JPH03501742A - 抗バクテリア・抗マラリア性ペプタイド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗バクテリア・抗マラリア性ベプタイド本願は、１９８９年４月１２日出顧にな る本願と共に系属中の合衆国特許出願番号第０７／３３６．７７７号の部分ｓ１ 続出願であり、それを本願に引用するものとする。

１里坐１量 病理性バクテリア及びその他の微生動部に対して有用な治療効果を有する天然産 の抗生物的活性ベプタイドかい（つか最近確認されており、これらは、昆虫類、 蛙類、及びその他の動物から単離されている。これらには、セクロビン類、フタ シン類、マガイニン類、サクロトキシン、サブシン、バタテネシン類、アラメチ シン類、デフエンジン類及びＰＧＬａが含まれる。

その他、微生物、昆虫類及び高等動物からの天然ベブタイドが赤血球ならびにそ の他の真檎生物細胞を溶解するトキシン類として一般に知られている。これらの トキシン類は、それぞれ異る溶血素、例えば、ストレプトリジン類、メリチン、 バルバトリジン、パラダキシン類、デルタ・ヘモリジンなどを含む、メリチンの ような一部のトキシンがバクテリアを殺すだろうことは、知られてはいるが、広 く認識されているとはいえない、従って、本明細書の記述の目的においては、こ れらを抗生物的活性ベブタイドとして記述する。

本明細書に記述し、特許を請求する発明は、異る抗生物質の少（とも二つの連鎖 を結合させることによって、新規な抗生物的化合物を構成させることができると いう予期に反した発見に基づく。

このような混成分子が持つ利点の一つは、これらを導き出した天然ペプタイドに 比して分子の長さが短く、従って合成が容易であるように構成されていることで ある。

このような混成ベブタイドは、その抗生物的活性に加えて、その他の特徴を共通 して備えているように思われる。例えば、これらはすべて、約２０ないし４０の アミノ酸を含み、また、その末端炭素基をアミド化またはその他の方法でブロッ クした場合にしばしば−そう有効性を増す、従って、これらは、固相合成によっ て商業的製剤を得るための潜在的候補物質である。さらに、これらはすべて、分 子の一部分に特定の二次的特性を付与するある種のアミノ酸配列を含んでいるよ うに思える。しばしば、末端窒素基は親水性かつ塩基性であり、末端炭素基は親 水性である。分子中のある部分はヘリシティ−の傾向を有し、その他の部分はそ の（横向を持たない、ある化合物は、可撓性の比較的長い連鎖がらなり、それに よって化合物のちょうつがい部分を形成している。しばしば、らせん形部位は両 親媒性である。すなわち、親水性及び疎水性の表面によって特徴づけられている 。

本抗生物質は、バクテリアまたはその他の生物の細胞膜を破裂させることによっ て機能するように思われる０本ベプタイドの細胞膜への結合によって、細胞液へ のイオンの侵入が可能となり、それによって浸透圧が増大し、より多くの液を細 胞に侵入させ、それによって内圧が増大し、細胞の破裂を起こさせる。抗生物的 ベプタイドのそれぞれの部位によってそれぞれ異る二次的特性が、このような細 胞膜貫通様式と助は合って働くものと思われる。

現代医学におけるきわめて重大な問題は、人の病理体、特に、現在適切な抗生物 質が入手できないような病理体、あるいは、原病理性生物の突然変異によって抵 抗性の生物が生じているような病理体に対して、勝れた活性を有する抗生物質を 見つけることにある。抗生物質に対して抵抗性を有する生物の発生に対応する手 段の一つは、これらの化合物の合成誘導体を造ることとされてきた。しかし、こ の手段は、誘導体を遣るための基点として利用し得る母化合物上の官能基の利用 の可能性において限りがある。

もし、比較的簡単な構造の抗生物質群が得られて、それが比較的容易に合成でき て、それが同時に、非毒性の抗生物質が現在得られていないような特定の生物に 対して有用な、あるいは、現在得られている抗生物質が宿主に対して有毒性であ るようなその他の生物に対して改善された活性ををする、合成抗生物的活性ベブ タイドを主意するための、既成の化学構造種の改良種に到達し得な生体内での安 定性を有しているべきであろう。

以上に述べたような天然産のベブタイド、ならびにそれらの類似物質が、一つの 群を構成する、ということが知られた。

皿Ｉ衾呈皇星脱ユ 第１図は、プラスモジウム・ファルシバリウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｅ ｉｐａｒｉｕｍ）に対する活性を試験評価した再侵入阻止率を関数とするベブタ イド濃度（ｕＭ）を示す。

主主皿 約２０ないし約４０のアミノ酸残基を含む新規な合成抗生物的及び／または抗マ ラリア性、非毒性ベプタイドがここに見出された。これらのベブタイドは、いく つかの理由のうちのいずれかの理由によって、改善された医薬品としての活性を 有するものである。あるものは、既知の病理体に対して改善された活性ををする 。

あるものは、その天然産対応物とは異って、非毒性で、赤血球に対する溶解作用 を生じない。さらにその他のものは、現在のところ十分に満足すべき治療法がな い病理体に対して活性を有する。

治療剤として有用な本発明ベブタイドは、天然抗生物的ベグタイド中の対応断片 と実質的にＩＩ（Ｈした配列の約ＩＯないし約１５アミノ酸残基の長さ及び配列 における多少の変更は可能である。

本発明は、本発明をセクロピン類（ｃｅｃｒｏ−ｐｉｎｓ）及びメリチン（ｍｅ ｌｉｔｔｉｎ）に応用する場合を考察することによって−そう良く理解し得るで あろう。

セクロビン類は、米国特許第４，３５５．１０４号に記述されてでいるように、 ある種の昆虫類の液素性免疫反応によって生成される塩基性抗バクテリア性ベブ タイドの一群である。セロビン類は、アタシンｍｌ　（ａｔｔａｃｉｎｓ）及び リゾチームと共に、ジャイアント・シルク・モス（Ｈｙｌｏｐｈｏｒａ　ｃｅｃ ｒｏｐｉａ）の蛸に生存バクテリアを注射した後の血リンパ中に誘発される。３ 種の主要なセクロビンＡ。

Ｂ、及びＤが存在する。これらの間には高度の類縁性があり、いずれもほぼ同じ 大きさくセクロビンＡは３７残基、セクロビンＢは３５残基、セクロピンＤは３ ６残基）である。それぞれが、親水性の末端アミノ基鎖及び疎水性のアミド化カ ルボキシル末端基を有している。

セクロピンＡ、Ｂ及びＤのアミノ酸配列を第１表に示す、同表はまた、メリチン の配列をも含む。便宜上、また解析を容易にするために、セクロチン分子を三つ の区分に分けである。すなわち、１−１１残基、１２−２４残基、及び２５ない し末端残基の三つである。５業熟練者なら、高度のＭ縁性と、セクロチンＡ及び Ｂがその第２次構造において極めて類似しているという事実とを認識するであろ う、そのいずれもが、極性環境のもとで、末端窒素基で両親媒性のα−ヘリック スを形成する強い可能性を持つことが期待される。末端炭素基は、また、α−ヘ リックス形成の傾向を有するだろう、中央の１２−２４区分片では、例えば１２ −１５残基、１５−１８残基、２１−２４残基におけるように、い（分β−ター ンの傾向がある。セクロピンＤの末端Ｎ基は、Ａまたし、また、末端炭素区分域 において強いヘリンクス採択性を有する。

要するに、セクロビン類は、末端窒素基で強親水性、両親媒性のα−ヘリックス 、末端炭素基で比較的疎水性のα−へワックス、多少のβ−ターンの可能性を有 する比較的可撓性の、構造的にあまり限定されない中央区分域、を有する。ハチ の毒液から単離した抗バクテリア性ベプタイドであるメリチンの構造を第１表に 示す。このものは陽イオン性両親媒性ベブタイドであり、１−２０残基は主とし て疎水性で、２１−２６残基は両親媒性で塩基性であり、セクロビン類の場合は 、これらは親水性／疎水性である。

分子の中はどにＧｕｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ区分域が存在し、これがちょうつがいと して働くことがある。メリチンは抗生物的活性を有するが、白血球、赤血球、及 び広く各種の他の細胞を溶解するために、哺乳類に対しては有用ではない。

今や、天然の低分子量抗生物的活性ベブタイドについて、その選ばれた区分域ま たは配列を再配列化し、また、ある場合には、天然ベブタイドの無傷な区分域に 全（新しい区分域を付加することによって、その医薬品的有用性を改善すること ができることを見出した。かくして、セクロビンへの末端アミノ基としての最初 の１３個のアミノ酸残基を、メリチンの最初の１３個のアミノ酸残基と結合させ ることによって形成されるベブタイド、　ＣＡ　ｃｉ３）Ｍ（１−１３）は、セ クロビンＡよりも致死１度が低く、スタフルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　５ｕｂｔｉ＋ｉｓ）に対して高い活性を有する。加えて、この新規な２６残基 ベブタイドは、ヒツジ赤血球に対して、２００ｕＭ以上の１度においてさえも溶 解作用を示さなかった。これに対して、メリチンは４４−６ｕで溶解作用を示し た。

本明細書にいう「医薬品的活性の改善」という言葉は、この新規なベプタイドが 、それを誘導した天然ベブタイドよりも、哺乳類細胞に対して毒性が低く、かつ ／あるいは、あるスペクトラムの病理体に対して、またはある特定の病理体に対 して活性が強いことを意味する。本発明のベブタイドは、天然ベブタイドにおけ るある区分域と同一ないし実質的に同族である区分域を少くとも一つ含んでいる 場合に、天然ベブタイドから「誘導された」ものと称される。かくて、ＣＡ　（ １−１３）Ｍ　（１−１３）は、セクロビンＡ及びメリチンの両方から誘導され たものと考えることができる０本発明の範囲に属するその他のベプクィドは、例 えば、ある種のマガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）及びある種のアタシン（ａｔｔ 、ａｃｉｎ）の配列を含み、あるいは、例えばメリチンのようなある抗生物質の 区分域を再配列したもの、あるいは、セクロビンからのある区分域と、「天然に 存在する」配列順序よりも多少とも疎水性、親水性、またはヘリカルであるよう に設計した全く非天然形のその他の区分域とからなるもの、などを含むことがで きる。

本発明の新規な最終生産物における「天然に存在する」ペブタイドの選ばれた区 分域は、その天然ベプタイドにおける区分域と同一である必要はない、というこ とが当業者には明らかであろう。

塩基度を増大させるために、または、ヘリシティ−を妨害するために、あるいは その他何らかの有用な理由によつて、天然ペプタイドのアミノ酸残基の一つ以上 を別の選ばれたアミノ酸に置き換えることができる。しかし、この新規生産物に おけるアミノ酸残基の配列順序は、天然の配列順序と実質的に類似しているもの である。

本発明のベブタイドは、通常は約２０ないし約４０のアミノ酸残基を含有してい る。一つの理由として、抗生物的活性低分子量ベプタイドは、最小成約２０のア ミノ酸を含むのが昔通である。

もう一つの理由として、約４０よりも多くのアミノ酸を有するベブタイドは、化 学合成によって純粋な形に合成することが比較的困難であり、また、醗酵または 組み換えＤＮＡ操作によって最もよく製造し得るからである０本発明の有用なベ プタイドの特別な利点は、これらが面相法によって容易に合成されること、なら びに、特定の要求結果を達成するために種々の組み合わせが可能であることであ る０面相技術を用いる利点は、末端炭素基をアミド化またはその他の手段でブロ ックして直接的に生産物を合成することが可能であることである。

本明細書でいう「区分域（ｒｅｇｉｏｎ）　Ｊという言葉は、「区分片（ｓｅｇ ｍｅｎｔ）　ｊないし「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）　Ｊと同じである。それは、 少くとも５個、通常は約５個ないし約２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をい う。ある「区分域」は、通常、可撓性、塩基性、疎水性、親水性、両親媒性、あ るいはヘリカルであるように選択され、あるいは構成され、これがその区分域の 特徴となる。一つの分子は、少（とも二つの区分域を有するように構成させるこ とができ、ちょうつがい区分域は含まれていても、含まれていなくてもよい、こ の区分域は、２０ないし４０個のアミノ酸残基を含む天然抗生物的活性ベプタイ ドから誘導されなければならないものではない、それは、２０個より少い、ある いは４０個より多い残基を含むベブタイドから誘導することもできる。

しかして、本発明は、本新規ペブタイドを誘導した天然抗バクテリア性及び／ま たは抗マラリア性ベプタイドの対応配列と実質的に類似していて、それと同一の 、または別の天然抗生物的及び／または抗マラリア性ペプタイドの一つ以上の他 の区分域と結合して混成分子を形成していてもよい、少（とも一つの５−２０個 のアミノ酸残基の区分域を含む、約２０個ないし約４０固のアミノ酸残基を含有 する抗生物的及び／または抗マラリア性活性ベブタイドを包含するものである。

その他の面からいえば、本発明は、天然の抗生物的及び／または抗マラリア性活 性ベブタイドの対応配列順序と実質的に同一な、約５個ないし約２０個のアミノ 酸残基を含む少くとも一つのアミノ酸残基または区分域を含有する、約２０個な いし約４０個のアミノ酸残基を含む新規なベブタイドを合成することを包含する 、抗生物的及び／または抗マラリア性活性ベプタイドの医薬品的活性の改善方法 である。

本発明の範囲に属する代表的な化合物は、以下のリストによって示すことができ る。ここに、Ｃはセクロビン、ＣＡ、ＣＢ、及びＣＤはセクロピンのＡ、Ｂ、及 びＤ型を示し、Ｍはメリチンを、Ｍａｇはマガイニンを示す、数字は、天然ペブ タイドの対応区分域におけるアミノ酸残基の配列順序を示す、説明書きは、以下 のように区分域の特性を規定するものである。

ＣＡ（１−１３）Ｍａｇ（１３−２３）　−親水性／疎水性Ｍ（１５−２６）Ｍ ａｇ（１３−２３）　−親水性／疎水性Ｍａｇ（１３−２３）ＣＡ（１−１３） 　−疎水性／親水性Ｍａｇ（１３−２３）Ｍ（１５−２６）　−疎水性／ａ水性 ？ｌ　（１−１３）　ＣＢ　（１−１３）　−疎水性／親水性Ｍ（１−１２）Ｐ ｒｏＣＡ（１−１３）　−疎水性−Ｐｒｏ−親水性Ｍ（１−１５）Ｃ（１−１１ ）　−疎水性／Ｉｔ水性Ｍ（１６−２６）ＣＡ（１４−３７）　−親水性／疎水 性ＣＡ（２５−３６）ＰｒｏＣＡ（１−１３）　−疎水性−Ｐｒｏ−親水性ＣＡ （２５−３７）ＣＡ（１−１３）　−疎水性／ａ水性ＣＡ　（１−２４）　Ｍ　 （１−１３）　−親水性／疎水性ＣＡ（１−１３）門（１−１３）　−疎水性／ 親水性Ｍ　（１６−２６）　？＋　（１−１３）　−１１水性／疎水性Ｍ（１６ −２６）ＣＡ（２３−３７）　−親水性／疎水性ＣＡ（１−２４）Ｍ（１６−２ ６）　−親水性／疎水性ＣＢ（２５−３５）門（１４−２６）　−疎水性／￥！ Ｌ水性ＣＡ　（１−１１）ＣＤ　（１２−３７）　−親水性／疎水性ＣＡ（１− ８）ＩＩ（１−１８）　−親水性／疎水性Ｃ＾（１−９）Ｍ（１−１７）　−親 水性／疎水性ＣＢ　（１−１３）　Ｍ　（１−１３）　−親水性／疎水性ＣＡ　 （１−１７）　Ｍ　（１−９）　−親水性／疎水性Ｃ＾（１−１８）Ｍ（１−８ ）　−親水性／疎水性Ｍ　（１−１３）　ＣＡ　（１−２２）　−疎水性／親水 性Ｍ（１−１３）ＣＡ（１−１３）　−疎水性／親水性上記の生産物のほとんど は、疎水性／親水性、あるいはその逆であることに加えて、ヘリシティ−または 両親媒性の区分域をも有している。ときには、プロリン（Ｐｒｏ）を用いてヘリ ックスを妨害させているが、その他のアミノ酸も同じように用いることができる 。上記のベブタイドは、また、可撓性の、あるいはちょうつがいの区分域を含ま せるように構成させることも可能である。

本発明の化合物は、各特定アミノ酸またはベブタイドに適切な、保護、脱保護、 及び開裂の技法及び試薬を用いる標準的な固相法の操作手順によって合成される 。本発明の新規ベプタイドを合成するには、手動または自動の（例えばＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ　４３０Ａなど）固相法の技法を組み合わせて用い ることができる。

固相法の背景知識としては、アンドルー、Ｄ　（Ａｎｄｒｅ＋ｇ　Ｄ、）、メリ フィールド、Ｒ，Ｂ、（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、）、スタイナー、Ｈ （ｓｔｅｉｎｅｒ、　Ｈ，）　、及びボーマン、Ｉ（、Ｇ、（Ｂｏｍａｎ、　Ｈ ，Ｇ、）　、（１９８３年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　 ｌｌ５Ａ　８０．　６４７５−６４７９　；アンドルー、Ｄ（Ａｎｄｒｅｖ、　 Ｄ、）、メリフィールド、Ｒ，Ｂ、　（１つｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ。

Ｒ，Ｂ、）　、スタイナー、　Ｈ，（ｓｔｅｉｎｅｒ、　）１．）、及びボーマ ン、）１．Ｇ、（Ｂｏｍａｎ、　Ｈ，Ｇ、）、（１９８５年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ２４　、１６８３　１６８８　；フインク、Ｊ（ＦｘｎＬ　Ｊ、）、 ボーマン、Ａ（（Ｂｏｍａｎ、　Ａ、）　、ボーマン、Ｈ，Ｇ、（Ｒｏｍａｎ、 　Ｈ，Ｇ、）、及びメリフィールド、Ｒ，Ｂ、　（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。

Ｒ，Ｂ、）、（１９８９年６月）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ ｅデｎ　Ｒｅｓ、　３３＋４１２−４２１；フインク、Ｊ、（Ｆｉｎｋ、　Ｊ、 ）　、メリフィールド、６２６０−６２６７、を参照されたい、これらのそれぞ れを、本明細書に引用して含ませるものとする。

本発明化合物の生体内安定性は、末端窒素基及び炭素基にＤ−アミノ酸を付加さ せることによって改善することが可能である。

本発明の生産物は両親媒性であるため、これらは′ｔｉ離塩基として、あるいは 酸付加塩として、あるいは金属塩として利用するこく、 とができる、いうまでもなけ−これらの塩は医薬品として容認されるものでなけ ればならず、これらには、種々の金属塩、特に、アルキル金属塩、アルカリ土類 金属塩、好適にはカリウム塩、ナトリウム塩が含まれる。広く各種の、医薬品と して容認し得る酸付加塩が用い得る。これらには、有機酸及び無機酸、好ましく はｔ、ｆｄｔから造ったものが含まれる０例示として示すことのできる代表的な 酸としては、クエン酸、コハク酸、乳酸、塩酸、臭化水素酸が含まれる。これら の生産物は、当業者によく知られた手順によって容易に製造される。

本発明のさらに別の特色は、医薬品製剤を提供するものであり、それは、一つ以 上の本発明化合物と、医薬品として容認し得る担体とを包含するものである。こ の製剤は、所望の投与経路に通した医薬品形体に仕上げることができる。このよ うな製剤の例としては、錠剤、カプセル、ビル、粉剤、及び顆粒、などの経口投 与用固型製剤が含まれる。また、溶液、懸濁液、シロップ、またはエリキシルの ような経口投与用液状製剤があり、また、滅菌した溶液、懸濁液、乳濁液などの 非経口的投与用製剤がある０本製剤はまた、滅菌した水、生理的食塩水、または 何かその他の′ｔＸ菌した注射用媒体に使用直前に溶解することのできる滅菌固 型製剤の形体に製造することもできる。皮膚軟化剤、懸濁剤、キレート剤、補強 剤、及びその他の、抗生物質含有外用製剤に普通に用いる成分を含むことのある 乳液、懸濁液、クリーム、ローション、または気泡剤の形体の外用製剤も調製し 得る。

これらすべての製剤において、抗生物的成分及び／または抗マラリア性成分が通 常は主生理活性成分である。

当業者によって容易に確認し得る。いうまでもなく、実際上の投与量は、個々の 調製製剤、個々の使用化合物、使用様式、治療すべき個所、宿主、及び疾病、な どに応じて異ることは認識されよう０年齢、体重、性別、食物、投与の時期、投 与経路、***速度、患者の状態、薬剤の組み合わせ、反応感受性、疾病の重さ、 など、本薬剤の作用を変更させる多くの要因を考慮する必要があろう。

以下の、限定を目的としない実施例は、単なる例示の目的で示されるものであり 、本発明をｆ＃［するものと考えてはならない。

本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、種々の明白な改変を行うこと が可能である。

１鉦■ −ＣＡ−ＣＤ−７Ｍ 二ｌ旦り立夏二数 自動式の（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｉ＋　４３ＯＡ）固相法の技法の 組み合わせ（前述の合成に関する文献を参照）によって、本発明の新規ベプタイ ド及びメリチンを合成した。具体的にいえば、メリチン及び、新規なペブタイド であるＣＡ　（２５−３７）　ＣＡ　（１−１３）、Ｍ　（１−１３）ＣＡ　（ １−１３）　、ＣＡ　（１−１１）ＣＤ　（１２−３７＞　、ＣＡ　（１−２４ ）Ｍ　（１−１３）　、ＣＡ　（１−１３）Ｍ（１−１３）、及びＭ　（１６− ２６）Ｍ　（１−１３）は、出発樹脂（０、２１糟ｍｏｌ　／　ｇ）　２．５　 ｇを用いて、以下のような標準二重カプリング・プロトコールに従うて調製した 。すなわち、（１）ＣＨＩＣに寞　、　５１１Ｌ％　４　Ｘ　１ａｉｎ　ｓ　（ ２）　５　０　％ＴＦＡ／ＣＨ＊Ｃ１２％　５０１１Ｌ％　２　Ｘ　１ａｉｎ　 ｓ　（３＞　５０％ＴＦＡ／ＣＩ（ＩＣ２ｔ　。

５０社、Ｉ　Ｘ　２０ｍ１ｎ　；　（４）　ＣＨ１Ｃｆ友、５０＋ａＬ、５Ｘ１ ｍｉｎ；（５）５％Ｄ　Ｉ　ＥＡ／ＣＬＣ１ｔ　１５０ｍＬ、　２　Ｘ　２ｍ１ ｎ　；　（６）ＣＨｇＣＩｌｚ　、５０ｍＬ、６　Ｘ　１ａｉｎ　；　（７）保 護アミノ酸、Ｃ）１．ｃ　ｆ　。

２０糺中４ｅｑを反応容器に加え、ＣＨｚＣＲｚ　４　ｓＬで洗滌し、室温で５ ｍ１ｎ振とう１ｃＨｚｃＩ２ｔ　３ｍ１．中のＤＣＣ４ｅｑを反応容器に加え、 ＣＴｏＣｌｉ　２ｍＬで洗滌、室温で１００ｍ１ｎ振とう；　（８）　ＣＨ，ｌ ｌ、、５０ｍＬ、４Ｘ１ａｉｎ　ｓ　（９）５％Ｄ　Ｉ　ＥＡ／ＣＨｚＣＩｌｚ 　、５０ｍＬ。

５　（１＋Ｌ、　２　Ｘ　２ｍ１ｎ　ｉ　（１２）保護アミノ酸ＣｈＣＮｔ　３ ｍＬ中８ｅｑ、０℃、にＣＨｚＣ１ｔ　１　ｍｌ−中４ｅｑのＤＣＣ，０℃を加 え、ＣＨｚＣ１２２１１Ｌ。

０℃で洗滌し、０℃、１０１ｍ１ｎ後に濾過し、ＤＭＦ２５ｍ１．．０℃、を加 え、反応容器に加え、ＤＭＦ５峠で洗滌し、室温で１ｈ振とう；　（１３）ＤＭ Ｆ、　５０ｍＬ、　２　Ｘ　２ｍ１ｎ　；　（１４）ＣＨｇＣＩｌｚ　、５０ｍ １１．４　ｘ　１ａｉｎ　ｉ　（１５）５　％Ｄ　Ｉ　ＥＡ／ＣＨ＊Ｃｆｔ　、 ５　０ｍＬ、Ｉ　Ｘ　２ｍ１ｎ　；（１６）ＣＴｏＣｆｔ　−、５０ｍＬ、　４ 　Ｘ　１ａｉｎ　；（１７）ニンヒドリン分析用サンプル３ないし５■。その後 のアミノ酸を用いて所望のベプタイドの組み立てを完了させるために、このプロ トコールを繰返した。

樹脂上で完全に保護されたベブタイドを、次いでＴＦＡで処理してＮＢｏｃグル ープを除き、乾燥させる。樹脂支持体からのベプタイドの開裂は、低／高ＨＦ法 、タム等（Ｔａｘ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８３行った。低ＨＦ法は、ＨＦ／ジメ チルサルファイド／ｐ−クレゾール／ｐ−チオクレゾール（２５：６５ニア、５ ：２．５）５ｍＬ、０℃、２ｈｒを用いて行った。高ＨＦ法は、ＨＦ／ｐ−クレ ゾール／ｐ−チオクレゾール（９５：３．７５：１．２５）１０吐、０℃、１ｈ ｒを用いて行った。ＨＦを蒸発させた後、生成物をまず無水エーテルで洗滌して 不純物を除き、次いでＨＯＡｃ　１０％水溶液中に溶解させる。凍結乾燥によっ て粗物質を得る。

次いで、本発明のベブタイドを、Ｉ　Ｍ　ＨＯＡｃ中５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　− ％の収率で生成物が得られる。νｙｄａｃ０１８カラム（２１８ＴＰＢ１０）上 の逆相低圧分離用液体クロマトグラフィー、及び２５−６５％のアセトニトリル の線型勾配濃度を用いる展開を行い、場合によってその後に５ｅｐｈａｄｅｘゲ ル濾過を行う。

本発明生産物を、いくつか異る種類の病理体を代表するものとして選ばれた各種 供試生物に対する活性について試験した。これらの病理体の一部は、ホフマン等 （Ｈｏｆｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８１年）　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃ ｈｅ＋ｗ。上止　５３７−５４８　＜これを本明細書に引用して加える）の阻止 帯検定法によって特に悪性であることが知られているものである。ストレプトマ イシン１１００ｕ／＋＋ｄ及び、ストレプトマイシン耐性の供試生物の生存細胞 ２Ｘ１０’を含んだ高栄養媒地６ｍＬを用いて寒天またはアガロースの薄平板（ 直径８．５ｃｍ）を調製した。平板中に直径３５ｍ１のくぼみを穿孔し、逐次希 釈した試料３　ｕｌをくぼみ中に入れた。３０”または３７℃で一夜培養した後 、くぼみ周辺の阻止帯の直径を測定した。各ベプタイドについて、阻止帯の直径 の２乗値を、濃度の対数値に対してブ０７トし、ハルトマーク（Ｈａｌｔｍａｒ ｋ）　（１９８３年）　ＥＭＢ。

Ｊ、２，５７１−７６、あるいはハルトマーク等（Ｈｕｌｔｍａｒｈ　ｅｔ、　 ａｌ）（１９８２年）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、□　２０７−２１ ７　（これらを本明細書に引用して加えるものとする）に記述されているように 、傾斜と切片から致死濃度を計真した。本発明の生産物の一部を用いて検定結果 を第２表に示す。

第２表はまた、これらの化合物がヒツジの赤血球を溶解する濃度をも示している 。これらの値は、メリチンについて通常用いられている溶解検定法、あるいは、 上記のハルトマーク等の論文の抗バクテリア阻止帯検定法をヒツジ赤血球（Ｓ　 ＲＣ）平板に適用した方法のいずれかによって得られた。後者については、滅菌 アガロース平板は、アルセバース溶液中に１％のアガロース、０．９％ＮａＣ１ 、及び１０％のＳＲＣが懸濁した培養液６ｍＬを含んでいた。各サンプル３ｕβ を装填した３ｆｌのくぼみに、ベブタイドの希釈系液を滴下した。平板を３０℃ で２４ｈ培養し、阻止帯の状態を記録し、ハルトマーク等の論文に述べられてい るようにしてＬＣ値を計算した。培養の数時間後に澄明な阻止帯を記録した。

こうしたデータを用いれば、２４ｈ後の読み取り値と同桁のＬＣ値が得られた。

この平板検定法は、メリチンについて通常用いられている溶解検定法よりも短時 間で、手軽である。

試験の際に、塩基性のベプタイドはしばしば寒天平板に結合するが、アガロース にはあまり結合しないことが観察された。従って、寒天上で測定された致死濃度 は、事実は、実際の致死濃度よりもかなり高いかも知れない。

ヒツジ赤血球の溶解能かられかるように、本混成ベブタイドはすべて、メリチン よりも毒性が低いことがわかる。また、本ベブタイドのほとんどは、特定の生物 に対して、それが誘導された天然ベブタイドの少くとも一つよりも活性が高い、 ＣＡ　（１−１１）ＣＤ　（１２−３７）は、供試生物に対して、セクロビンＡ またはセクロビンＤのいずれよりも活性が高い、最も抗生物活性が増強されたも のは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒ ｅｕｓ）及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に 対してＣＡ　（１−１３）Ｍ　（１−１３）及びＣＡ　（１−２４）Ｍ　（１− １３）を用いた場合であった。この場合はセクロビンＡの４０倍ないし２００倍 の増強度が観察された。これら二つの混成ベプタイドの酵母菌サツカロミセス・ セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋＊ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する力 価も、セクロピンＡより大きかった。さらにまた、これら二つの化合物は、１０ ０ｕ−以上でもヒツジ赤血球に対して毒性を示さなかった 本発明の一つの興味ある具体例は、混成Ｍ　（１６−２６）　Ｍ（１−１３）で ある、このものは、メリチンの二つの主要な区分域が反対に結合している。この 生産物は、２４０ｕＭでも赤血球を溶解しないが、天然のメリチン分子は４　６ ｕＭで溶解を起こす。

これは４０−６０倍以上改善されたことになる。

？−８？Ｉａ　ＣＢ　ＣＡ　ＰＧＬａの先に述べたようにして（実施例１−６参 照）混成ベプタイドＣＡ　（１−１３）　Ｍ　（１−１３）及びＣＡ　（１−８ ）Ｍ　（１−１８）を調製し、血流形体のプラスモジウム・ファルシバリウム（ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）に対する活性を検定した。比 較のために、セクロピンＡ及びセクロビンＢ１及び蛙の皮膚のベプタイドである マガイニン２及びＰＧＬａの試験を行った。

血液形体のマラリア寄生虫プラスモジウム・ファルシバリウム、すなわち、主と して後期の栄養型及び所期の繁殖型のものは、ワーリン、Ｂ等（Ｗａｈｌｉｎ、 　Ｂ、＋ｅｔ　ａｌ）、（１９８４年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ＩＡｃａｄ、Ｓ ｃｉ、　ＬＩＳＡ　ｌ上、７９１２−１６　（本明細書に引用して加える）の方 法に従って、人の赤血球への再侵入阻止率を記録することによって検定を行った 。Ｆ３２株（タンザニア型）の四重ミクロカルチャーを、それぞれ異る濃度の検 定ベプタイドを含み、あるいは含まない完全′Ｍｉ織培養体中で、３７℃で２０ ｈｒ培養した。

アクリジン・オレンジで染色した後、蛍光顕微鏡下に、新しく感染した赤血球の 比率を測定した。各培養物について、４０，０００の赤血球の寄生虫感染率を解 析した。ＣＡ　（１−１３）Ｍ　（１−１３）については、二重検定を行った。

第１図はＣＡ（１−１３）Ｍ（１１３）、ＣＡ、ＣＢ、、Ｍａｇ、及びＰＧＬａ についての結果を示す、第１図から、ＣＡは無視し得る程度の活性しか示さず、 ＣＢはＭａｇ程度の力価であり、混成物ＣＡ　（１−１３）　Ｍ　（１−１３＞ は、ＣＢよりも高い力価を示し、ＰＧＬａはその中間の活性度であつた。ＣＡ（ １−１８）Ｍ　（１−１８）は、ＣＡ　（１−１３）Ｍ　（１−１３）よりもさ らに高い力価を有する。事実、ＣＡ　（１−８）Ｍ　（１−１８）はＣＡ（１− ｔ　３）　Ｍ　ｃ１″−１３）よりも約４倍も高い力価を有する。すなわち、約 ２．２　ｕＭの濃度のＣＡ　（１−１８）Ｍ　（１−１８）は、５０％再侵入阻 止率を示す。本発明の混成体によって、ごくわずかな溶血作用が観察された。

−びＣＡＣＢ、Ｍとの　へ 前述（実施例１−６を参照）と同様にして、新規ペブタイド、ＣＡ　（１−８） Ｍ　（１−１８）　、ＣＡ　（１−９）Ｍ　（１−１７）、ＣＢ　（１−１３） Ｍ　（１−１３）　、ＣＡ　（１−１７）Ｍ　（１−９）、ＣＡ　（１−１８） Ｍ　（１−８）　、Ｍ　（１−１３）ＣＡ　（１−２２）、及びＭ　（１−１３ ）ＣＡ　（１−１３）を調製した。これらの新規ペプタイド及びＣＡ、ＣＢ、Ｍ について、い（つか異る種の病源体を代表するものとして選ばれた種々の生物に 対する活性を試験した。これらの病源体のあるものは、ホフマン等（）Ｉｏｆｆ ｍａｎｎ　ｅｔａり（１９８１年）　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌ上　 ５３７−４８の阻止帯検定によって特に有毒なものとして知られている。実施例 １−６におけると同様、それぞれの生物を用いてアガロース薄平板を調製した。

３０℃で一夜培養後、阻止帯の直径を測定した。前述（実施例１−６に述べたハ ルトマーク等の論文を参照）と同様にして致死濃度を測定した。これらの新規ベ プタイドの検定結果を第３表に示す。

第３表かられかるように、本部成体ペプタイドはメリチンよりも毒性が低く、そ れが誘導された天然ベブタイドの少くとも一つよりも活性が高い。

°ジ翻あ２−あ−角も 傘　セクロビンＡの配列番号を使用、アンダーラインのあるものは、寒天平板に よる値である。その他はすべて、アガロース平板上の測定値である。

傘＊　ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）及びボナー（Ｂｏｎｎｅｒ）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ。

２Ｌ８：９７−１０６．１９５６ 奉＄＄平坦な濃度依存関係を示す。

１　数値におけるａの記号は、３０℃で一夜培養後、ならびに３７℃で一夜培養 後の数値である。

ｂ　数値におけるｂの記号は、３０℃で一夜培養後の値である。

Ｃ数値におけるＣの記号は、３７℃で一夜培養後の値である。

？　混濁帯を示す。

第３表 致死濃度ｕＭ ＣＡ（１−３７）　３７　０．２　２　４　２００　＞２００　４　＞２００Ｃ Ｂ（１−３５）　３５　０．３　１　ｎｄ　ｎｄ　＞２００　１２　ｎｄＭ（１ −２６）　２６　０．８　３　０．２　０．３　０．２　０．５　４−８ＣＡ（ １４−８ＣＡ（１−８）　２６　０．３　０．７　０．４　０．５　１　２　＞ （３）ＣＡ（１−９）Ｍ（Ｌ−ＩＴ）　２６　０．３　１　０．７　０，９　６ 　０．３　＞（３）ＣＢ（１−１３）Ｍ（１−１３）　２６　０．３　１　０． ４　０．４　４　１　＞４００ＣＡ（１−１７）Ｍ（１−９）　２６　０．５　 ５　０．５　１　４　０．２　＞運ＣＡ（１−１８）Ｍ（１−８）　２６　１　 １５　４　２０　＞６００　３　瀾Ｍ（１−１３）ＣＡ（１−２２）　３５　０ ．７　ｎｄ　ｎｄ　Ｏ，２ｈ　１　４０？Ｍ（１−１３）ＣＡ（１−１３）　２ ６　１　５　０．３　０．１　５ｍ　１　８０７Ｂａｌｌ　＋　ＭＥ　ｍ　Ｂ、 　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　ｅｅｄｉｕ＋ａ　Ｅを用いて平板を調整ｎｄ　寓　測定 せず 手続補正書１発） 平成３年１　月２２日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．約２０ないし約４０のアミノ酸残基を含有し、少くとも一つの区分域が、セ クロピン（Ｃ）、セクロビンＡ（ＣＡ）、セクロビンＢ（ＣＢ）、セクロピンＤ （ＣＤ）、メリチン（Ｍ）、マガイニン（Ｍａｇ）、またはアタシンから選ばれ た天然抗生物的かつ／または抗マラリア性活性ペプタイドにおける対応配列順位 と実質的に類縁の配列で、約５ないし約２０のアミノ酸残基を含む、抗生物的か つ／または抗マラリア性活性の合成混成ペプタイド類。
2. ２．二つの区分域を含み、そのそれぞれが、セクロピン（Ｃ）、セクロピンＡ（ ＣＡ）、セクロピンＢ（ＣＢ）、セクロピンＤ（ＣＤ）、メリチン（Ｍ）、マガ イニン（Ｍａｇ）、またはアタシンから選ばれた天然抗生物的かつ／または抗マ ラリア性活性ペプタイドにおける対応配列順位と実質的に類縁の配列で、約１０ ないし約１５のアミノ酸残基を含有している請求の範囲第１項のペプタイド。
3. ３．いずれの区分域もが同一の天然抗生物的かつ／または抗マラリア性活性ペプ タイドからのものである請求の範囲第２項のペプタイド。
4. ４．ＣＡ（１−１３）Ｍ（１−１３）を包含する請求の範囲第１項のペプタイド 。
5. ５．ＣＡ（１−２４）Ｍ（１−１３）を包含する請求の範囲第１項のペプタイド 。
6. ６．ＣＡ（１−１１）ＣＤ（１２−３７）を包含する請求の範囲第１項のペプタ イド。
7. ７．Ｍ（１６−２６）Ｍ（１−１３）を包含する請求の範囲第１項のペプタイド 。
8. ８．ＣＡ（１−１３）Ｍａｇ（１３−２３）、Ｍ（１５−２６）Ｍａｇ（１３− ２３）、Ｍａｇ（１３−２３）ＣＡ（１−１３）、Ｍａｇ（１３−２３）Ｍ（１ ５−２６）、Ｍ（１−１３）ＣＢ（１−１３）、Ｍ（１−１２）ＰｒｏＣＡ（１ −１３）、Ｍ（１−１５）Ｃ（１−１１）、ＣＡ（２５−３６）ＰｒｏＣＡ（１ −１３）、ＣＡ（２５−３７）ＣＡ（１−１３）、ＣＡ（１−１３）Ｍ（１−１ ３）、Ｍ（１６−２６）Ｍ（１−１３）、Ｍ（１６−２６）ＣＡ（２３−３７） 、ＣＢ（２５−３５）Ｍ（１４−２６）、ＣＢ（１−１３）Ｍ（１−１３）、及 びＭ（１−１３）ＣＡ（１−１３）からなる群から選ばれた請求の範囲第２項の ペプタイド。
9. ９．Ｍ（１６−２６）ＣＡ（１４−３７）、ＣＡ（１−２４）Ｍ（１−１３）、 ＣＡ（１−２４）Ｍ（１６−２６）、ＣＡ（１−１１）ＣＤ（１２−３７）、Ｃ Ａ（１−８）Ｍ（１−１８）、ＣＡ（１−９）Ｍ（１−１７）、ＣＡ（１−１７ ）Ｍ（１−９）、ＣＡ（１−１８）Ｍ（１−８）、及びＭ（１−１３）ＣＡ（１ −２２）からなる群から選ばれた請求の範囲第１項のペプタイド。
10. １０．約２０ないし約４０のアミノ酸残基を含有し、少くとも一つの区分域が、 セクロピン（Ｃ）、セクロピンＡ（ＣＡ）、セクロピンＢ（ＣＢ）、セクロピン Ｄ（ＣＤ）、メリチン（Ｍ）、マガイニン（Ｍａｇ）、またはアタシンから選ば れた天然抗生物的かつ／または抗マラリア性活性ペプタイドにおける対応配列順 位と実質的に類縁の配列で、約５ないし約２０のアミノ酸残基を含む、抗生物的 かつ／または抗マラリア性活性の合成混成ペプタイドの、抗生物的かつ／または 抗マラリア的有効量とともに、医薬品として容認し得る担体を含有する医薬品製 剤。
11. １１．ペプタイドが二つの区分域を含み、そのそれぞれが、セクロピン（Ｃ）、 セクロビンＡ（ＣＡ）、セクロピンＢ（ＣＢ）、セクロピンＤ（ＣＤ）、メリチ ン（Ｍ）、マガイニン（Ｍａｇ）、またはアタシンから選ばれた天然抗生物的か つ／または抗マラリア性活性ペプタイドにおける対応配列順位と実質的に類縁の 配列で約１０ないし約１５のアミノ酸残基を含むものであるような請求の範囲第 １０項の製剤。
12. １２．区分域の二つともが、同一の天然抗生物的かつ／または抗マラリア性活性 ペプタイドからのものであるようなペプタイドである請求の範囲第１１項の製剤 。
13. １３．ペプタイドがＣＡ（１−２４）Ｍ（１−１３）である請求の範囲第１０項 の製剤。
14. １４．ペプタイドがＣＡ（１−１１）ＣＤ（１２−３７）である請求の範囲第１ ０項の製剤。
15. １５．ペプタイドがＭ（１６−２６）Ｍ（１−１３）である請求の範囲第１０環 の製剤。
16. １６．ペプタイドが、Ｍ（１６−２６）ＣＡ（１４−３７）、ＣＡ（１−２４） Ｍ（１−１３）、ＣＡ（１−２４）Ｍ（１６−２６）、ＣＡ（１−１１）ＣＤ（ １２−３７）、ＣＡ（１−８）Ｍ（１−１８）、ＣＡ（１−９）Ｍ（１−１７） 、ＣＡ（１−１７）Ｍ（１−９）、ＣＡ（１−１８）Ｍ（１−８）、及びＭ（１ −１３）ＣＡ（１−２２）からなる群から選ばれた請求の範囲第１０項の製剤。
17. １７．ペプタイドが、ＣＡ（１−１３）Ｍａｇ（１３−２３）、Ｍ（１５−２６ ）Ｍａｇ（１３−２３）、Ｍａｇ（１３−２３）ＣＡ（１−１３）、Ｍａｇ（１ ３−２３）Ｍ（１５−２６）、Ｍ（１−１３）ＣＢ（１−１３）、Ｍ（１−１２ ）ＰｒｏＣＡ（１−１３）、Ｍ（１−１５）Ｃ（１−１１）、ＣＡ（２５−３６ ）ＰｒｏＣＡ（１−１３）、ＣＡ（２５−３７）ＣＡ（１−１３）、ＣＡ（１− １３）Ｍ（１−１３）、Ｍ（１６−２６）Ｍ（１−１３）、Ｍ（１６−２６）Ｃ Ａ（２３−３７）、ＣＢ（２５−３５）Ｍ（１４−２６）、ＣＢ（１−１３）Ｍ （１−１３）、及びＭ（１−１３）ＣＡ（１−１３）からなる群から選ばれた請 求の範囲第１１項の製剤。
18. １８．約２０ないし約４０のアミノ酸残基を含み、少くとも一つの区分域が、セ クロビン（Ｃ）、セクロピンＡ（ＣＡ）、セクロピンＢ（ＣＢ）、セクロピンＤ （ＣＤ）、メリチン（Ｍ）、マガイニン（Ｍａｇ）またはアタシンから選ばれた 天然抗生物性かつ／または抗マラリア性活性ペプタイドにおける対応配列順位と 実質的に類縁の配列で約５ないし約２０のアミノ酸残基を含む、抗マラリア性活 性の合成混成ペプタイドの、抗マラリア的有効量で環者に投与することを包含す る、マラリア治療の必要のある患者の治療方法。
19. １９．抗マラリア性活性の合成混成ペプタイドがＣＡ（１−１３）Ｍ（１−１３ ）またはＣＡ（１−８）Ｍ（１−１８）を包含する請求の範囲第１８項の方法。