JPH03504325A - Ｈｌａ ｄｐタイプ分け方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を含んで成るキット。 １４、　ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子の標的領域の増幅のために有用なオリゴヌクレオチ ドブライマーを含む容量をさらに含んで成る請求項１３に記載のキット。 １５、請求項１に記載の方法に従って個体のＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型を決定し、そ して該個体の遺伝子型が自己免疫疾患に関連するものであるか否かを決定する、 ことを含んで成る自己免疫疾患への個体の感受性を決定する方法。 １６、前記自己免疫疾患が幼年性リウマチ性関節炎であり、そして個体の１（Ｌ Ａ　ＤＰ遺伝子型がＤＰ８２．１対立遺伝子を含んで成る、請求項１５に記載の 方法。 １７、前記自己免疫疾患がＩ　ＤＤＭである、請求項１５に記載の方法。 １８、前記自己免疫疾患がＣＤであり、そして前記遺伝子型がＤＰＢＩ３．　Ｄ ＰＢＩ、　ＤＰＢ３及びＤＰＢ４．２から成る群から選択された対立遺伝子につ いて陽性である、請求項１５に記載の方法。 １９、ゲノム核酸を含有するサンプルの逸脱に関する法医学的証拠を提供する方 法であって、請求項１の方法に従ってサンプルのＨＬＡ　ＤＰ及び容疑者の肛Ａ 　ＤＰを決定し、該固体のＨＬＡ　ＤＰ及びサンプルの）ＩＬＡ　ＤＰを比較し 、そしてサンプルがその個体に由来するか否かを推定する、ことを含んで成る方 法。 明　　　細　　　書 ＨＬＡ　ＤＰタイプ分は方法 本発明は個体の肛Ａ　ＤＰ遺伝子型を決定するための方法及び組成物に関する。 好ましい態様において、本発明は、米国特許隘４，６８３．１９５及び阻４，６ ８３．２０２に開示されておりそして請求の範囲に記載されている遺伝子増幅方 法並びに米国特許阻４、６８３．１９４に開示されておりそして請求の範囲に記 載されているドツトプロット及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ 法の使用に関する。本発明の方法及びプローブは特に多形性クラスＩＩＨＬＡＤ Ｐ遺伝子の検出に関する０本発明は分子生物学、診断医学及び法医学に関する。 ヒト主要組織適合性複合体遺伝子のクラス■遺伝子座は、Ｂ−リンパ球、活性化 されたＴ−リンパ球、マクロファージ及び樹枝状突起細胞上で発現されるＨＬＡ Ｄ細胞表面糖蛋白質をコードしている０個々にＤＲ，Ｄ（］及びＤＰと称される これらの蛋白質はα及び高多形性βサブユニットから構成され、そしてＴ細胞に 対する抗原のプレゼンテーションを担当している。 この高多形性βサブユニットにおける可変性はアミノ末端細胞外ドメインに位置 しており、このドメインはＴ細胞受容体及び抗原ペプチド断片と相互作用すると 考えられる。クラスＩＩ　ＨＬＡ蛋白質をコードする遺伝子はヒトにおける染色 体６の短片上に位置している。ＨＬＡ　ＤＰα鎖及びＨＬＡ　ＤＰβ鎖をコード する遺伝子はこの領域のセントロマ一端にクラスター状となっており、そしてお そらく発現レベルが低いために肛ＡＤ遺伝子の中で最後に発見されたものであり 、そしてそれ故に最も少なく特性決定がなされている。　ＨＬＡ　Ｄ　９５域の 構造、配列及び多形性はＴｒｏｗｓｄａｌｅら、１９８５．１ｗｍｕｎｏ１．　 Ｒｅｕ、　８５　：　５−４３に総説されており、その記載を引用により本明細 書に組み的タイプ分は試薬により、及び混合リンパ球培養（ＭＬＣ）反応により 定義され、この場合ホモ接合タイプ分は細胞（ＨＴＣ）に応答してのＴ細胞の増 殖が培養物中で測定される。ＨＬＡ　ＤＰ抗原は最初、特異的にプライムされた Ｔ細胞において強い二次応答を刺激するそれらの能力により定義されたものであ り、この方法はプライムされたリンパ球タイプ分け（ＰＬＴ）として知られてお り、そしてＭａｗａｓら、１９８１　Ｔｉ５ｓｕｅ　ハ■■旦、ｔｓ：４５８− ４６６ＨＷａｎｔら、１９７８．　Ｉａａｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　６　：　 １０７−１１５；及びＳｈａｗら、１９８０、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５２　 ：　５６５−５８０により記載されている。　ＨＬＡ　ＤＰ抗原は一次ＭＬＣに おいて弱い応答のみ惹起し、そして肛Ａ　ＤＲ及び肛Ａ　ＤＱ多形の研究とは異 り、肛Ａ　ＤＰにおける対立遺伝子変化の分析は血清学的試薬及びタイプ分は細 胞の欠如により複雑なものとされている。さらに、ＰＬＴアッセイにおいて使用 される特異的細胞系は発生させることが困難であり、そしてタイプ分はアッセイ は遅く且つ実験室により幾分異る。 細胞性多形（Ｏｄｕｍら、１９８７、Ｔｉ５ｓｕｅ　　ハ旦註旦＋　２９　：　 １０１−１０９を参照のこと）、生化学的多形（Ｌｏｔｔｅａｕら、１９８７、 Ｉｍｍｕ−匹ｇ旦ｃｓ、　２５　：　４０３−４０７を参照のこと）及び制限断 片製多形（ＲＦＬＰ；ｌ（ｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ８４　：　１６４４−１６４８を参照のこと）の分析が示すところによれば、Ｄ ？領領域おける多形性の程度は、現在血清学的に、免疫的に、又はＰＬＴにより 定義されるＤＰｗｌ−ＤＰｗ６タイプより広範である。 ＲＦＬＰアプローチが示すところによれば、ＤＰＳＮ域のＲＦＬＰは相対的に広 範であり、そして断片の幾つかはある種のＤＰ抗原と強く会合する。しかしなが ら、ＲＦＬＰ技法は幾つかの制限を有する。変異配列を担持する対立遺伝子は、 変化ヌクレオチドが分析に使用される制限酵素の認識部位内にある場合にのみ、 又は多形性制限部位が特異的コード配列変化とリンケージ非平衡（ｌｉｎｋａｇ ｅ　ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｏｓ）にある場合にのみ、同定可能である。さら に、ＲＦＬＰ分析は単にコード配列変化が存在する証拠を提供するが、しかしそ の変化の正確な性質についての情報は提供しない、さらに、分析のためにはゲノ ム核酸の比較的大きな断片を使用しなければならない、この後者の要求はしばし ば、ゲノムＤＮＡの分解をもたらす条件下に保持されていたサンプルの使用を排 除する。 正確なりＰタイプ分けが幾つかの医療用途において重要であることが明らかであ ろう、　ＤＰ遺伝子座と血清学的にタイプ分けされたＯＲ遺伝子座との間の遺伝 子組換が起って血清学的に同一のｓｉｂがＤＰにおいてマツチしないことが起り 得る。八−ａｒら、１９８７、Ｌ力ｌ凹劇！ｕｌＬ坦：　１９４７−１９５３に より記載されているように、見かけ上ＨＬＡが同一の提供者と受容者との対の間 での急性の移植片対宿主病の幾つかの症例においてＲＦＬＰ分析により肛Ａ　Ｄ Ｐの相違が示されている。さらに、腔腸病を含めての幾つかの自己免疫疾患が特 異的ＤＰタイプと関連することが示されており、このタイプはＰＬＴ分析（Ｏｄ ｕ−ら、１９８６、Ｔｉ５ｓｕｅ　紅旦■且、　２８　：　２４５−２５０）に より又はＲＦＬＰ分析（Ｈｏｗｅ　ｌ　ｌら、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５　：　２２２−２２６）により定義されるも のである。 ＤＮＡ増幅における有意な改良、すなわちポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法 がＭｕｌｌｉｓにより米国特許Ｎ［Ｌ４，６８３．１９５において開示されてお り、そして核酸のクローニング及び検出においてＰＣＲを用いる方法がＭｕｌ　 Ｉ　ｉｓらにより米国特許Ｎａ４，６８３，２０２に開示されており、この両特 許の開示を引用により本明細書に組み入れる。　　ＰＲＣ技法においては増刷さ れるべき配列の相対する末端にマツチするように短いオリゴヌクレオチドプライ マーが調製される。これらのプライマー間の配列は知られる必要がない、核酸（ ＤＮＡ又はＲＮＡ、但しＲＣＲ法においてＲＮＡはまずＤＮＡに転換される）の サンプルが抽出され、そして好ましくは熱によって、変性され、そしてモル過剰 で存在するオリゴヌクレオチドブライマーとハイブリダイズされる１重合は、デ オキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下でポリメラーゼによ り触媒される。これが２個の「長い生成物」をもたらし、これらの生成物はもと の鎖の新たに合成された相補体に共有結合したそれぞれのプライマーをそれらの ５′−末端に含有する。複製されたＤＮＡはやはり変性され、オリゴヌクレオチ ドブライマーとハイブリダイ・ズされ、重合条件にもどされ、そして第二サイク ルの複製が開始される。 二の第二サイクルは、２本のもとの鎖、第一サイクルからの２本の長い生成物及 び第二サイクルからの２本の長い生成物、並びに第二サイクルにおいて生成した 長い生成物から複製された２本の「短い生成物」をもたらす、これらの短い生成 物は標的配列に由来する配列（センス又はアンチセンス配列）を含有し、そして ５′末端におけるプライマーと３′−末端におけるプライマーに相補的な配列と より挟まれている。各追加のサイクルの際、短い生成物の数は指数的に増加する 。 従って、ＰＣＲ法は特定の標的配列の増幅を惹起し、そして最初に非常に少量の みサンプル中に存在する配列の検出を可能にする。 ５ａｉｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、　３２４　：　１６３−１６６に記載 されているように、ヘモグロビンのβ−グロビンをコードする遺伝子における及 びＨＬＡ　ＤＱαをコードする遺伝子における対立遺伝子配列変化が、それらと 完全にマツチする配列とのみアニールするであろう対立遺伝子特異的オリゴヌク レオチド（ＡＳＯ）を用いることにより検出されている。これらの研究もまた、 サンプル中に存在するＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲ法を用い、そして該サ ンプルへのプローブのハイブリダイゼーションを検出するためにドツト−プロッ ト法を使用した。 本発明は、ＨＬＡ　Ｄｒタイプ分けにおける上記の問題点を解決するものであり 、そしてＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型の決定のための比較的迅速で、便利で、実際的で 正確でしかも再現性ある方法を提供するものである。この方法は部分的に、今ま で知られていない多数のＤＰβ対立遺伝子が存在する、という知見に基くもので ある、対立遺伝子間の差異は高度に分散した性質のものである。本発明はまた、 この方法において使用するための異るＤＰ対立遺伝子間を区別するに際して最も 情報に冨む）ＩＬＡＤＰβ遺伝子の領域についての核酸プローブを提供するもの である。 これらのオリゴヌクレオチドプローブはＳＳＯ（配列特異的オリゴヌクレオチド ）と称され、適切な条件下でそれらの相補的配列と特異的に結合することができ るものである。 １つの対立遺伝子をもっばら同定するために特定のプローブを使用することがで きる場合、このプローブを対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と称 する。　ＤＰβ対立遺伝子間の差異の分散した性質のため、いずれか１つのプロ ーブが特定のＤＰβ対立遺伝子もっばら同定することができるのはまれである。 むしろ、本発明の方法に従えば、対立遺伝子の同一性は複数のプローブの１つの パネルの結合パターンから推定され、ここで該パネルの各個のプローブは肛Ａ　 ＤＰＰ伝子の異るセグメントに特異的である。これらのプローブは、ＤＰＰ伝子 の可変セグメントの変化配列に全体的に相補的なヌクレオチド配列を含んで成る 。プローブの相補的配列は通常１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、最もしば しば１７〜１９ヌクレオチドの長さを有する。 前記のごと＜、ＰＲＣは核酸に基く診断法において非常に重要な道具である。言 うまでもなく本発明の新規なプローブはＰＣＨにより増幅されたＤＮＡ中の特異 的配列を検出するために用いることができる。ＰＣＲに基＜　）ＩＬＡ　ＤＰ　 ＤＮＡタイプ分けを可能にするため、本発明はＰＣＲによる情報に富むＤＰ領領 域増幅を可能にするオリゴヌクレオチドブライマーを提供する。 従って、本発明の１つの観点は、固体から得られた核酸含有サンプルからの個体 のＨＬＡ　ＤＰ遺遺伝梨型決定するための方法であり、この方法は、（ａ）ＨＬ ＡＤＰ遺伝子の多形成領域を含有する前記核酸の標的領域を増幅し；ｌｂ）該増 幅された核酸を）ＩＬＡ　ＤＰＰ伝子の変異セグメントについて特異的な配列特 異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）プローブのパネルとｉｓｓ。 プローブと増幅された核酸とが安定なハイブリド二本鎖を形成することを許容す る条件下でハイブリダイズせしめ；そして（ｃ）前記増幅された核酸とＳＳＯプ ローブとの間で形成されたバイブリドを検出する、ことを含んで成る。 本発明の他の観点は個体の旧、Ａ　ＤＰ遺遺伝梨型決定するのにを用なキットに 関し、これらのキットは（ａ）前記標的領域中の対立遺伝子変異配列のためのＳ ＳＯプローブのパネル；及び（ｂ）キット成分を用いることにより遺伝子型を決 定するための指示書を含んで成る。 本発明の理解の一層として、幾つかの用語を下に定義する。 「遺伝子型」は、個体（又はサンプル）中に存在する対立遺伝子の遺伝子型変化 の記述に関する。個体の遺伝子型は、例えば、血清学的試薬を使用することによ り、タイプ分は細胞を使用することにより、ゲノムのＲＦＬＰ分析により、そし て後で検討するようにＳＳＯを用いることにより決定することができる。 ｒＨＬＡ　ＤＰ領領域又はｒＤＰＪは、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅら、前掲により記載 されたＨＬＡ　Ｄ複合体に関し、これはＨＬＡＤｅＮ域のセントロマー側に存在 しそして２個のα遺伝子及び２個のβ遺伝子を含有しその一対は偽遺伝子（ｐｓ ｅｕｄｏｇｅｎｅ）である。 「オリゴヌクレオチド」は、ブライマー、プローブ、検出されるべき核酸断片、 核酸対照、及び未標識のブロッキングオリゴマーに間しそして２個以上のデオキ シリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドから成る分子として定義される。オリ ゴヌクレオチドの正確なサイズは多くの因子及びオリゴヌクレオチドの最終的機 能又は用途に依存するであろう。オリゴヌクレオチドは任意の適当な方法により 調製することができる。この様な方法には、例えば、適切な配列のクローニング 及び制限酵素処理、並びにＮａｒａｎｇら、１９７９、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ ｌ。 皿：９０、ホスホジエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　 ｍｏｌ。 ６８　：　１０９のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅ ｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、、　２２　：　１８５９−１８６２のジエ チルホスホラミダイト法、及び米国特許Ｎ１１４．４５８，０６６の固体支持体 法のごとき方法による直接化学合成により調製することができる。 「多形性」又はｒ　ＤＮＡ多形」は、同一の交配集団（ｓａｍｅｉｎｔｅｒｂｒ ｅｅｄｉｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に特定のＤＮＡ配列の２以上の変異が共 存する状態を意味する。 「ブライマー」は、核酸鎖に対して相補的なブライマー延長生成物の合成が誘導 される条件下、すなわち適当な緩衝液中及び適当な温度での４種類の異るヌクレ オチドトリホスフェートと重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵 素）の存在下でＤＮＡ合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオ チドに関し、これは天然物でも合成品でもよい。ブライマーは好ましくはオリゴ デオキシリボヌクレオチドであり、そして増幅における最大効率のためには単鎖 であるが、しかし二本鎖であることもできる。二本鎖であれば、そのブライマー は延長生成物を調製するために使用される前にその鎖を分離するためにまず処理 される。ブライマーの正確な長さは多くの因子に依存するが、しかし典型的には １５〜２５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマーヌクレオチドは一般に、 鋳型と十分に安定なバイブリド複合体を形成するために一層低い温度を必要とす る。ブライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、しかし鋳型とハイ ブリダイズするために十分なだけ相補的でなければならない。ブライマーに導入 され得る非相補的配列の例は制限酵素認識部位コードする配列である（米国特許 に４．８００．１５９を参照のこと）。 ここで用いられる「ブライマー」は、増幅されるべき標的の一端又は両端に関す る情報に幾分の不明瞭さが存在する場合には特に、複数のブライマーを意味する ことができる。例えば、核酸配列が蛋白質配列から推定される場合、「ブライマ ー」は実際には、遺伝コードの縮重に基くすべての可能性あるコドン変化を代表 する配列を含む複数のブライマーオリゴヌクレオチドの集合である。この集合中 のプライマーオリゴヌクレオチドの１つが標的配列の末端と相同であろう。同様 に、「保存されたＪ　（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）　領域が一集団中の有意なレベル の多形性を示す場合、隣接する配列を増幅するであろうプライマーの混合物を調 製することができる。所望により、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又 は化学的手段により検出可能な標準を導入することによりプライマーを標識する ことができる０例えば、有用な標識には、ｓｚｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵 素（ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるようなもの）、ビオチン、又はそれに 対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が得るハプテンもしくは蛋白質が含ま れる。 プライマー又は増幅されたＤＮＡの固体支持体への固定化を促進するように、プ ライマーを「捕捉する」ために標識を使用することもできる。 「制限エンドヌクアージ」及び「制限酵素」は、特定の核酸配列において又はそ の近傍で二本鎖ＤＮ＾を切断する０通常は細菌由来の酵素を意味する。 「制限断片製多形」又はｒ　ＲＦＬＰ　Ｊは、全ゲノムを通じてランダムに分配 されておりそしてゲノムＤＮＡの消化の後に異る固体について異る制限エンドヌ クレアーゼパターンを生成するＤＮＡヌクレオチド配列の相違に関する。 「配列特異的オリゴヌクレオチド」゛又はｒ　ＳＳＯＪは、検出されるべき配列 に対して正確に相補的な配列、典型的には、「配列特異的」ハイブリダイゼーシ ョン条件下でその正確に相補的な標的配列のみとハイブリダイズするであろう、 特定のＯＰ対立遺伝子に特異的な配列、を有するオリゴヌクレオチドを意味する 。ハイブリダイゼーションはストリンジェント条件下である。ストリンジェント ハイブリダイゼーション条件は当業界において知られており、そして例えばＭａ ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　ＨＡ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）に記載されている。 分析されるべき配列に依存して、各配列につき１又は複数の配列特異的オリゴヌ クレオチドを使用することができる。用語「プローブ」及びｒ　ｓｓｏプローブ 」はＳＳＯと相互交換可能に用いられる。 「標識領域」は、通常多形性ＤＮＡ配列を含有する分析されるべき核酸の領域を 意味する。 「熱安定性ポリメラーゼ酵素」は、熱に対して比較的安定であり、且つ標的配列 の核酸鎖の１つに相補的なブライマー延長生成物を形成するためのヌクレオチド の重合を触媒する酵素に関する。一般にこの酵素はプライマーを用いて標的配列 の３′−末端において合成を開始しそして鋳型にそって５′一方向に合成が終る まで進行する。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素はヨーロッパ出願公開Ｎ１ ２５８．０１７により十分に記載されており、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｓｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから商業的に入手可能であり、゛この出 願公開を引用により本明細書に組み入れる。 本発明は、個体のＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型を決定するための方法及び試薬を提供す る０本発明は部分的に、ＰＣＲ増幅法、クローニング法及びＤＮＡ配列決定法の 組合せによるＨＬＡ　ＤＰβ遺伝子の可変性第二エクソン中の多量性の発見に基 く、その結果、２２０Ｐβ（ＤＰＢ）対立遺伝子変異体が発見された。これらの ＤＰ遺伝子の新規な配列に基いて、変異体遺伝子型の検出のためにＳＳＯプロー ブが提供される。従って１個のプローブが特定のＤＰβ対立遺伝子を特異的に同 定することができるのはまれである。むしろ、対立遺伝の同一性は複数のプロー ブから成る１つのパネルの結合のパターンから推定され、該パネルの各個のプロ ーブはＤＰ遺伝子の異るセグメントに対して特異的である。 本発明の好ましい態様において、ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型のＤＮＡに基くタイプ分 けの方法は、肚Ａ　ＤＰ遺伝子の可変部分を含む核酸配列を増幅し、ＳＳＯを用 いて存在する変異体ＨＬＡ　ＤＰ配列を決定し、そして該増幅された標的配列へ のＳＳＯプローブの結合のパターンからＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型を推定することか ら成る。 この好ましい態様の実施を促進するため、本発明はＨＬＡ　ＵＰ標的領域をＰＣ Ｒにより増幅するために有用なプライマーを提供する。 この好ましい方法において、ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型を決定すべき個体から核酸を 含有するサンプルが得られる０本発明の目的のためにＨＬＡ　ＤＰ核酸を含有す る任意のタイプの組織を用いることができる０本発明はまた増幅された核酸と適 合性であるから、そしてＰＣＲ法は極めて少量ψ核酸を増幅することができるか ら、本発明の方法により非常に少量の核酸を含有するサンプルを特定の肛Ａ　Ｄ Ｐ変異体の存在についてタイプ分けすることができる０例えば、旧ｇｕｃｈｉ　 ら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、　３３２：５４３−５４６により記載されたＯＱ αを用いての研究により証明されるように、１本の毛でさえ本発明の目的のため に十分なりＮ＾を含有する。 一般に、サンプル中の核酸はＤＮＡであり、最も普通にはゲノムＤＮＡであろう 、しかしながら、本発明はまた他の核酸、例えばメツセンジャーＲＮＡ又はクロ ーン化されたＤＮＡを用いて実施することもでき、そして核酸はサンプル中で単 鎖でも二本鎖でもよく、そして本発明の目的のためになお適当である。核酸の性 質がどうであろうと、単に方法の有意義な段階で適切な工程をとることにより本 発明の方法により核酸をタイプ分けすることができることを認識する。サンプル 中の核酸を増幅するためにＰＣＲが使用される場合、本発明の新規プローブによ りタイプ分けされる時にはサンプルは通常は二本鎖ＤＮＡを含んで成るであろう 。 前記のごとく、好ましい態様においては、本発明のＩＩＬＡ　ＤＰタイプ分は法 及びプローブはＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡと組合わせて用いられる。しかし ながら、サンプル中の肛Ａ　ＤＰ標的配列の増幅は、標的配列がＳＳＯプローブ への核酸ハイブリダイゼーシヨンにより検出され得るのに十分な増幅をもたらす 既知の任意の方法により達成することができることを、本発明の実施者は注目す べきである。　ＰＣＲ法は当業界においてよく知られている（米国特許漱４．６ ８３．１９５及びＮ１４．６８２．２０２を参照のこと）が、そして種々の商業 的売り土、例えばＰｅｒｋｉｎ−１ｉ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　１ｎｓｔｒｕａｅ ｎｅｔａがＰｃｔ？試薬を販売しそしてＰＣＲ処方を公表しているが、ＰＣＲ法 に親しみのない者に本発明を十分に理解してもらいそして本発明を明確にするた めに幾らかのＲＣＨの一般的情報を下に記載する。 サンプル中の標的核酸配列をＰＣＨにより増幅するため、配列は増幅系の成分に 接近可能でなければならない、一般に、この接近可能性はサンプルから核酸を単 離することにより保証される。生物学的サンプルから核酸を抽出するための種々 の方法が当業界において知られている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　 　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、１９８２）により記載されているものを参照のこと）。あるいは、サ ンプルが全く容易に分解可能であれば、ＰＣＲ法による増幅に先立って核酸を精 製する必要はない。すなわち、サンプルが細胞、特に末梢血リンパ球又は羊膜細 胞である場合、細胞を単に低張緩衝液中に懸濁することにより細胞溶解及び細胞 内成分の分解を達成することができる。 ＰＣＲ法を開始するためにサンプル中の核酸がまず変性される（サンプルの核酸 が二本鎖であると過程して）ため、及び幾つかのサンプルの単なる加熱が細胞の 破壊をもたらすため、サンプルからの核酸の単離は時として鎖分離との組合せに おいて達成される。鎖分離は任意の適当な変性法によって達成され得るが、これ には物理的、化学的、又は酵素的手段が含まれる。典型的な熱変性は約１〜１０ 分間にわたる約８０°Ｃ〜１５０°Ｃの範囲の温度を用いる。鎖分離はまた、ヘ リカーゼ活性を示すことができる酵素であるヘリカーゼによっても誘導され得る 。例えば、酵素ＲｅｃＡはＡＴＰの存在下でヘリカーゼ活性を有する。ヘリカー ゼによる鎖分離のために適当な反応条件は当業界において知られている（Ｋｕｈ ｎ　Ｈｏｆｆ＋＋＋ａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ＋１９７８、Ｃ５Ｈ−Ｑｕａｎｔｉｔ ａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏ　　、　４３：６３、及びＲａｄｄｉｒｉｇ、　１９Ｂ ２、Ａｎｎ、Ｒｅｕ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１６　：　４０５−４３６を参照 のこと）。 特表千３−５０４３２５　（５） 上記のごとく、鎖分離はサンプルの核酸の単離と組合わせて、又は別の段階とし て達成することができる。さらに、鎖分離はＰＣＲ法における次の段階、すなわ ちブライマーのアニーリング及びブライマー延長生成物の合成、と同時に達成す ることができる。　　ＰＣＲ法のこの態様において、鎖分離及びブライマーアニ ーリング及び延長が平衡し、て起こるように温度が非常に注意深く制御される。 　　ＰＣＲ法のこの具体例において、反応は熱安定性ポリメラーゼにより触媒さ れそして上昇した温度において行われる。この温度は酵素が熱安定である温度で あり、そして十分なブライマーが鋳型鎖とアニールして重合の合理的な速度が可 能なように核酸が単鎖と二本鎖との平衡状態にあるような温度である。しかしな がら、ＰＣＨ温の好ましい態様においては、二本鎖の変性を生じさせるがしかし ポリメラーゼの非可逆的変形を生じさせないような有効時間にわたる十分高い温 度に反応混合物を加熱することにより達成される（ＨＰ、　Ｎａ２５８．０１７ を参照のこと）。 しかしながら、鎖分離がいかにして達成されようと、鎖が一旦分離されればＰＣ Ｈにおける次の段階は分離された鎖と標的配列を挟むブライマーとのハイブリダ イゼーションを含む。 次に、ブライマーを延長して標的類の相補的コピーを生成せしめ、そして変性、 ハイブリダイゼーション及び延長のサイクルを、所望量の増幅された核酸を得る のに必要なだけ多数回反復する。 前記のごとく、本発明はＨＬＡ　ＤＰ　ＤＮＡ増幅及びタイプ分けのためのＰＣ Ｒブライマーを提供する。これらのブライマーは、ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子座の変異 領域中の標的配列を挟む保存領域中の配列に対して相補的である。この発明の目 的のため、ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子座の好ましい変異領域はＤＰα遺伝子及びＤＰβ 遺伝子の第二エクソンである。好結果のＰＣＲ増幅のため本発明のブライマーは 次の様に設計される。すなわち、二本鎖にそって各ブライマーがハイブリダイズ する位置は、一方のブライマーから合成された延長生成物が、その鋳型（相補体 ）から分離された時、他方のブライマーの延長のためのブライマーとして機能し て定義された長さの核酸の増幅されたセグメントを生成するようなものである。 さらに、選択的アニーリング条件下でＨＬＡ　ＤＰＥＩ域に優先的に結合するで あろうブライマーが提供される。 ＰＣＲにおけるブライマーの鋳型−依存的延長は、適当な塩、金属陽イオン及び ｐＨ緩衝系を含んで成る反応媒体中適当量の４種類のデオキシリボヌクレオチド トリホスフェート（ｄＡＴＰ。 ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）の存在下で重合剤により触媒される。 適当な重合剤は鋳型依存的ＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である ０例えば、鋳型がＪ？ＮＡである場合、該１２ＮＡを相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ に転換する適当な重合剤は逆転写酵素（ＲＴ）、例えばトリ筋芽球症ウィルスＲ Ｔである。一旦、増幅のための標的がＤＮＡとなれば、適当なポリメラーゼには 、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのＫｌｅｎ咋断片、Ｔ４ＤＮＡポ リメラーゼ、及びテルムス・アクアチフス（…ｇ−ｔｉｃｕｓ）から単離されそ してＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎ５ｔｕａ＋ｅｎｔｓ（ＰＥＣ Ｉ）から市販されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼ である。後者の酵素が核酸の増幅及び配列決定において広く使用されている。Ｄ ＮＡポリメラーゼを用いるための反応条件は当業界において知られており、そし て例えば論文伽Ｕ列１山１□□□１眩国江、及びＭａｎｊａｔｉｓら、励セに垣 ａｒ　Ｃお皿Ｄ」堕りし辿ヅ１道工Ｌ１但■劃１、前掲、に記載されている。 ＰＣＲ法は段階的に行うことができ、この場合、各段階の後に新たな試薬が添加 され、あるいはすべての試薬を同時に添加する態様で行うことができ、あるいは 部分的段階的に行うことができ、この場合は所定数の段階の後新鮮な又は異る試 薬が添加される。例えば、鎖分離が熱により行われそしてポリメラーゼは熱悪受 性であれば、各回の鎖分離の後に添加されなければならないであろう。しかしな がら、例えばへりカーゼが変性のために用いられるならば、又は熱安定性ポリメ ラーゼが延長のために用いられるならば、すべての試薬を最初に加えることがで き、あるいはこれに代えて、試薬のモル比が反応にとって重要であれば、試薬が 合成反応により消耗されるに従ってそれを定期的に補供することができる。ＰＣ Ｒ法が熱安定性酵素を用いて自動化された工程として最も普通に行われる。この 方法においては、反応混合物は変性領域、プライマーアニーリング領域、及び反 応領域を通して循環される。熱安定性酵素と共に使用するために適合された装置 はＥＰ２３６，０６９により完全に開示されており、そしてＰＥＣｌから市販さ れている。 前記のように、本発明の方法においてＰＣＲ法が重要である１つの理由は、ＨＬ Ａ　ＤＰ　ＤＮＡタイプ分けに先立ってサンプル核酸を増幅するためにＰＣＲ法 を使用することができることである。しかしながら、本発明の目的のためのＰＣ Ｈの他の重要な用途は、ＨＬＡ　ＤＰｆｉＪｌ域中に存在するまだ発見されてい ない対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列を決定して、それらの変異体のための プローブを構成しそして本発明の方法において使用され得るようにするためであ る。　　ＰＣＲ法のこの用途において、ＤＰα遺伝子及びＤＰβ遺伝子の多形性 領域が増幅され、そしてこれらの多形性標的領域、例えばＤＰα遺伝子及びＤＰ β遺伝子の第二エクソンが決定される。前に説明したように、特定の変異を含有 する細胞を血清学的タイプ分け、混合リンパ球タイプ分は又はプライムされたリ ンパ球タイプ分けによりタイプ分けし、特定の変異体の核酸配列を従来技術の方 法により確立されたＤＰタイプと関連づけることも有用である。 計度異体対立遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列の分析はＰＣＲ生成物の直接 分析により容易に行うことができる。好ましい配列決定法はＩｎｎ１ｓら、１９ ８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。 ８５　：　９４３６−９４４０に記載されており、この記載を引用により本明細 書に組み入れる。　　ＰＣＲ増幅生成物の直接配列分析の方法は５ａｉｋｉら、 １９８８．５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９　：　４Ｂ？−４９１に記載されている。 あるいは、５ｃｈａｆら、１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３　：　１０７６ −１０７８に記載されているように、配列分析に先立って、増幅された標的配列 をクローニングすることができる。 下記の実施例において検討するように、多数の異るハブロタイブを代表するＤＰ ｗタイプ分けされた細胞のパネルをＰＣＲ及びＤＰβ遺伝子の第二エクソンのヌ クレオチド配列決定によた種々の個体から得られたサンプルを用いてのこの成果 及び他の類似体の成果の結果として、この遺伝圧における２２の異る対立遺伝子 変異体が発見された。一般に、この結果が示すところによれば、特定のＤＰβ配 列は標準ＰＬＴ一定義ＤＰｗｌ〜ＤＰＨ６特異性に関連する。まれな例外は標準 的で且つ再現性あるＰＬＴ　ＤＰ−タイプ分は系を得ることの困難さを反映して おり、この困難は本発明の方法の利点を強調するものである。これに関して、も ともとＤＰ％１１としてタイプ分けされた細胞系Ｃｏｘが最近ＤＰｗ３として再 タイプ分けされそしてＤＰ８３対立遺伝子を含有することは重要である。 血清学的に定義されたＤＰタイプとＤＰ変異体ヌクレオチド配列との間の他の興 味ある且つ重要な相間々係が本発明によりもたらされた進歩の結果として発見さ れた０例えば、従来技術のＤＰｗＪタイプは今や本発明の方法により２種類のＤ Ｐβサブタイプ（ＤＰＢ４．１及びＤＰＢ４．２と命名される）に細分類され得 る。 ＤＰＢ４゜２対立遺伝子が、異常なりＰｗＪタイプを有することが知られている ２種の（ＡＰＤ及びＬＢＩ）ＤＰｗ４ホモ接合タ接合タイ細分（ＨＴＣ）中に見 出された。　ＤＰｗ２タイプについてのＤＰβサブタイプ（ＤＰＢ２．１及びＤ ＰＢ２．２と命名する）も本発明の結果として発見された。 本発明により提供された他の有意義な進歩は、従来技術の方法によりＤＰ″ｂｌ ａｎｋ”としてタイプ分けされた種々の細胞における多数の変異体ＤＰβ対立遺 伝子の発見に関する。これらの変異体対立遺伝子はＤＰＢ番号７以上により命名 されている。 ＤＰｗ　ｂｌａｎｋの更なる分析はおそらく、本発明の方法によりタイプ分けさ れ得る追加のＤＰβ対立遺伝子の同定及び特徴付けを導くであろう。ＤＰｗ　ｂ ｌａｎｋ細胞は、Ｔ細胞試薬の既存のＰＬＴパネルを刺激しないものである。　 Ｈｏｒｎら、１９８８、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８５　：　６０１２−６０１６　、により記載 されたようにユニークＤＱＢ配列によりコードされる血清学的ＤＱｗ　ｂｌａｎ ｋ特異性とは異り、ＤＰｗ　ｂｌａｎｋ特異性は不均一である。ＤＰｗ　ｂｌａ ｎｋハブロタイブ頻度が４０％と予想されるから、本発明は、この大きなりＰ− タイプのサブタイプ分けを初めて可能にする点において重要である。 ＤＰｗタイプ分けされた細胞からのＤＰＩＤＮＡ配列の入手可能性は血清学的Ｄ Ｐ−タイプの細分類を可能にするのみならず、血清学的タイプ分は試薬及び細胞 性タイプ分は試薬により定義される線状エピトープの同定を可能にする０例えば 、抗体５Ｐ４２はＤＰｗ２及びＤＰｗ４細胞と反応する。これら２種類の特異性 に対してユニークな唯一の配列８４〜８７位のＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ （ＧＧＰＭ）であり、従ってこれらは５Ｐ４２エピトープを構成すると信じられ る。同様に、抗体ＳＰ３はＤＰｗ３及びＤＰｗ６細胞、並びにＤＰｗ　ｂｌａｎ ｋ細胞系Ｔｏｋ及びＡｋｉｂａのごとき幾つかの他の細胞と反応する。これらの 細胞系は特異性Ｃｐ６３を担持しそして密接に関連するＤＰβ対立遺伝子ＤＰＢ ９及びＤＰＢ１２を含有する。　ＳＰ３反応性細胞に対してユニークな唯一の配 列は５５〜５７位のＡｓｐＧｌｕ　Ａｓｐ（ＤＥＤ）配列である。従って、ＳＰ ３エピトープはＤＰβ鎖のこの領域に位置するようである。 本発明の新規なりＰ配列がいかにして血清学的に定義されたエピトープのマツピ ングを可能にするかの他の例として、抗体ＤＰ１１．１はＤＰｗ２及びＤＰｗ４ 細胞と反応する。　Ｂｏｄｍｅｒら、１９８７、Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８４　：　１６４４−１６４８は、ウェスタンプロット分析により、こ の抗体がＤＰα鎖に結合することを示した０本発明により提供されるＤＰβ多形 性のパターンが与えられれば、この観察は、ＤＰｌｌ、１抗体が、８４〜８７位 にＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ（ＧＧＰＭ）を含有するＤＰα鎖及びＤＰβ 鎖により形成されるコンホーメーション決定基に結合する。 ＨＬＡ　ＤＰ領領域多形性残基はまたＴ細胞クローンにより認識されるエピトー プを形成することができる。クローン１６６６からの細胞はＤＰｗ５及び幾つか のＤＰＮ２細胞と反応する。第１０回国ＦＩ＆ＩＩ織適合性ワークショップにお いて開示されたように、ＡＢＬ（ＤＰ８２．２）は陽性であり、そしｒｌｌＰＶ （ＤＰ８２．１）は陰性である。これらのＣ１６６６細胞は５５〜５７位のＧｌ ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ（ｆ！Ａｔり残基を認識することができる。なぜならこの配 列はＤＰＢ２．２及びＤＰＢ５細胞にユニークだからである。３５位のＬｅｕ　 （Ｐｈｅではなく）もＣ１６６６反応性細胞にユニークである。 特定の多形性残基をＤＰｗ特異性に関連付ける同じアプローチを用いてＰＬＴタ イプ分けにより定義されるエピトープをマツプすることができる０例えば、ＤＰ Ｂ２．１及びＤＰＢ４．２対立遺伝子間の唯一の差異は６９位におけるＧｌｕか らＬｙｓへの変化である。これらの対立遺伝子を含有する細胞はＰＬＴ系におい て相互に区別されるので、多形性６９位残基の変化はＰＴＴタイプ分は細胞によ り認識されるエピトープに含まれると信じられる。 同様に、ＤＰＢ３及びＤＰＢ６対立遺伝子の差異は６９位のＬｙｓからＧｌｕへ の置換及び７６位のＶａｌからＭｅｔへの変化のみである。 前記のごとく、本発明により提供される新規なりＰβ配列は非常に有用なりＰβ ＤＮＡタイプ分は法の基礎を提供するのみならず、血清学的ＤＰβタイプ分は結 果の解釈において非常に有用な情報を提供する。本発明はまた、ＤＰβ遺伝子座 においてのみならず同様にＤＰα遺伝子座においても肛Ａ　　ＤＮＡタイプ分け を行うことを可能にする。後で説明するように、現在、ＤＰα遺伝子座の第二エ クソンに２個のみの対立遺伝子が存在することが知られている（Ｔｒｏｗｓｄａ ｌｅら、前掲、を参照のこと）。 これら２個の対立遺伝子（これらの対立遺伝子はＤＰＡＩ及びＤＰＡ２と命名さ れる）の第二エクソンによりコードされる蛋白質配列はわずか３個のアミノ酸に よってのみ相互に異り、そしてこれらの差異はいずれの特定のＰＬＴで定義され るタイプとも関連しないようである。すなわち、ＤＰα変化はＤＰαプローブ　 （Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ８４　：　１６４４−１６４８）により検出されるＲＦＬＰ変化により推定され るのよりも広範ではなく　、ＲＦＬＰ分析によりＤＰα遺伝子中に検出される多 形のほとんどが非コード領域又は近くのＤＰβ遺伝座中にあることが示される。 従っておそらく、ＤＰ−タイプとＤＰαＲＦＬＰマーカーとの間の観察される相 間々係は、ＤＲαＲＦＬＰマーカーとＯＲ特異性との間の連係（Ｓｔｅｔｌｅｒ ら、１９８５、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２　：　８１００−８１０４を参照 のこと）がそうであるのと同様に、ＤＰβ配列変化とＤＰαプローブにより検出 される多形性制限部位との間の連結不安定反映している。 ＤＰα遺伝子及びＤＰβ遺伝子のＤＮＡ配列は本発明の配列特異的オリゴヌクレ オチドプローブの設計において有用な出発点として役立つ。これらのプローブは 、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で該プローブがＤＰα及びＤ Ｐβ対立遺伝子の変異体セグメント中の正確に相補的である配列にのみ特異的に ハイブリダイズするように設計される。これらのＳＳＯプローブは、変異領域中 の変異配列を包含しそして配列特異的ハイブリダイゼーションを許容する任意の 長さのものでよいが、しかし好ましくは、プローブのハイブリダイズする領域は １０〜３０塩基の範囲であり、そしてさらに好ましくは約１７〜１９塩基の長さ である。固定化のため、プローブは、照射により固体支持体に固定され得るポリ Ｔの長いストレッチをも含有することができる。 本発明のＳＳＯプローブはまた、ＤＰ対立遺伝子の特定の変異体セグメントと特 異的にハイブリダイズしそして該特定のセグメントについて知られている他の変 異体配列との不安定化ミスマツチを有するように設計される。好ましくは、プロ ーブはＤＰα及びＤＰβ遺伝子の可変的第二エクソン中の変異体ＤＮＡセグメン トに対して特異的であり、そしてさらに好ましくはプローブは該第二エクソンの ８−１１　、３６　、５５−５７　、６５−６９　、７６、及び８４−８７位近 傍の残基をコードするＤＮＡセグメントに対して特異的である。ＤＰβ及びＤＰ α対立遺伝子の第二エクソンに特異的にハイブリダイズするように設計されたオ リゴヌクレオチドプローブを後に及び実施例中にさらに詳細に記載する。 本発明のプローブはＰＣＲプライマーの検討において前に記載した技法を用いて 合成しそして標識することができる。例えば、プローブはその５′−末端におい て、該プローブを３２ｐ−＾ＴＰ及びキナーゼと共にインキュベートすることに より標識することができる。　　ＳＳＯプローブのための適当な非放射性ラベル は西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。この標識を含有するプローブ を調製しそして検出する方法は実施例において後記する。この様な標識されたプ ローブについての追加の情報のため、米国特許Ｎａ４．７８９．６３０；５ａｉ ｋｉら、１９８８、ムハＬム血ム、　３１９　：　５３７−５４１；及びＢｕｇ ａｗａｎら、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ■、　　６　：　９４３−９ ４７を参照のこと。これらの記載を引用により本明細書に組み入れる。有用な色 原体にはレッド・ロイコ色素及びＴＭＢが含まれる。 本発明のプローブは、サンプル中に存在するＨＬＡ　ＤＰ配列にどのＳＳＯプロ ーブが結合するかを決定することによりサンプル中に存在する対立遺伝子配列を 同定するために使用することができる。　　ＳＳＯプローブとサンプル中の核酸 配列との間に形成されるバイブリドを検出する本発明の目的のために適当なアッ セイ法は当業界において知られている０例えば、実施例に記載されるようなドツ トプロット方式を用いて検出を行ことができる。このドツトプロット方式におい ては、未標識の増幅されたサンプルを膜に結合させ、該膜を標識されたプローブ と共に適当なハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、ハイブリダイ ズしていないプローブを洗浄し、そして該フィルターを結合したプローブの存在 についてモニターする。複数のサンプルが少数のプローブを用いて分析される場 合、完全にマツチしたバイブリドのみの存在を許容するように、好ましい方法は 高ストリンジエンシバイプリダイゼーション条件及び洗浄条件を必要とする。 他の方法は「逆」ドツトプロット方式であり、この方式においては増幅された配 列がラベルを含有する。この方式においては、未標識のＳＳＯプローブが膜に結 合され、そして適当なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標識 されたサンプルに暴露される。次に、ハイブリダイズしなかった標識されたサン プルが適当なストリンジェント条件下で洗浄により除去され、そして次にフィル ターが結合した配列の存在についてモニターされる。 「逆」ロットプロット方式の他の変法においては、ＳＳＯプローブが標識され、 そしてサンプルの核酸が標識されない。 ハイブリダイゼーション及び洗浄の後、標識されたプローブ又はプローブの標識 された断片が横から放出され、そして検出されることにより、サンプル中の配列 が標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かが決定される。二 本鎖バイブリド中の制限部位を認識する制限酵素を用いる消化により標識の放出 が達成される。オリゴマー制限法として知られるこの方法は、米国特許に４．６ ８３．１９４及び対応するＢＰ出願公開Ｎａ１６４，０５４に一層十分に記載さ れており、これらの記載を引用により本明細書に組み入れる。 本発明のどのＤＰ　ＳＳＯプローブがサンプル中のＤＰ配列にハイブリダイズす るかを決定するための方法のいかんに拘らず、ＤＰ　ＤＮＡタイプ分は法の中心 的特徴は、ＳＳｏプローブのパネルの結合のパターンを分析することによりサン プル中に存在するＨＬＡ　ＤＰ対立遺伝子を同定することを含む０本発明の単一 プロブは有用な情報を得るために使用することが確かにできるが、ＤＰβ対立対 立遺伝子嚢化は分散しているので、特定のＤＰ変異体をいずれか１つのプローブ により特異的に同定できるのはまれである。むしろ、実施例に示すように、対立 遺伝子の同一性は、ＤＰα及びＤＰβＰβ子の異るセグメントに対して特異的な 複数のＳＳＯプローブから成る１つのパネルの結合のパターンから推定される。 ）ＩＬＡ　ＤＰ対立遺伝子のタイプ分けは多くの異る目的のために有用である０ 例えば、ＤＰβＰβ性は同種移植片の組織拒絶に関与する。Ａｌａｒら、ムｈ遍 北ゴ旦■、　１３Ｂ　：　１９４７により記載されているように、骨髄移植の研 究が示すところによれば、急性移植片対宿主病及び弱いＭＬＣ反応性を示す３組 の見かけ上回じＩＩＬＡの提供者−受容者対は、ＲＦＬＰ分析によりすべてのＤ Ｐ領領域おいて異っていた。従って、移植片拒絶を防止するための有用な方法は 、ＨＬＡ　ＤＰ　ＤＮＡタイプ分けの本発明の方法を適用することにより、すな わち、提供者及び宿主の両者から得られるサンプル中に存在するＤＰＢ及び／又 は叶α核酸配列へのＳＳＯプローブのハイブリダイゼーションのパターンから提 供者及び宿主中に存在するＨＬＡ対立遺伝子を推定して、提供者及び受容者のＨ ＬＡ　ＤＰタイプをマツチさせることを含むであろう。 ＨＬＡ　ＤＰ　ＤＮＡタイプ分けの本発明の方法の他の重要な用途はある種のＨ ＬＡ　ＤＰ対立遺伝子に関連する自己免疫疾患に対する個体の感受性の決定にお いてである。自己免疫疾患に罹っている個体に所与の対立遺伝子が存在する頻度 を本発明の方法を用いて決定し、そしてその頻度を、他のＨＬＡタイプ分は系を 用いて行われているような対照群の健康な個体について決定された頻度と比較す ることにより、特定のＤＰ対立遺伝子と自己免疫疾患との関連性を見出すことが できる０例えば、Ｈｏｅｉｅｌｌら、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５　：　２２２−２２６は小児脂肪便症と一対のＨＬＡ 　ＤＰα及び肛Ａ　ＤＰＢＲＦＬＰとの間の有意な関係を報告した。この様な研 究はしばしば、患者及び対照の両群において、今まで特徴付けられていないＤＰ 対立遺伝子の発見の追加の利点を与える０例えば、その配列が本発明の重要な観 点であるＤＰＢ１３〜ＤＰＢ１６対立遺伝子は、自己免疫疾患患者群及び対照群 を含む研究の過程で発見された。 このようにして、本発明の方法によりタイプ分けされた４人のＣＤ患者の最初の 研究が示したところによれば、ＤＰＢ４．２対立遺伝子はＣＤ感受性を与える。 イタリア人の個体からのサンプルに基く一層広範な研究はまた、ＤＰＢ４．２対 立遺伝子についてのＣＤの計算された相対危険度（ＲＲ）が９．３であること、 及び本発明の方法によりタイプ分けされた１１人のＣＤ患者の内６人がＤＰＢ３ 対立遺伝子を担持していることを示した０本発明の方法により試薬されたＣＤ患 者の約７８％がＤＰＢ４．２又はＤＰＢ３対立遺伝子を担持しており、これらの 対立遺伝子のいずれかの存在のＲＲは１３．５である。ＣＤを有する米国人の個 体の他の研究において、ＤＰＢＩ対立遺伝子頻度の増加及びＤＰＢ４．２対立遺 伝子の増加が、対照群におけるこれらの対立遺伝子の頻度と比較した場合に観察 された。これらの研究がさらに示すところによれば、ＤＱθ対立遺伝子（ＤＱＢ ２）、ＤＷＱ対立遺伝子（ＤＱＡ４）及びＤＰβＰβ遺伝子（ＤＰＢ４．２又は ＤＰＢ３）の特定の組合わせがＣＤ感受性の危険の増加と関連する。 前に示したように、本発明は個体のＣＤ感受性を決定するための重要な新規な方 法を提供し、この方法はＣＤ感受性と関連するＤＰ対立遺伝子を個体が担持する か否かを決定することを含んで成る。ここに示すように、　ＣＤ感受性付与対立 遺伝子にはＤＰＢ４．２、ＤＰＢ３及び叶Ｂ１対立遺伝子が含まれ、そしてＤＰ Ｂ４．１は相対的に一般的な対立遺伝子であるので、ＣＤ感受性個体における遺 伝子型ＤＰ８４．１／４．２の頻度の増加が存在する。 ＣＤの場合と同様に、本発明は他の深刻な自己免疫疾患について類似の進歩を提 供する０例えば、対立遺伝子頻度を疾患と関係付ける研究が示すところによれば 、特定のＤＰβＰβ遺伝子の頻度はインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ） 及び筋無力症（ＭＧ）の患者において、他のＨＬＡマツチ対照に比べて高い。 ＭＧについては、第二エクソンの３′末端の配列ＩＩＥＡＶをコードするＤＰ対 立遺伝子、例えばＤＰＢ３及びＤＰＢ５の頻度が増加する。 さらに、肛遺伝におけるＤＰＢ４．１対立遺伝子の頻度（健康な対照個体に比べ て）が劇的に上昇し、ＤＰＢ４．１がＭＧからの保護を提供することができる。 　ＩＤＤＭについては、ＤＰβ対立遺伝子ＤＰＢ２．１．　ＤＰＢＢｌ、　ＤＰ Ｂ４．１及びＤＰＢ１３の頻度が上昇する。　ＤＰＢ１３対立遺伝子を担持す名 研究されたＩＤＤＭ患者の多くがさらにＨＬＡ対立遺伝子８１８及びＤＲ３を担 持していた。 本発明のＤＰタイプ分は法はまた、個体がある形の関節炎に感受性であるか否か の決定において重要な進歩を提供した。 例えば、古典的類リウマチ因子陽性の成人関節リウマチ（ＡＲＡ）を有する患者 はＤＰＢ４．２対立遺伝子の頻度の増加を示した。但し、この増加が統計的に有 意であることを保証するためにはさらなる研究を行わなければならない、さらに 、ＤＰｗ２血清型が特定の小児性関節リウマチ（ＪＲＡ）と関連することを長年 知っている。前記のごとく、本発明は２つのＤＰＢ　ＤＮＡタイプに細分類され る血清学的ＤＰｗＺタイプを認め、そして本発明の疾患感受性タイプ分は法が示 すところによれば、ＪＲＡに対する既知のＤＰｗ２関連感受性がｆｌＰ８２．１ 対立遺伝子にさらに特異的に寄与する。試験したＪＲＡ患者の約５５％がＤＰＢ ２．１について陽性であり、他方対照個体のわずか１６％がこの対立遺伝子を有 しており、ＤＰＢ２．１対立遺伝子を有する個体においてＪＲＡについて６．３ のＲＲを与えた。ＪＲＡとＤＰＢ２．１の関連は前に定義されたＨＬＡ　ＤＰｆ ｉｌ域マーカーとの連結から独立しており、そしてこのＪＡＡとＤＰＢ２．１と の関連の有意性は、ＤＰＢ２．２配列がＢｌドメインの６９位の唯一個のアミノ 酸によりＤＰＢ４．２対立遺伝子（ＪＲＡ感受性とは関連しないようである）と 異ることを考えるとき、一層容易に評価され得る。しかしながら、ＤＰＢ２．１ 対立遺伝子を有するほとんどのＪＲＡ患者はさらに疾患関連ＯＲマーカー、例え ばＤＲｗ８．０Ｒｗ５、又はＤＲｗ６を有することに注目すべきである。 従って、本発明はまた、ＪＲ＾感受性を検出する方法を提供し、この方法は、好 ましくは増幅の後に個体の肛Ａ　ＤＰゲノム性ＤＮＡをＤＰＢ２．１対立遺伝子 について特異的なオリゴヌクレオチドブローブにより処理し、そしてハイブリダ イゼーションが生じたか否かを決定することを含んで成る。しかしながら、本発 明の一般的実施はＤＰβプローブの全パネルを用いるであろう。前記のように、 本発明の方法は、ＪＲＡのみではなく広範囲の種類の自己免疫疾患とＤＰの関連 を決定するのにを用である。この事実は下記の表を考慮することにより一層容易 に理解することができ、この表には多数の患者群及び１つの対照群における種々 のＤＰ対立遺伝子について対立遺伝子頻度（示されたＤＰタイプの対立遺伝子の 数を存在するＤＰ対立遺伝子の合計数で除し、そして次に１００倍したもの）が 示される。 表中でＭＳは多発生硬化症患者を示す。 選択された患者群におけるＨＬＡ−ＤＰ対立遺伝子頻度２．１　　　１０％　　 　６％　　３０％　　１２％　　１２％２．２　　０％　　　２％　　０％　　 ６％　　０％３　　６％　　　１３％　　１１％、　　１７％　　１１％４．１ 　　　５６％　　　２５％　　４０％　　４８％　　４１％４．２　　　１０％ 　　　１０％　　６％　　６％　　２２％５　　２％　　　１０％　　０％　　 ０％　　２％６　　２％　　　０％　　２％　　０％　　２％７　　０％　　　 ０％　　０％　　２％　　０％８　　０％　　　６％　　０％　　０％　　０％ ９　　０％　　　６％　　１％　　０％　　０％１０　　１ぎ　　　６％　　１ ％　　０％　　２％１１　　３％　　　２％　　１％　　０％　　０％１２　　 ０％　　　０％　　０％　　０％　　０％１３　　　１％　　　２％　　１％　 　２％　　０％１４　　２％　　　０％　　０％　　２％　　２％１５　　０％ 　　　０％　　２％　　０％　　２％１６　　０％　　　０％　　１％　　２％ 　　０％１７　　　１％　　　２％　　０％　　０％　　２％１８　　０％　　 　０％　　０％　　０％　　０％１９　　０％　　　０％　　０％　　０％　　 ０％２０　　　０％　　　２％　　０％　　０％　　０％−Ｓに、自己免疫疾患 のこれらの研究が示すところによれば、ＤＰβ鎖の５５　、５６及び６９位の多 形性残基の変化が自己免疫疾患に対する遺伝的感受性に関与する。３例えば、５ ５位におけるアラニンからアスパラギン酸への変化がＤＰＢ２．１及びＤＰＢ４ ．２対立遺伝子の両方に存在するが、しかしながらＤＰ８２．１に関連するらし いＩＤＤＭにおいては、６９位のアミノ酸の変化がさらに存在する。但し、感受 性を付与するのは対立遺伝子全体であって単に１つの場所のアミノ酸ではないこ とに注目すべきである。 自己免疫疾患感受性に対するＨＬＡ叶対立遺伝子の効果はＨＬＡ　ＤＲ及びＨＬ Ａ　ＤＱ遺伝子座における類似の知見に反映する。 例えば、５ｃｈａｒｆら、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　８５　：３５０４−３５０８　；及びＨｏｒｎら、１９８８、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋　８５　：６０１２−６０１６は、 ＤＱβ鎖の５７位及びＤＲβＩ鎖の７０位の多形性残基が自己免疫疾患である尋 常性天庖ｆ　（ＰＶ）及びＩＤＤＭに対する遺伝的感受性に関連することを報告 している。 前記のように、医療技術が発達するに従って、グレージス病、全身性紅斑性狼疹 及びショーグレン（Ｓｊｇｇｒｅｎ）症候群を含めてのより多くの疾患又は病的 状態が種々のＤＰ対立遺伝子と関連することが知られてきている。本発明はこの 様な対立遺伝子を他の対立遺伝子から区別する方法を提供し、そしてそれ故に自 己免疫疾患について高い危険性のある個体を同定する手段を提供する。好ましい ｎ様においては、その感受性が決定されるべき個体が、ＨＬＡ　ＤＰ遺伝子座の 標的領域を増幅するためにＰＣＲ法を用いてまず）ＩＬＡ　ＤＰタイプについて 分析される。次に、ＳＳＯプローブが増幅された標的領域にハイブリダイズされ 、そして増幅されたＤＮＡ中に存在する特定のＤＰ対立遺伝子がＳＳＯプローブ の結合パターンから決定される。最後に、増幅されたＤＮＡ中に存在する対立遺 伝子が自己免疫疾患に関連する対立遺伝子であるか否かを決定する。 本発明はしかしながら、有意義な利益を提供する能力において医科学の分野に限 定されない。ＤＮＡＮイタ分は法は今やさらに、犯罪の現場に残された証拠と個 体とを関連付けることにより犯罪者又は犠牲者の特定が達成される場合のように 犯罪事件を解決するために、又は個体の母系又は父系を決定するために生物学的 材料が使用される場合のように非犯罪的性質の他の事件を解決するために、個体 特定の重要な分野において有意義な役割を演する。 本発明を用いる目的のいかんに拘らず、種々のＤＰ対立遺伝子間の相違がこの方 法の成功の鍵である。対立遺伝子によりコードされている種々のアミノ酸が並列 されそして試験される場合、ＤＰ対立遺伝子間の最も有意な相違が非常に容易に 検出され得る。この様な並列を下に示す。ここではダッシュはＤＰ８４．１対立 遺伝子（ＳＸＢと称する種々のＤＰβ対立遺伝子及びＤＰβ偽遺伝子について） と又はＤＰＡＩ対立遺伝子（ＳＸＡと称するＤＰαＤＰＡ２対立遺伝子及びＤＰ α偽遺伝子について）と同一であることを示す。この表示において、番号位置は 成熟蛋白質サブユニットについてのものであり、対立遺伝子の標示は左にあり、 そして代表的な細胞源は右に示しである。 しかしながら、実際的且つ経済的な態様でＤＰ対立遺伝子を検出しその間を区別 するためには、対立遺伝子のヌクレオチド配列を知らなければならない。種々の ＤＰα及びＤＰβ対立遺伝子のヌクレオチド配列の部分を下に示す、配列は前記 と同じである。本発明の代表的なブライマーがＤＮＡの生産を可能にし、そのコ ドン８〜９０の配列を決定することができる０本発明の種々のプローブとのハイ ブリダイゼーションのための好ましい標的配列である対立遺伝子配列の位置は１ ・・・Ａ・・・１゜１・・・Ｂ・・・１．　　ｌ・・・Ｃ・・・１．１・・・Ｄ ・・・１，１・・・Ｅ・・・Ｅ、及びＩ・・・Ｆ・・・１として示される。 上記のＤＮＡ配列は本発明の重要な観点である。配列の一方のみの鎖が示されて いるが、当業者は、上記の情報から配列の他方の鎖が推定され得ることを認識す る。この情報は本発明のプローブの構成を可能にする。本発明の多くの例示的な プローブが後記の実施例に示される。しかしながら、ＤＰβ対立遺伝子のハイブ リダイゼーション分析のための適当なＳＳＯプローブはある種の多形性配列を含 んでなる（又はそれに対して相補的である）であろう。本発明の６セツトの例示 的プローブを下に記載する。各セットは肛Ａ　ＤＰβ遺伝子の第二エクソンの特 定のセグメント中の多形間を区別するように設計されている。セグメント表示は 前記の通りである。それに対してプローブがハイブリダイズする対立遺伝子変異 体内にコードされている多形性残基を１文字アミノ酸コードで（ダッシュはプロ トタイプ残基がそれらの位置に存在することを示す）プローブ配列の左に示す。 プローブは、多形性アミノ酸残基をコードする領域を含み、そして約１８ヌクレ オチドの長さを有するものとして示される。多形性アミノ酸残基をコードしそし てそれ故に表示されたセグメントをコードする対立遺伝子を検出するためのプロ ーブ内に含まれなければならないプローブ中の配列は、配列中のスラッシュ記号 の間に存在する。それに対してプローブがハイブリダイズするであろうＤＰ対立 遺伝子をプローブの右に示す。 ＨＬＡＤＰＳＳＯプローブ 本発明のプローブはハイブリダイゼーションにおいて使用するために単鎖である から、例えばコード鎖と／％イブリダイズするようにプローブが設計されている ことは、非コード鎖上に存在する相補鎖にハイブリダイズするであろう、同様に 有用なプローブを設計することができないことを意味するものではないことに注 目すべきである。 上記の配列情報は本発明の他の重要な観点にも関連する。 多くの異るＤＰ対立遺伝子を増幅するために本発明の好ましいプライマーが設計 される。多くの場合、下記の実施例において記載するように、この様なプライマ ーは非常に有用である。 しかしながら、当業者は、前記の配列情報が、対立遺伝子特異的増幅を可能にす るであろうプライマーを設計するためにも使用され得ることを認識する。この様 な対立遺伝子特異的ブライマーは単一の対立遺伝子又は既知対立遺伝子のある１ つのサブセットのみを増幅するであろう０例えば、本発明のｒ　ＤＥＡＶ　Ｊプ ローブは、ｒ　ＤＥＡＶＪ　ＤＰβ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅を提供す るためのブライマ一対の一方のプライマーとして使用することができる。 本発明はまた、本発明の方法を実施するために重要な構成要素を含んで成る子容 器ユニットを含むキットに関する０例えば、ＰＣＲのためのプライマーは本発明 の好ましい態様において必要であるから、このキットはＰＣＨのためのプライマ ーを含有することができる。これらのプライマーは少な（ともＤＰβ遺伝子を増 幅し、そして適当な場合には、例えば法医学文机において、ＤＰα遺伝子を増幅 するプライマーも含まれ得る。キットはまた、少なくともＤＰβ遺伝子のための ＳＳＯプローブを含有しなければならず、そして適当な場合には、同様にＤＰα 遺伝子のためのプローブも含有する。幾つかの場合には、ＳＳＯプローブをハイ ブリダイゼーション分析のために有用な適当な支持膜に固定することができる。 キットの容器に収容することができる他の任意成分には、例えば、ブライマー延 長生成物の合成を触媒するための試薬、基質ヌクレオチド、標識するために用い る手段（例えば、標識がビオチンである場合には、アビジン−酵素接合体及び酵 素基質並びに色原体）、並びにＰＣＲ又はハイブリダイゼーション反応のための 適当な緩衝剤が含まれる。上記の成分に加えて、キットは本発明の方法を実施す るためのキットを含むことができる。 本発明の多くの実施例を下に示すが、これらは例示のためにも与えられそして本 発明の範囲を限定するものではない。 請求の範囲内の本発明の多くの態様が、前記の記載及び後記の実施例を読むこと により、当業者には明らかであろう、下記の実施例において、ある種の技法は特 にことわらない限り標準的なものである。これらの技法には、５ｈａ−ら、１９ ８０、ＬＪ」し町印工１５２：５６５−５８０により実質的に記載されているよ うにして実施されるＰＬＴが含まれる。一般に、リンパ球ブライミングのために は、リスボングー及びステイムレータ−細胞が解凍され、洗浄され、そしてグル タミン及び抗生物質を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（完全培地）中に再懸 濁される。リスボングー細胞が照射されたステイムレータ−細胞と２：ｌの比率 で混合され、そしてこの細胞混合物が３７℃にて１０日間インキエベートされた 。照射されプライムされたステイムレータ−細胞が照射されたステイムレータ− 細胞と共に完全培地中で同時培養された。４８時間後、３Ｈ−チミジンが培養物 に添加された。細胞が１８時間後に回収され、そしてトリチェラムの取込みがβ −放射の計数により評価された。 ＤＮＡ配列分析はＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　 ：　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。 １９８２）により記載されているようにして行われた。一般に、分析されるべき 配列はＭ１３クローニングベクターにクローニングされ、そしてＭａｘａ霞−Ｇ 、１ｂｅｒｔ技法により又はジデオキシチェインターミネーション技法により分 析された。プライマー及びプローブの両者の合成オリゴヌクレオチドは市販の装 置及び当業界において知られている技法を用いて合成された。 １隻■工 ＨＬＡ　ＤＰ・１゛云のＤＮＡ　　の ＤＰα遺伝子及びＯＰβ遺伝子の種々の対立遺伝子の可変第二エクソンのＤＮＡ 配列を決定した。使用したＤＮＡサンプルは、できるだけ広範囲のＰＬＴで定義 されるＤＰ対立遺伝子を代表するように選ばれた。　　ＤＮＡを、標準的６タイ プのＤＰ−についてホム接合性である細胞系から、異常なタイプ分は反応を示す 細胞から、及びＤＰブランク反応を示す細胞から抽出した。ＤＮＡの抽出は、Ｍ ａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒＭａｎｕａｌにより記載されている標準的技法により行った。　ＤＰα 遺伝子及びＤＰβ遺伝子の可変第二エクソンは、前記のようにしてＲＣＲ法によ り増幅した。増幅されたＤＮＡ配列をＭ１３由来のベクターにクローニングし、 そしてチェインターミネーション法によりＤＮＡ配列を決定した。使用した細胞 系、それらのＤＲ血清型、それらのＰＬＴで定義されるＤＰｗタイプ、及びこれ らが含有することが見出されたＤＮ＾で定義される対立遺伝子を下記の表に示す （空欄はデータが決定されていないことを示す）。 ＯＰ″ＭＡＳ”はＩ）ＰＢ４．２対立遺伝子に関連する新しく定義されたＤＩ” 特異性についての仮の表示である。　”ＣＤ”細胞系は実際にＣＤ遺伝からのサ ンプルである。 ＊は異常なりＰｗ表現型を有する細胞である。 前記から示されるように、ＨＬＡ叶サブタイプのＤＮＡ分析が示すところによれ ば、特定の配列が既知のＰＬＴで定義されるＤＰｗタイプ分けと相関し、プライ ムドＴ−細胞により認識される多形性エピトープがＤＰβ鎖上に存在することが 示される。 幾つかのＤＰタイプ、例えばＤＰｗ２及びＤＰＩについは、配列分析がサブタイ プ変形体（ｖａｒｉａｎｔ）を示した。ＤＰｗ２についての変形体はＤＰＢ２． １及びＤＰＢ２．２と命名され、　ＰＬＴについてＤＰｗ４″ｎｅｔ＋’例えば ＬＢＩ）又はＤＰｗ４”　（例えばＡＰＤ）としてタイプ分けされた細胞はさら にまれなりＰＨ１，２サブタイプを含有する。ＤＰ８４．２サブタイプは配列に よりＤＰ８４．１対立遺伝子によりもＤＰ８２．１対立遺伝子により一層関連付 けられる。個々のＣＤＩＩはＤＰｗ２としてタイプ分けされるＰＬＴであるが、 密接に関連するＤＰＢ２．１及びＤＰＢ４．２対立遺伝子を含有する。 上記の結果はまた、ユニークＤＰβ配列がＤＰｗｌ、　ＤＰｗ３．　ＤＰｗ５及 びＤＰｗ６特異性に関連することを示し、そしてこれらの対立遺伝子はこの相間 々係を反映するように命名された。しかしながら、少数の例外においては、細胞 系ＤＫＹはＤＰｗ５としてタイプ分けされているがしかしＤＰ８２．１対立遺伝 子を含有し、そして個々のＣＤ２はＤＰｗ２としてタイプ分けされるＰＬＴであ るがしかしＤＰ８４．２及び叶ＢＩＯ対立遺伝子を含有する。 叉施炭Ｉ ＤＰα　びＤＰ゛　　云　のＰＣＲ 実施例１に記載した細胞の幾つかのＤＰα及びＤＰβ遺伝子をＰＣＨにより増幅 した。使用された合成ブライマーを下に示す。 この表示において、左側のプライマーＧＨ９８及び０８０１は上方鎖からもので あり、そしてＤＮＡポリメラーゼが右側に延長するのを指令する。右側のプライ マーＧ）１９９及びＤＢＯ３は下方鎖からのものであり、そして左側への合成を 指令する。ブライマーが結合する及びブライマー延長のための鋳型として作用す る遺伝子の領域も示されている。小文字、標的ゲノムＤＮＡ　（反対の鎖に示さ れる）に相補的でないブライマー中の塩基を示す。プライマー中のこれらの変化 が増幅されたＤＮＡの末端に制限酵素部位（ＢａｍＨＩ又はＰｓｔＩ）を導入し 、そして増幅されたＤＮＡのクローニングを促進する。ＯＰαの第二エクソンの 増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーＧ　Ｈ９Ｂ及びＣＤ９９ は２４３ｂｐセグメントを増幅する。Ｐｃｔ？生成物の最初の２ｂｐはこのエク ソンを挟む介在配列からのものである。オリゴヌクレオチドプライマーＤＢＯＩ 及びＤＢＯ３はＤＰβの第二エクソンの２４９ｂｐセグメントを増幅する。この 生成物の左の１３ｂρ及び右の１７ｂｐは介在配列からのものである。ブライマ ーのハイブリダイゼーション及び延長されたプライマー含有生成物の合成は、Ｅ Ｄ　２５８，０１７、及びＰＣＲを実施するために使用されるＴｈｅｒｍａｌ　 Ｃｙｃｌｅｒの製造者ＰＥＣｌにより提供される処方中に実質的に記載されてい る。 ・・・　　　　　　　　　　　　　　ＡＱＤＰβ対立遺伝子の第二エクソンを増 幅するための本発明の他の２つのプライマーはＵＣｌ３及び１ＩＧ２１と称され る。これらのブライマー、及び本発明の他のＤＰβブライマーの配列を下記する 。 １座■１ ＤＰ　欠１゛　云　のバイブｉ　゛イゼーション　　のための下記の表に記載す る０表中には、プロプの名称、プローブの配列、該プローブがハイブリダイズす る対立遺伝子中にコードされている多形性アミノ酸配列、セグメントの名称、並 びにハイブリダイゼーション及び洗浄の条件が示される。プローブは３ｔＰ又は 「Ｘ」標識を有するものとして示され、ここでＸは後の実施例に示されるように ＨＲＰを表わす、プローブ配列がＸ及びこれに続くプローブの名称により示され る場合、プローブの配列はＸの後に名称が付されたプローブのそれと同一である が、但し２ｔｐ標識がＩＩＲＰ標識により置換えられている。 当業者は、使用される標識のタイプに依存してハイブリダイゼーション及び洗浄 の条件が異ることを認識する。好ましい態様においてはプローブは非放射性標識 される（例えばＨＲにより）であろうが、アイソトープ（例えばＩＰ）標識を有 するプローブの幾つがか使用されている。従って、ｘｔｐ−標識プローブ及びＨ ＲＰ−標識プローブについてハイブリダイゼーション及び洗浄の条件が示され、 これらの条件は実験的に決定された（Ｂｕｇａｗａｎら、１９８８、Ｊ、Ｉｍａ ＋ｕｎｏ１．１４Ｈ１２）　：　４０２４−４０３０を参照のこと〕０表におい て、言及される条件は５ｘＤｅｎｈａｒｄｔｉ液、０．５％ＳＯ５から成るハイ ブリダイゼーション溶液及び示される蓋（すなわち、０．１　ｘ　、　３　ｘ　 、　５　ｘ）０）ＳＳＰＥを仮定しているｅ　５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は ５００　ｄ当り０．５ｇのＦｉｃｏｌｌ、０．５ｇのポリビニルピロリドン、０ ．５ｇのＢＳＡ（Ｐｅｎｔａｘ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含有する。洗浄溶液は０ ．１　ｘ　５ＳＰＥ及び０、１％ＳＯ３を含有する（ＨＲＰ−標識プローブのた めには０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−１００が５ＤＳＯ代りに使用される）、洗浄 段階はｉｏ分間にわたって同じ温度で行われる。しがしながら、実施例工１に記 載するように、サンプル中のＤＰ対立遺伝子のタイプを決定するためにパネル中 の多数のプローブが使用される場合の好ましい条件である、より均一なハイブリ ダイゼーション及び洗浄条件を可能にするようにテトラメチルアンモニウムクロ リド又は類似の塩を使用することができる。 ？Ｐ　　　　　　　　　　　ＨＬＡ　ＤＰタイプ　レノためのＳＳＯ上記の表に 関して０Ｂ２８はＤＢ３２と交叉ハイブリダイズするので、ＤＢ２Ｂ及びＤＢ３ ２の代りにそれぞれプローブＤＢ５Ｂ及びＤＢ５９を用いて卓越した結果が得ら れることに注目すべきである。さらに、プローブＤＢ６３はＤＢ３９より好まし い。 スｍ ＤＰα・立゛　−のハイブリダイゼーション　析のためのＳＳＯプローブ ＯＰα対立遺伝子のハイブリダイゼーション分析のための適当なＳＳＯプローブ の例を下に示す。２セツトのプローブが例示され、各セットは、Ｉ（ＬＡ　ＤＰ α遺伝子の第二エクソンの特定のセグメントにおける多形性の間を識別するよう に設計されている。　ＡＳＯＩ及びＡＳＯ２はそれぞれ、メチオニン（Ｍ）及び グルタミン（Ｑ）を含有する多形性セグメントを含む領域におけるＤＰＡＩ対立 遺伝子に結合する。ＡＳＯ３及びＡＳＯ４はそれぞれ、グルタミン及びアルギニ ン（Ｒ）を含有する多形性セグメントを含む領域のＤＰＡ２対立遺伝子に結合す る。　ＡＳＯ２及びＡＳＯ４はグルタミンを含有する多形性セグメントからアル ギニンを含有するそれを区別する。これらのプローブは、これらの多形性アミノ 酸残基をコードするＮ城を含む、これらのプローブを用いるハイブリダイゼーシ ョンは通常、５Ｘ　５ＳＰＩ！、　　５ＸＤｅｎｈａｒｄ　を及び０．５％ＳＤ Ｓを含有する溶液中で４２℃にて少なくとも１時間にわたり行われる。これらの プローブと共に使用される洗浄条件も下される。 ＨＬ＾ＯＰαＳＳＯプローブ プローブ　　　　’！−−−−刀　　　　迭−企一条一住２４ＨＴＣｓからのＰ ＣＲ増幅されたＤＰβ配列をＩＰ−標＠　ＳＳＯプローブのパネル（ｎ＝９）に より、ドツトプロット法で分析し、そしてＤＰタイプをプローブ結合のパターン から推定した。 細胞からのＤＮＡの抽出は実施例１に記載した通りであった。 細胞ゲノムの標的領域、すなわちＤＰβ遺伝子の第二エクソンを実施例２に記載 したようにしてＰＣＲ法により増幅したが、ＤＮＡは前記の表に挙げた細胞から のものであった。 増幅されたＤＮＡをフィルター上にドツトプロットし、サンプルのパネルを含む 個別のフィルターを調製して、各ＳＳＯプローブとのハイブリダイゼーションに より分析を行った。サンプルをドツトプロットするため、５ｉｌｌの各増幅され たサンプルを０．４　Ｎ　、ＮａＯＨ及び２５ｍＭ　ＥＤＴ＾を含有する溶液１ ９５Ｊ１１で希釈し、そして次の様にしてＧｅｎａｔｒｏｎ　４５（Ｐｌａｓｃ ｏ）ナイロンフィルターにスポットした。まずフィルターを水で湿し、これらを ドツトプロットの調製のためのＢｉｏ−ｄａｔ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ。 リッチモンド、ＣＡ）中に置き、そして各ウェルを０．４戚の２０　ｘ　５ＳＰ Ｅ　（３，６Ｍ　ＮａＣｆ、２００ａ＋Ｍ　ＮａＨｚＰＯａ及び２０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ）によりすすいだ、フィルターを取り出し、２　ｘ　５ＳＰＥ中ですすぎ、 そして真空オープン中で８０°Ｃにて３０分間ベータした。 フィルター上のサンプルを本発明のＳＳＯブコーニーハイブリダイズせしめた。 ハイブリダイゼーションは０．２５〜０．５ｐｍｏｌｅのプローブを用いて２〜 ５ｄのハイブリダイゼーション溶液中で行った。このＤＰαタイプ分けの結果を 下に示す。 この結果は、フィルター上のサンプルがハイブリダイズしたプローブ及びプロー ブにより検出されたコードされているアミノ酸を示す。 、　　　　　　１１ヌとり 一〜の寸の　ロト■■０−への啼 ＳＳＯプローブを用いるハイブリダイゼーション分析に暴く細胞のＤＰβタイプ の決定を上に検討した。サンプルのＤＰβタイプを決定するため、サンプルへの プローブの結合を試験した。存在する対立遺伝子をプローブ結合のパターンから 推定した。例えば、サンプルｌはＳＳＯプローブＤＢＩＩ、　ＤＢＩ７及びＤＢ ２０と共にバイブリドを形成した。ＤＢＩｌ、　ＤＢ１７及びＤＢ２０によりコ ードされるアミノ酸はそれぞれＶＹＱＬ、　ＤＥＤ及びＬＥＥＫである。 ＤＰβ対立遺伝子アミノ酸配列のセグメン）Ａ、Ｃ及びＤの試験が示すトコロニ ヨれば、配列ＶＹＱＬがＤＰＢ６．　ＤＰＢＩＩ及びＤＰＢ１３中に存在し；配 列ＤＥＤがＤＰＢ１７．　ＤＰＢ１４．　ＤＰＢ１２．　ＤＰＢ９．　ＤＰＢ６ 及びＤＰＢ３中に存在し；配列ＬＥＥＫ（Ｌ　　　Ｋ）がＤＰ８１Ｂ、　ＤＰＢ １４゜ＤＰＢ４．１．　ＤＰＢ４．２．　ＤＰＢ５．　ＤＰＢ７．　ＤＰＢ３及 びＤＰＢＩ中に存在する。 このプローブとハイブリダイズする３つの配列を含有する唯一の対立遺伝子はＤ ＰＢ３である。従って、ＳＳＯＳイタ分けに基くサンプル１のＤＰタイプはＤＰ Ｂ３である。 他のサンプルのＤＰＢタイプを同じ型の分析により推定し、そして決定されたタ イプを上に示す。この表示において、星印（＊）は配列分析によりＤＰβ遺伝子 型も決定されている細胞を示す、細胞系ＣＯＸ　（最初−１→ｗ３）及び８Ｍ２ １　（最初Ｈ１→ブランク）のＤＰｗタイプが最近、示されたタイプに変更され た。 記号上はプローブにより得られる弱いシグナルを意味する。 幾つかの場合（８Ｍ２１及びＴＯＫ）において、この弱いシグナルは、アミノ酸 残基ＶＨＹＬをコードする領域Ａ中の追加の多形性配列であってＤＢＩＩプロー ブと交叉ハイブリダイズするものの存在を反映している。この配列は領域Ａプロ ーブＤＢ２２を用いて−層便利にタイプ分けすることができる。他の細胞系（８ Ｍ９２）については、ＤＢＩＯプローブにより認識される配列へのＤＢＩＩプロ ーブのバックグラウンド交叉ハイブリダイゼーションが存在するようである。同 様に、Ｉ］８１８プローブに相補的な配列上でＤＢ１９プローブによる交叉ハイ ブリダイゼーションシグナルが生ずるようである。 この実施例で使用されるＳＳＯのパネルは５個の多形性領域の内の３個のみにお いて変化を検出し、そしてこれら３個の領域においてすべての対立遺伝子変異は 検出しない。この実施例の方法を用いるタイプ分は系は単純でありそしてＨＴＣ について明瞭であるが、しかし多形性の寄せ集めが与えられる場合、種々のプロ ーブのハイブリダイゼーションパターンが対立遺伝子のユニークな一対より多い ものとして解釈され得る場合、時としてヘテロ接合性個体について不明瞭なタイ プ分けを生じさせる場合がある。この不明瞭性は異るＤＰβ対立遺伝子を構成す るＤＮＡβ配列変異体の多くの異る組合せから生ずる。しかしながら、残りの多 形性領域を含む本発明により提供される追加のＳＳＯプローブを用いて、ヘテロ 接合性固体について明瞭なタイプ分けを得ることができる。 裏胤医旦 ＰＣＲれた　・＄　のＤＮＡ配薯　　によるハ１日８声　のＨＬＡ　ＤＰ　　イ ブ　け 小児脂肪便症（ＣＤ）を有する４人の患者の細胞をＰＬＴ−タイプ分けし、そし てＤＰβの第二エクソンのＤＮＡ配列を実施例１に記載したようにして決定した 。　ＣＤ診断は臨床症状に基いた。 ＣＤ細胞のＤＰβ（第二エクソン）のＤＮＡ配列決定により得られた分析の結果 を上に検討した。これらの結果から、ＣＤ細胞が非−ＣＤ細胞と比較される場合 にＤＰ８４．２対立遺伝子の頻度に見かけ上の増加が存在することが観察される 。さらに、３０の非−ＣＤ細胞系の１つのみに観察されたＤＰＢＩＯ対立遺伝子 配列が２人の独立のＣＤ患者に存在する。 １隻■ユ ＳＳＯプローブハイブリダイゼーション　　によるハ’ＸＪＭ症患　のタイプ　 け ＣＤを有する１９人の患者及び４３人の非−ＣＤ対照の細胞を、ＳＳＯプローブ ハイブリダイゼーション分析によりＨＬＡ　ＤＰタイプについて分析した。　Ｃ Ｄの診断は臨床症状に基いた。　ＣＤ患者及び対照個体はすべてイタリア人であ った。　　ＤＮＡの抽出は実施例１に記載したようにして行った。サンプルのＰ ＣＲ増幅は実施例２に記載したようにして行った。増幅された配列の分析は実施 例４に記載されているようにして行った。 分析の結果が示すところによれば、非−ＣＤ対照に比べてＣＤ患者においてＤＰ ８４．２対立遺伝子の有意な増加が存在した。すなわち、この対立遺伝子は１９ 人のＣＤ患者中１２人に存在したが、４３人の対照老中わずか３人に存在した。 　ＤＰＢ４．２及び［１ＰＢ３対立遺伝子は、１９人のＣＤ患者の内１７人及び ４３人の対照の内１５人に存在した。遺伝子型ＤＰ８４．１／４．２は１９人の ＣＤ患者の内１０人及び４３人の対照の内わずか１人に存在した。 実ｌ１１影 法　　・サンプルのＨＬＡ　ＤＰタイプ　番容疑者のゲノム核酸を含有するサン プルを得る。該ゲノムの標的領域、すなわちＤＰα及びＤＰβ遺伝子の第二エク ソンを含有する領域を実施例２に記載したようにしてＰＣＲ法により増幅するが 、該実施例における細胞からの核酸の代りに容疑者からの核酸を用い、そして増 幅されたサンプルは３ｔｐ−標識を含有する。同じフィルターにドツトプロット されておりそしてポリーαＴティンによりフィルターに固定されている本発明プ ローブと上記の増幅されたサンプルとをハイブリダイズさせる。このフィルター のためのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は完全にマツチしたバイブリド のみを二本鎖として残す。フィルターを試験してどのプローブが標識されたサン プルとハイブリダイズするかを決定する。 容疑者から得られたサンプルと比較されるべきサンプルをＤＰタイプについて同 じ方法により、すなわちＰＣＲ増幅及び固定化されたＳＳＯプローブとのハイブ リダイゼーションにより試験する。容疑者からのサンプル及び比較サンプルのＳ ＳＯプローブへの結合のパターンを試験してハイブリダイゼーションパターンの 同量を決定する。 叉施勇工 ′　サビパーオキシ゛−ゼによ　　−されたＳＳＯプローブを　　してのＨＬＡ 　ＤＰタイプ　番３９人の個体からの細胞のパネルをＤＰβ対立遺伝子について ＳＳＯプローブを用いて第二エクソンの変異に関してタイプ分けした。プローブ を西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識し、そしてバイブリドをド ツトプロット法により検出した。 分析された細胞は、１４人のＩＩ）ＤＭ患者、５人の対照非−ＩＤＤＭ患者、及 びＤＰブランクとしてＰＬＴによりタイプ分けされた１９人のＨＴＣからのもの であった。ＩＤＤＭ患者は臨床症状により同定された。実施例１に記載したよう にして細胞からＤＮＡを単離した。標的領域、すなわちＤＰβ対立遺伝子の第二 エクソンをＰＣＲ法を用いて、５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，３ ）、２．５ａ＋Ｍ　ＭｇＣｊ！ｚ　。 １００ｘ／ａｆゼラチン、０．７５ｄづつの４種のデオキシヌクレオシドトリホ スフェート、ブライマーＤＢＯＩ及びＤＢＯ２、並びにＴａｇポリメラーゼを含 有する反応混合液２００　ｄ中で増幅した。増幅工程は次の通りであった８３０ 秒で９４℃への加熱及びこの温度での３０秒間のインキュベーション＝１分間で ５５℃への冷却及びこの温度での３０秒間のインキュベーション：３０秒で７２ ゛Ｃへの加熱及びこの温度での４５秒間のインキュベーション。このサイクルを ４２サイクル反復した。増幅の後、反応混合物をサンプリングし、そして３％Ｎ ｕｓｉｅｖｅ及び１％アガロースを含有するゲル上でのゲル電気泳動によりモノ ターし、すべてのＤＮＡ量が匹敵するか否かを決定した。 ５０ｄｌドツトの変性され増幅されたＤＮＡをＧｅｎａｔｒａｎナイロン膜上に プロットしそしてサンプルを含有するフィルターを５分間Ｕｖ処理することによ り、ドツトプロットされたサンプルを含有するフィルターを調製した。後者の処 理はサンプルを膜に固定するためのものである。５ｕ１のＰＣＲ反応混合物を、 ０．４　Ｎ　ＮａＯＨ及び２５＋ｗＭ　ＥＤＴＡを含有する１５０Ｉの全容量中 で５分間処理することにより、増幅されたＤＮＡを変性させた。ＨＲＰで標識さ れたＡＳＯプローブとのハイブリダイゼーションのために８枚のレプリカフィル ターを調製した。 ハイブリダイゼーションに先立ち、サンプル含有フィルターをプローブを含有し ないプレーハイブリダイゼーション溶液（１ｘ　５ＳＰＥ　、　５　ｘ　Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ溶液、１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−１００）中で１５分間インキュベート した。プレーハイブリダイゼーションにおいてはＳＤＳの代りにＴｒｉｔｏｎ　 ｘ−１００が使用された。さらにｌ　ｐｊｃｏｍｏｌｅ、’ｄ！のプローブを含 有する同じ溶液中でハイブリダイゼーションを行った。各フィルターを、ＨＲＰ 標識のプローブの１つを含有するハイブリダイゼーション溶液２．５−と共に４ ５分間インキュベートした。使用したプローブはＤＢ２７゜ＤＢ２８．　ＤＢ２ ９．　ＤＢ３０．　ＤＢ３１．　ＤＢ３２．　ＤＢ３３及びＤＢ２５であった。 プローブ及びハイブリダイゼーション条件は実施例３において表に示す。ハイブ リダイゼーションの後、実施例３に記載したようにして、適当なストリンジェン ト条件下で、すなわち０、１　ｘ　５ＳＰＥ、　０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ４０ ０中で４２°Ｃにて５分間洗浄した。ＨＲＰ標識ＳＳＯプローブはＰＣＴ公開８ ９１０２９３１及び８９１０２９３２に記載されている方法と実質的に同様にし て調製した。 これらの記載を引用によりこの明細書に組入れる。 これらの方法は実質的に、一端にホスホラミダイト成分を有しそして他端に保護 されたスルヒドリル成分を有する親水性ポリマー鎖（例えば、ポリオキシエチレ ン）を含んで成る線状連結分子を用いて核酸プローブを誘導体化することを含む 。ホスホラミダイト成分は当業界においてよく知られている反応（例えば、月囮 旦、工０工勤互句−ｏｎ　Ｌ且具工録：１８５９−１８６２）により核酸プロー ブにカップリングし、他方脱保護されたスルヒドリル基は蛋白質例えばＨＲＰと ジスルフィド結合又は他の共有結合を形成することができる。）ＩＲＰはＮ−マ レイミド−６−アミノカプロイル基を介して連結基に接合する。Ｎ−マレイミド ー６−アミノカプロン酸を４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホン酸ナト リウムによりジメチルホルムアミド中１当量のジシクロへキシルカルボジイミド の存在下でエステル化することにより標識が調製される。精製の後、生成物をＨ ＲＰ含有リン酸緩衝液にＦＩｌ？Ｐ　：エステルの重量比８：１で加えた。オリ ゴヌクレオチドプローブをＤＮＡ合成機中で合成し、そして（Ｃ，Ｈ５）３Ｃ５ −（ＣＨ２ＣＦＩｔＯ）、−Ｐ（Ｃ１１２ＣＨＩＣＮ）　（Ｎ（ｉ−ＰＲ）ｚ） の構造を有する連結分子を、ホスホラミダイト合成条件を用いて接合させた。ト リチル基を除去し、そしてＨＲＰ誘導体及びプローブ誘導体を一緒に混合し、そ して標識されたプローブを形成するように反応せしめる。 ハイブリダイズしたプローブを含有するサンプルを、５ｈｅｌ−ｄｏｎら、１９ ８６、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３　：　９０８５ −９０８９に記載されているようにして、ＴＭＢ／ＨｚＯｔを用いる発色反応に より検出した。反応系を実施例１０に後者する。増幅されたＤＮＡサンプルのＨ ＬＡ　ＤＰ遺伝子型はフィルターから容易に明らかであった。 ス１１殊則 ＨＲＰで　　　れたｓｓｏプローブによるＨＬＡ　ＰＯイブ　けＡ１匹」１損 ＤＰＢタイプ分けは１４又はそれより多くのＳＳＯプローブ（配列特異的オリゴ ヌクレオチド）を用いることができ、ＤＮＡに制限がなければ増幅は０．５〜２ ４のＤＮＡに対して２００１１１の反応容量中で行われる。より少量、すなわち １１００ｎ、のＤＮ＾を増幅することができるが、この様なサンプルによればよ り多くのサイクル、すなわち４５サイクル、の増幅が行われるべきである。 ＰＣＲ反応は下記のものを１〜２秒間渦動して混合することにより開始される。 ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５〜２■１０　ｘ　Ｔａｑ緩 衝液　　　　　　　　　　　　２０ｉ１００　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　　　　　　　 　　　　　　１．５ＪｌｌＤＰＢブライマー［１０ｍ　ＵＣｌ３　ｏｒ　ＤＢＯ ＩＩ　　　　１０ｍＤＰＢブライマー［１０団ＬＩＧ２１　ｏｒ　ＤＢＯ３］　 　　　１０Ｊ！！Ｔａｑポリメラーゼ５　Ｕ／Ｉ！１１．２ｍガラス蒸留した水 を添加して最終容量２００　ｄとする。１０ｘＴａｑ塩は５００ｍＭ　ＫＣｊ２ 、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，３）、１５ｍＭ　ＭｇＣｆ　ｚ、及び１■／ ｄゼラチンである。負対照（すなわちＤＮＡなし）を各ＰＣＲ操作に含めるべき である。典型的には、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩｏ＋ｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒにおいて３０〜３５サイク ルの増幅で十分である。サイクルは、９６℃にて３０秒間変性し、そして６５℃ にて３０秒間アニールしそして延長するように設計される。ブライマ一対ＤＢＯ Ｉ／ＤＢＯ３が使用される場合、アニールは５５°Ｃにて３０秒間であり、そし て延長は７２℃にて３０秒間である。ＰＣＲをチェックするため、及びドツトプ ロットのために使用されるべきＤＮＡの量を決定するために分析ゲルを用いるこ とができる。 Ｂ、ドツトプロット 典型的には、５４の増幅されたＤＮＡは、１回のドツトプロットのためには十分 過ぎる約２００ｎｇを含有している。しかしながら、１４ドツト以上が必要かも 知れないこと、すなわちドツトプロットを調製するために約７０ｍの増幅反応混 合物が使用されるかも知れないことを記憶すべきである。５１１１の増幅反応混 合物当り５０Ｊ１１の０．４　Ｎ　ＮａＯＨ及び２５ｍＭ　ＥＤＴＡがＤＮＡに 添加される。ＤＮＡの変性を完了するのに５分間で十分である。 Ｇｅｎａ　ｔｒａｎ膜をまず２ｘＳＳＰＥ中で湿し、そして次に１５０ｐ１の変 性したＤＮＡをドツトプロット装置にかける。膜を２ｘＳＳＰＥ中ですすぎ、そ して５分間にわたるυＶ光への暴露により、すなわちＳ　ｔｒａ　ｔｅｇｅｎｅ から市販されている５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　１８００（商標）ＵＶ先光ボッ クス中５ｓＪ／ｃｄの暴露によりＤＮＡを膜に固定する。 Ｃ，ハイブリ　゛イゼーション 膜を再びＺｘＳＳＰＥ中で湿し、そして８Ｘ１２ＣＩｌの膜（ドツトプロット装 置のサイズ）当り約５ＩＩｉのハイブリダイゼーション溶液を加える。ハイブリ ダイゼーション溶液ｉ当り約１〜１、５　ｐｉｃｏ−ｏｌｅのＨＲＰブローフ゛ を加え、そしてこのプローブを少なくとも１時間ハイブリダイズせしめる。ハイ ブリダイゼーション溶液は、ＳＳＰ［！（前記）、５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ及 び１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００である。次に、膜を０．１　ｘ　５ＳＰＥ及び０ ．２％Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ４００で１０分間洗浄する。その外は、ハイブリダイゼ ーション条件は実施例３に記載した通りであった。使用したプローブはＤＢ２７ ．　ＤＢ２９．　ＤＢ３０．　ＤＢ３１．　ＤＢ３３．　ＤＢ３４．　ＤＢ３５ ．　ＤＢ３７゜ＤＢ３Ｂ、　ＤＢ４０．　ＤＢ４１．　ＤＢ５８．　ＤＢ５９． 　ＤＢ６２、及びＤＢ６３であった。 Ｄ、挟−■ プローブの検出のための下記の段階を室温にて、穏やかに撹拌しながら、膜を完 全に覆うのに十分な溶液を用いて、Ｂｕｇａｗａｎら、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　６　：　９４３−９４７に記載されているようにして行 う、膜を緩衝液Ｂと共に５分間インキュベートし、緩衝液Ｃと共に５分間インキ ュベートし、そして光を排除しながら緩衝液Ｂ及びＴＭＢ（４８ｍの緩衝液Ｃ及 び２．５ｄの２■／ｄ　ＴＭＢ）と共に１００分間インキュベートることにより 検出を行う、緩衝液Ｂは１００ｍＭ　ＮａＣ１，１Ｍ尿素、５％Ｔｒｉｔｏｎ　 ｘ−１００、及び１％硫酸デキストランである。緩衝液Ｃは１００ｍＭクエン酸 ナトリウム（ｐｉｆ５．０　）である、　ＴＭＢは３゜３’、５．５’−テトラ メチルベンジジンである。約２３ｄの３％Ｈ，０□を５５．５ｍの緩衝液Ｃ／Ｔ ＭＢに加え、得られる溶液を用いて、光排除条件下で膜上に色を発生させる（色 は１〜５分間以内に現われる）。 少量の緩衝液Ｃを含有する水中での洗浄により発色を停止させる。洗浄を３０分 間２回反復する。膜の写真を取り、そして膜を緩衝液Ｃ中暗所に貯蔵する。 ここに記載する方法、並びにＳＳＯプローブ及びプライマー及びこれらを含むキ ットは、個体のＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型の正確な、比較的簡単な、そして経済的な 決定のために有用である。正確なりＰタイプ分けは幾つかの医学的用途において 有用であることが証明されよう。例えば、提供者と受理者との間の正確なＨＬＡ 　ＤＰのマツチが同種移植片の拒絶の回避及び宿主対移植片病の回避のための助 けとなろう。ある種のＨＬＡ　ＤＰ遺伝子型が、例えば小児脂肪便症、筋無力症 、及びＩＤＤＭを含めてのある種の自己免疫疾患と関連しているらしいので、Ｈ ＬＡ　ＰＰ　ＤＮＡタイプ分けは完全な臨床症状の出現に先立つ疾患の早期診断 のために有用である。 正確なＨＬＡ　ＤＰタイプ分けは法医学において有用である０例えば、これは、 ゲノム核酸を含有するサンプル、例えば血液、毛、又は***が容疑者個人に由来 するか否かの証拠を提供する。これはまた、個体の父系又は母系を決定するのに 有用である。後者は歴史的サンプルを分析するのに特に有用である。 叉施勇旦 ＴＭＡＣＬにおけるプローブハイブリダイゼーションテトラメチルアンモニウム クロリド（ＴＭＡＣＬ）がハイブリダイゼーション溶液中に存在する場合、プロ ブの区別はプローブの長さに基き、プロプのＣ，Ｃ，Ａ又はＴの組成に基くもの ではない。ハイブリダイゼーション溶液中にＴＭＡＣＬを用いることにより、単 一の温度において多くの異るプローブをハイブリダイズさせそして洗浄すること ができる。 この目的のための適当なハイブリダイゼーション溶液は３　Ｍ　ＴＭＡＣＬ、　 ０．５％ＳＤＳ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）　、及び０、 １　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する。ハイブリダイゼーションは、１９−ｍａｒプロ ーブＤＢ２７．　ＤＢ２Ｂ、　ＤＢ２９．　ＤＢ３５．　ＤＢ３４．　ＤＢ３７ ．０Ｂ３８及びＤＢ６２のためには５５°Ｃにて３０〜６０分間；　１７−ｍｅ ｒ　ＤＢ３０＋　ＤＢ３１＋ＤＢ３３及びＤＢ５９のためには５０°Ｃに°ζ； そしてＤＢ４０及びＤＢ４１のためには６０゛Ｃで行われる。洗浄溶液は３Ｍ　 ＴＭＡＣＬ、　５ｋＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！（ｐＨ８）及び２ＩＩＩＭＥＤＴ 八である。洗浄はまず３７°Ｃにて２０分間行われ、そして高ストレンジエンシ 一温度（ハイブリダイゼーション温度）にて１０分間行われる。ハイブリダイゼ ーションの検出は実施例１０に記載したようにして行われる。 このために有用なプローブ、又は本発明の目的のための任意の他のハイブリダイ ゼーション方式のために有用なプローブが下に示される（ＸはＩＩＲＰである） 。 国際調査報告 −一１＾廟峠軸奉　　ＰＣ？／υＳ　８９１０２１６９国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個体から得られる核酸含有サンプルから個体のＨＬＡＤＰ遺伝子型を決定す る方法であって、 （ａ）サンプル中の核酸の標的領域であってＨＬＡＤＰ遺伝子の多形性領域を含 むものを増幅し； （ｂ）前記増幅された核酸とＨＬＡＤＰ遺伝子の変異セグメントのための配列特 異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）プローブのパネルとを、これらが完全に相補 的であれば、ＳＳＯプローブが前記増幅された核酸に結合して安定なハイプリド 二本鎖を形成する条件下で混合し；そして （ｃ）前記増幅された核酸とＳＳＯプローブとの間で形成されるハイプリドを検 出する； ことを含んで成る方法。 ２．前記増幅される標的領域がＤＰβ遺伝子の第二エクソンからの配列であり、 そしてＳＳＯプローブのパネルがＤＰβ遺伝子の前記エクソンの変異体セグメン トに対して相補的である、請求項１に記載の方法。 ３．前記増幅がＤＰα遺伝子の第二エクソンの増幅であり、そしてＳＳＯプロー ブが該エクソンの変異体セグメントに対して相補的である、請求項１に記載の方 法。 ４．前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を行うために適当な条件下で前記サンプ ルを処理することを含む、請求項１に記載の方法。 ５，前記ＳＳＯプローブのパネルが、ＤＰβの少なくとも１つの可変セグメント の対立遺伝子変異体に対するプローブを含んで成り、各プローブが１７〜２３ヌ クレオチドの長さのＤＰβの可変セグメントの変異体配列に相補的である核酸配 列から成る、請求項１に記載の方法。 ６．前記ポリメラーゼ連鎖反応が、ＧＨ９８，ＧＨ９９，ＤＢ０１，ＤＢ０３， ＵＧ１９及びＵＧ２１プライマーから成る群から選択されるプライマーの存在下 で行われる、請求項４に記載の方法。 ７．前記パネルのプローブがＤＰβ対立遺伝子の第二エクソンの多形性ＤＮＡ配 列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列から成り、該多形性配列 がおよそコドン８−１１，３６，５５−５７，６５−６９，７６、及び８４−８ ７に中心を置く多形性領域に対して特異的な配列から成る群から選択される、請 求項５に記載の方法。 ８．前記パネルのプローブが、次の配列：【配列があります】 から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。 ９．次の配列： 【配列があります】 から成る群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。 １０．ＤＢ０１，ＤＢ０３，ＧＨ９８，ＧＨ９９，ＵＧ１９及びＵＧ２１プライ マーから成る群から選択されるプライマー。 １１．個体から得られる核酸含有サンプルから個体のＨＬＡＤＰ遺伝子型を決定 するために有用なＳＳＯプローブであって、ＤＰβ対立遺伝子の第二エクソンの 可変セグメントの変異体配列に全体的に相補的であり且つ１７〜２３ヌクレオチ ドの長さを有するヌクレオチド配列から成るプローブ。 １２．個体から得られる核酸含有サンプルから個体のＨＬＡＤＰ遺伝子型を決定 するために有用なＳＳＯプローブであって、ＤＰα対立遺伝子の第二エクソンの 可変セグメントの変異体配列に全体的に相補的であり且つ１７〜２３ヌクレオチ ドの長さを有するヌクレオチド配列から成るプローブ。 １３．個体のＨＬＡＤＰ遺伝子型を決定するために有用なキットであって、 （ａ）前記標的配列中の対立遺伝子変異配列に対するＳＳＯプローブのパネル； 及び （ｂ）キット成分を用いることにより遺伝子型を決定するための指示書； を含んで成るキット。 １４．ＨＬＤＰ遺伝子の標的領域の増幅のために有用なオリゴヌクレオチドプラ イマーを含む容量をさらに含んで成る請求項１３に記載のキット。 １５．請求項１に記載の方法に従って個体のＨＬＡＤＰ遺伝子型を決定し、そし て該個体の遺伝子型が自己免疫疾患に関連するものであるか否かを決定する、こ とを含んで成る自己免疫疾患への個体の感受性を決定する方法。 １６．前記自己免疫疾患が幼年性リウマチ性関節炎であり、そして個体のＨＬＡ ＤＰ遺伝子型がＤＰＢ２．１対立遺伝子を含んで成る、請求項１５に記載の方法 。 １７．前記自己免疫疾患がＩＤＤＭである、請求項１５に記載の方法。 １８．前記自己免疫疾患がＣＤであり、そして前記遺伝子型がＤＰＢ１３，ＤＰ Ｂ１，ＤＰＢ３及びＤＰＢ４．２から成る群から選択された対立遺伝子について 陽性である、請求項１５に記載の方法。 １９．ゲノム核酸を含有するサンプルの逸脱に関する法医学的証拠を提供する方 法であって、請求項１の方法に従ってサンプルのＨＬＡＤＰ及び容疑者のＨＬＡ ＤＰを決定し、該固体のＨＬＡＤＰ及びサンプルのＨＬＡＤＰを比較し、そして サンプルがその個体に由来するか否かを推定する、ことを含んで成る方法。