JPH11183381A - Fluorescence microscope evaluating method and device - Google Patents
Fluorescence microscope evaluating method and deviceInfo
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- JPH11183381A JPH11183381A JP35313697A JP35313697A JPH11183381A JP H11183381 A JPH11183381 A JP H11183381A JP 35313697 A JP35313697 A JP 35313697A JP 35313697 A JP35313697 A JP 35313697A JP H11183381 A JPH11183381 A JP H11183381A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光顕微鏡の蛍光
検出性能を評価する方法および装置に関するものであ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and an apparatus for evaluating fluorescence detection performance of a fluorescence microscope.
【０００２】[0002]
【従来の技術】蛍光顕微鏡は、被測定対象物に励起光を
照射し、その被測定対象物に含まれる蛍光物質から発生
する蛍光を検出するものであり、種々の分野において用
いられている。また、一般に蛍光の強度は微弱であるこ
とから、蛍光顕微鏡は高感度であることが望まれる。し
たがって、蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価することは
重要である。2. Description of the Related Art Fluorescent microscopes irradiate excitation light to an object to be measured and detect fluorescence generated from a fluorescent substance contained in the object to be measured, and are used in various fields. Further, since the intensity of fluorescence is generally weak, it is desired that the fluorescence microscope has high sensitivity. Therefore, it is important to evaluate the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope.
【０００３】蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価するに
は、既知量の蛍光物質が蛍光顕微鏡の観察視野内に存在
する状態で被測定対象物に励起光を照射し、これに伴い
発生する蛍光の強度を測定する必要がある。実際には、
単一分子と認められる蛍光物質が蛍光顕微鏡の観察視野
内に存在する状態で励起光を照射し、これに伴い発生す
る蛍光および背景光の強度を測定し、また、励起光を照
射しないで背景光のみの強度を測定し、そして、両者の
差分を求める必要がある。従来の蛍光顕微鏡の評価で
は、強力な励起光源と特殊な光学系とを使用した特殊な
顕微鏡が用いられている。[0003] In order to evaluate the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope, an object to be measured is irradiated with excitation light in a state where a known amount of a fluorescent substance is present in the observation field of view of the fluorescence microscope. It is necessary to measure the strength. actually,
Excitation light is irradiated while a fluorescent substance recognized as a single molecule is present in the observation field of view of the fluorescence microscope, and the intensity of the resulting fluorescence and background light is measured. It is necessary to measure the intensity of light only and then determine the difference between the two. In the evaluation of a conventional fluorescence microscope, a special microscope using a strong excitation light source and a special optical system is used.
【０００４】また、蛍光顕微鏡の蛍光検出性能の他の評
価方法として、蛍光ビーズに励起光を照射して発生する
蛍光の強度を測定して蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価
する方法や、蛍光溶液に励起光を照射して発生する蛍光
の強度を測定して蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価する
方法が知られている。Other methods for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope include a method of evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope by measuring the intensity of fluorescence generated by irradiating excitation light onto fluorescent beads, and a method of evaluating a fluorescence solution. There is known a method of measuring the intensity of fluorescence generated by irradiating a fluorescent light with excitation light to evaluate the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope.
【０００５】また、アクチンに蛍光分子を結合させたも
のに励起光を照射して発生する蛍光の強度を測定して蛍
光顕微鏡の蛍光検出性能を評価する方法が知られてい
る。この方法では、アクチン繊維の単位長さ当たりに結
合している蛍光分子の量を徐々に減じて蛍光を検出し、
蛍光顕微鏡で蛍光検出可能な蛍光試薬量を求め、これに
より蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価するものである。There is also known a method for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope by measuring the intensity of fluorescence generated by irradiating actin with a fluorescent molecule bound to a fluorescent molecule and exciting light. In this method, the amount of fluorescent molecules bound per unit length of actin fiber is gradually reduced to detect fluorescence,
The amount of a fluorescent reagent that can detect fluorescence with a fluorescence microscope is determined, and the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope is evaluated based on the amount.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来例のうち、単一分子と認められる蛍光物質を用いる方
法は、蛍光検出性能が高くない蛍光顕微鏡では単一蛍光
分子から発生する蛍光を検出することができないことか
ら、その蛍光顕微鏡により単一蛍光分子が観察され得る
か否かの評価しかできず、蛍光検出性能を定量的に評価
することができない。However, among the above-mentioned conventional examples, the method using a fluorescent substance recognized as a single molecule detects fluorescence generated from a single fluorescent molecule in a fluorescence microscope which does not have high fluorescence detection performance. Therefore, it is only possible to evaluate whether or not a single fluorescent molecule can be observed with the fluorescence microscope, and the fluorescence detection performance cannot be quantitatively evaluated.
【０００７】蛍光ビーズを用いる方法は、蛍光顕微鏡の
蛍光検出性能を相対的に評価することができるものの、
１つの蛍光ビーズから発生する蛍光が幾つの蛍光分子に
由来するものであるかを判定することができないので、
絶対的な評価が不可能であるという問題点がある。In the method using fluorescent beads, the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope can be relatively evaluated.
Since it is not possible to determine how many fluorescent molecules originate in the fluorescence emitted from one fluorescent bead,
There is a problem that absolute evaluation is impossible.
【０００８】蛍光溶液を用いる方法は、蛍光分子を溶液
中に稀釈して所望の濃度の蛍光溶液を作成することが必
要であるが、希薄な蛍光溶液を定量性よく作成すること
が困難であり、また、顕微鏡下の観察領域内に蛍光分子
が幾つ含まれているかを決定することができず、蛍光顕
微鏡の蛍光検出性能の評価の精度が低いという問題点を
有する。In the method using a fluorescent solution, it is necessary to dilute the fluorescent molecules in the solution to prepare a fluorescent solution having a desired concentration. However, it is difficult to prepare a dilute fluorescent solution with high quantitativeness. In addition, it is not possible to determine how many fluorescent molecules are contained in the observation area under the microscope, and there is a problem that the accuracy of the fluorescence detection performance evaluation of the fluorescence microscope is low.
【０００９】さらに、蛍光性アクチン繊維を用いる方法
は、単位長さ当たりの蛍光分子数が互いに異なるアクチ
ン繊維を用意する必要があることから、評価が容易では
ないという問題点を有する。Furthermore, the method using fluorescent actin fibers has a problem that evaluation is not easy because it is necessary to prepare actin fibers having different numbers of fluorescent molecules per unit length.
【００１０】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、容易かつ高精度に蛍光顕微鏡の蛍光検
出性能を評価することができる蛍光顕微鏡評価方法およ
び装置を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a fluorescence microscope evaluation method and apparatus capable of easily and accurately evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope. And
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光顕微鏡
評価方法は、蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価する蛍光
顕微鏡評価方法であって、(1) 単位長さ当たりに存在す
る蛍光分子の数が一定であって蛍光顕微鏡の観察視野内
に置かれた蛍光性繊維から発生した蛍光の強度を蛍光顕
微鏡の光学系を介して検出し、(2) 蛍光性繊維の像を蛍
光顕微鏡の光学系を介して撮像し、その像に基づいて蛍
光性繊維の長さを求め、(3) 蛍光の強度および蛍光性繊
維の長さに基づいて蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価す
る、ことを特徴とする。Means for Solving the Problems The fluorescence microscope evaluation method according to the present invention is a fluorescence microscope evaluation method for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope, comprising: (1) the number of fluorescent molecules existing per unit length; The intensity of the fluorescent light generated from the fluorescent fibers placed within the observation field of the fluorescent microscope is detected through the optical system of the fluorescent microscope, and (2) the image of the fluorescent fibers is detected by the optical system of the fluorescent microscope. (3) evaluate the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope based on the intensity of the fluorescence and the length of the fluorescent fiber, and determine the length of the fluorescent fiber based on the image. I do.
【００１２】この蛍光顕微鏡評価方法によれば、蛍光性
繊維が蛍光顕微鏡の観察視野内に置かれ、この蛍光性繊
維から発生する蛍光の強度が蛍光顕微鏡の光学系を介し
て検出される。また、この蛍光性繊維の像に基づいて蛍
光性繊維の長さが求められる。そして、蛍光性繊維の単
位長さ当たりに存在する蛍光分子の数が一定であるの
で、蛍光の強度および蛍光性繊維の長さに基づいて蛍光
顕微鏡の蛍光検出性能が評価される。According to the fluorescence microscope evaluation method, the fluorescent fiber is placed in the observation field of the fluorescent microscope, and the intensity of the fluorescence generated from the fluorescent fiber is detected via the optical system of the fluorescent microscope. The length of the fluorescent fiber is determined based on the image of the fluorescent fiber. Since the number of fluorescent molecules existing per unit length of the fluorescent fiber is constant, the fluorescence detection performance of the fluorescent microscope is evaluated based on the intensity of the fluorescent light and the length of the fluorescent fiber.
【００１３】本発明に係る蛍光顕微鏡評価装置は、蛍光
顕微鏡の蛍光検出性能を評価する蛍光顕微鏡評価装置で
あって、(1) 単位長さ当たりに存在する蛍光分子の数が
一定であって蛍光顕微鏡の観察視野内に置かれた蛍光性
繊維から発生した蛍光の強度を蛍光顕微鏡の光学系を介
して検出する光検出器と、(2) 蛍光性繊維の像を蛍光顕
微鏡の光学系を介して撮像するカメラと、(3) カメラに
より撮像された蛍光性繊維の像に基づいて蛍光性繊維の
長さを求める画像解析部と、(4) 蛍光の強度および蛍光
性繊維の長さに基づいて蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評
価する演算部と、を備えることを特徴とする。The fluorescence microscope evaluation apparatus according to the present invention is a fluorescence microscope evaluation apparatus for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope. (1) The number of fluorescent molecules per unit length is constant and the fluorescence A photodetector that detects the intensity of the fluorescent light generated from the fluorescent fibers placed in the observation field of the microscope through the optical system of the fluorescent microscope, and (2) an image of the fluorescent fibers through the optical system of the fluorescent microscope. (3) an image analysis unit that calculates the length of the fluorescent fiber based on the image of the fluorescent fiber captured by the camera, and (4) a camera based on the intensity of the fluorescent light and the length of the fluorescent fiber. And a calculation unit for evaluating the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope.
【００１４】この蛍光顕微鏡評価装置によれば、蛍光性
繊維が蛍光顕微鏡の観察視野内に置かれ、これに励起光
が照射されて発生する蛍光の強度が蛍光顕微鏡の光学系
を介して光検出器により検出される。また、この蛍光性
繊維の像が蛍光顕微鏡の光学系を介してカメラにより撮
像され、その像に基づいて蛍光性繊維の長さが画像解析
部により求められる。そして、蛍光性繊維の単位長さ当
たりに存在する蛍光分子の数が一定であるので、蛍光の
強度および蛍光性繊維の長さに基づいて蛍光顕微鏡の蛍
光検出性能が演算部により評価される。According to the fluorescence microscope evaluation apparatus, the fluorescent fiber is placed in the observation field of the fluorescence microscope, and the intensity of the fluorescence generated by irradiating the fiber with the excitation light is detected through the optical system of the fluorescence microscope. Detected by the detector. Further, an image of the fluorescent fiber is captured by a camera via an optical system of a fluorescent microscope, and the length of the fluorescent fiber is determined by the image analysis unit based on the image. Since the number of fluorescent molecules existing per unit length of the fluorescent fiber is constant, the calculation unit evaluates the fluorescence detection performance of the fluorescent microscope based on the intensity of the fluorescent light and the length of the fluorescent fiber.
【００１５】また、本発明に係る蛍光顕微鏡評価装置
は、光検出器に到る検出光学系とカメラに到る撮像光学
系との分岐位置に設けられ、検出光学系および撮像光学
系の何れか一方に蛍光の光路を切り替える光路切替手段
を更に備えることを特徴とする。この場合には、蛍光強
度検出および蛍光性繊維撮像は順次に行われる。Further, the fluorescence microscope evaluation apparatus according to the present invention is provided at a branch position between a detection optical system reaching a photodetector and an imaging optical system reaching a camera. On the other hand, an optical path switching means for switching an optical path of fluorescence is further provided. In this case, the fluorescence intensity detection and the fluorescent fiber imaging are performed sequentially.
【００１６】また、本発明に係る蛍光顕微鏡評価装置
は、光検出器に到る検出光学系とカメラに到る撮像光学
系との分岐位置に設けられ、蛍光を分岐して検出光学系
および撮像光学系の双方に蛍光を導く光分岐手段を更に
備えることを特徴とする。この場合には、蛍光強度検出
および蛍光性繊維撮像は同時に行われる。Further, the fluorescence microscope evaluation apparatus according to the present invention is provided at a branch position between a detection optical system reaching a photodetector and an imaging optical system reaching a camera. It is characterized by further comprising a light branching means for guiding fluorescence to both optical systems. In this case, the fluorescence intensity detection and the fluorescent fiber imaging are performed simultaneously.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。Embodiments of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements will be denoted by the same reference symbols, without redundant description.
【００１８】先ず、本発明に係る蛍光顕微鏡評価装置の
１実施形態について説明する。図１は、本実施形態に係
る蛍光顕微鏡評価装置の構成図である。この図には、本
実施形態に係る蛍光顕微鏡評価装置３０とともに、この
蛍光顕微鏡評価装置３０の評価対象である蛍光顕微鏡１
０およびこの蛍光顕微鏡１０の被測定対象物２１等も示
されている。First, an embodiment of a fluorescence microscope evaluation apparatus according to the present invention will be described. FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescence microscope evaluation device according to the present embodiment. In this figure, together with the fluorescence microscope evaluation device 30 according to the present embodiment, the fluorescence microscope 1 to be evaluated by the fluorescence microscope evaluation device 30 is shown.
0 and the object 21 to be measured of the fluorescence microscope 10 are also shown.
【００１９】蛍光顕微鏡１０は、この蛍光顕微鏡評価装
置３０による評価対象であり、励起光源１１、励起光フ
ィルタ１２、ダイクロイックミラー１３、対物レンズ１
４、励起光除去フィルタ１５および第２対物レンズ１６
を備えて構成される。The fluorescence microscope 10 is an object to be evaluated by the fluorescence microscope evaluation apparatus 30, and includes an excitation light source 11, an excitation light filter 12, a dichroic mirror 13, and an objective lens 1.
4. Excitation light removal filter 15 and second objective lens 16
It is comprised including.
【００２０】励起光源１１は、被測定対象物２１に含ま
れる蛍光性繊維に結合している蛍光分子を励起し得る波
長を含む光を出力する。励起光フィルタ１２は、励起光
源１１から出力された光のうち励起波長のものを透過し
て、これを励起光とする。例えば、励起光源１１は超高
圧水銀灯であり、励起光フィルタ１２は透過帯域５１０
ｎｍ〜５６０ｎｍのバンドパスフィルタである。また、
例えば、励起光源１１は単色光を励起光として出力する
レーザ光源であり、この場合には、励起光フィルタ１２
は不要である。The excitation light source 11 outputs light having a wavelength that can excite fluorescent molecules bound to the fluorescent fibers contained in the object 21 to be measured. The excitation light filter 12 transmits light having an excitation wavelength of the light output from the excitation light source 11 and uses the light as excitation light. For example, the excitation light source 11 is an ultra-high pressure mercury lamp, and the excitation light filter 12 has a transmission band 510.
nm to 560 nm. Also,
For example, the excitation light source 11 is a laser light source that outputs monochromatic light as excitation light. In this case, the excitation light filter 12
Is unnecessary.
【００２１】励起光フィルタ１２から到達した励起光を
入力するダイクロイックミラー１３は、その励起光を反
射させて対物レンズ１４に入射させるとともに、対物レ
ンズ１４から到達した蛍光を透過させる。対物レンズ１
４は、ダイクロイックミラー１３により反射された励起
光を入力し、その励起光を観察視野内にある被測定対象
物２１に照射するとともに、その観察視野内にある被測
定対象物２１から発生した蛍光を入力し、その蛍光をダ
イクロイックミラー１３へ出力する。そして、ダイクロ
イックミラー１３は、その蛍光を透過する。A dichroic mirror 13 for inputting the excitation light arriving from the excitation light filter 12 reflects the excitation light to make it enter the objective lens 14 and transmits the fluorescence arriving from the objective lens 14. Objective lens 1
Reference numeral 4 denotes an input of the excitation light reflected by the dichroic mirror 13, irradiates the excitation light to the object to be measured 21 in the observation visual field, and emits the fluorescence generated from the object to be measured 21 in the observation visual field. And outputs the fluorescence to the dichroic mirror 13. Then, the dichroic mirror 13 transmits the fluorescence.
【００２２】励起光除去フィルタ１５は、ダイクロイッ
クミラー１３から到達した蛍光を透過させ、その蛍光と
共に到達した散乱光等を除去する。第２対物レンズ１６
は、励起光除去フィルタ１５から到達した蛍光を入力
し、その蛍光の像を結像する。The excitation light removing filter 15 transmits the fluorescent light that has arrived from the dichroic mirror 13 and removes scattered light and the like that have arrived together with the fluorescent light. Second objective lens 16
Inputs the fluorescence that has reached from the excitation light removal filter 15 and forms an image of the fluorescence.
【００２３】被測定対象物２１は、スライドガラス２２
とカバーガラス２３との間に挟まれた状態で、蛍光顕微
鏡１０のステージ（図示せず）の上に載置されている。
この被測定対象物２１は、単位長さ当たりに存在する蛍
光分子の数が一定である蛍光性繊維であり、例えば、ロ
ーダミン等の蛍光分子が結合したアクチン繊維や、チュ
ーブリンが重合した微小管が好適に用いられる。また、
上記アクチン繊維におけるローダミンに替えて BODIPY
、Cy3 、Cy5 、Eosin 、Fluorescein 、OregonGreen、
DiI 、Texas Red 等の蛍光分子を特定のアミノ酸に特異
的に接合させることのできる aziridine基、iodoacetam
ide 基、maleimide 基を結合させたものも好適に用いら
れる。The object 21 to be measured is a slide glass 22
It is placed on a stage (not shown) of the fluorescence microscope 10 in a state sandwiched between the cover glass 23 and the cover glass 23.
The measurement target 21 is a fluorescent fiber in which the number of fluorescent molecules present per unit length is constant, for example, an actin fiber to which a fluorescent molecule such as rhodamine is bound, or a microtubule in which tubulin is polymerized. Is preferably used. Also,
BODIPY instead of rhodamine in the above actin fiber
, Cy3, Cy5, Eosin, Fluorescein, OregonGreen,
Aziridine group, iodoacetam that can specifically bind fluorescent molecules such as DiI and Texas Red to specific amino acids
Those bonded with an ide group and a maleimide group are also preferably used.
【００２４】蛍光顕微鏡評価装置３０は、ピンホール３
１、ミラー３２、レンズ３３、光検出器３４、カウンタ
３５、レンズ３６、カメラ３７、画像記録部３８、画像
解析部３９および演算部４０を備えて構成される。The fluorescence microscope evaluation device 30 includes a pinhole 3
1, a mirror 32, a lens 33, a photodetector 34, a counter 35, a lens 36, a camera 37, an image recording unit 38, an image analyzing unit 39, and a calculating unit 40.
【００２５】ピンホール３１は、被測定対象物２１から
発生した蛍光が蛍光顕微鏡１０の対物レンズ１４および
第２対物レンズ１６に依り結像される位置に開口を有す
るものである。光路切替手段であるミラー３２は、可動
または着脱自在であって、ピンホール３１の開口を通過
した蛍光の光路上に配されているときには、蛍光を反射
させて、レンズ３６を含む撮像光学系へ蛍光を導き、ピ
ンホール３１の開口を通過した蛍光の光路上から待避し
ているときには、レンズ３３を含む検出光学系へ蛍光を
導く。The pinhole 31 has an opening at a position where the fluorescence generated from the measured object 21 is imaged by the objective lens 14 and the second objective lens 16 of the fluorescence microscope 10. The mirror 32 serving as an optical path switching means is movable or detachable, and when arranged on the optical path of the fluorescent light passing through the opening of the pinhole 31, reflects the fluorescent light to the imaging optical system including the lens 36. When the fluorescent light is guided and evacuated from the optical path of the fluorescent light passing through the opening of the pinhole 31, the fluorescent light is guided to the detection optical system including the lens 33.
【００２６】レンズ３３は、ピンホール３１の開口を通
過した蛍光を光検出器３４の受光面上に集光し、光検出
器３４は、その集光された蛍光を検出する。この光検出
器３４として、例えば、光子計数が可能な光電子増倍管
やアバランシェフォトダイオード等が好適に用いられ
る。カウンタ３５は、光検出器３４が蛍光光子を受光し
て出力したパルス信号を入力し、そのパルスを計数す
る。このカウンタ３４に依り一定時間計数されたパルス
数は、蛍光の強度を表すものである。The lens 33 condenses the fluorescence passing through the opening of the pinhole 31 on the light receiving surface of the photodetector 34, and the photodetector 34 detects the collected fluorescence. As the photodetector 34, for example, a photomultiplier capable of photon counting, an avalanche photodiode, or the like is suitably used. The counter 35 receives a pulse signal output from the photodetector 34 after receiving the fluorescent photon, and counts the pulses. The number of pulses counted by the counter 34 for a certain period of time indicates the intensity of the fluorescent light.
【００２７】一方、レンズ３６は、ピンホール３１の開
口の位置に一旦結像された蛍光の像をカメラ３７の撮像
面上に再結像し、カメラ３７は、その撮像面上に結像さ
れた蛍光の像を撮像する。このカメラ３７として、高感
度撮像が可能なＳＩＴ（Silicon Intensified Tube Cam
era ）、イメージインテンシファイア付ＣＣＤ（Charge
d Coupled Device）、冷却型ＣＣＤ等が好適に用いられ
る。On the other hand, the lens 36 re-images the fluorescent image once formed at the position of the opening of the pinhole 31 on the image pickup surface of the camera 37, and the camera 37 forms the image on the image pickup surface. An image of the fluorescent light is captured. As the camera 37, an SIT (Silicon Intensified Tube Cam) capable of high-sensitivity imaging is used.
era), CCD with image intensifier (Charge
d Coupled Device), a cooled CCD or the like is preferably used.
【００２８】画像記録部３８は、カメラ３７により撮像
された蛍光の像を入力して記録し、画像解析部３９は、
画像記録部３８に記録された蛍光の像を読み出し、その
蛍光の像を画像解析して、その像に含まれる蛍光性繊維
の長さを求める。このとき、その像に含まれる蛍光性繊
維が複数本であれば、その複数本の蛍光性繊維それぞれ
の長さの総和を求める。The image recording unit 38 inputs and records the fluorescence image picked up by the camera 37, and the image analysis unit 39
The fluorescent image recorded in the image recording unit 38 is read, and the fluorescent image is subjected to image analysis to determine the length of the fluorescent fiber contained in the image. At this time, if the image includes a plurality of fluorescent fibers, the total length of each of the plurality of fluorescent fibers is obtained.
【００２９】演算部４０は、カウンタ３５により得られ
た蛍光の強度と画像解析部３９により得られた蛍光性繊
維の長さとに基づいて、蛍光顕微鏡１０の蛍光検出性能
の評価を行う。また、演算部４０は、被測定対象物２１
として蛍光性繊維を含まない場合のカウンタ３５からの
出力信号すなわち背景光の強度にも基づいて蛍光顕微鏡
１０の蛍光検出性能の評価を行うことにより、更に高精
度な評価が可能である。The calculation unit 40 evaluates the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope 10 based on the intensity of the fluorescence obtained by the counter 35 and the length of the fluorescent fiber obtained by the image analysis unit 39. In addition, the calculation unit 40 is configured to execute
By evaluating the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope 10 based on the output signal from the counter 35 when no fluorescent fiber is included, that is, the intensity of the background light, more accurate evaluation is possible.
【００３０】次に、蛍光顕微鏡評価装置３０の作用を説
明するとともに、本発明に係る蛍光顕微鏡評価方法の１
実施形態について説明する。Next, the operation of the fluorescence microscope evaluation apparatus 30 will be described, and one of the fluorescence microscope evaluation methods according to the present invention will be described.
An embodiment will be described.
【００３１】評価対象である蛍光顕微鏡１０では、励起
光源１１から出力された光は、被測定対象物２１中に含
まれる蛍光性繊維を励起し得る波長成分が励起光フィル
タ１２を透過して励起光とされ、その励起光は、ダイク
ロイックミラー１３により反射されて対物レンズ１４に
入射する。そして、励起光は、対物レンズ１４から被測
定対象物２１に向けて出力されて、その対物レンズ１４
の観察視野内にある被測定対象物２１に照射される。被
測定対象物２１に含まれる蛍光性繊維に励起光が照射さ
れて発生した蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロイック
ミラー１３、励起光除去フィルタ１５および第２対物レ
ンズ１６からなる蛍光顕微鏡１０の光学系を経て、蛍光
顕微鏡評価装置３０のピンホール３１の開口の位置に結
像される。In the fluorescence microscope 10 to be evaluated, the light output from the excitation light source 11 is such that a wavelength component capable of exciting the fluorescent fiber contained in the object 21 to be measured passes through the excitation light filter 12 and is excited. The excitation light is reflected by the dichroic mirror 13 and enters the objective lens 14. Then, the excitation light is output from the objective lens 14 toward the object 21 to be measured, and the objective lens 14
Is irradiated on the object to be measured 21 in the observation field of view. The fluorescence generated by irradiating the excitation light onto the fluorescent fibers included in the object 21 is generated by the optical system of the fluorescence microscope 10 including the objective lens 14, the dichroic mirror 13, the excitation light removal filter 15, and the second objective lens 16. Is formed at the position of the opening of the pinhole 31 of the fluorescence microscope evaluation device 30.
【００３２】蛍光顕微鏡評価装置３０では、ピンホール
３１の開口を通過した蛍光の光路上にミラー３２が有る
ときには、その蛍光は、ミラー３２により反射され、レ
ンズ３６によりカメラ３７の撮像面上に再び結像され、
カメラ３７により撮像される。カメラ３７により撮像さ
れた蛍光の像は、画像記録部３８に送られて一旦記録さ
れる。画像記録部３８に記録された蛍光像は、画像解析
部３９により読み出されて画像解析され、蛍光像内にあ
る蛍光性繊維の長さが求められる。一方、ピンホール３
１の開口を通過した蛍光の光路上にミラー３２が無いと
きには、その蛍光は、レンズ３３により集光され光検出
器３４により検出される。光検出器３４が蛍光光子を検
出して出力したパルス信号は、カウンタ３５により一定
時間計数される。In the fluorescence microscope evaluation device 30, when the mirror 32 is on the optical path of the fluorescent light passing through the opening of the pinhole 31, the fluorescent light is reflected by the mirror 32, and is again reflected on the imaging surface of the camera 37 by the lens 36. Imaged,
The image is taken by the camera 37. The fluorescent image picked up by the camera 37 is sent to the image recording unit 38 and is once recorded. The fluorescent image recorded in the image recording unit 38 is read out by the image analyzing unit 39 and image-analyzed, and the length of the fluorescent fiber in the fluorescent image is obtained. On the other hand, pinhole 3
When the mirror 32 is not on the optical path of the fluorescent light passing through the opening 1, the fluorescent light is collected by the lens 33 and detected by the photodetector 34. The pulse signal output by the photodetector 34 detecting the fluorescent photon is counted by the counter 35 for a certain period of time.
【００３３】カウンタ３５による計数値すなわち蛍光強
度および画像解析部３９により求められた蛍光性繊維の
長さは、演算部４０に入力される。そして、演算部４０
では、蛍光性繊維の単位長さ当たりに存在する蛍光分子
の数が一定であるので、これらに基づいて蛍光性繊維の
単位長さ当たりの蛍光強度が求められる。また、その単
位長さ当たりに存在する蛍光分子数が他の方法で求めら
れていれば、単一の蛍光分子から発生し蛍光顕微鏡１０
に依り検出され得る蛍光の強度が求められる。すなわ
ち、蛍光顕微鏡１０の蛍光検出性能が評価される。The count value of the counter 35, that is, the fluorescence intensity and the length of the fluorescent fiber obtained by the image analysis unit 39 are input to the calculation unit 40. And the operation unit 40
Since the number of fluorescent molecules present per unit length of the fluorescent fiber is constant, the fluorescence intensity per unit length of the fluorescent fiber is determined based on these. If the number of fluorescent molecules existing per unit length is determined by another method, the fluorescent light is generated from a single fluorescent molecule.
, The intensity of the fluorescence that can be detected is determined. That is, the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope 10 is evaluated.
【００３４】なお、上記のようにして光検出器３４およ
びカウンタ３５に依り得られた蛍光強度は、真の蛍光に
加えてノイズである背景光をも含む強度である。この背
景光の強度は、蛍光性繊維を含まないものを被測定対象
物２１として用い、ミラー３２を光路上から待避させ
て、光検出器３４およびカウンタ３５に依り求められ
る。そして、演算部４０において、背景光成分が除去さ
れた真の蛍光の強度が求められ、蛍光顕微鏡１０に依り
検出し得る真の蛍光の強度が求められる。また、演算部
４０において、蛍光顕微鏡１０のＳ／Ｎ比が求められ
る。The fluorescence intensity obtained by the photodetector 34 and the counter 35 as described above is an intensity including background light which is noise in addition to true fluorescence. The intensity of the background light is obtained by the photodetector 34 and the counter 35 with the mirror 32 being evacuated from the optical path by using a material not containing the fluorescent fiber as the object 21 to be measured. Then, the arithmetic unit 40 obtains the intensity of the true fluorescence from which the background light component has been removed, and obtains the intensity of the true fluorescence that can be detected by the fluorescence microscope 10. Further, the S / N ratio of the fluorescence microscope 10 is obtained in the calculation unit 40.
【００３５】次に、１実施例について説明する、被測定
対象物２１に含まれる蛍光性繊維の作成方法は以下のと
おりである。蛍光分子とアクチン分子とを濃度比５対１
で重合溶液（０．１ＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭＯＰＳ、１
ｍＭのＭｇＣｌ2 、１．５ｍＭのＮａＮ3 、０．１ｍＭ
のＡＴＰ、ｐＨ７．０）中に入れ充分に攪拌し、この溶
液を遮光して氷温下に置き、数時間ごとに一度ゆっくり
と攪拌して１２時間かけて染色した。その後、反応を停
止させるため、蛍光分子の濃度の約１００倍の濃度のＤ
ＴＴを溶液に加え、６０分間放置後に、脱重合溶液（２
ｍＭのＴｒｉｓ、０．２ｍＭのＣａＣｌ2 、０．３ｍＭ
のＮａＮ3 、０．２ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ８．０）で透析
した。透析後、加速度３４６０００ｇで１時間に亘り遠
心分離し、上澄に残った染色アクチン分子のみを再び重
合させた。重合した染色アクチン分子を再び遠心分離で
回収して脱重合溶液で攪拌した。脱重合溶液に溶かした
状態で１０時間以上に亘り氷上に置き、その溶液を脱重
合溶液中で透析し、加速度３４６０００ｇで１時間に亘
り遠心分離した。その上澄を回収し、Sephadex Ｇ-２５
カラム（Pharmacia Biotech :ＰＤ−１０）でゲル濾過
を行った。ゲル濾過後の染色アクチン繊維を、被測定対
象物２１に含まれるべき蛍光性分子とした。ただし、ゲ
ル濾過後の分子には染色されたアクチン分子と染色され
ていないアクチン分子とが混在しているので、この比率
を吸光光度計により測定し、その測定値に基づいて蛍光
性繊維の単位長さ当たりに結合している蛍光分子数を決
定した。Next, a method of producing the fluorescent fiber contained in the object 21 to be measured, which will be described in one embodiment, is as follows. Fluorescent molecules and actin molecules in a concentration ratio of 5: 1
And the polymerization solution (0.1 M KCl, 2 mM MOPS, 1
mM MgCl 2 , 1.5 mM NaN 3 , 0.1 mM
ATP, pH 7.0), and the mixture was sufficiently stirred. The solution was placed under ice temperature while protecting from light, and the mixture was slowly stirred once every several hours and stained for 12 hours. Thereafter, in order to stop the reaction, the concentration of D is about 100 times the concentration of the fluorescent molecule.
TT was added to the solution, and after standing for 60 minutes, the depolymerization solution (2
mM Tris, 0.2 mM CaCl 2 , 0.3 mM
NaN 3 , 0.2 mM ATP, pH 8.0). After the dialysis, centrifugation was performed at an acceleration of 346000 g for 1 hour, and only the stained actin molecules remaining in the supernatant were polymerized again. The polymerized stained actin molecules were collected again by centrifugation and stirred with the depolymerization solution. The solution in the depolymerization solution was placed on ice for 10 hours or more, and the solution was dialyzed in the depolymerization solution and centrifuged at an acceleration of 346000 g for 1 hour. The supernatant was recovered and separated by Sephadex G-25.
Gel filtration was performed with a column (Pharmacia Biotech: PD-10). The stained actin fiber after gel filtration was used as a fluorescent molecule to be contained in the object 21 to be measured. However, since the stained actin molecules and unstained actin molecules are mixed in the molecules after gel filtration, this ratio is measured by an absorptiometer, and the unit of the fluorescent fiber is determined based on the measured value. The number of fluorescent molecules bound per length was determined.
【００３６】被測定対象物２１の作成方法は以下のとお
りである。サイズ３６×２４ｍｍのカバーガラス２２の
上に、予めワセリンが塗られた帯状の２枚の紙片（１．
５×２０×厚０．０３ｍｍ）を一定距離だけ互いに離し
て平行に置き、その上に、１８×１８ｍｍのカバーガラ
ス２３を載せた。そして、スライドガラス２１とカバー
ガラス２３との間の間隙に poly-L-lysine水溶液（１ｍ
ｇ／ｍｌ）を流して系を poly-L-lysineコートした。な
お、２枚の紙片に塗られたワセリンから水溶液中へ蛍光
物質が溶け出すことはない。その後、緩衝溶液Ａ（２５
ｍＭの imidazole／ＨＣｌ、２５ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、ｐＨ７．５）を系に流し込み、そこへ酵
素処理したミオシン分子を稀釈し、流し込み後１分間放
置した。１分間放置後、カバーガラス２３に付着しなか
ったミオシン分子を取り除くため緩衝溶液Ａを流した。
充分洗い流した後に重合溶液を流し溶液を置換した。低
濃度に稀釈した蛍光性繊維を重合溶液（ＡＴＰなし）に
溶かし、その溶液を系に導入した。１分間放置後、付着
しなかった蛍光性繊維を洗い流し、脱気溶液（ＡＴＰ無
しの重合溶液へ Glucose Oxidaseを０．１ｍｇ／ｍｌ、
Catalaseを０．０１８ｍｇ／ｍｌ、 Glucoseを３ｍｇ／
ｍｌそれぞれ加えたもの）を導入した。これを被測定対
象物２１とした。なお、ミオシン分子の濃度、蛍光性繊
維の濃度および放置時間等については、最終状態を蛍光
顕微鏡で観察し各実験により適量を調節した。The method of preparing the object 21 to be measured is as follows. On a cover glass 22 of 36 × 24 mm in size, two strip-shaped pieces of paper (1.
5 × 20 × 0.03 mm thick) were placed parallel to each other with a certain distance, and an 18 × 18 mm cover glass 23 was placed thereon. Then, a poly-L-lysine aqueous solution (1 m) is filled in a gap between the slide glass 21 and the cover glass 23.
g / ml) and the system was poly-L-lysine coated. The fluorescent substance does not dissolve into the aqueous solution from the vaseline applied to the two pieces of paper. Thereafter, buffer solution A (25
mM imidazole / HCl, 25 mM KCl, 4 mM
MgCl 2 , pH 7.5) was poured into the system, and the myosin molecule treated with the enzyme was diluted there. After standing for 1 minute, buffer solution A was flowed to remove myosin molecules that did not adhere to the cover glass 23.
After sufficient washing, the polymerization solution was poured to replace the solution. The fluorescent fiber diluted to a low concentration was dissolved in a polymerization solution (without ATP), and the solution was introduced into the system. After leaving for 1 minute, the fluorescent fibers that did not adhere were washed away, and a degassed solution (0.1 mg / ml of Glucose Oxidase to the polymerization solution without ATP,
Catalase 0.018mg / ml, Glucose 3mg / ml
ml each added). This was designated as the object 21 to be measured. Regarding the concentration of the myosin molecule, the concentration of the fluorescent fiber, the standing time, and the like, the final state was observed with a fluorescence microscope, and an appropriate amount was adjusted by each experiment.
【００３７】蛍光性繊維の単位長さ当たりに結合してい
る蛍光分子の数の見積方法は以下のとおりである。蛍光
分子が結合しているアクチン繊維すなわち蛍光性繊維
は、顕微鏡下で１本の紐として観察することができる
（T.Yanagida, et al., Nature,Vol.307, No.5946, pp.
58-60 (1984) を参照）。また、アクチン繊維の１μｍ
を構成するアクチン分子の数は一定であり、その値は３
６６であることが知られている（E.H.Egelman, Journal
of Muscle Research and Cell Motility, Vol.6,pp.12
9-151 (1985) を参照）。したがって、蛍光顕微鏡の観
察視野内にある蛍光性繊維の長さを測定することによ
り、その観察視野内にある蛍光分子の数を求めることが
できる。The method of estimating the number of fluorescent molecules bound per unit length of the fluorescent fiber is as follows. The actin fiber to which the fluorescent molecule is bound, that is, the fluorescent fiber, can be observed as a single string under a microscope (T. Yanagida, et al., Nature, Vol. 307, No. 5946, p.
58-60 (1984)). In addition, 1 μm of actin fiber
Is constant and its value is 3
It is known to be 66 (EHEgelman, Journal
of Muscle Research and Cell Motility, Vol. 6, pp. 12
9-151 (1985)). Therefore, by measuring the length of the fluorescent fiber in the observation field of view of the fluorescence microscope, the number of fluorescent molecules in the observation field can be obtained.
【００３８】また、 iodoacetamide基を有する蛍光分子
を用いて特定のアミノ酸のみに蛍光分子を結合すること
により、アクチン分子１個に対して１個の蛍光分子のみ
を結合させることができる（J.F.Tait, C.Frieden, Arc
hives of Biochemistry andBiophysics, Vol.216, No.
1, p.133-141 (1982) を参照）。アクチン繊維を用いた
試料を顕微鏡下で観察した場合、蛍光強度は、アクチン
繊維単位長さ当たりの蛍光色素分子数とアクチン繊維長
とに比例することが知られている（I.Sase, etal., Bio
physiccal Journal, Vol.69, pp.323-328 (1995) 、Y.H
arada, et al., Journal of Molecular Biology, Vol.2
16, pp.49-68 (1990)を参照）。Further, by using a fluorescent molecule having an iodoacetamide group to bind a fluorescent molecule only to a specific amino acid, only one fluorescent molecule can be bound to one actin molecule (JFTait, C .Frieden, Arc
hives of Biochemistry and Biophysics, Vol.216, No.
1, p.133-141 (1982)). When a sample using actin fiber is observed under a microscope, it is known that the fluorescence intensity is proportional to the number of fluorescent dye molecules per unit length of actin fiber and the actin fiber length (I. Sase, etal. , Bio
physiccal Journal, Vol. 69, pp. 323-328 (1995), YH
arada, et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 2
16, pp.49-68 (1990)).
【００３９】以上のようにして作成された被測定対象物
２１を蛍光顕微鏡１０のステージに置いた。ここで評価
対象である蛍光顕微鏡１０は、励起光源１１として超高
圧水銀灯を、励起光フィルタ１２として透過帯域５１０
ｎｍ〜５６０ｎｍのバンドパスフィルタを、それぞれ有
するものである。また、蛍光顕微鏡評価装置３０は、光
検出器３４として光電子増倍管を、カメラ３７としてＳ
ＩＴを、それぞれ有するものである。ピンホール３１
は、観察視野の中央領域に相当する位置に開口が配さ
れ、その開口の径が１．５ｍｍである。また、カメラ３
７に依り撮像される蛍光像において１本から数本の蛍光
性繊維が観察されるようにした。The object 21 to be measured prepared as described above was placed on the stage of the fluorescence microscope 10. Here, the fluorescence microscope 10 to be evaluated has an ultra-high pressure mercury lamp as the excitation light source 11 and a transmission band 510 as the excitation light filter 12.
nm to 560 nm. In addition, the fluorescence microscope evaluation device 30 uses a photomultiplier tube as the photodetector 34 and an S
IT. Pinhole 31
Has an opening arranged at a position corresponding to the central region of the observation visual field, and the diameter of the opening is 1.5 mm. In addition, camera 3
7, one to several fluorescent fibers were observed in the fluorescent image taken.
【００４０】このときの蛍光の像をカメラ３７に依り撮
像し、画像記録部３８に依り記録し、その蛍光像に基づ
いて蛍光性繊維の長さを画像解析部３９に依り求めた。
また、ミラー３２を蛍光光路上から取り去って、光検出
器３４およびカウンタ３５により光子計数法で蛍光（背
景光を含む）の強度を測定した。さらに、カメラ３７に
より蛍光性繊維が観測されない領域へ被測定対象物２１
をステージ上で移動し、そのときに光検出器３４および
カウンタ３５により測定された結果を背景光強度として
求めた。The image of the fluorescence at this time was taken by the camera 37, recorded by the image recording section 38, and the length of the fluorescent fiber was determined by the image analysis section 39 based on the fluorescence image.
Further, the mirror 32 was removed from the fluorescent light path, and the intensity of the fluorescent light (including the background light) was measured by the photodetector 34 and the counter 35 by the photon counting method. Further, the measurement object 21 is moved to an area where the fluorescent fiber is not observed by the camera 37.
Was moved on the stage, and the result measured by the photodetector 34 and the counter 35 at that time was obtained as the background light intensity.
【００４１】そして、演算部４０では、背景光を含む蛍
光の強度から背景光強度を減じることにより真の蛍光強
度を求め、この真の蛍光強度および蛍光性繊維の長さに
基づいて蛍光性繊維の単位長さ当たりの蛍光強度を求め
た。図２は、蛍光性繊維の長さと蛍光強度（蛍光光子
数）との関係を示すグラフである。このグラフには、２
６組の蛍光性繊維の長さおよび真の蛍光強度の測定デー
タとともに、一次回帰直線も示されている。このグラフ
から判るように、測定データは直線上によく乗ってお
り、蛍光性繊維の単位長さ（１μｍ）当たりに検出され
た蛍光光子数は約６１８ｃｐｓであり、蛍光性アクチン
１分子当たりに検出された蛍光光子数は約６ｃｐｓであ
った。The arithmetic unit 40 calculates the true fluorescence intensity by subtracting the background light intensity from the fluorescence intensity including the background light, and based on the true fluorescence intensity and the length of the fluorescent fiber, The fluorescence intensity per unit length was determined. FIG. 2 is a graph showing the relationship between the length of the fluorescent fiber and the fluorescence intensity (the number of fluorescent photons). In this graph, 2
A linear regression line is also shown, along with the measured data of the length and the true fluorescence intensity of the six sets of fluorescent fibers. As can be seen from this graph, the measurement data is well on a straight line, and the number of fluorescent photons detected per unit length (1 μm) of the fluorescent fiber is about 618 cps, which is detected per fluorescent actin molecule. The number of fluorescent photons determined was about 6 cps.
【００４２】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、
光検出器３４に到る検出光学系およびカメラ３７に到る
撮像光学系の何れか一方に蛍光の光路を切り替える光路
切替手段として着脱自在のミラー３２を設けたが、これ
に限られるものではない。例えば、ミラーの位置を動か
すことなく方位のみを変え、ミラー方位の切替により、
検出光学系および撮像光学系の何れか一方に蛍光の光路
を切り替えるようにしてもよい。なお、これら何れの場
合も、ピンホール３１の開口を通過した蛍光の全てが光
検出器３４およびカメラ３７の何れか一方に到達するの
で、蛍光強度検出および蛍光像撮像の効率がよい。The present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications are possible. In the above embodiment,
The detachable mirror 32 is provided as an optical path switching means for switching the optical path of the fluorescent light in one of the detection optical system reaching the photodetector 34 and the imaging optical system reaching the camera 37, but is not limited to this. . For example, changing only the azimuth without moving the mirror position, and switching the mirror azimuth,
The fluorescent light path may be switched to one of the detection optical system and the imaging optical system. In any of these cases, since all of the fluorescent light that has passed through the opening of the pinhole 31 reaches one of the photodetector 34 and the camera 37, the efficiency of fluorescent intensity detection and fluorescent image imaging is high.
【００４３】また、何れか一方に蛍光の光路を切り替え
るのではなく、図１中に示すミラー３２の位置にミラー
３２に替えて光分岐手段であるハーフミラーを設け、ピ
ンホール３１の開口を通過した蛍光をハーフミラーによ
り２分岐して、検出光学系および撮像光学系の双方に同
時に蛍光を導くようにしてもよい。この場合、可動部が
なく、また、蛍光強度検出と蛍光像撮像とが同時に行わ
れる点で好適である。しかし、光検出器３４に到達する
蛍光はハーフミラーの透過率に依存して弱くなる。そこ
で、光検出器３４およびカウンタ３５により検出された
光強度をハーフミラーの透過率で補正するのが好適であ
る。Also, instead of switching the optical path of the fluorescent light to one of them, a half mirror as a light splitting means is provided at the position of the mirror 32 shown in FIG. The fluorescence thus obtained may be split into two by a half mirror, and the fluorescence may be simultaneously guided to both the detection optical system and the imaging optical system. In this case, there is no movable part, and it is preferable that the fluorescence intensity detection and the fluorescence image imaging are performed simultaneously. However, the fluorescence reaching the photodetector 34 is weakened depending on the transmittance of the half mirror. Therefore, it is preferable to correct the light intensity detected by the light detector 34 and the counter 35 by the transmittance of the half mirror.
【００４４】また、上記実施形態では蛍光像に基づいて
蛍光性繊維の長さを求めたが、これに限られるものでは
ない。例えば、被測定対象物２１を落射照明して得られ
た反射光の像をカメラ３７により撮像し、その像に基づ
いて蛍光性繊維の長さを求めてもよい。この場合、励起
光フィルタ１２および励起光除去フィルタ１５は不要で
あり、ダイクロイックミラー１３に替えてハーフミラー
が設けられる。In the above-described embodiment, the length of the fluorescent fiber is obtained based on the fluorescent image. However, the present invention is not limited to this. For example, an image of reflected light obtained by epi-illuminating the measured object 21 may be captured by the camera 37, and the length of the fluorescent fiber may be obtained based on the image. In this case, the excitation light filter 12 and the excitation light removal filter 15 are unnecessary, and a half mirror is provided instead of the dichroic mirror 13.
【００４５】[0045]
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、蛍光性繊維が蛍光顕微鏡の観察視野内に置か
れ、この蛍光性繊維から発生する蛍光の強度が蛍光顕微
鏡の光学系を介して検出される。また、この蛍光性繊維
の像に基づいて蛍光性繊維の長さが求められる。そし
て、蛍光性繊維の単位長さ当たりに存在する蛍光分子の
数が一定であるので、蛍光の強度および蛍光性繊維の長
さに基づいて蛍光顕微鏡の蛍光検出性能が評価される。
したがって、容易かつ高精度に蛍光顕微鏡の蛍光検出性
能を評価することができる。As described above in detail, according to the present invention, the fluorescent fiber is placed in the observation field of the fluorescent microscope, and the intensity of the fluorescent light generated from the fluorescent fiber is controlled by the optical system of the fluorescent microscope. Is detected through. The length of the fluorescent fiber is determined based on the image of the fluorescent fiber. Since the number of fluorescent molecules existing per unit length of the fluorescent fiber is constant, the fluorescence detection performance of the fluorescent microscope is evaluated based on the intensity of the fluorescent light and the length of the fluorescent fiber.
Therefore, the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope can be easily and accurately evaluated.
【００４６】また、光検出器に到る検出光学系とカメラ
に到る撮像光学系との分岐位置に設けられた光路切替手
段により、検出光学系および撮像光学系の何れか一方に
蛍光の光路を切り替える場合には、蛍光強度検出および
蛍光性繊維撮像は順次に行われ、蛍光強度検出および蛍
光性繊維撮像の効率がよい。Further, an optical path switching means provided at a branch position between the detection optical system reaching the photodetector and the imaging optical system reaching the camera provides a fluorescent optical path to one of the detection optical system and the imaging optical system. In the case of switching, the detection of the fluorescence intensity and the imaging of the fluorescent fiber are sequentially performed, and the efficiency of the fluorescence intensity detection and the imaging of the fluorescent fiber is high.
【００４７】また、光検出器に到る検出光学系とカメラ
に到る撮像光学系との分岐位置に設けられ蛍光を分岐す
る光分岐手段により、検出光学系および撮像光学系の双
方に蛍光を導く場合には、蛍光強度検出および蛍光性繊
維撮像は同時に行われる。Further, the optical branching means provided at a branching position between the detection optical system reaching the photodetector and the imaging optical system reaching the camera and splitting the fluorescence emits the fluorescence to both the detection optical system and the imaging optical system. When guiding, the fluorescence intensity detection and the fluorescent fiber imaging are performed simultaneously.
【図１】本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の構成図であ
る。FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescence microscope device according to an embodiment.
【図２】蛍光性繊維の長さと蛍光強度との関係を示すグ
ラフである。FIG. 2 is a graph showing the relationship between the length of a fluorescent fiber and the fluorescence intensity.
１０…蛍光顕微鏡、１１…励起光源、１２…励起光フィ
ルタ、１３…ダイクロイックミラー、１４…対物レン
ズ、１５…励起光除去フィルタ、１６…第２対物レン
ズ、２１…被測定対象物、２２…スライドガラス、２３
…カバーガラス、３０…蛍光顕微鏡評価装置、３１…ピ
ンホール、３２…ミラー、３３…レンズ、３４…光検出
器、３５…カウンタ、３６…レンズ、３７…カメラ、３
８…画像記録部、３９…画像解析部、４０…演算部。Reference Signs List 10: fluorescence microscope, 11: excitation light source, 12: excitation light filter, 13: dichroic mirror, 14: objective lens, 15: excitation light removal filter, 16: second objective lens, 21: object to be measured, 22: slide Glass, 23
... cover glass, 30 ... fluorescence microscope evaluation device, 31 ... pinhole, 32 ... mirror, 33 ... lens, 34 ... photodetector, 35 ... counter, 36 ... lens, 37 ... camera, 3
8 image recording unit, 39 image analysis unit, 40 operation unit.
Claims (4)
光顕微鏡評価方法であって、 単位長さ当たりに存在する蛍光分子の数が一定であって
前記蛍光顕微鏡の観察視野内に置かれた蛍光性繊維から
発生した蛍光の強度を前記蛍光顕微鏡の光学系を介して
検出し、 前記蛍光性繊維の像を前記蛍光顕微鏡の光学系を介して
撮像し、その像に基づいて前記蛍光性繊維の長さを求
め、 前記蛍光の強度および前記蛍光性繊維の長さに基づいて
前記蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価する、 ことを特徴とする蛍光顕微鏡評価方法。1. A fluorescence microscope evaluation method for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope, wherein the number of fluorescent molecules present per unit length is constant and the fluorescence placed in an observation field of the fluorescence microscope is provided. Detecting the intensity of the fluorescent light generated from the fluorescent fiber through the optical system of the fluorescent microscope, capturing an image of the fluorescent fiber through the optical system of the fluorescent microscope, A method for evaluating a fluorescence microscope, comprising determining a length, and evaluating the fluorescence detection performance of the fluorescence microscope based on the intensity of the fluorescence and the length of the fluorescent fiber.
光顕微鏡評価装置であって、 単位長さ当たりに存在する蛍光分子の数が一定であって
前記蛍光顕微鏡の観察視野内に置かれた蛍光性繊維から
発生した蛍光の強度を前記蛍光顕微鏡の光学系を介して
検出する光検出器と、 前記蛍光性繊維の像を前記蛍光顕微鏡の光学系を介して
撮像するカメラと、 前記カメラにより撮像された前記蛍光性繊維の像に基づ
いて前記蛍光性繊維の長さを求める画像解析部と、 前記蛍光の強度および前記蛍光性繊維の長さに基づいて
前記蛍光顕微鏡の蛍光検出性能を評価する演算部と、 を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡評価装置。2. A fluorescence microscope evaluation apparatus for evaluating the fluorescence detection performance of a fluorescence microscope, wherein the number of fluorescent molecules present per unit length is constant and the fluorescence placed in an observation field of the fluorescence microscope. A photodetector that detects the intensity of the fluorescent light generated from the fluorescent fiber via the optical system of the fluorescent microscope, a camera that captures an image of the fluorescent fiber via the optical system of the fluorescent microscope, and an image captured by the camera An image analysis unit that determines the length of the fluorescent fiber based on the image of the fluorescent fiber that is obtained, and evaluates the fluorescence detection performance of the fluorescent microscope based on the intensity of the fluorescent light and the length of the fluorescent fiber. A fluorescence microscope evaluation device, comprising: a calculation unit.
メラに到る撮像光学系との分岐位置に設けられ、前記検
出光学系および前記撮像光学系の何れか一方に前記蛍光
の光路を切り替える光路切替手段を更に備えることを特
徴とする請求項２記載の蛍光顕微鏡評価装置。3. The optical path of the fluorescence, which is provided at a branch position between a detection optical system reaching the photodetector and an imaging optical system reaching the camera, and is provided to one of the detection optical system and the imaging optical system. 3. The fluorescence microscope evaluation apparatus according to claim 2, further comprising an optical path switching means for switching the light path.
メラに到る撮像光学系との分岐位置に設けられ、前記蛍
光を分岐して前記検出光学系および前記撮像光学系の双
方に前記蛍光を導く光分岐手段を更に備えることを特徴
とする請求項２記載の蛍光顕微鏡評価装置。4. A detection optical system that reaches the photodetector and an imaging optical system that reaches the camera, and is provided at a branching position to split the fluorescent light to be provided to both the detection optical system and the imaging optical system. 3. The fluorescence microscope evaluation apparatus according to claim 2, further comprising a light branching unit that guides the fluorescence.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35313697A JPH11183381A (en) | 1997-12-22 | 1997-12-22 | Fluorescence microscope evaluating method and device |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35313697A JPH11183381A (en) | 1997-12-22 | 1997-12-22 | Fluorescence microscope evaluating method and device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11183381A true JPH11183381A (en) | 1999-07-09 |
Family
ID=18428807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35313697A Pending JPH11183381A (en) | 1997-12-22 | 1997-12-22 | Fluorescence microscope evaluating method and device |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11183381A (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102023145A (en) * | 2009-09-10 | 2011-04-20 | 住友化学株式会社 | Method for evaluating adhesion property of film |
| CN103175812A (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-26 | 阿自倍尔株式会社 | Microorganism detecting apparatus calibration method, and microorganism detecting apparatus calibration kit |
| CN103513411A (en) * | 2013-09-27 | 2014-01-15 | 香港应用科技研究院有限公司 | Device and method for focusing in fluorescence microscope |
| CN103698197A (en) * | 2013-12-16 | 2014-04-02 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | Single-ion-beam irradiation operating device for optical tweezers |
| CN104677874A (en) * | 2015-03-18 | 2015-06-03 | 中国水稻研究所 | Plant leaf shading device and chlorophyll fluorescence determination method applying plant leaf shading device |
| US9240043B2 (en) | 2008-09-16 | 2016-01-19 | Novartis Ag | Reproducible quantification of biomarker expression |
| JP2020139239A (en) * | 2019-02-27 | 2020-09-03 | 株式会社島津製作所 | Fiber length measuring method, fiber length measuring device, and fiber length measuring program |
-
1997
- 1997-12-22 JP JP35313697A patent/JPH11183381A/en active Pending
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