JPH03152444A - Method and apparatus for detecting germ - Google Patents
Method and apparatus for detecting germInfo
- Publication number
- JPH03152444A JPH03152444A JP29299889A JP29299889A JPH03152444A JP H03152444 A JPH03152444 A JP H03152444A JP 29299889 A JP29299889 A JP 29299889A JP 29299889 A JP29299889 A JP 29299889A JP H03152444 A JPH03152444 A JP H03152444A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- intensity
- fluorescence
- difference
- microorganisms
- intensity ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 103
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 101
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 98
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 33
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 7
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 7
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 7
- 235000020279 black tea Nutrition 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 235000020333 oolong tea Nutrition 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013215 result calculation Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の背景〕
本発明は、微生物の検出法および検出装置に関し、より
詳細には、螢光染色した微生物試料中の微生物を自家螢
光を有する異物と識別して検知することができる微生物
の検出法および検出装置に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Background of the Invention] The present invention relates to a method and apparatus for detecting microorganisms, and more particularly, the present invention relates to a method and apparatus for detecting microorganisms, and more particularly, a method for detecting microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample to distinguish them from foreign substances having autofluorescence. The present invention relates to a method and device for detecting microorganisms.
〈従来の技術〉
医薬、食品、化粧品をはじめ広い分野の学界あるいは産
業界において、微生物検査は日常的な検査項目の一つで
あり、微生物の迅速測定法に対してこれまでにも強い要
望があったが、現在までに実用化されている微生物迅速
測定装置についてはいずれもこれらの要望を満足させる
レベルに至っているものは開発されていない（春田三佐
夫他「食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速化」、Ｐ
ｌｌ、サイエンスフォーラム（１９８５）；貫名正文、
食品工業、３１ （１０） 、４１（１９８８））。<Prior art> Microbial testing is one of the routine testing items in a wide range of academic and industrial fields, including medicine, food, and cosmetics, and there has been a strong demand for rapid microbial measurement methods. However, none of the rapid microorganism measurement devices that have been put into practical use to date have reached a level that satisfies these demands (Misao Haruta et al., "Simplification and Automation of Food Microbial Testing"). , Speeding up”, P.
ll, Science Forum (1985); Masafumi Nukina,
Food Industry, 31 (10), 41 (1988)).
これに対して微生物を螢光染色する螢光検出法により微
生物を迅速に自動検出する装置が最近になって提案され
（特願平１−１６５６３５号明細書、特開昭６３−５３
４４７号公報）、より迅速性の高い機器として実用化の
検討がなされている。In response to this, a device for quickly and automatically detecting microorganisms using a fluorescent detection method that dyes microorganisms with fluorescent light has recently been proposed (Japanese Patent Application No. 1-165635, Japanese Patent Application Laid-open No. 63-53).
No. 447), the practical application of which is being considered as a more rapid device.
しかしながら自然界には自家螢光を有する微細な異物が
多数存在しており、このためにこれらの装置は螢光染色
微生物以外の自家螢光異物をも同時に検出してしまうも
のである。したがって、検査試料、たとえばビール、そ
の他の飲料等の製品、中の微生物検査においては、最終
判定は螢光顕微鏡部での目視検査による確認に頼らざる
を得ないという問題が残されている。従ってこのことが
螢光検出法による微生物検出の自動化において最大の課
題となっている。However, in the natural world there are many minute foreign substances that exhibit self-fluorescence, and for this reason, these devices simultaneously detect self-fluorescent foreign substances other than fluorescent-stained microorganisms. Therefore, when testing microorganisms in a test sample, such as a product such as beer or other beverages, the problem remains that the final judgment must be made by visual inspection using a fluorescence microscope. Therefore, this is the biggest challenge in automating the detection of microorganisms using the fluorescence detection method.
く要旨〉
本発明は、上記の問題点を解決し、螢光染色微生物と自
家螢光異物とを光学的に識別できるようにすることを目
的とし、特定条件の励起光に対して発生する螢光のスペ
クトル、強度、強度差、強度比および強度比差からなる
群から選ばれる値の差異を利用することにより、この目
的を達成しようとするものである。Summary of the Invention The present invention aims to solve the above-mentioned problems and to make it possible to optically distinguish between fluorescently dyed microorganisms and self-fluorescent foreign substances. This objective is achieved by utilizing differences in values selected from the group consisting of light spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference.
すなわち、本発明による微生物の検出法は、螢光染色し
た微生物試料中の該微生物を顕微測光により検知する微
生物の検出法において、微生物試料に一種の波長または
複数種の波長の励起光を照射して発生した螢光を測定し
、得られる螢光のスペクトル、強度、強度ヱ、強度比お
よび強度比差からなる群から選ばれる値の差異を利用す
ることにより螢光染色微生物と自家螢光異物を識別する
こと、を特徴とするものである。That is, the microorganism detection method according to the present invention is a microorganism detection method in which microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample are detected by microphotometry, and the microorganism sample is irradiated with excitation light of one wavelength or multiple wavelengths. By measuring the fluorescence generated by the method and using the difference in values selected from the group consisting of the spectrum, intensity, intensity ヱ, intensity ratio, and intensity ratio difference of the obtained fluorescence, it is possible to identify fluorescently stained microorganisms and autofluorescent foreign substances. It is characterized by identifying.
また、本発明による微生物の検出装置は、螢光染色した
微生物試料中の該微生物を検知する顕微測光手段を備え
た微生物の検出装置において、微生物試料に一種の波長
または複数種の波長の励起光を照射する光源照射手段と
、微生物試料から発生する螢光を検出して光電変換する
検出手段と、該検出手段からの信号出力値を読みとって
螢光のスペクトル、強度、強度差、強度比および強度比
差からなる群から選ばれる値をもとめ、この値の差異に
より螢光染色微生物を自家螢光異物と識別してＡＩ定す
る信号処理手段と、を有すること、を特徴とするもので
ある。Further, the microorganism detection device according to the present invention is a microorganism detection device equipped with a microphotometric means for detecting microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample, and in which the microorganism sample is exposed to excitation light of one wavelength or a plurality of wavelengths. a light source irradiation means for irradiating the microbial sample, a detection means for detecting and photoelectrically converting the fluorescence generated from the microbial sample, and a detection means for reading the signal output value from the detection means to determine the spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, The present invention is characterized by having a signal processing means for obtaining a value selected from a group consisting of intensity ratio differences, and identifying a fluorescently stained microorganism from a self-fluorescent foreign substance based on the difference in the value, and performing an AI determination. .
く作用〉
（１）微生物の検出法
螢光染色された微生物試料を顕微ｉｌｌ光により検知す
る際、まず微生物試料に一種の波長または複数種の波長
の励起光を順次照射すると、該試料から螢光が発生する
。次にこの螢光のスペクトル、特定波長における螢光の
強度を測定し、必要に応じて螢光の、強度差、強度比お
よび強度比差からなる群から選ばれる値をもとめる。(1) Detection method for microorganisms When detecting a fluorescently stained microorganism sample using microscopic illumination light, first, the microorganism sample is sequentially irradiated with excitation light of one wavelength or multiple wavelengths, and then fluorescent light is released from the sample. Light is generated. Next, the spectrum of this fluorescent light and the intensity of the fluorescent light at a specific wavelength are measured, and if necessary, a value selected from the group consisting of an intensity difference, an intensity ratio, and an intensity ratio difference of the fluorescent light is determined.
この螢光スペクトル、螢光の強度、強度差、強度比もし
くは強度比差のいずれか一つの値、またはこれらの値の
複数の組合せによるデータは、螢光染色微生物と自家螢
光異物とにおいて異なるので、あらかじめ両者を区別す
る基準値を定めておく。This fluorescence spectrum, fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio, or intensity ratio difference, or data based on multiple combinations of these values are different between fluorescently stained microorganisms and autofluorescent foreign substances. Therefore, a standard value for distinguishing between the two should be determined in advance.
螢光測定から得られた螢光スペクトル、螢光の強度、強
度差、強度比および強度比差からなる群から選ばれる値
をこの基準値と比較することにより、試料中の微生物を
自家螢光異物と識別して検出する。By comparing the value selected from the group consisting of the fluorescence spectrum, fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference obtained from fluorescence measurement with this reference value, microorganisms in the sample are detected by autofluorescence. Identifies and detects foreign objects.
（２）微生物の検出装置
螢光染色された微生物を螢光顕微鏡部の所定位置にセッ
トし、一種の波長または複数種の波長の励起光を順次照
射すると、該試料から螢光が発生する。(2) Microorganism Detection Device When a fluorescently stained microorganism is set at a predetermined position in a fluorescence microscope section and sequentially irradiated with excitation light of one wavelength or a plurality of wavelengths, fluorescence is generated from the sample.
この螢光は検出手段によって種々の波長または特定の波
長のものが感知されて電気信号に変換される。この電気
信号は信号処理手段によって読みとられて処理され、螢
光スペクトル、強度、強度差、強度比および強度比差か
らなる群から選ばれる値がもとめられる。更にこの信号
処理手段により、上記の螢光スペクトル、螢光の強度、
強度差、強度比もしくは強度比差のいずれか一つの値、
またはこれらの値の複数の組合せによるデータが、あら
かじめ螢光染色微生物と自家螢光異物とを区別する基準
値と比較され、微生物が自家螢光異物と識別されて検出
される。Various wavelengths or specific wavelengths of this fluorescent light are detected by the detection means and converted into electrical signals. This electrical signal is read and processed by signal processing means to determine a value selected from the group consisting of fluorescence spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio and intensity ratio difference. Furthermore, by this signal processing means, the above-mentioned fluorescence spectrum, fluorescence intensity,
One value of intensity difference, intensity ratio, or intensity ratio difference,
Alternatively, data based on a plurality of combinations of these values is compared with a reference value that previously distinguishes between fluorescently stained microorganisms and autofluorescent foreign substances, and the microorganisms are identified and detected as autofluorescent foreign substances.
く効果〉
本発明による微生物の検出法および検出装置は、微生物
を螢光染色してＤＩ定する螢光検出法を利用しているも
のでありながら、被検査試料中の螢光染色微生物を自家
螢光を有する異物と識別して検出することができる。従
って、微生物のみを特異的に且つ迅速に測定することが
可能となる。Effects> Although the method and device for detecting microorganisms according to the present invention utilizes a fluorescent detection method in which microorganisms are fluorescently dyed and DI determined, the microorganisms detection method and detection device of the present invention do not require self-introduction of fluorescently stained microorganisms in a test sample. It can be detected by distinguishing it from foreign substances that have fluorescence. Therefore, it becomes possible to specifically and quickly measure only microorganisms.
本発明による検出法および検出装置に使用されれる螢光
染色された微生物試料は、好ましくは、被検査物、たと
えば飲料食品、液体状の医薬品および化粧品、あるいは
水、空気などの試料、中の微生物（具体的にはたとえば
、飲料食品であればビール中の酵母など）を適当な孔径
を有するメンブランフィルタ−上に捕捉し、このフィル
ター上の微生物を螢光物質、たとえばフルオレセインジ
アセテート、プロビデイウム・イオダイド、フルオレセ
インイソチオシアネート、アクリジンオレンジ、エチジ
ュムブロマイドなど、好ましくはフルオレセインジアセ
テート、によって染色したものであり、必要に応じて短
時間培養後染色したものである。The fluorescently stained microbial sample used in the detection method and detection device according to the present invention is preferably a test object, such as a sample of water, air, etc. (Specifically, for example, in the case of beverages, yeast in beer) is captured on a membrane filter with an appropriate pore size, and the microorganisms on this filter are treated with fluorescent substances such as fluorescein diacetate and providium iodide. , fluorescein isothiocyanate, acridine orange, ethidium bromide, etc., preferably fluorescein diacetate, and if necessary, the staining is carried out after short-term culture.
〈検出法〉
本発明による微生物の検出法は、螢光染色した微生物試
料中の該微生物を顕微測光により検知する微生物の検出
法において、微生物試料に一種の波長または複数種の波
長の励起光を照射して発生した螢光を測定し、得られる
螢光のスペクトル、強度、強度差、強度比および強度比
差からなる群から選ばれる値の差異を利用することによ
り螢光染色微生物と自家螢光異物を識別すること、を基
本原理とするものである。<Detection method> The microorganism detection method according to the present invention is a microorganism detection method in which microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample are detected by microphotometry, in which excitation light of one wavelength or multiple wavelengths is applied to the microorganism sample. By measuring the fluorescence generated by irradiation and using the difference in values selected from the group consisting of the spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of the resulting fluorescence, it is possible to distinguish between fluorescently dyed microorganisms and autologous fluorescents. The basic principle is to identify optical foreign objects.
本発明検出法における励起光としては、波長約５４５ｎ
ｍのもの（以下、Ｇ励起光ともいう）、約４９０ｎｍの
もの（以下、Ｂ励起光ともいう）、約４０５ｎｍのもの
（以下、■励起光ともいう）、および約３６５ｎ１１の
もの（以下、Ｕ励起光ともいう）が適当である。The excitation light in the detection method of the present invention has a wavelength of approximately 545 nm.
m (hereinafter also referred to as G excitation light), approximately 490 nm (hereinafter also referred to as B excitation light), approximately 405 nm (hereinafter also referred to as ■ excitation light), and approximately 365n11 (hereinafter referred to as U excitation light). (also called excitation light) is suitable.
微生物試料がフルオレセイン（たとえばフルオレセイン
ジアセテート）染色の場合は、一種の励起光を使用する
時はＢ励起光を用いることが、複数種の励起光を使用す
る時はＢ励起光を他の励起光と組合せて用いることが、
より好ましい。If the microbial sample is stained with fluorescein (for example, fluorescein diacetate), when using one type of excitation light, use B excitation light, and when using multiple types of excitation light, use B excitation light with other excitation lights. It can be used in combination with
More preferred.
複数種の波長の励起光を用いる場合の励起光の組合せは
任意のものが可能である。たとえば２種の波長の励起光
を用いる場合、上記ＢＳＧＳＵ、■の４種の励起光でい
えば、Ｂ−ＧＳＢ−Ｕ。When using excitation lights of multiple types of wavelengths, any combination of excitation lights is possible. For example, when using excitation lights of two types of wavelengths, the above four types of excitation lights are BSGSU and B-GSB-U.
Ｂ−ＶＳＧ−ＵＳＧ−Ｖ、Ｕ−Ｖ （すヘテ順不同）の
組合せが可能であるが、上述したようにＢ（励起光）を
含む組合せ、すなわちＢ−Ｇ、Ｂ−ＵおよびＢ−Ｖが好
ましく、また３種の波長の励起光を用いる場合、たとえ
ばＢ−Ｇ−Ｖ、Ｂ−Ｕ−Ｖ（いずれも順不同）などのＢ
（励起光）を含む組合せが好ましい例としてあげられる
。Combinations of B-VSG-USG-V and U-V (in random order) are possible, but as mentioned above, combinations that include B (excitation light), that is, B-G, B-U, and B-V, are possible. Preferably, when using excitation light of three different wavelengths, for example, B-G-V, B-U-V (in no particular order),
A preferred example is a combination including (excitation light).
本発明検出法において、螢光のスペクトル、強度、強度
ｌおよび強度比差からなる群から選ばれる値とは、これ
らの値のうちのいずれか一つ、またはこれらの値のうち
の適当な複数の組合せ、を表わすものである。In the detection method of the present invention, the value selected from the group consisting of fluorescence spectrum, intensity, intensity l, and intensity ratio difference is any one of these values, or an appropriate plurality of these values. It represents a combination of
本発明検出法において、螢光スペクトルの差異を利用す
ることにより螢光染色微生物と自家螢光異物を識別する
検出法は、一つの励起光の照射によって螢光スペクトル
を得るものであり、一種の波長の励起光を使用する場合
は一つの螢光スペクトルが得られ、複数種の波長の励起
光を使用する場合は、一つまたは所望の複数の螢光スペ
クトルを得ることができる。In the detection method of the present invention, the detection method for distinguishing between fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances by utilizing differences in fluorescent spectra obtains the fluorescent spectra by irradiation with a single excitation light, and is a type of detection method. When using excitation light of different wavelengths, one fluorescence spectrum is obtained, and when using excitation lights of multiple wavelengths, one or a plurality of desired fluorescence spectra can be obtained.
ここで、螢光スペクトルとは、励起光の照射によって発
生した螢光についてその強度を２種以上の波長において
表わしたものであり、特定の２種以上の波長における螢
光強度を表わしたもの、およびある範囲の波長域におい
て螢光強度を連続的に表わしたもの、を含むものである
。また、螢光スペクトルの差異を利用する場合、実際に
は、２種以上の複数の各波長における螢光の強度そのも
の、強度差、適当な２種の波長における螢光強度の比お
よび強度比差からなる群から選ばれる値の差異を利用す
ることになる。Here, the fluorescence spectrum is a representation of the intensity of fluorescence generated by excitation light irradiation at two or more wavelengths, and represents the fluorescence intensity at two or more specific wavelengths. and a continuous representation of fluorescence intensity in a certain range of wavelengths. In addition, when using differences in fluorescence spectra, in reality, the intensity of the fluorescence itself at each of two or more wavelengths, the intensity difference, the ratio of the fluorescence intensity at two appropriate wavelengths, and the intensity ratio difference. The difference between the values selected from the group consisting of is used.
ここで、強度とは１種または複数種の波長の励起光の照
射によって得られる個々の強度値（たとえばａＳｂ、・
・・）を表わし、強度差とは強度値間の差（すなわち上
記の例でいえば、たとえばａ −ｂなど任意の組合せに
よる差）を表わし、強度比す
とは強度値間の比（たとえば−などの任意の組合せによ
る比）あるいは強度差を含む比（たとえば表わし、強度
比差とは強度比間の差（たとえばａｃ ａ
ｃる差）を表わすものである。Here, intensity refers to individual intensity values obtained by irradiation with excitation light of one or more wavelengths (for example, aSb, .
. -, etc.) or a ratio including an intensity difference (e.g., expressed), and an intensity ratio difference is a difference between intensity ratios (e.g., ac a
c).
本発明検出法において、螢光スペクトルの差異を利用す
る検出法の好ましい態様の一つは、励起光として波長約
４９０ｎｍのＢ励起光を用い、発生した螢光を波長５０
０〜６００ｎｍ、好ましくは５１０〜５５０ｎｍ、およ
び５５０〜７００ｎｍ、好ましくは５６０〜６００ｎｍ
、を中心とする２種類以上の干渉フィルターを別々に通
過させてそれぞれ測定することによりそれぞれの螢光の
強度、強度差、強度比および強度比差からなる群から選
ばれる値をもとめるものである（検出法Ａ）。In the detection method of the present invention, one of the preferred embodiments of the detection method that utilizes differences in fluorescence spectra uses B excitation light with a wavelength of about 490 nm as the excitation light, and
0-600 nm, preferably 510-550 nm, and 550-700 nm, preferably 560-600 nm
By passing the fluorescent light separately through two or more types of interference filters centered on , and measuring each, a value selected from the group consisting of the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of each fluorescent light is obtained. (Detection method A).
この検出法は第５図、６図および第８図に示すように、
螢光染色微生物（この場合、フルオレセインジアセテー
ト（ＦＤＡ）染色したビール酵母：５ａｃｃｈａｒｏＩ
ｌｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｉ＋ ）は約４９０ｎｍのＢ励
起光に対して５００〜５５０ｎｍの波長域に螢光強度の
ピークがあり、６家螢光を有する異物は５５０〜７００
ｎｍの波長域に螢光強度のピークがあるという結果に基
づくものである。This detection method is shown in Figures 5, 6 and 8.
Fluorescently stained microorganisms (in this case, fluorescein diacetate (FDA) stained brewer's yeast: 5accharoI
lyces uvarui+) has a peak fluorescence intensity in the wavelength range of 500 to 550 nm for B excitation light of approximately 490 nm, and foreign substances with six families of fluorescence have a peak of fluorescence intensity of 550 to 700 nm.
This is based on the result that the fluorescence intensity has a peak in the nm wavelength range.
検出法Ａにおいて、螢光染色微生物と自家螢光異物との
識別は、スペクトルの２つ以上の螢光強度の値について
それぞれ基準値を設定し、得られたそれぞれの強度値を
基準値と比較することによって行なうか、または２つ以
上の螢光強度の値からそれぞれの、強度差、強度比およ
び強度比差からなる群から選ばれる値の基準値を設定し
、得られた２つ以上の強度値から強度差、強度比および
強度比差からなる群から選ばれる値を求めてこれを基準
値と比較することによって行なうことができるが、強度
比を用いるのがより好ましい。In detection method A, discrimination between fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances is achieved by setting reference values for each of two or more fluorescence intensity values in the spectrum, and comparing each obtained intensity value with the reference value. or by setting a reference value for each value selected from the group consisting of intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference from two or more fluorescence intensity values, and This can be done by determining a value selected from the group consisting of an intensity difference, an intensity ratio, and an intensity ratio difference from the intensity value and comparing it with a reference value, but it is more preferable to use the intensity ratio.
螢光スペクトルの差異を利用する検出法の好ましい他の
態様として、励起光の種類を複数用いた場合の下記の２
つの例があげられる。Other preferable embodiments of the detection method that utilizes differences in fluorescence spectra include the following two methods in which multiple types of excitation light are used.
There are two examples.
その第１は、二種の波長の励起光として波長的４９０ｎ
ｍのＢ励起光および波長的４０５ｎｍのＶ励起光を用い
、発生した螢光をＢ励起では波長５００〜６００ｎｍお
よびそれより長くて５５０〜７００ｎｔｘを中心とする
二種類の干渉フィルターを別々に通過させてそれぞれ測
定することにより両替光の強度、強度差、強度比、およ
び強度比差からなる群から選ばれる値をもとめ、この螢
光スペクトルの差異を利用し、■励起では波長４８０〜
５３０ｎｍおよびそれより長くて５１０〜５６０ｎｍを
中心とする二種類の干渉フィルターを別々に通過させて
それぞれ測定することにより両替光の強度、強度差、強
度比および強度比差からなる群から選ばれる値をもとめ
、この螢光スペクトルの差異を利用するものである（検
出法Ａ’ ）。The first is 490n wavelength as excitation light of two wavelengths.
Using B excitation light with a wavelength of m and V excitation light with a wavelength of 405 nm, the generated fluorescence is separately passed through two types of interference filters centered on a wavelength of 500 to 600 nm for B excitation and a longer wavelength of 550 to 700 ntx. By measuring each of them, a value selected from the group consisting of the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of the exchange light is obtained, and by utilizing this difference in fluorescence spectrum,
A value selected from the group consisting of the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of the exchange light by passing it through two types of interference filters centered on 530 nm and 510 to 560 nm, which are longer than that, and measuring each. This method uses the difference in the fluorescence spectra (detection method A').
第２は、二種の波長の励起光として波長的４９０ｎｍの
Ｂ励起光および波長的３６５ｎｍのＵ励起光を用い、発
生した螢光をＢ励起では波長５００〜６００＋ｖおよび
それより長くて５５０〜７０００Ｉを中心とする二種類
の干渉フィルターを別々に通過させてそれぞれ測定する
ことにより両替光の強度、強度差、強度比、および強度
比差からなる群から選ばれる値をもとめ、この螢光スペ
クトルの差異を利用し、Ｕ励起では波長４２０〜５００
ｎ■およびそれより長くて４８０〜５８０ ｎｍを中心
とする二種類の干渉フィルターを別々に通過させてそれ
ぞれ測定することにより両替光の強度、強度差、強度比
および強度比差からなる群から選ばれる値をもとめ、こ
の螢光スペクトルの差異を利用するものである（検出法
Ａ′）。The second method uses B excitation light with a wavelength of 490 nm and U excitation light with a wavelength of 365 nm as excitation lights of two types of wavelengths. By passing through two types of interference filters centered on Utilizing the difference, the wavelength is 420 to 500 for U excitation.
The intensity of the exchanged light is selected from the group consisting of the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference by passing separately through two types of interference filters centered on 480 to 580 nm and longer than that. This method uses the difference in the fluorescence spectrum (detection method A').
これらの検出法Ａ’ 、Ａ’のような方法では、前記検
出法Ａにおける強度値、強度差、強度比および強度比差
からなる群から選ばれる値と基準値との比較をそれぞれ
の励起光について行なうことになる。従ってこのような
検出方法は、微生物と異物をより明確に判別したり、一
種類の励起光の使用だけでは両者の判別が難しいなどの
場合に有効に用いることができる。In these detection methods A' and A', a value selected from the group consisting of an intensity value, an intensity difference, an intensity ratio, and an intensity ratio difference in the detection method A is compared with a reference value using each excitation light. I will be doing about it. Therefore, such a detection method can be effectively used to more clearly distinguish between microorganisms and foreign substances, or when it is difficult to distinguish between the two using only one type of excitation light.
本発明検出法において、螢光の強度、強度差、強度比お
よび強度比差からなる群から選ばれる値の差異を利用す
る検出法の好ましい態様の一つは、二種の波長の励起光
として波長的４９０ｎｍのＢ励起光および波長的５４５
ｎｍのＧ励起光を用い、発生した螢光をそれぞれ波長５
００〜６００ｎｍ。In the detection method of the present invention, one of the preferred embodiments of the detection method utilizes a difference in values selected from the group consisting of fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference. B excitation light with a wavelength of 490 nm and a wavelength of 545 nm
Using G excitation light with a wavelength of 5 nm, the generated fluorescence is
00-600nm.
好ましくは５１０〜５５０ ｎ ｍ、および５５０〜７
００ ｎ ｍ、好ましくは５６０〜６００ｎｍ、を中心
とす不干渉フィルタを通過させてｈｔ１定することによ
り両替光の強度、強度差、強度比および強度比差からな
る群から選ばれる値をもとめるものである（検出法Ｂ）
（ここで強度、強度差、強度比および強度比差とは、前
記した通りの内容を表わすものである）。Preferably 510-550 nm, and 550-7
00 nm, preferably 560 to 600 nm, to obtain a value selected from the group consisting of intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of exchange light by passing through a non-interference filter centered on 560 to 600 nm and determining ht1. (Detection method B)
(Here, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference represent the contents as described above).
この検出法は第５〜８図に示すような、約４９０ｎｍの
Ｂ励起光および約５４５ｎｍのＧ励起光を照射して発生
する両者の螢光の強度の違いに基づくものであり、検出
法Ｂにおいて、螢光染色微生物と自家螢光異物との識別
は、得られる２つの螢光強度について、検出法Ａと同様
にして螢光の強度値、強度差、強度比および強度比差か
らなる群から選ばれる値をそれぞれの基準値と比較する
ことにより行なうことができるが、前者の強度値を用い
るのがより好ましい。This detection method is based on the difference in intensity of fluorescence generated by irradiating B excitation light of approximately 490 nm and G excitation light of approximately 545 nm, as shown in Figures 5 to 8. In this method, fluorescent-stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances can be distinguished by using the two obtained fluorescent intensities in the same way as in detection method A, using groups consisting of fluorescent intensity values, intensity differences, intensity ratios, and intensity ratio differences. This can be done by comparing the values selected from the above with respective reference values, but it is more preferable to use the former intensity values.
本発明検出法において、螢光のスペクトルならびに、強
度、強度差、強度比および強度比差からなる群から選ば
れる値の差異の両者を利用することにより、螢光染色微
生物と自家螢光異物とをより確実に識別することができ
る。このような検出法の好ましい態様の一つは、検出法
Ａにおいて、螢光測定の後に、検出法Ｂにおける螢光測
定を行なって螢光スペクトルならびに螢光の強度、強度
差、強度比および強度比差からなる群から選ばれる値を
もとめるものである（検出法Ｃ）。In the detection method of the present invention, by utilizing both the fluorescence spectrum and the difference in values selected from the group consisting of intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference, fluorescent-stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances can be distinguished. can be identified more reliably. One of the preferred embodiments of such a detection method is to perform fluorescence measurement in detection method B after fluorescence measurement in detection method A to obtain a fluorescence spectrum, fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity. This is to find a value selected from a group consisting of ratio differences (detection method C).
この検出法において、螢光染色微生物と自家螢光異物と
の識別は、螢光のスペクトルならびに強度、強度差、強
度比および強度比差からなる群から選ばれる値について
、それぞれの基準値を設定し、得られた上記の多値をこ
れらの基準値と比較することにより行なうことができる
。In this detection method, to distinguish between fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances, standard values are set for each value selected from the group consisting of the fluorescent spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference. This can be done by comparing the obtained multi-values with these reference values.
また、螢光のスペクトルおよび強度、強度差、強度比お
よび強度比差からなる群から選ばれる値の差異の両者を
利用する検出法としては、検出法Ｃにおいて、螢光測定
の前に検出法Ｂにおける螢光測定を行なう方法も可能で
ある。In addition, as a detection method that utilizes both the fluorescence spectrum and the difference in values selected from the group consisting of intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference, in detection method C, the detection method A method of performing fluorescence measurements in B is also possible.
く検出装置〉
本発明による微生物の検出装置は、螢光染色した微生物
試料中の該微生物を検知する顕微測光手段を備えた微生
物の検出装置において、微生物試料に一種の波長または
複数種の波長の励起光を照射する光源照射手段と、微生
物試料から発生する螢光を検出して光電変換する検出手
段と、該検出手段からの信号出力値を読みとって螢光の
スペクトル、強度、強度差、強度比および強度比差から
なる群から選ばれる値をもとめ、この値の差異により螢
光染色微生物を自家螢光異物と識別して測定する信号処
理手段と、を有すること、を特徴とするものであり、上
述したような検出法を基本原理とするものである。Microorganism Detection Device> The microorganism detection device according to the present invention is a microorganism detection device equipped with a microphotometric means for detecting microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample. A light source irradiation means for irradiating excitation light, a detection means for detecting fluorescence generated from a microbial sample and photoelectrically converting it, and a signal output value from the detection means is read to detect the spectrum, intensity, intensity difference, and intensity of the fluorescence. and a signal processing means for determining a value selected from the group consisting of a ratio and a difference in intensity ratio, and distinguishing and measuring a fluorescently stained microorganism from a self-fluorescent foreign substance based on the difference in the value. The basic principle is the detection method described above.
以下は、本発明による検出装置について、第１〜３図の
好ましい具体例に基づいて更に詳細に説明するものであ
る。In the following, the detection device according to the present invention will be explained in more detail based on preferred embodiments shown in FIGS. 1 to 3.
本発明による好ましい検出装置は、基本的には第１図に
示すように、螢光染色した微生物試料ａのＭＢ用の電動
ステージ６および一定波長の励起光を上記試料ａに照射
する光源手段（光源部２を含む）を備えた螢光顕微鏡部
１と、微生物試料ａからの螢光を検知して光電変換する
検出手段３と、検出手段３からの信号出力値を読みとっ
て演算処理する信号処理手段としてのマイクロコンピュ
ータ（ＰＣ）５と、を有してなるものである。A preferred detection device according to the present invention basically comprises, as shown in FIG. 1, a motorized stage 6 for MB of a fluorescently stained microbial sample a, and a light source means ( a fluorescence microscope section 1 equipped with a light source section 2), a detection means 3 for detecting fluorescence from a microorganism sample a and photoelectrically converting it, and a signal for reading and arithmetic processing the signal output value from the detection means 3. It has a microcomputer (PC) 5 as a processing means.
螢光顕微鏡部１、光源部２、および検出手段３によって
螢光顕微測光装置部が構成されることになるが、この螢
光顕微測光装置部の主要な具体的構成は第２図に示され
ている。The fluorescence microscope section 1, the light source section 2, and the detection means 3 constitute a fluorescence microscope photometer section, and the main specific configuration of this fluorescence microscope photometer section is shown in FIG. ing.
螢光顕微測光装置部は、水銀ランプあるいはキセノンラ
ンプなどの光源部２と、微生物試料ａを載置する電動の
ステージ６と、光源部２からステージ６への光路中に設
けられた励起光選択用のフィルター７、ダイクロイック
ミラー８および対物レンズ９と、光源部２からの励起光
の照射により試料ａから発生する螢光を２つの光路に分
割するダイクロイ・ツクミラー９と、この光路を通る分
岐した螢光の特定波長選択用の第１フイルター１０．１
０−および第２フイルター１１．１１′と、各光路にお
けるフィルター間に設けられた絞り用のスリット１２お
よび１３と、これらのスリットおよびフィルターを通過
した微生物試料ａからの螢光を検出して光電変換する光
電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタな
どの検出部４および４′、好ましくは光電子増倍管を有
してなるものである。The fluorescence microphotometer unit includes a light source unit 2 such as a mercury lamp or a xenon lamp, an electric stage 6 on which a microorganism sample a is placed, and an excitation light selection device provided in the optical path from the light source unit 2 to the stage 6. a filter 7, a dichroic mirror 8, an objective lens 9, a dichroic mirror 9 that splits the fluorescence generated from the sample a by irradiation with excitation light from the light source 2 into two optical paths, and a dichroic mirror 9 that splits the fluorescence generated from the sample a into two optical paths. First filter 10.1 for selecting a specific wavelength of fluorescence
0- and second filters 11 and 11', slits 12 and 13 for aperture provided between the filters in each optical path, and the fluorescence from the microorganism sample a that has passed through these slits and filters is detected and photoelectrically generated. Detectors 4 and 4' such as photomultiplier tubes, photodiodes, and phototransistors for conversion, preferably photomultiplier tubes, are provided.
励起光選択用フィルタ７７は、波長約４９０ｎｍのＢ励
起用または（および）約５４５ｎｍのＧ励起用のもので
あり、第１フイルター１０および１０′は５００〜６０
０ｎｍ、好ましくは５１０〜５５０ｎｍを中心とする波
長域を通過させる干渉フィルターでフィルター７がＢ励
起用の場合のものであり、第２フイルター１１および１
１′は、５５０〜７００ｎｍ、好ましくは５６０〜６５
０ｎｍを中心とする干渉フィルターでフィルター７がＧ
励起用の場合のものである。The excitation light selection filter 77 is for B excitation with a wavelength of approximately 490 nm or (and) for G excitation with a wavelength of approximately 545 nm, and the first filters 10 and 10'
This is an interference filter that passes a wavelength range centered on 0 nm, preferably 510 to 550 nm, and is used when filter 7 is for B excitation, and second filters 11 and 1
1' is 550-700 nm, preferably 560-65
Filter 7 is an interference filter centered at 0 nm.
This is for excitation.
また本発明においては前述した検出方法のように、励起
光としてＶあるいはＵの励起光を使用することができる
が、この場合励起光選択用フィルター７は波長約４０５
ｎｍのＶ励起用あるいは波長約３６５ｎｍのＵ励起用の
ものとすることができることはいうまでもない。この場
合には前記検出方法で記載したように、■励起光に対し
ては、第１フイルター１０および１０′は４８０〜５３
０ｎＩｍを、第２フイルター１１および１１′は５１０
〜５６０ｎｍを、Ｕ励起光に対しては、第１フイルター
１０および１０’は４８０〜５８０ｎ１１を、第２フイ
ルター１１および１１′は４２０〜５００ｎｍを、それ
ぞれ中心とする波長域を通過させる干渉フィルターを適
用するように構成することができる。Further, in the present invention, as in the detection method described above, it is possible to use V or U excitation light as the excitation light, but in this case, the excitation light selection filter 7 has a wavelength of approximately 405 nm.
It goes without saying that it can be used for V excitation at a wavelength of approximately 365 nm or for U excitation at a wavelength of approximately 365 nm. In this case, as described in the above detection method, the first filters 10 and 10' are 480 to 53
0nIm, and the second filters 11 and 11' are 510
-560 nm, for U excitation light, the first filters 10 and 10' are 480-580n11, and the second filters 11 and 11' are 420-500nm, respectively. can be configured to apply.
第２図〜４図においては、検出部を２つ設けているが、
試料ａから発生する螢光の光路を３つ以上に分割し、こ
れに対応させて検出部など必要な構成を３つ以上設ける
ようにすることもできる。In Figures 2 to 4, two detection units are provided, but
It is also possible to divide the optical path of the fluorescent light generated from the sample a into three or more parts, and to provide three or more necessary components such as the detection section correspondingly.
信号処理手段、たとえばマイクロコンピュータ５は、検
出手段３からの電気信号をＡ／Ｄ変換してその出力値を
読みとって本発明検出法において前記した螢光のスペク
トル、強度、強度差、強度比および強度比差からなる群
から選ばれる値をもとめ、これらの値を、あらかじめ記
憶させであるそれぞれの前記基準値と比較することによ
り、螢光染色微生物を自家螢光異物と識別して測定する
機能を６している。The signal processing means, for example, the microcomputer 5, converts the electric signal from the detection means 3 into A/D and reads the output value, and calculates the spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and A function for identifying and measuring fluorescently stained microorganisms from autofluorescent foreign substances by determining values selected from a group consisting of intensity ratio differences and comparing these values with the respective reference values stored in advance. 6.
上述のような構成を有する本発明検出装置は、以下のよ
うな特徴的な機能を何する。The detection device of the present invention having the above-described configuration has the following characteristic functions.
（１）螢光分析機能
■ 螢光スペクトル分析機能
第２〜４図に示すように、Ｂ励起光を用いた場合、この
Ｂ励起光（波長約４９０ ｎ ｍ）に対して異なる２波
長域フイルター、すなわち波長５００〜６００ｎｍを中
心とする干渉フィルターおよび５５０〜７００ｎｍを中
心とする干渉フィルターを通過した螢光を２つの検出部
４．４′で受光して電気信号に変換し、これにより螢光
染色微生物の螢光スペクトルと自家螢光異物の螢光スペ
クトル差異を効率的に自動分析することができる。(1) Fluorescence analysis function ■ Fluorescence spectrum analysis function As shown in Figures 2 to 4, when B excitation light is used, two different wavelength range filters are used for this B excitation light (wavelength approximately 490 nm). In other words, the fluorescent light that has passed through the interference filter centered on the wavelength of 500 to 600 nm and the interference filter centered on the wavelength of 550 to 700 nm is received by the two detection sections 4.4' and converted into an electrical signal, thereby detecting the fluorescent light. Differences in the fluorescence spectra of dyed microorganisms and self-fluorescent foreign substances can be efficiently and automatically analyzed.
■ 異なる励起光に対する螢光強度検出機能Ｂ励起光に
対しては波長５００〜６００ ｎ ｍ。■Fluorescence intensity detection function for different excitation lights For B excitation light, the wavelength is 500 to 600 nm.
を中心とする干渉フィルターを、Ｇ励起光に対しては５
５０〜７００ｎｍを中心とする干渉フィルターを用いた
螢光強度のデータが得られる。For G excitation light, use an interference filter centered at 5
Fluorescence intensity data using an interference filter centered at 50-700 nm is obtained.
■ 螢光スペクトル分析および螢光強度検出機能上記■
と■を組み合わせることにより、１波長域の励起光に対
する螢光スペクトルおよび２つの異なる波長域の励起光
に対する螢光強度が得られる。■ Fluorescence spectrum analysis and fluorescence intensity detection function above ■
By combining and ■, a fluorescence spectrum for excitation light in one wavelength range and a fluorescence intensity for excitation light in two different wavelength ranges can be obtained.
（２）螢光分析結果処理機能
■ 螢光スペクトル分析結果演算機能
２つ以上の検出部の受光信号を演算し、２者の出力比、
すなわち螢光強度比の差異または各螢光強度の差異から
基準値との比較により微生物を異物と識別して自動検出
する。(2) Fluorescence analysis result processing function ■ Fluorescence spectrum analysis result calculation function Calculates the light reception signals of two or more detection units, and calculates the output ratio of the two,
That is, microorganisms are automatically detected as foreign substances by comparing them with a reference value based on the difference in the fluorescence intensity ratio or the difference in each fluorescence intensity.
■ 螢光強度結果処理機能
複数種の励起光から得られる複数の螢光強度、たとえば
２種の励起光から得られる２つの螢光強度を前記基準値
と比較するか、この２つの螢光の強度を演算して強度比
をもとめ、この強度比を基準値と比較することにより微
生物を異物と識別して自動検出する。■ Fluorescence intensity result processing function Compares multiple fluorescence intensities obtained from multiple types of excitation light, for example, two fluorescence intensities obtained from two types of excitation light, with the reference value, or compares these two fluorescence intensities. By calculating the intensity and determining the intensity ratio, and comparing this intensity ratio with a reference value, microorganisms are identified as foreign substances and automatically detected.
上記（１）−■および（２）−■の組合せによる機能は
、本発明検出法Ａに対応するものである。The functions resulting from the combination of (1)-■ and (2)-■ above correspond to detection method A of the present invention.
この場合の微生物識別のための信号処理はたとえば第４
図に示された信号処理回路によって行なわれる。すなわ
ち、Ｂ励起光の照射によって微生物試料より発生した螢
光は、ダイクロイックミラー９で２つの光路に分割され
、一方の螢光は短波長側の第１フイルター１０を通過後
に検出部４で検知されて光電変換され、増巾器１４で増
幅され、螢光強度値Ａが得られる。もう一方の螢光は長
波長側の第２フイルター１１を通過後に検出部４′で検
知されて光電変換され、増巾器１４′で増巾され、螢光
強度値Ｂが得られる。得られた螢光強度値ＡおよびＢは
、演算処理されてその螢光強度比（Ｙ）がもとめられ、
更にこの強度比と基準値ｋが比較され、たとえばこのＹ
値が基準値によりも大きいか小さいかによって微生物が
異物と識別されて検出される。In this case, the signal processing for identifying microorganisms is, for example, the fourth
This is performed by the signal processing circuit shown in the figure. That is, the fluorescent light generated from the microorganism sample by irradiation with the B excitation light is split into two optical paths by the dichroic mirror 9, and one of the fluorescent lights is detected by the detection unit 4 after passing through the first filter 10 on the shorter wavelength side. The light is photoelectrically converted and amplified by an amplifier 14 to obtain a fluorescence intensity value A. The other fluorescent light passes through the second filter 11 on the longer wavelength side, is detected by the detecting section 4', is photoelectrically converted, and is amplified by the amplifier 14' to obtain the fluorescent light intensity value B. The obtained fluorescence intensity values A and B are subjected to arithmetic processing to determine the fluorescence intensity ratio (Y),
Furthermore, this intensity ratio and a reference value k are compared, and for example, this Y
Microorganisms are identified as foreign substances and detected depending on whether the value is larger or smaller than the standard value.
上記（１）−■および（２）−■の組合せによる機能は
、本発明検出法Ｂに対応するものである。The functions resulting from the combination of (1)-■ and (2)-■ above correspond to detection method B of the present invention.
この場合の微生物識別のための信号処理は、第１および
第２の２種の波長の励起光（Ｂ励起光およびＧ励起光）
の照射によって得られた２つの螢光強度について、信号
処理手段がそれぞれの値を２つの基準値と比較処理する
か、または演算によって強度比をもとめ、上記と同様に
して基準値と比較することにより行なわれる。In this case, signal processing for identifying microorganisms involves excitation light of two wavelengths, first and second (B excitation light and G excitation light).
For the two fluorescent intensities obtained by irradiation, the signal processing means compares each value with two reference values, or calculates the intensity ratio and compares it with the reference value in the same manner as above. This is done by
また、上記（１）−■および（２）−■、■の組合せに
よる機能は、本発明検出法Ｃに対応するものである。こ
の場合の微生物識別のための信号処理は、得られた螢光
スペクトル、螢光強度、強度差、この強度から演算によ
りもとめた強度比および強度比差からなる群から選ばれ
る値について、信号処理手段によりそれぞれの上記基準
値と比較することにより行われるので、微生物の識別は
より正確なものとなる。Further, the functions resulting from the combinations of (1)-■, (2)-■, and (2) above correspond to detection method C of the present invention. In this case, signal processing for identifying microorganisms involves processing a value selected from the group consisting of the obtained fluorescence spectrum, fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio calculated from this intensity, and intensity ratio difference. Since the identification of microorganisms is carried out by comparing the values with the above-mentioned reference values, the identification of microorganisms becomes more accurate.
本発明検出装置において、第３図に示すように、螢光顕
微測光装置部の電気信号的後段、すなわち検出部４．４
′の後段、に信号フィルタユニ・ソト１５を設けること
により検出手段からの電気信号に由来するノイズを低減
させることができる。フィルタユニット１５は、特定周
波数帯の電流のみを通過させるものであり、通信分野な
どで一般的に用いられている帯域制限用の回路を用いる
ことができる。また、波形の変化を観測するためのオシ
ロスコープ１６を設けてもよく、このオシロスコープ１
６によって信号フィルタユニ・ソト１５からの信号検出
強度を設定し、一定の強度以下の信号を遮断することに
よって、目的とする特定信号のみを後述するマイクロコ
ンピュータ５に読みとらせるようにすることが望ましい
。更に、本発明検出装置において、ｍ３図に示すように
、マイクロコンピュータ５の自動螢光検査プログラムに
より、微生物試料の全面を自動的に走査できる機能をも
たせるためのドライバユニット１７およびＸ−Ｙステー
ジスキャナ１８を設けることができる。In the detection device of the present invention, as shown in FIG.
By providing the signal filter UniSoto 15 at the subsequent stage of ', it is possible to reduce noise originating from the electrical signal from the detection means. The filter unit 15 allows only current in a specific frequency band to pass, and may be a band-limiting circuit commonly used in the communication field. Further, an oscilloscope 16 may be provided for observing changes in the waveform, and this oscilloscope 1
By setting the signal detection strength from the signal filter Uni-Soto 15 using 6 and blocking signals below a certain strength, it is possible to allow the microcomputer 5, which will be described later, to read only the desired specific signal. desirable. Furthermore, in the detection apparatus of the present invention, as shown in Figure M3, a driver unit 17 and an X-Y stage scanner are provided to provide the function of automatically scanning the entire surface of a microbial sample using the automatic fluorescence inspection program of the microcomputer 5. 18 can be provided.
また、マイクロコンピュータ５の信号処理機能に、検査
データの表示機能および検査データファイル機能をもた
せることも可能である（以上、特願平１−１６５６３５
号明細書を参照されたい）。Furthermore, it is also possible to provide the signal processing function of the microcomputer 5 with an inspection data display function and an inspection data file function (as disclosed in Japanese Patent Application No. 1-165635).
(Please refer to the specification).
以上、本発明検出装置につき図面に基づいて具体的に説
明してきたが、本発明検出装置は、励起光の種類および
その組合せ、干渉フィルターの波長およびその組合せ、
基準値との比較における螢光スペクトル、強度、強度差
、強度比および強度比差からなる群から選ばれる値の組
合せなど種々の条件について、前記したように前述の本
発明検出方法に対応する所望の構成をとるようにするこ
とができるものである。As above, the detection device of the present invention has been specifically explained based on the drawings.
Regarding various conditions such as combinations of values selected from the group consisting of fluorescence spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference in comparison with reference values, as described above, the desired conditions corresponding to the detection method of the present invention are determined. This configuration can be configured as follows.
〈実施例〉
以下は、本発明の実施例を示すものであるが、本発明は
これによって限定されるものではない。<Example> The following is an example of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
（１）実施例１ 市販飲料（キリンビール社製品）中に酵母（Ｓ。(1) Example 1 Yeast (S) is present in commercially available beverages (Kirin Brewery products).
ｕｖａｒｕｉ）を混合し、この飲料中に含まれる自家螢
光物を酵母と共にポアサイズ０．４μのニュクレボアフ
ィルター（野村マイクロサイエンス社製）に捕捉してフ
ルオレセインダイアセテート（ＦＤＡ）染色し、十分水
洗した。この試料について、螢光染色微生物と自家螢光
異物を識別する第４図の信号処理回路において、励起フ
ィルターを４９０ｎｍ （Ｂ励起）とし、吸収フィルタ
ーには短波長を５３０ｎｍ、長波長を５８０ｎｍとして
螢光スペクトルを測定した。飲料中に含まれる螢光染色
酵母と自家螢光異物の信号処理結果は表１の通りであっ
た。この結果より、第４図中のに値をたとえば０．７に
設定すれば、容易に微生物と異物との識別は可能である
。The autofluorescent substance contained in this drink was captured together with the yeast in a Nuclebore filter (manufactured by Nomura Microscience Co., Ltd.) with a pore size of 0.4μ, stained with fluorescein diacetate (FDA), and thoroughly washed with water. did. Regarding this sample, in the signal processing circuit shown in Fig. 4 that identifies fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances, the excitation filter was set at 490 nm (B excitation), and the absorption filter was set at a short wavelength of 530 nm and a long wavelength of 580 nm. The light spectrum was measured. Table 1 shows the signal processing results for fluorescent dyed yeast and autofluorescent foreign substances contained in the beverage. From this result, microorganisms and foreign substances can be easily distinguished by setting the value in FIG. 4 to, for example, 0.7.
（２）実施例２
実施例１と同サンプルにつき、励起フィルターを４９０
ｎｍ （Ｂ励起）および５４５ｎｍ（Ｇ励起）の２つの
波長で走査を行ない、それぞれ５３０ｎｍおよび６２０
ｎｍの吸収フィルターを用いて螢光強度を測定したとこ
ろ表２の結果が得られた。この結果よりＢ励起時螢光値
〉ａｌおよびＧ励起時螢光値くａ２となるようそれぞれ
の定数設定を行なえば微生物のみ識別ができる。表２か
ら定数設定例としてａ １−４００ （Ａ ｕ ） 。(2) Example 2 For the same sample as Example 1, the excitation filter was set to 490
Scanning was performed at two wavelengths: 530 nm and 620 nm (B excitation) and 545 nm (G excitation), respectively.
When the fluorescence intensity was measured using a nm absorption filter, the results shown in Table 2 were obtained. From this result, only microorganisms can be identified by setting the respective constants so that the fluorescence value at B excitation >al and the fluorescence value at G excitation >a2. From Table 2, a 1-400 (A u ) is an example of constant setting.
ａ ２−２００ （Ａ ｕ ）とすれば、１００％微生
物が識別できる。If a 2-200 (A u ), 100% microorganisms can be identified.
表２ 市販飲料異物のＢ励起とＧ励起に対する螢光強度
（Ａｕ）Ｂ励起 ５８９ ２８９５ １４２９ １
０９１ ９００ ３３９ １７９１Ｇ励起 ８８
２９３９ ５５１ ７６８ １１７６ ２００ １１４
１注）
表中サンプルは表１に同じ
（３）実施例３
市販生ビール（キリンビール社製）中に酵母（Ｓ、 ｕ
ｖａｒｕｉ ）を添加し、この生ビール中に含まれる自
家螢光異物を酵母と共にポアサイズ０．４μのニュクレ
ボアフィルターに捕捉し実施例１と同様にＦＤＡ染色し
た。この試料について、螢光染色微生物と自家螢光異物
を識別する第４図の信号処理回路において、励起フィル
ターを４９０ｎ■（Ｂ励起）とし、吸収フィルターには
短波長を５３０ｎ■、長波長を５８０ ｎｍとして螢光
強度比を測定した。その結果、表３に示したように７種
類の自家螢光異物の内、５種類の自家螢光異物は第４図
中のに値をたとえば０．７に測定することによって螢光
染色微生物と識別可能であった。さらに、本日励起法に
おいて螢光染色微生物と怠別できなかった２種類の自家
螢光異物（自家螢光異物１、自家螢光異物３）は、励起
フィルターを４０５ｎｍ（Ｖ励起）とし、吸収フィルタ
ーには短波長を５００ ｎｍ、長波長を５２０１■とじ
て螢光強度比を測定し、第４図中のに値をたとえば１．
０に設定することによって螢光染色酵母と識別できるこ
とがわかった。Table 2 Fluorescence intensity (Au) for B excitation and G excitation of commercially available beverage foreign matter B excitation 589 2895 1429 1
091 900 339 1791G excitation 88
2939 551 768 1176 200 114
1 Note) The samples in the table are the same as those in Table 1. (3) Example 3 Yeast (S, u
varui) was added, and the self-fluorescent foreign substances contained in this draft beer were captured together with the yeast in a Nuclebore filter with a pore size of 0.4μ, and FDA-stained in the same manner as in Example 1. Regarding this sample, in the signal processing circuit shown in Fig. 4 that identifies fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances, the excitation filter is set to 490n (B excitation), the absorption filter has a short wavelength of 530n, and a long wavelength of 580n. The fluorescence intensity ratio was measured in nm. As a result, as shown in Table 3, among the seven types of self-fluorescent foreign substances, five types of self-fluorescent foreign substances can be identified as fluorescent-stained microorganisms by measuring the value of 0.7 in Figure 4. It was identifiable. Furthermore, two types of self-fluorescent foreign matter (self-fluorescent foreign matter 1, self-fluorescent foreign matter 3) that could not be distinguished from fluorescently stained microorganisms using the excitation method today were examined using an excitation filter of 405 nm (V excitation) and an absorption filter. In this case, the fluorescence intensity ratio is measured by setting the short wavelength to 500 nm and the long wavelength to 5201 nm, and converting the value in Fig. 4 to, for example, 1.
It was found that by setting it to 0, it was possible to distinguish it from fluorescently dyed yeast.
表３
螢光染色酵母と生ビール中の自家螢光異物の螢光強度比
による識別法
螢光染色酵母
自家螢光異物
■
５
＊螢光染色酵母と自家螢光異物１．
３について実施した。Table 3 Identification method based on fluorescence intensity ratio of fluorescent dyed yeast and autologous fluorescent foreign substances in draft beer Fluorescent dyed yeast autofluorescent foreign substances ■ 5 *Fluorescent dyed yeast and autologous fluorescent foreign substances 1. 3 was carried out.
第１図は、本発明装置の基本構成の一例を示す説明図で
ある。
第２図は、第１図の装置における螢光顕微測光装置部分
の基本的構成の一例を示す説明図である。
第３図は、本発明装置の一例の全体を示す説明図である
。
第４図は、微生物識別のための信号回路を示す説明図で
ある。
第５図は、螢光染色したビール酵母の螢光スペクトルを
示すものである。
第６図は、紅茶中の自家螢光異物の螢光スペクトルを示
すものである。
第７図は、螢光染色したビール酵母と市販飲料（紅茶、
ウーロン茶、麦茶）中の自家螢光異物のＢ励起光による
螢光スペクトルの差を示すものである。
第８図は、螢光染色したビール酵母と市販飲料（紅茶、
ウーロン茶、麦茶）中の自家螢光異物のＧ励起光による
螢光スペクトルの差を示すものである。FIG. 1 is an explanatory diagram showing an example of the basic configuration of the device of the present invention. FIG. 2 is an explanatory diagram showing an example of the basic configuration of the fluorescence microphotometer portion of the apparatus shown in FIG. 1. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the entire example of the apparatus of the present invention. FIG. 4 is an explanatory diagram showing a signal circuit for identifying microorganisms. FIG. 5 shows the fluorescence spectrum of fluorescently dyed brewer's yeast. FIG. 6 shows the fluorescence spectrum of autofluorescent foreign substances in black tea. Figure 7 shows fluorescently dyed brewer's yeast and commercially available beverages (black tea, black tea,
This figure shows the difference in the fluorescence spectra of autofluorescent foreign substances in oolong tea and barley tea due to B excitation light. Figure 8 shows fluorescently dyed brewer's yeast and commercially available beverages (black tea, black tea,
This figure shows the difference in the fluorescence spectra of autofluorescent foreign substances in oolong tea and barley tea due to G excitation light.
Claims (1)
より検知する微生物の検出法において、微生物試料に一
種の波長または複数種の波長の励起光を照射して発生し
た螢光を測定し、得られる螢光のスペクトル、強度、強
度差、強度比および強度比差からなる群から選ばれる値
の差異を利用することにより螢光染色微生物と自家螢光
異物を識別することを特徴とする、微生物の検出法。 ２、励起光として波長約４９０ｎｍのＢ励起光を用い、
発生した螢光を波長５００〜６００ｎｍおよびそれより
長くて５５０〜７００ｎｍを中心とする２種類の干渉フ
ィルターを別々に通過させてそれぞれ測定することによ
り両螢光の強度、強度差、強度比および強度比差からな
る群から選ばれる値をもとめ、この螢光スペクトルの差
異を利用する、請求項１記載の検出法。 ３、二種の波長の励起光として波長約４９０ｎｍのＢ励
起光および波長約５４５ｎｍのＧ励起光を用い、発生し
た螢光をそれぞれ波長５００〜６００ｎｍおよびそれよ
り長くて５５０〜７００ｎｍを中心とする干渉フィルタ
を通過させて測定することにより両螢光の強度、強度差
、強度比および強度比差からなる群から選ばれる値をも
とめる、請求項１記載の検出法。 ４、二種の波長の励起光として波長約４９０ｎｍのＢ励
起光および波長約４０５ｎｍのＶ励起光を用い、発生し
た螢光をＢ励起では波長５００〜６００ｎｍおよびそれ
より長くて５５０〜７００ｎｍを中心とする二種類の干
渉フィルターを別々に通過させてそれぞれ測定すること
により両螢光の強度、強度差、強度比および強度比差か
らなる群から選ばれる値をもとめ、この螢光スペクトル
の差異を利用し、Ｖ励起では波長４８０〜５３０ｎｍお
よびそれより長くて５１０〜５６０ｎｍを中心とする二
種類の干渉フィルターを別々に通過させてそれぞれ測定
することにより両螢光の強度、強度差、強度比および強
度比差からなる群から選ばれる値をもとめ、この螢光ス
ペクトルの差異を利用する、請求項１記載の検出法。 ５、請求項２記載の検出法において、螢光測定の後また
は前に、請求項３に記載の検出法における螢光測定を行
なって螢光スペクトルならびに螢光の強度、強度差、強
度比および強度比差からなる群から選ばれる値をもとめ
、これらの差異を利用することにより螢光染色微生物と
自家螢光異物を識別することを特徴とする、微生物の検
出法。 ６、微生物試料が、メンブランフィルターに被検査物中
の微生物を捕捉して該微生物を螢光染色したものである
、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出法。 ７、螢光染色した微生物試料中の該微生物を検知する顕
微測光手段を備えた微生物の検出装置において、微生物
試料に一種の波長または複数種の波長の励起光を照射す
る光源照射手段と、微生物試料から発生する螢光を検出
して光電変換する検出手段と、該検出手段からの信号出
力値を読みとって螢光のスペクトル、強度、強度差、強
度比および強度比差からなる群から選ばれる値をもとめ
、この値の差異により螢光染色微生物を自家螢光異物と
識別して測定する信号処理手段と、を有することを特徴
とする、微生物の検出装置。 ８、検出手段における光電変換の手段が光電子増倍管で
あり、該検出手段からの電気信号についてノズルに由来
する周波数の帯域制限を行なう手段を有する、請求項７
記載の検出装置。 ９、微生物試料から発生する螢光を相互に異なる波長域
について通過させる複数の光路を設けると共に該光路に
各波長域の螢光を検出する検出手段を有する、請求項７
または８記載の検出装置。 １０、微生物試料が、メンブランフィルターに被検査物
中の微生物を捕捉して該微生物を螢光染色したものであ
る、請求項７〜９のいずれか一項に記載の検出装置。[Claims] 1. In a method for detecting microorganisms in which microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample are detected by microphotometry, the microorganisms generated by irradiating the microorganism sample with excitation light of one wavelength or multiple wavelengths. Distinguish between fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances by measuring fluorescence and using differences in values selected from the group consisting of spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of the obtained fluorescence. A method for detecting microorganisms, characterized by: 2. Using B excitation light with a wavelength of about 490 nm as excitation light,
The generated fluorescent light is passed through two types of interference filters with wavelengths of 500 to 600 nm and longer wavelengths of 550 to 700 nm, respectively, and measured, thereby determining the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity of both fluorescent lights. 2. The detection method according to claim 1, wherein a value selected from the group consisting of ratio differences is obtained, and this difference in fluorescence spectra is utilized. 3. Using B excitation light with a wavelength of about 490 nm and G excitation light with a wavelength of about 545 nm as excitation lights of two types of wavelengths, the generated fluorescence is centered on wavelengths of 500 to 600 nm and longer wavelengths of 550 to 700 nm, respectively. 2. The detection method according to claim 1, wherein a value selected from the group consisting of intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of the two fluorescent lights is determined by passing through an interference filter and measuring. 4. B excitation light with a wavelength of approximately 490 nm and V excitation light with a wavelength of approximately 405 nm are used as excitation lights of two types of wavelengths, and the generated fluorescence is centered at a wavelength of 500 to 600 nm for B excitation and a longer wavelength of 550 to 700 nm. By passing the two types of interference filters separately and measuring each, a value selected from the group consisting of the intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference of both fluorescence is obtained, and the difference in the fluorescence spectrum is calculated. For V excitation, the intensity, intensity difference, intensity ratio, and 2. The detection method according to claim 1, wherein a value selected from the group consisting of intensity ratio differences is determined, and this difference in fluorescence spectra is utilized. 5. In the detection method according to claim 2, after or before the fluorescence measurement, the fluorescence measurement in the detection method according to claim 3 is performed to determine the fluorescence spectrum, fluorescence intensity, intensity difference, intensity ratio, and A method for detecting microorganisms, characterized in that a value selected from a group consisting of intensity ratio differences is obtained, and fluorescently stained microorganisms and self-fluorescent foreign substances are distinguished by utilizing these differences. 6. The detection method according to any one of claims 1 to 5, wherein the microorganism sample is obtained by capturing microorganisms in a test object on a membrane filter and staining the microorganisms with fluorescent light. 7. In a microorganism detection device equipped with a microphotometric means for detecting microorganisms in a fluorescently stained microorganism sample, a light source irradiation means for irradiating the microorganism sample with excitation light of one wavelength or a plurality of wavelengths; A detector selected from the group consisting of a detection means for detecting and photoelectrically converting fluorescence generated from a sample, and a fluorescence spectrum, intensity, intensity difference, intensity ratio, and intensity ratio difference by reading the signal output value from the detection means. 1. A microorganism detection device, comprising: a signal processing means that determines the value and uses the difference between the values to identify and measure fluorescently stained microorganisms from self-fluorescent foreign substances. 8. The photoelectric conversion means in the detection means is a photomultiplier tube, and the detection means includes means for band-limiting the frequency originating from the nozzle with respect to the electrical signal from the detection means.
Detection device as described. 9. Claim 7, wherein a plurality of optical paths are provided for passing the fluorescent light generated from the microbial sample in mutually different wavelength ranges, and the optical path has a detection means for detecting the fluorescent light in each wavelength range.
Or the detection device according to 8. 10. The detection device according to any one of claims 7 to 9, wherein the microorganism sample is obtained by capturing microorganisms in a test object on a membrane filter and staining the microorganisms with fluorescent light.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29299889A JPH03152444A (en) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | Method and apparatus for detecting germ |
| EP19900112197 EP0405480A3 (en) | 1989-06-28 | 1990-06-27 | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
| US08/047,606 US5480804A (en) | 1989-06-28 | 1993-04-13 | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29299889A JPH03152444A (en) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | Method and apparatus for detecting germ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03152444A true JPH03152444A (en) | 1991-06-28 |
Family
ID=17789154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29299889A Pending JPH03152444A (en) | 1989-06-28 | 1989-11-10 | Method and apparatus for detecting germ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03152444A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008151784A (en) * | 2006-12-18 | 2008-07-03 | Palo Alto Research Center Inc | System and method for removing auto-fluorescence through use of multiple detection channels |
| JP2011505004A (en) * | 2007-11-30 | 2011-02-17 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | Method and system for removing autofluorescence from images |
-
1989
- 1989-11-10 JP JP29299889A patent/JPH03152444A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008151784A (en) * | 2006-12-18 | 2008-07-03 | Palo Alto Research Center Inc | System and method for removing auto-fluorescence through use of multiple detection channels |
| JP2011505004A (en) * | 2007-11-30 | 2011-02-17 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | Method and system for removing autofluorescence from images |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Müller et al. | [4] Fluorescence correlation spectroscopy | |
| JP3213334B2 (en) | Urine cell analyzer | |
| JP3098273B2 (en) | Urine cell analyzer | |
| EP0713087A1 (en) | Apparatus and process for rapid and ultrasensitive detection and counting of microorganisms by fluorescence | |
| US20160018301A1 (en) | Automated Staining and Decolorization of Biological Material | |
| JP6116502B2 (en) | Sample analyzer and sample analysis method | |
| JP2011513752A (en) | Method using optofluidic microscope apparatus | |
| WO2014133160A1 (en) | Urine sample analysis device and urine sample analysis method | |
| JP2006194711A (en) | Performance evaluation method and performance evaluation device of fluorescence-emission pigment | |
| JP4779518B2 (en) | Fluorescence reader and microorganism counting device | |
| JP3734080B2 (en) | Method and apparatus for immediate discrimination of fungi | |
| JP4967280B2 (en) | Microbe counting device | |
| EP0405480A2 (en) | Method of and apparatus for detecting microorganisms | |
| JP4487985B2 (en) | Microorganism weighing device | |
| JPH08334466A (en) | Fluorophotometry and device | |
| JPH03152444A (en) | Method and apparatus for detecting germ | |
| JP2735626B2 (en) | Microbial rapid measurement device | |
| JP2007101314A (en) | Device and method for analyzing particles | |
| JP3919267B2 (en) | Method for measuring surface condition of steel | |
| JP2006333812A (en) | Method for metering microorganism and apparatus for metering microorganism | |
| JP2003169695A (en) | Method for measuring microorganism and instrument for the same | |
| JPH11183381A (en) | Fluorescence microscope evaluating method and device | |
| JP3385078B2 (en) | How to detect microorganisms | |
| JP2007097583A (en) | Microorganisms-counting apparatus | |
| KR20230172515A (en) | Method and system for determining magnetic bead concentration in suspension |