JPH03155795A - マウス・インターロイキン―６レセプター蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はマウスＩＬ−６レセプター蛋白質および該蛋白
質をコードするＤＮＡ、さらには該蛋白質を遺伝子工学
的に生産するための手段および方法に関するものである
。

〔従来の技術〕

ＩＬ−６は、免疫、造血、炎症という生体防御系におい
て重要な役割を果たしていることを特徴とする、生体の
増殖分化に広く関与するタンパク質である。一方、ＩＬ
−６の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である
可能性が報告されている（厚木、平野、Ａｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　５．　ｐ４３５゜１９８８年参
照）。

ＩＬ−６のシグナル伝達経路は、以下のように解明され
てきた。まずＩＬ−６と特異的に結合する細胞膜上のＩ
Ｌ−６レセプターが、田賀らにより解析され、各細胞上
の数、ＩＬ−６との結合定数が報告された（Ｊ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、、　１９６．　ｐ９６７、１９８７年参照）
。次にヒ）ＩＬ−６レセプターのｃＤＮＡが出端らによ
り単離され、１次構造が決定された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、
　２４１．　ｐ８２５．１９８８年参照）。さらにＩＬ
−６のシグナル伝達に関与する細胞膜上の別の蛋白質が
田賀らにより発見された（Ｃｅｌｌ、　５８゜ｐ５７３
．１９８９年参照）。

生体内で多様な生理活性を強く発揮するＩＬ−６の作用
を人為的に調節することは、各種疾患の新しい治療のメ
カニズムとして期待されている。

例えば、ＩＬ−６の骨髄細胞増殖効果や血小板増加効果
は放射線等の癌治療の効果を高める。一方、各種自己免
疫疾患では、その病因と考えられるＩＬ−６作用の抑制
が、症状の軽減につながる。

前者の目的には、遺伝子工学的に作成されたヒトＩＬ−
６が、後者の目的には、遺伝子工学的に作成された細胞
表層より離脱したく可溶性）ヒトＩＬ−６レセプターや
ヒトＩＬ−６に対する中和抗体が考えられるが、さらに
他の合成物質や天然物質にもＩＬ−６の作用を調節する
物質の存在が期待される。

可溶性ヒトＩＬ−６レセプターをＩＬ−６作用を調節す
る薬剤として開発するためには、マウス等の実験動物に
投与して、その効果を調べることが必須となる。しかし
、ヒト可溶性ＩＬ−６レセプターをマウス等の実験動物
に投与しても、実験動物由来のＩＬ−６と特異的に結合
することが期待できない。さらには、ヒト可溶性ＩＬ−
６レセプターの実験動物に対する抗原性も問題となる。

実験動物の中では、マウスが、取り扱いの容易さにおい
て、さらにはＩＬ−５過剰産生により自己免疫疾患にな
るストレインが確立されているという点において、最も
その使用が望まれる。しかし、マウス可溶性ＩＬ−６レ
セプターを遺伝子工学的に生産するには、マウスＩＬ−
６レセプターをコードするＤＮＡ配列が必須である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明はマウスＩＬ−６レセプター及びそれを
コードするＤＮＡ並びに該ＤＮＡを用いる該レセプター
の製造方法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕 上記の目的を達成するために、本発明者は、ＩＬ−６レ
セプターについて鋭意研究を行った結果、マウスＩＬ−
６レセプターをコードするＤＮＡ配列を明らかにし、こ
の知見をもとに遺伝子工学的にＩＬ−６レセプターを生
産する手段および方法を完成した。

すなわち本発明は、マウスＩＬ−６と特異的に結合する
マウスＩＬ−６レセプター；マウスＩＬ−６レセプター
をコードするＤＮＡ配列；組換微生物または培養細胞中
で前記ＤＮＡ配列を発現し得る複製可能な発現ベクター
；前記発現ベクターにより形質転換された微生物または
培養細胞；および前記微生物または培養細胞においてマ
ウスＩＬ−６レセプターをコードするＤＮＡ配列を発現
させることを特徴とするマウスＩＬ−６レセプターの生
産方法、を提供するもであり、以下詳細１ご言桑明する
。

〔発明の詳細な説明〕

１、　マウスＩＬ−６レセプター マウスＩＬ−６レセプターは、マウス由来の細胞膜上に
存在し、マウスＩＬ−６と特異的に結合するタンパク質
である。詳しくは次の式（Ｉ）Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
ＶａｔＡｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｅ
ｕＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＶａｌＡｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ
　Ｇｌｙ＾１ａ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｙｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｔ
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ｒ　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｇｌｕ
　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ＾ｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ
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ｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｃｙｓ　
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ｓｐ　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

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ｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　
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ｅｕＧｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＶａｌＡｒｇ　
Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＨｌｓＧｌｙ　　Ｌｙｓ　　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　
Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ＾１ａ　ｌｉ
ｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＴｒｐＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ
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ｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅｒＧｌｕ　ｌｉｅ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　ＣｙｓＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　５ｅｒ
Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＭｅｔＰｒｏ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＶａｌＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ａｒｇ　ＴｒｐＧｌｎ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＰｈｅＰｒｏ　　
Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　ＬｙｓＬｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ａｌａｌｌｅ　ｔｌｉｓ　Ａｓｐ
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ｈｒ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ
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ｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙ
ｓＴｒｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ
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ｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｌ
ｅｕＶａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ
　）！＋ｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＳｅｒ　Ａｓｐ　
Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｃ
ｙｓ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＡｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈ
ｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（Ｃ末端） はグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｙはグリシ
ン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはアスパラギン酸、Ｃ
ｙｓはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍｅｔはメチオニン
、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはヒスチジン、Ｉ
ｌｅはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔｒｐ　はリジン
、Ｎｅｔはチロシン、そしてＶａｌはフェニルアラニン
、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒ　はトレ
オニン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、
そしてＶａｌ　はバリン残基を示す。）で表されるアミ
ノ酸配列を有するものである。本発明では前記アミノ酸
配列を有する蛋白質の他、前記アミノ酸配列中のＩＬ−
６との特異的な結合に寄与する部分を含有する蛋白質ま
たはポリペプチドであれば良い。すなわち前記アミノ酸
配列中の１個または複数個のアミノ酸残基が他のアミノ
酸残基により置換されているかまたは欠失もしくは付加
されているアミノ酸配列を有し、かつマウスＩＬ−６と
特異的に結合する能力を保持している蛋白質またはポリ
ペプチドはすべて本発明のマウスＩＬ−６レセプターの
範囲に含まれる。例えば、このような蛋白質として、前
記アミノ酸配列中のｔＬ−６との結合に寄与するアミノ
酸配列および／ｌ、たはアミノ酸残基部分以外のアミノ
酸配列および／またはアミノ酸残基が置換、欠損、挿入
等により変化したもの、さらには前記アミノ酸配列のＮ
末端側および／またはＣ末端側にアミノ酸配列および／
またはアミノ酸残基が追加された蛋白質、あるいは例え
ばヒト成長ホルモン等の他の蛋白質等が融合したもので
あっても良い。

式（１）で示されるアミノ酸配列は４６０アミノ酸残基
からなり、Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシンか
ら第１９番目に位置するアラニンにかけてと、第３５８
番目に位置するセリンから第３８５番目に位置するロイ
シンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が位置してい
る、この２つの疎水性領域は、前者がシグナルペプチド
領域、後者が膜貫通領域であると考えられる。

２、　　ＤＮＡ配列 生体内で産生されるマウスＩＬ−６レセプターをコード
するＤＮＡ配列は、詳しくは次の式（ｎ）により示され
る。

（５−） ＡＴＣＣＴＧ　ＡＣＣ ＧＣＣＣＴＧ　ＣＴＧ ＧＴＣＣＴＣＧＧＧ ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＧＧＣ ＧＣＣＡＣＣＧＴＴ ６＾＾ＧＣＡ　ＧＣＡ ＧＴＧ　ＴＡＣＴＣＴ ＡｃＴ　　ＡｃＣＡＣＡ ＧＡＣＧＴＧ　ＣＡＧ ＴＴＡ　ＴＧＣＴＣＣ ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣ ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＣＴＴ ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＡＧＣ ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ ＡＣＣＡＣＣＡＡＣ ＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＴＴＣＴＣＣＴＧＣ ＧＡＣＡＡＡ　ＧＴＡ ＧＴＣ’　ＧＧＣＴＧＣＡＣＧ ＧＣＣＧＣＧ　ＣＣＣＧＣＧ ＡＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧ ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣ＾＾ＧＣ ＡＣＣＣＴＧ　ＡＴＴ　ＴＧＣ ＧＧＣＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＣＣ ＧＧＣＴＣＡ　ＣＡ＾＾ＡＣ ＧＧＡ　ＡＡＣＡＣＡ　ＣＴＧ ＣＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴ ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＣ ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＴ ＡＡＧ　ＣＴＣＴＣＣＴＧＣ ＧＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣ ＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴ ＣＴＧ　　ＴＴ丁　ＧＣＡ　　ＡＡＧ ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣ ＴＡＴ　　ＴＣＴ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧＣＡＧ　ＧＴＧ
　ＧＡＧ　ＡＴＣ ＴＡＣＣＡＣＡＴＡ　ＧＴＧ ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴＣ ＧＴＣＧＣＧ　ＣＴＧ ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＧ ＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＧ ＡＴＴ　ＣＡＣＴＧＧ ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＴＧＧ ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＡＧＧ ＧＧＧ　ＧＡＣＴＡＴ ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ ＧＴＴ　ＣＣＣＣＣＡ ＴＴＣＣＧＧ　　八＾Ｇ ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＴＧＧ ＣＣＡ　ＡＣＣＡＣＧ ＡＡＡ　ＡＴＣＡＡＣ ＴＴＣＣＡＧ　ＧＴＧ ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＥ： ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＴ ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＴＧＣ ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＧＴ　ＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧ
ＡＡ　ＧＣＧ　ＴＴＴ ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡＧＴＡ　ＴＣ
ＡＧＣＣＡＴＡ　ＣＣＴ ＣＴＣＡＡＡ　ＧＴＣＡＧＣＴＧＧ ＴＧＧ　ＧＡＣＣＣＧ　ＡＧＴ　ＴＡＣＣＡＧ　ＣＴＴ
　ＣＧＡ　ＴＡＣＣＧＡＧ八Ｇ　へＴＴＣＡＣＧ　　Ｇ
ＴＧ　　ＴＴＧＣＡＧ　ＴＡＣＣＡＡ　ＴＧＣＧＴＣ ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＧＧＧ　ＡＡ
Ｇ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＴＡＧＴ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　
ＴＣＣＣＣＡＣＣＴ　　ＴＧＧ　　八ＴＡ　　ＧＣＡ　
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ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＧＣＣＣＣＡ　Ｇ
ＴＧ ＡＧＧ　　ＴＣＣ（１：ＴＧ　　ＣＣＣＡＣＡＧＧＡ　
ＡＧＣＴＴＧ　ＧＣＧ　ＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴ
ＣＣＴＧ ＧＧＡ　ＡＧＣＡＡＧ ＣＡＣＡＧＣＴＴＡ ＣＣＴ　ＧＣＣＡＡＣ ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＣＣＧ ＣＡＧ　ＣＡＣＣＣＴ ＴＡＣＴＴＧ　ＣＴＧ ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＴＧＧ ＣＴＧ　ＣＴＣＣＣＧ ＡＴＣＣＡＴ　ＧＡＴ ＧＴＧ　ＧＴＣＣＡＧ ＧＡＣＣＴＴ　ＧＧＣ ＧＡＧ　　ＧＴＣＡＣＧ ＣＣＣＡＧＧ　ＡＣＣ ＡＡＣＣＣＣＡＣＡ ＧＣＣＡＡＣＣＡＣ ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ ＣＡＡ　　ＧＡＡ　ＴＣＣ ＴＴＣＣＴＧ　ＧＴＡ ＧＧＧ　ＴＴＧ　ＣＴＴ ＡＧＡ　ＣＴＣＡＡＧ ＴＣＣＡＧＣ ＡＡＡ　ＡＴＧ ＣＴＴ　ＧＴＧ ＣＧＣＴＧＧ ＧＡＧ　ＡＣＣ ＣＡＧ　ＴＴＣ ＴＣＡ　ＡＡＧ ＧＴＧ　ＧＣＣ ＧＣＣＴＴＧ ＧＴＣＣＧＴ ＣＡＧ　ＴＧＧ ＧＧＣＡＣＴ ＡＣＣＣＣＧ ＣＡＧ　ＧＴＣ ＧＡＧ　　ＧＡＴ ＡＣＧ　ＡＧＴ ＴＣＧ　ＴＣＣ ＧＣＴ　ＧＧＡ ＣＴＣＴＧＴ ＣＡＧ　ＡＡＡ ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　Ａ
ＡＧ　ＧＡＡ　ＡＧＣＡＡＧＡＣＧ　ＡＣＣＴＣＴ　Ｃ
ＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣＣＣＣＡ　ＣＣＧ　ＴＡＴ　ＴＣＣ
ＴＴＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＡＣ
ＣＴＴＣＣＴＴ　ＣＴＧＧＴＴ　ＣＣＴ　ＣＴＣＣＴＣ
ＡＣＣＣＣＡ　ＣＡＣＡＧＣＴＣＴ　ＧＧＧＴＣＴ　Ｇ
ＡＣＡＡＴ　ＡＣＣＧＴＡ　ＡＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣ
ＣＴＧＧＧＴ　ＧＴＣＡＧＧ　ＧＡＣＧＣＡ　ＣＡＧ　
ＡＧＣＣＣＴ　ＴＡＴ　ＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧ
Ａ　ＧＡＣＴＡＣＴＴＡ　ＴＴＣＣＣＣＡＧＡ（３−） で表されるＤＮＡ配列を有するものである。本発明のＤ
ＮＡ配列は、式（ｎ）のＤＮＡ配列の他、このＤＮＡ配
列中の１個または複数個のヌクレオシドが他のヌクレオ
シドにより置換されているかまたは欠失もしくは付加さ
れているＤＮＡ配列を有し、かつマウスＩＬ−６と特異
的に結合する能力を有する蛋白質をコードしているＤＮ
Ａ配列をも含有する。例えば、前記ｌにおいて記載した
種々のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
配列があげられる。

これらのＤＮＡ配列は、例えはＢＡＬＢ／ｃ等のマウス
の例えば膵臓細胞から、公知な方法で抽出した種々のメ
ツセンジャーＲＮＡより、本発明により提供される式（
ｎ）ＤＮＡ配列をもとに作製したプローブ等を用いて目
的とするメツセンジャーＲＮＡを抽出し、これをもとに
作製しても良いし、また例えば一部あるいは全部を本発
明をもとに化学的に合成しても良い。

３、発現ベクター 本発明で提供されるＩＬ−６レセプターをコードするＤ
ＮＡ配列を発現、すなわち生産し得る複製可能な発現ベ
クターは、前記２で説明されたようなりＮＡ配列を発現
させ得るＤＮＡ配列と読取り可能に結合しているマウス
ＩＬ−６レセプターをコードするＤＮＡ配列および宿主
中でベクターＤＮＡを複製するための複製オリジン等を
有し、選定した宿主を形質転換できるものであれば制限
なく適宜選定して使用できる。例えば宿主として大腸菌
等の細菌株を用いる場合は、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
７等のプラスミドが例示できる。また例えば、宿主とし
て哺乳動物等の培養細胞を用いる場合には、ＳＶ４０ウ
ィルス由来のＤＮＡ複製オリジンを有するベクターが例
示できる。

ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列の中でも、プ
ロモーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関
係において適宜選定する必要である。宿主として大腸菌
を使用する場合のプロモーター系としては、乳糖プロモ
ーター系、トリプトファンプロモーター系、さらにはこ
れらのハイブリッドプロモーター系が例示できる。宿主
として哺乳動物由来の培養細胞を使用する場合のプロモ
ーター系としては、ＳＶ４０プロモーター系、アデノウ
ィルスプロモーター系が例示できる。

４、宿主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に蛋
白質を生産するために用いられる微生物または培養細胞
が使用できる。微生物としては、Ｋ−１２・Ｗ−３１１
０等の大腸菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養
細胞としては、ＣＯ８細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）・、
ＣＨＯ細抱（チャイニーズハムスターの卵母細胞）等が
例示できる。

５、形質転換された宿主を用いたマウスＩＬ−６レセプ
ターの生産 前記３で説明したベクターにより形質転換された前記４
で説明された様な宿主を培養し、ベクターＤＮＡ中のマ
ウスＩＬ−６レセプターをコードするＤＮＡ配列を発現
させることでマウスＩＬ−６レセプターを生産すること
ができる。これはマウスＩＬ−６レセプターをコードす
るＤＮＡ配列を結合した該ＤＮＡ配列を発現させ得るＤ
ＮＡ配列中のプロモーター系の活性化により実現される
。

〔実施例〕

以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１．　マウスＩＬ−６レセプターｃＤＮへの単離
一連の遺伝子組み換え操作方法（ｍ−ＲＮＡの抽出、Ｄ
ＮＡの制限酵素による切断等）は、マニアナイスらの方
法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｒｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
１９８２年参照）、バーウィンらの方法（ＤＮＡｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ　ｖｏｌ。

１、　ｐ４９．　ＩＲＬ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９３５
年参照）を参照１：行った。

マス、マウス・ミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１　（ＡＴ　Ｃ
ＣＣＲＬ　１９５７）からｍＲＮＡを抽出し、ラムダフ
ァージｇｔｌＯ（アマ−ジャム）を用いてｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。次にｐＢｓＦ２Ｒ，２３６（Ｋ、
Ｙａｍａｓａｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．　ｐ
８２５．１９８８年参照〉のインサートｃＤＮＡのＦｓ
ｐｌ−Ｂａｎｌ断片をプローブとして用い、７゜３Ｘ１
０’　クローンを以下の条件でスクリーニングした。プ
ラークをプロットするフィルターにはナイロンフィルタ
ーであるシーンスクリーンプラス（ＮＥＮ社）を用いた
、ハイブリーダイゼーションは、１％ＳＯ３，ＬＭ　Ｎ
ａＣｊ！、　０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　Ｈ１ｊ！　　（ｐ
Ｈ７，５）、５Ｘデンハルト溶液、２０Ｏｆｆ　／−サ
ケ***ＤＮＡ存在下で、６５℃で１６時間行った。その
後、２　Ｘ５ＳＣ，１％ＳＯ３で、６０℃にてフィルタ
ーを洗って非特異的にフィルターに結合したプローブを
分離させ、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。

なお、前記プラスミドｐＢｓＦ２Ｒ，２３６を制限酵素
Ｘｈｏ　Ｉで部分消火し、ＢＳＦ　２レセプターをコー
ドする塩基配列をすべて含有するＤＮＡ断片を得、これ
を市販のベクターｐｌＢＩ７６　（１８１社）のＳａｌ
　１部位に挿入してプラスミドｐＩＢＩＢｓＦ２Ｒを作
製した。

このプラスミドｐｌＢＩＢｓＦ２Ｒを含有する大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ−ｐｌＢＩＢｓＦ２Ｒは、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第２２３２号（ＦＢＲＭ　Ｂ
Ｐ−２２３２）として寄託されている。このプラスミド
から、常法に従って適当な制限酵素によりＢＳＦ　２レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡ断片を切り出し、本
発明で用いるプローブを作製することができる。

このようにして単離された１つのクローンをラムダＰ　
１　（ｌａｍｂｄａ　Ｐｉ）　と名付けた、第１図にラ
ムダＰ１の制限酵母地図および対応するＩＬ−６レセプ
ター蛋白質の模式図を示す。しかしながら、ラムダＰ１
めインサー）　ｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、ヒ
トーＩＬ−６レセプターとの比較より、完全長のマウス
ＩＬ−６レセプターがコードされていないことが判明し
た。

そこで、完全長のマウスＩＬ−６レセプターｃＤＮＡを
単離する目的で、上記方法でＢＡＬＢ／ｃの膵臓からｍ
ＲＮＡを抽出し、ｇｔｌＯを用いてｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。プローブとして図１のプローブを用い、
通常の方法でスクリーニングした結果、１つのクローン
、ラムダ３０１　（Ｉａｍｂｄａ３０１）を単離した、
ラムダ３０１のインサー）　ｃＤＮＡの塩基配列を決定
した結果、ヒトＩＬ−６レセプターとの比較より、完全
長のマウスＩＬ−６レセプターがコードされていること
が判明した。ヒ）ＩＬ−５レセプターとマウスＩＬ−６
レセプターの相同性は、ＤＮＡレベルで６９％、アミノ
酸レベルで５４％であった。

またラムダＰ１とラムダ３０１のそれぞれコードするマ
ウスＩＬ−６レセプターｃＤＮＡ塩基配列を比較したと
ころ、第１番目のメチオニンから第３８５番目のロイシ
ンまでをコードするＤＮＡ配列は一致したが、それ以降
のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列は全く異なっていた
。さらに詳細な塩基配列の解析を行ったところ、ラムダ
Ｐ１の第３８６番目以降のアミノ酸をコードするＤＮＡ
配列は、１ｎｔｒａｃｙｓｔｅｒｎａｌ　Ａ−ｐａｒｔ
ｉｃｌｅ（ＩＡＰ）遺伝子由来であることが判明した。

第１図に、ラムダ３０１の制限酵素地図および対応する
ＩＬ−６レセプター蛋白質の模式図を示す。

第２図に、ラムダ３０１のインサー）ｃＤＮＡの塩基配
列および塩基配列から推定されるマウスＩＬ−６レセプ
ターのアミノ酸配列を示す。

田賀らにより、ヒトＩＬ−６レセプターの細胞外領域が
、ＩＬ−６との結合およびシグナルの伝達に必須で、細
胞内領域はこれらの目的には不要であることが示された
（Ｃｅｌｌ、　５８．　ｐ５７３．１９８９年参照）。

単離したラムダ３０１のインサートｃＤＮＡが、マウス
ｔＬ−６レセプターのａｌｌ）ＮＡであること、および
、マウスＩＬ−６レセプター蛋白質の細胞外領域のみが
ＩＬ−６との結合およびシグナルの伝達に必須であるこ
とを示す目的で、ラムダＰ１のインサ−）ｃＤＮＡ　（
細胞外領域をコードするＤＮＡはラムダ３０１と一致す
るが、膜貫通領域および細胞内領域はラムダ３０１　と
異なる。）、あるいはラムダ３０１のインサートＣ口Ｎ
＾を細胞に導入し、マウスＩＬ−６レセプターを細胞膜
上に発現させ、ＩＬ−６によるシグナル伝達を調べた。

まず、アミノ酸コード領域を完全に含むラムダＰ１のＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片、およびラムダ３０１のＢｃ
ｏＲＩ−Ｋｐｎｌ断片をそれぞれ、ネオマインシ耐性遺
伝子を含む動物細胞発現ベクター、９Ｍ５Ｇ　（Ｃ１Ｌ
ａｋｅｒら、Ｐｒｏｃ、ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　８４．ｐ８４５９．　１９８７年参
照）に組み込んだ。次に、１０％牛血清、５０ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｉ７ペニシリン、５０ｎ／−ストレプトマイシン
、２ｍＭグルタミン、５０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、１０ｕｎｉｔｓ／Ｉｎ！ヒトＩＬ−６を含むＲＰＭ
１１６４０培地で培養したヒ）ＩＬ−６依存性ヒトＴ細
胞株、ＫＴ　−３（Ｓ、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｌｏｏｄ
　７２．　ｐ１８２６゜１９８８年参照）に、通常のエ
レクトロポーレーション法で、作製したベクターをそれ
ぞれ導入した。

７５０ｘ／ｍｊ’の６４１８　（シグマ社）を含む上記
組成の培地でスクリーニングを行い、最終的に、２種類
の形質転換細胞を得た。

この形質転換細胞２．５　ＸＩＯ’を種々の濃度のマウ
ス・リコンビナントＩＬ−６あるいは６　ｎｇ／ｒｎｌ
のヒト・リコンビナントＩＬ−６存在下で６６時間培養
した。最後の６時間は、０．５μＣｉのトリチウム標識
チミジンでパルスし、細胞への取り込みをシンチレーシ
ョンカウンター（ベックマン社）で測定した。

第３図から明らかなように、ラムダＰｌ由来のマウスＩ
Ｌ−６レセプターが発現している細胞、および、ラムダ
３０１由来のマウスＩＬ−６レセプターが発現している
細胞はマウス・リコンビナン）ＩＬ−６に濃度依存的に
増殖する。一方、形質転換されていないＫＴ−３は、マ
ウス・リコンビナントＩＬ−６に反応しない。また、３
種類の細胞ともヒト・リコンビナントＩＬ−６には反応
する。これらの事実は、ラムダ３０１のインサートＤＮ
ＡはマウスＩＬ−６レセプターのｃＤＮＡであることを
証明するものであり、マウスＩＬ−６レセプターはヒト
ＩＬ−６レセプターと同様に、細胞外領域がＩＬ−６と
の結合およびシグナルの伝達に重要であり、細胞内領域
は他の配列に置き換えられることを示す。

〔発明の効果〕

本発明で提供されるマウスＩＬ−６レセプターをコード
するＤＮＡ配列は、さらには該蛋白質を遺伝子工学的に
生産するための手段および方法により、自然状態では極
めて微量にしか生産されない該蛋白質を大量に生産する
ことが可能である。

また本発明により、マウスＩＬ−６レセプターの生体内
での諸性質を解析および推定することが可能である。こ
のことはＩＬ−６レセプターさらには生体の免疫機構等
の研究、またはそれらを用いた免疫疾患に対する治療薬
診断薬等の開発等に大きな意義をもつものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラムダＰ１およびラムダ３０１の制限酵素地
図および対応するＩＬ−６レセプター蛋白質の模式図、
さらにはプローブ１の位置を示す。 Ｂは３ａｍ）Ｉｆ　サイト、Ｅは！ＥＣ０ＲＩ　サイト
、ＦはＦＯにＩサイト、Ｈは旧ｎｄＩＩＩサイト、Ｋは
Ｋｐｎｌサイト、ＰはＰｓｔｌサイト、ＳはＳｍａｌサ
イトをそれぞれ示す。 また、ＳＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは
膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 第２図は、ラムダ３０１のインサートＣ口ＮＡ、すなわ
ちマウスＩＬ−６レセプターをコードするＤＮＡ配列に
ついてその塩基配列を解析した結果、およびこのＤＮＡ
配列が発現された場合に生産される蛋白質すなわちマウ
スＩＬ−６レセプターの推定されるアミノ酸配列を示す
。下線部分はＮ末端側の疎水性アミノ酸領域を示し、二
重下線部分はＣ末端側の疎水性アミノ酸領域を示す。 第３図は、ラムダＰ１由来のマウスＩＬ−６レセプター
発現ＫＴ−３（○）、ラムダ３０１由来マウスＩＬ−６
レセブタ一発現ＫＴ−３（・）、正常のＫＴ−３（ロ）
の、種々の濃度のマウス・リコンビナントＩＬ−６存在
下でのトリチウム標識チミジンの取り込みを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マウス・インターロイキン−６（以下ＩＬ−６とい
   う。）と特異的に結合しうるマウス・インターロイキン
   −６レセプター蛋白質。 ２、下記の式（ I ）： （Ｎ末端） 【遺伝子配列があります】 （Ｃ末端） （ただし、式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン
   、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃ
   ｙｓはシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグル
   タミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉ
   ｌｅはイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジ
   ン、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、
   Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニ
   ン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、そし
   てＶａｌはバリン残基を示す。）で表されるアミノ酸配
   列を有するか、あるいはこのアミノ酸配列中の１個また
   は複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換
   されているかまたは欠失もしくは付加されているアミノ
   酸配列を有し、かつマウスＩＬ−６と特異的に結合する
   能力を保持していることを特徴とする請求項１に記載の
   マウスＩＬ−６レセプター蛋白質。 ３、マウスＩＬ−６レセプター蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。 ４、請求項２に記載のいずれかのアミノ酸配列を有する
   マウスＩＬ−６レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ。 ５、下記の式（II）： （５＾−） 【遺伝子配列があります】 （３＾−） （ただしＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、
   Ｔはチミンを有するヌクレオシドを示す）で表される請
   求項３に記載のＤＮＡ。 ６、前記ＤＮＡを発現させうるＤＮＡ配列と読取り可能
   に結合していることを特徴とする請求項３に記載のＤＮ
   Ａ。 ７、組換微生物または培養細胞中で請求項３に記載のＤ
   ＮＡ配列を発現しうる複製可能な発現ベクター。 ８、請求項７に記載の発現ベクターにより形質転換され
   た微生物または培養細胞においてマウスＩＬ−６レセプ
   ター蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させ、該蛋白
   質を生産させることを特徴とするマウスＩＬ−６レセプ
   ター蛋白質の生産方法。