−リボース
を含む培地中で成育しうる能力を有している。
【0018】本発明の好ましい実施態様として、D−リ
ボース産生は、D−グルコースを含み適当な栄養物が補
われている水性培地中、好気的条件下、上記微生物を培
養することによって行なわれる。前記培地は、約50g
/lないし300g/l、好ましくは約100g/lな
いし250g/lの濃度のD−グルコースを含むことが
できる。
ボース産生は、D−グルコースを含み適当な栄養物が補
われている水性培地中、好気的条件下、上記微生物を培
養することによって行なわれる。前記培地は、約50g
/lないし300g/l、好ましくは約100g/lな
いし250g/lの濃度のD−グルコースを含むことが
できる。
【0019】培地は、以下の様な栄養物を含むことが通
常必要である;D−グルコース、D−フルクトース、D
−マンノース、D−ソルビトール、D−マンニトール、
ショ糖、糖みつ、澱粉水解物、澱粉、酢酸及びエタノー
ルなどの同化可能な炭素源;ペプトン、酵母抽出物、大
豆粉、コーンスティープリカー、綿実かす、乾燥酵母及
び肉抽出物などの有機物及び硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム及びリ
ン酸カリウムなどの無機物などの消化可能な窒素源;ビ
タミン、金属、アミノ酸及び微量元素。
常必要である;D−グルコース、D−フルクトース、D
−マンノース、D−ソルビトール、D−マンニトール、
ショ糖、糖みつ、澱粉水解物、澱粉、酢酸及びエタノー
ルなどの同化可能な炭素源;ペプトン、酵母抽出物、大
豆粉、コーンスティープリカー、綿実かす、乾燥酵母及
び肉抽出物などの有機物及び硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム及びリ
ン酸カリウムなどの無機物などの消化可能な窒素源;ビ
タミン、金属、アミノ酸及び微量元素。
【0020】培養は、pH約4.0ないし9.0、好まし
くは4.5ないし8.0で行われる。培養時間は、使用
される微生物及び栄養培地によって種々異なるが、好ま
しくは約10ないし100時間である。培養を行なうに
あたっての好ましい温度範囲は約20ないし45℃であ
り、更に好ましくは25ないし40℃である。
くは4.5ないし8.0で行われる。培養時間は、使用
される微生物及び栄養培地によって種々異なるが、好ま
しくは約10ないし100時間である。培養を行なうに
あたっての好ましい温度範囲は約20ないし45℃であ
り、更に好ましくは25ないし40℃である。
【0021】かくして蓄積されたD−リボースは例えば
以下の方法によって容易に回収することができる。すな
わち培養液を最初にろ過又は遠心分離し、それによって
細胞は極めて簡単に除去しうる。次に、ろ液を活性炭及
びイオン交換樹脂で処理することによって脱塩、脱色し
た後、濃縮する。濃縮液にエタノールなどの有機溶媒を
加え、D−リボース結晶が分離される。上記方法であろ
うと他の方法であろうと、D−リボースは容易に回収さ
れうる。
以下の方法によって容易に回収することができる。すな
わち培養液を最初にろ過又は遠心分離し、それによって
細胞は極めて簡単に除去しうる。次に、ろ液を活性炭及
びイオン交換樹脂で処理することによって脱塩、脱色し
た後、濃縮する。濃縮液にエタノールなどの有機溶媒を
加え、D−リボース結晶が分離される。上記方法であろ
うと他の方法であろうと、D−リボースは容易に回収さ
れうる。
【0022】以下の実施例は本発明をさらに説明する一
例であるが本発明は決してこれだけに限定されるもので
はない。
例であるが本発明は決してこれだけに限定されるもので
はない。
【0023】変異株RA8の調製 寒天培地上で生育するバチルス プミルス ATCC
31093の一白金耳を、下記に示す成分の種培養用培
地100mlに接種した。 D−ソルビトール 2% コーンスティープリカー 2% KH2 PO4 0.1% K2 HPO4 0.3% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% (滅菌前 pH6.7)
31093の一白金耳を、下記に示す成分の種培養用培
地100mlに接種した。 D−ソルビトール 2% コーンスティープリカー 2% KH2 PO4 0.1% K2 HPO4 0.3% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% (滅菌前 pH6.7)
【0024】フラスコを30℃で、18時間インキュベ
ートした。細胞を遠心分離で採取し、50mMリン酸緩
衝液(pH8.0)50mlに懸濁した。細胞懸濁液の
一部(3ml)に、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン(MNNG)100μg/ml(最終
濃度)を加え、30℃で30分間、処理した。処理細胞
を遠心分離で採取し、滅菌水で1回洗浄し、種用培地5
mlに再懸濁し、更に30℃で2時間インキュベートし
た。この様にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈
し、下記に示すような寒天培地に塗布した。 D−ソルビトール 0.5% バクト ペプトン(Difco) 1% 酵母抽出物(オリエンタル酵母) 0.2% Nacl 0.2% 寒天 1.5% (pH7.0) プレートを36.5℃で2日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために36.5℃で、24時間インキ
ュベートした。
ートした。細胞を遠心分離で採取し、50mMリン酸緩
衝液(pH8.0)50mlに懸濁した。細胞懸濁液の
一部(3ml)に、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン(MNNG)100μg/ml(最終
濃度)を加え、30℃で30分間、処理した。処理細胞
を遠心分離で採取し、滅菌水で1回洗浄し、種用培地5
mlに再懸濁し、更に30℃で2時間インキュベートし
た。この様にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈
し、下記に示すような寒天培地に塗布した。 D−ソルビトール 0.5% バクト ペプトン(Difco) 1% 酵母抽出物(オリエンタル酵母) 0.2% Nacl 0.2% 寒天 1.5% (pH7.0) プレートを36.5℃で2日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために36.5℃で、24時間インキ
ュベートした。
【0025】このように調製した寒天培養の各々を以下
に示す産生培地5mlに接種するのに用いた。 D−グルコース 14.5% モラティン(乾燥酵母) 0.07% (鐘淵化学) D−ソルビトール 0.2% コーンスティープリカー 0.5% (NH4)2SO4 0.55% (NH4)2HPO4 0.2% KH2PO4 0.01% K2HPO4 0.03% L−フェニルアラニン 0.00025% L−トリプトファン 0.00025% FeSO47H2O 0.00032% MnSO46H2O 0.00019% CaCO3 4%
に示す産生培地5mlに接種するのに用いた。 D−グルコース 14.5% モラティン(乾燥酵母) 0.07% (鐘淵化学) D−ソルビトール 0.2% コーンスティープリカー 0.5% (NH4)2SO4 0.55% (NH4)2HPO4 0.2% KH2PO4 0.01% K2HPO4 0.03% L−フェニルアラニン 0.00025% L−トリプトファン 0.00025% FeSO47H2O 0.00032% MnSO46H2O 0.00019% CaCO3 4%
【0026】試験管を36.5℃で5日間、インキュベ
ートした。次に培養液の上清を遠心分離で得、薄層クロ
マトグラフィーでD−リボース生産レベルの分析を行っ
た。上清1μlをシリカゲルプレート(Kieselg
el 60 F254 ,Merck)上にスポットし、ア
セトン、n−ブタノール及び水(5:4:1)から成る
溶媒系で展開した。次にシリカゲルプレートに、ナフト
レゾルシノール−H2 SO4 試薬をふきつけ、100℃
で2〜3分間加熱し、リボースのスポットを視覚化させ
た。培養された変異株の中からその親株よりも優れたD
−リボース高生産株としてRA8を選択した。
ートした。次に培養液の上清を遠心分離で得、薄層クロ
マトグラフィーでD−リボース生産レベルの分析を行っ
た。上清1μlをシリカゲルプレート(Kieselg
el 60 F254 ,Merck)上にスポットし、ア
セトン、n−ブタノール及び水(5:4:1)から成る
溶媒系で展開した。次にシリカゲルプレートに、ナフト
レゾルシノール−H2 SO4 試薬をふきつけ、100℃
で2〜3分間加熱し、リボースのスポットを視覚化させ
た。培養された変異株の中からその親株よりも優れたD
−リボース高生産株としてRA8を選択した。
【0027】変異株RC15の調製 変異株RA8の調製法に記載したものと同様な方法でR
A8株を、MNNG(100μg/ml最終濃度)及び
2−メトキシ−6−クロロ−9−〔3−(エチル−2−
クロロエチル)アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−
ジヒドロクロライド(10μg/ml最終濃度)の混合
液で処理した。処理細胞を、D−ソルビトール(0.5
%);バクト ペプトン(1%)(Difco);酵母
抽出物(0.2%)(オリエンタル酵母)、NaCl
(0.2%)及びD−リボース70g/lを含む培地に
接種し、36.5℃で1日、インキュベートした。培養
液の一部をD−リボース90g/lが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、36.5℃で、2日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、D−リボース90g/lを補った寒天培地に塗り、
36.5℃で2日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのD−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のD−リボース産生能を、変異株RA8の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株RC15をD−
リボースー高生産株として選択した。
A8株を、MNNG(100μg/ml最終濃度)及び
2−メトキシ−6−クロロ−9−〔3−(エチル−2−
クロロエチル)アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−
ジヒドロクロライド(10μg/ml最終濃度)の混合
液で処理した。処理細胞を、D−ソルビトール(0.5
%);バクト ペプトン(1%)(Difco);酵母
抽出物(0.2%)(オリエンタル酵母)、NaCl
(0.2%)及びD−リボース70g/lを含む培地に
接種し、36.5℃で1日、インキュベートした。培養
液の一部をD−リボース90g/lが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、36.5℃で、2日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、D−リボース90g/lを補った寒天培地に塗り、
36.5℃で2日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのD−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のD−リボース産生能を、変異株RA8の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株RC15をD−
リボースー高生産株として選択した。
【0028】変異株RE5の調製 変異株RC15の調製に記載したのと同様な方法で、R
C15株を、MNNG100μg/ml(最終濃度)で
処理し、処理細胞を、D−リボース70g/lが補われ
た寒天培地に塗った。D−リボース耐性変異株の中か
ら、変異株RE5を、その親株より優れているD−リボ
ース−高生産株として選択した。
C15株を、MNNG100μg/ml(最終濃度)で
処理し、処理細胞を、D−リボース70g/lが補われ
た寒天培地に塗った。D−リボース耐性変異株の中か
ら、変異株RE5を、その親株より優れているD−リボ
ース−高生産株として選択した。
【0029】変異株RX13の調製 変異株RC15の調製において記載したものと同様な方
法で、RE5株の反復変異誘発によってD−リボース−
耐性変異株を得た。D−リボース−耐性変異株の中から
変異株RX13をその親株より優れているD−リボース
−高生産株として選択した。
法で、RE5株の反復変異誘発によってD−リボース−
耐性変異株を得た。D−リボース−耐性変異株の中から
変異株RX13をその親株より優れているD−リボース
−高生産株として選択した。
【0030】実施例1 変異株RA8,RC15,RE5又はRX13の寒天培
養の一白金耳を試験管中の種用培地7mlに接種した。培
地の成分は下記に示す通りである。 D−ソルビトール 2.0% コーンスティープリカー 2.0% KH2 PO4 0.1% K2 HPO4 0.3% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% (pH6.7)
養の一白金耳を試験管中の種用培地7mlに接種した。培
地の成分は下記に示す通りである。 D−ソルビトール 2.0% コーンスティープリカー 2.0% KH2 PO4 0.1% K2 HPO4 0.3% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% (pH6.7)
【0031】接種した試験管を試験管振とう機上、3
6.5℃で、6時間インキュベートした。このように調
製した種培養(4ml)を、500mlエルレンマイヤ
ー フラスコ内の産生培地に接種し、40mlとした。
産生培地の成分は以下の通りである。 モラティン 0.07% (NH4)2SO4 0.55% (NH4)2HPO4 0.2% FeSO4・7H2O 0.00032% MnSO4・6H2O 0.00019% CaCO3 4% D−グルコース (表1に示す) コーンスティープリカー (表1に示す) (pH約7.0)
6.5℃で、6時間インキュベートした。このように調
製した種培養(4ml)を、500mlエルレンマイヤ
ー フラスコ内の産生培地に接種し、40mlとした。
産生培地の成分は以下の通りである。 モラティン 0.07% (NH4)2SO4 0.55% (NH4)2HPO4 0.2% FeSO4・7H2O 0.00032% MnSO4・6H2O 0.00019% CaCO3 4% D−グルコース (表1に示す) コーンスティープリカー (表1に示す) (pH約7.0)
【0032】フラスコを、36.5℃及び220rpm
で、4日間インキュベートした。変異株RA8,RC1
5,RE5及びRX13のD−リボース生産性を表1に
示す。親株、バチルス プミルスATCC 31093
を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に示
す。変異株RE5およびRX13は、各々親株より1.
5及び1.7倍高いD−リボース生産性を示した。
で、4日間インキュベートした。変異株RA8,RC1
5,RE5及びRX13のD−リボース生産性を表1に
示す。親株、バチルス プミルスATCC 31093
を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に示
す。変異株RE5およびRX13は、各々親株より1.
5及び1.7倍高いD−リボース生産性を示した。
【0033】
【表1】 表 1 変異株RA8,RC15,RE5及びRX13のD−リボース生産性 D−リボース生産量 株 D−グルコース コーンスティープリカー (g/l) (g/l) (g/l) 3日間 4日間 RA8 145 3 70.9 73.8 RC15 145 3 68.9 77.8 RE5 145 3 83.7 85.1 RE5 172 6 94.5 100.3 RX13 200 3 77.5 118.8 親 株 145 3 68.5 66.6 親 株 172 6 67.9 68.9
【0034】実施例2 実施例1に記載したのと同様な方法で、変異株RE5の
種培養を調製し、D−グルコース及びコーンスティープ
リカー(Lot.No. 630315B 日本食品化工株
式会社)の濃度が各々145及び4.5g/lであるこ
と以外は同一の産生培地に接種した。日立自動アミノ酸
分析機、モデル835で測定されたコーンスティープリ
カー中の遊離アミノ酸濃度は以下の通りである。 アミノ酸 濃 度 (m モル/100g コーンスティープリカー) L−アスパラギン酸 0.17 L−スレオニン 1.75 L−セリン 2.79 L−グルタミン酸 2.68 L−プロリン 7.41 L−グリシン 1.93 L−アラニン 10.87 L−シスチン 測定せず L−バリン 3.60 L−メチオニン 1.55 L−イソロイシン 1.57 L−ロイシン 6.16 L−チロシン 2.11 L−フェニルアラニン 2.38 L−リジン 2.82 L−ヒスチジン 1.05 L−トリプトファン 0.18 L−アルギニン 3.56 フラスコを3日間インキュベートし、D−リボース8
7.0g/lを得た。
種培養を調製し、D−グルコース及びコーンスティープ
リカー(Lot.No. 630315B 日本食品化工株
式会社)の濃度が各々145及び4.5g/lであるこ
と以外は同一の産生培地に接種した。日立自動アミノ酸
分析機、モデル835で測定されたコーンスティープリ
カー中の遊離アミノ酸濃度は以下の通りである。 アミノ酸 濃 度 (m モル/100g コーンスティープリカー) L−アスパラギン酸 0.17 L−スレオニン 1.75 L−セリン 2.79 L−グルタミン酸 2.68 L−プロリン 7.41 L−グリシン 1.93 L−アラニン 10.87 L−シスチン 測定せず L−バリン 3.60 L−メチオニン 1.55 L−イソロイシン 1.57 L−ロイシン 6.16 L−チロシン 2.11 L−フェニルアラニン 2.38 L−リジン 2.82 L−ヒスチジン 1.05 L−トリプトファン 0.18 L−アルギニン 3.56 フラスコを3日間インキュベートし、D−リボース8
7.0g/lを得た。
【0035】実施例3 変異株RE5の寒天培養の一白金耳を、500mlエル
レンマイヤー フラスコ中の下記種用培地100mlに
接種した。 D−ソルビトール 2% バクトペプトン 0.25% 酵母抽出物 0.2% K2HPO4 0.3% KH2PO4 0.1% MgSO4・7H2O 0.05% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% L−チロシン 0.0025% L−バリン 0.0025%
レンマイヤー フラスコ中の下記種用培地100mlに
接種した。 D−ソルビトール 2% バクトペプトン 0.25% 酵母抽出物 0.2% K2HPO4 0.3% KH2PO4 0.1% MgSO4・7H2O 0.05% L−フェニルアラニン 0.0025% L−トリプトファン 0.0025% L−チロシン 0.0025% L−バリン 0.0025%
【0036】フラスコを36.5℃及び220rpmで
9時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培
地150mlを含む2つの500mlエルレンマイヤー
フラスコに、それぞれ培養液0.1mlを移した。 D−ソルビトール 4% コーンスティープリカー 4% KH2PO4 0.2% K2HPO4 0.6% L−フェニルアラニン 0.005% L−トリプトファン 0.005%
9時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培
地150mlを含む2つの500mlエルレンマイヤー
フラスコに、それぞれ培養液0.1mlを移した。 D−ソルビトール 4% コーンスティープリカー 4% KH2PO4 0.2% K2HPO4 0.6% L−フェニルアラニン 0.005% L−トリプトファン 0.005%
【0037】フラスコを、36.5℃及び220rpm で
19時間インキュベートし、得られた培養液を、3リッ
トル ジャー ファーメンテイションの接種用として用
いた。種培養液(170ml)を、接種後、1.7リット
ルになるように調製した産生用培地に接種した。産生用
培地の成分を以下に示す。 D−グルコース 17.2% モラテイン 0.07% コーンスティープリカー 0.3% (NH4 )2 SO4 0.55% (NH4 )2 HPO4 0.2% FeSO4 ・7H2 O 0.00032% MnSO4 ・6H2 O 0.00019%
19時間インキュベートし、得られた培養液を、3リッ
トル ジャー ファーメンテイションの接種用として用
いた。種培養液(170ml)を、接種後、1.7リット
ルになるように調製した産生用培地に接種した。産生用
培地の成分を以下に示す。 D−グルコース 17.2% モラテイン 0.07% コーンスティープリカー 0.3% (NH4 )2 SO4 0.55% (NH4 )2 HPO4 0.2% FeSO4 ・7H2 O 0.00032% MnSO4 ・6H2 O 0.00019%
【0038】培養を、36.5℃、及び500rpm で行
ない、0.85リットル/分の通気を行った。培養中、
培地のpHを6N水酸化ナトリウムを用いて5.3から
7.0の間に調節した。71時間の培養において、D−
リボース産生量は94.0g/lであった。この培養液
から、細胞をろ過によって除去し、ろ液をもとの容積の
半分まで濃縮した。次にその容積の約 1/4 量のエタノ
ールを加え、沈澱物を除去した。残渣を陽イオン及び陰
イオン交換樹脂で脱塩し、次いで活性炭カラムにて脱色
した。脱色した溶液を濃縮し、その容積の約4倍量のエ
タノールを加え、それによってD−リボース結晶15
9.8gを得た。
ない、0.85リットル/分の通気を行った。培養中、
培地のpHを6N水酸化ナトリウムを用いて5.3から
7.0の間に調節した。71時間の培養において、D−
リボース産生量は94.0g/lであった。この培養液
から、細胞をろ過によって除去し、ろ液をもとの容積の
半分まで濃縮した。次にその容積の約 1/4 量のエタノ
ールを加え、沈澱物を除去した。残渣を陽イオン及び陰
イオン交換樹脂で脱塩し、次いで活性炭カラムにて脱色
した。脱色した溶液を濃縮し、その容積の約4倍量のエ
タノールを加え、それによってD−リボース結晶15
9.8gを得た。
【0039】実施例4 バチルス プミルス ATCC 31093、変異株R
A8、RC15、RE5、又はRX13の一白金耳を、
変異株RA8についての調製において記載した様な成分
の種用培地7mlを入れた試験管に接種し、36.5℃及
び280rpm で、5時間インキュベートした。次にD−
グルコース濃度が100g/lであり、何例かではD−
リボースが最終濃度70、90又は120g/lになる
ように加えられたことを除く外は変異株RA8の調製に
おいて記載した産生培地6mlにそれぞれ種培養0.6ml
を接種した。
A8、RC15、RE5、又はRX13の一白金耳を、
変異株RA8についての調製において記載した様な成分
の種用培地7mlを入れた試験管に接種し、36.5℃及
び280rpm で、5時間インキュベートした。次にD−
グルコース濃度が100g/lであり、何例かではD−
リボースが最終濃度70、90又は120g/lになる
ように加えられたことを除く外は変異株RA8の調製に
おいて記載した産生培地6mlにそれぞれ種培養0.6ml
を接種した。
【0040】試験管を36.5℃及び280rpm で、2
日間インキュベートした。試験を行った微生物の生育を
1日目及び2日目に、590nmにおいて光学的に測定し
た。その結果を表2に示す。変異株RC15、RE5及
びRX13は、親株であるバチルス プミルス ATC
C 31093、および変異株RA8よりもD−リボー
ス70及び90g/lに対して著しく高い耐性を示し
た。
日間インキュベートした。試験を行った微生物の生育を
1日目及び2日目に、590nmにおいて光学的に測定し
た。その結果を表2に示す。変異株RC15、RE5及
びRX13は、親株であるバチルス プミルス ATC
C 31093、および変異株RA8よりもD−リボー
ス70及び90g/lに対して著しく高い耐性を示し
た。
【0041】
【表2】
【0042】酵素活性 実施例3に記載したのと同様な方法で、バチルス プミ
ルス ATCC 31093、及び変異株RA8、RC
15、RE5及びRX13を、3リットル ジャーファ
ーメンター中で培養した。培地中のD−グルコースが完
全になくなった時、培養液50mlをファーメンターから
引き出した。培養液を6,000×gで10分間遠心分
離し、沈澱した細胞を10mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)10mlに懸濁した。細胞懸濁液を6,000×
gで10分間遠心分離し、沈澱した細胞を前記したのと
同様な方法で再び洗浄した。得られた細胞を使用するま
で−20℃で凍結した。
ルス ATCC 31093、及び変異株RA8、RC
15、RE5及びRX13を、3リットル ジャーファ
ーメンター中で培養した。培地中のD−グルコースが完
全になくなった時、培養液50mlをファーメンターから
引き出した。培養液を6,000×gで10分間遠心分
離し、沈澱した細胞を10mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)10mlに懸濁した。細胞懸濁液を6,000×
gで10分間遠心分離し、沈澱した細胞を前記したのと
同様な方法で再び洗浄した。得られた細胞を使用するま
で−20℃で凍結した。
【0043】凍結細胞を解凍し、10mMトリス−塩酸緩
衝液(pH7.5)10mlに懸濁し、6,000×gで1
0分間遠心分離した。沈澱した細胞を同一の緩衝液2ml
に再懸濁し、リゾチーム(Sigma Chemica
l Co.)を加え、200μg/mlの最終濃度にし
た。次に混合液を攪拌(240rpm )しながら、37℃
で1時間インキュベートし、細胞を溶解した。このよう
にして得られた溶解物を6,000×gで10分間遠心
分離した。得られた上清を、無細胞抽出液として使用し
た。
衝液(pH7.5)10mlに懸濁し、6,000×gで1
0分間遠心分離した。沈澱した細胞を同一の緩衝液2ml
に再懸濁し、リゾチーム(Sigma Chemica
l Co.)を加え、200μg/mlの最終濃度にし
た。次に混合液を攪拌(240rpm )しながら、37℃
で1時間インキュベートし、細胞を溶解した。このよう
にして得られた溶解物を6,000×gで10分間遠心
分離した。得られた上清を、無細胞抽出液として使用し
た。
【0044】バチルス プミルス ATCC 3109
3及び、変異株RA8、RC15、RE5並びにRX1
3の無細胞抽出液中のD−グルコース デヒドロゲナー
ゼ(GDH)、D−グルコース−6−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ(G6PDH)、グルコノキナーゼ(GAK)及
び6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(6PGD
H)の酵素活性を測定したその結果を表3に示す。変異
株RE5及びRX13は、親株よりも10倍高いグルコ
ノキナーゼ活性を有することが見出された。
3及び、変異株RA8、RC15、RE5並びにRX1
3の無細胞抽出液中のD−グルコース デヒドロゲナー
ゼ(GDH)、D−グルコース−6−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ(G6PDH)、グルコノキナーゼ(GAK)及
び6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(6PGD
H)の酵素活性を測定したその結果を表3に示す。変異
株RE5及びRX13は、親株よりも10倍高いグルコ
ノキナーゼ活性を有することが見出された。
【0045】
【表3】 表 3 バチルス プミルス ATCC 31093及び変異株 RA8、RC15、RE5並びにRX13の無細胞抽出 液中の酵素活性 酵 素 活 性 バチルス 酵 素 プミルス 変異株 変異株 変異株 変異株 ATCC 31093 RA8 RC15 RE5 RX13 GDH 0.067* 0.073 0.074 0.091 0.088 (0.019)** (0.023) (0.025) (0.036) (0.035) GAK 0.009 0.021 0.051 0.075 0.083 (0.003) (0.007) (0.017) (0.030) (0.041) * 単位/ml−培養液 ** 単位/mg−タンパク
【0046】形態 実施例1に示したのと同様にして、バチルス プミルス
ATCC 31093、及び変異株RE5を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養5.5時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図1に示した。
バチルス プミルス ATCC 31093では2又は
3個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株RE
5では10個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
ATCC 31093、及び変異株RE5を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養5.5時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図1に示した。
バチルス プミルス ATCC 31093では2又は
3個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株RE
5では10個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
【図1】生物の形態を示すものであり、バチルス プミ
ルス ATCC 31093及び変異株RE5の形態を
示す顕微鏡写真(1,100倍及び2,800倍)であ
る。
ルス ATCC 31093及び変異株RE5の形態を
示す顕微鏡写真(1,100倍及び2,800倍)であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 瀬戸口 豊 神奈川県藤沢市片瀬海岸1−12−13− 805 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12P 19/00 - 19/02 BIOSIS(DIALOG)
Claims (10)
- 【請求項1】 トランスケトラーゼを欠損し、高いD−
リボース耐性および高いD−グルコノキナーゼ活性を有
し、D−グルコースからD−リボースを産生する能力を
有するバチルス(Bacillus)属に属する微生物
を、D−グルコースの存在下にて培地中で培養し、得ら
れたD−リボースを培養液から回収することを特徴とす
るD−リボースの製造法。 - 【請求項2】 バチルス属に属する微生物が70g/l
以上、好ましくは120g/l以上の濃度のD−リボー
スを含む培養液中で成育する能力を有する請求項1に記
載の製造法。 - 【請求項3】 バチルス属に属する微生物が、0.01
単位/mgタンパク以上のD−グルコノキナーゼ活性を有
する請求項1に記載の製造法。 - 【請求項4】 微生物がバチルス プミルス種(Bac
illus pumilus)に属する請求項1に記載
の製造法。 - 【請求項5】 微生物が、バチルス プミルスRC15
(FERM−BPNo. 2834)、バチルス プミルス
RE5(FERM−BP No. 2833)又はRX13
(FERM−BP No. 2835)である請求項1に記
載の製造法。 - 【請求項6】 培養液中のD−グルコースの初期濃度
が、約50g/lないし300g/l、好ましくは約1
00g/lないし250g/lである請求項1〜5のい
ずれか1項に記載の製造法。 - 【請求項7】 pH約4.0ないし9.0、好ましくは
5.0ないし8.0の範囲内において培養を行う請求項
1〜6のいずれか1項に記載の製造法。 - 【請求項8】 約20ないし45℃、好ましくは約25
ないし40℃の範囲内の温度で培養を行う請求項1〜7
のいずれか1項に記載の製造法。 - 【請求項9】 トランスケトラーゼを欠損し、高いD−
リボース耐性および高いD−グルコノキナーゼ活性を有
し、D−グルコースからD−リボースを産生する能力を
有するバチルス プミルス種(Bacillus pu
milus)に属する微生物。 - 【請求項10】 トランスケトラーゼを欠損し、高いD
−リボース耐性および高いD−グルコノキナーゼ活性を
有し、D−グルコースからD−リボースを産生する能力
を有するバチルス プミルスRC15(FERM−BP
No. 2834)、バチルス プミルスRE5(FER
M−BP No. 2833)及びバチルス プミルスRX
13(FERM−BP No. 2835)。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP90114427 | 1990-07-27 | ||
AT901144279 | 1990-07-27 |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH07203982A JPH07203982A (ja) | 1995-08-08 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP18720891A Expired - Fee Related JP3129773B2 (ja) | 1990-07-27 | 1991-07-26 | D−リボースの製造法 |
Country Status (1)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69825852T2 (de) | 1997-12-04 | 2005-09-01 | Dsm Ip Assets B.V. | Riboflavin Glucosid |
-
1991
- 1991-07-26 JP JP18720891A patent/JP3129773B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07203982A (ja) | 1995-08-08 |
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