JP2983629B2 - エリスロポエチンイソフォーム - Google Patents
エリスロポエチンイソフォームInfo
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Description
日出願の米国出願番号421,444の一部継続出願である。
本発明は、エリスロポエチンイソフォーム又はその混合
物、特定のイソフォーム又はその混合物の調製法、かか
るイソフォーム又はその混合物から成る医薬用組成物、
及びかかるイソフォーム及び組成物を用いた治療法に関
する。
成熟過程に係わる糖蛋白ホルモンである。これは、循環
赤血球のレベルの調節に必須である。自然界に存在する
エリスロポエチンは胎児期の肝臓及び成人の腎臓により
生産され、血液中を循環して骨髄に於る赤血球生産を刺
激する。腎不全の結果、腎臓のエリスロポエチン生産の
減少によりほとんど常に貧血になる。エリスロポエチン
をコードした遺伝子で形質転換した宿主細胞の蛋白質生
成物の発現を含む遺伝子工学技術により生産された組み
換えエリスロポエチンは、慢性腎不全の結果起こる貧血
の治療に用いる場合効果的であることが見いだされてい
る。
いた。この蛋白質は、ヒトの尿に存在するが、排出量が
非常に少ないことからこれを実際的な治療用エリスロポ
エチン源とすることはできない。再生不良性貧血患者
は、健常人と比較して高水準の尿中エリスロポエチン量
を示すが、この尿の供給が限定されていることから、や
はり実質的にかかる源とすることはできない。J.Biol.C
hem.,252,5558(1977年)に於て、Miyake等によりヒト
尿性エリスロポエチンの精製が、再生不良性貧血患者由
来の尿を出発物質として用いて行われた。
ニング及び発現は、米国特許第4,703,008号(Lin)に記
載されている。例えば、組み換えエリスロポエチンプラ
スミドを含む哺乳動物細胞の成長を支持した細胞培地か
らの組み換えエリスロポエチンの分離精製についての記
載は、米国特許第4,667,016号(Lai等)に含まれる。組
み換えプラスミド上にエリスロポエチン遺伝子を含む哺
乳動物宿主細胞に於る、生物学的に活性な組み換えエリ
スロポエチンの発現及び回収は、初めて治療に十分な量
のエリスロポエチンを使用可能にした。更に、遺伝子配
列の知識及び、より大量の精製された蛋白質の使用可能
性は、この蛋白質の作用様式についての理解を深めた。
は、蛋白質の一次構造(即ち、そのアミノ酸配列)は、
合成中及び合成後のポリペプチドによる二次(例えばア
ルファヘリックス又はベータシート)及び三次(三次折
りたたみ構造全体)構造形成の情報を提供する。突然変
異の誘導又は化学もしくは酵素処理による適切な二次及
び三次構造の破壊は、生物学的活性の減少をもたらす。
造により大きく支配される。原核細胞からの蛋白質と異
なって、真核細胞により生成される多数の細胞表面及び
分泌蛋白質は、一又はそれ以上のオリゴサッカリド残基
によって修飾されている。この修飾は、グリコシレーシ
ョンと称し、蛋白質の物理特性に劇的に影響し、蛋白質
の安定性、分泌及び細胞下局在性に於ても重要である。
適切なグリコシレーションは、生物学的活性に必須であ
る。事実、真核生物由来の遺伝子が、細胞内蛋白質グリ
コシレーションプロセスを欠いたバクテリア(例えば大
腸菌)に於て発現した場合、グリコシレーションの欠乏
により活性がないか又はほとんどない蛋白質を生じる。
置で起き、通常二つの型、即ち、O−結合オリゴサッカ
リドがセリン又はスレオニン残基と結合する型とN−結
合オリゴサッカリドが、配列Asn−X−Ser/Thr(ここで
Xはプロリンを除くアミノ酸を表す)の一部であるアス
パラギン残基と結合する型がある。各型に於て見いださ
れたN−結合及びO−結合オリゴサッカリドの構造及び
糖残基は、異なっている。通常両者に見いだされる糖の
一種は、N−アセチルノイラミン酸(以下、シアル酸と
称する)である。シアル酸は、通常N−結合及びO−結
合オリゴサッカリド両者の末端残基であり、その負の電
荷により糖蛋白質に酸の特性を与えることができる。
る組み換えエリスロポエチン(哺乳動物細胞内で発現)
及びヒト尿由来のエリスロポエチンの両者は、糖蛋白質
の全分子量の約40%から成る三ケ所のN−結合及び一ケ
所のO−結合オリゴサッカリド鎖を含む。N−結合グリ
コシレーションは24、38及び83の位置に存在するアスパ
ラギン残基で起こり、一方O−結合グリコシレーション
は126の位置に存在するセリン残基で起こる(Lai等J.Bi
ol.Chem.261,3116(1986年);Broudy等Arch.Biochem.Bi
ophys.265,329(1988年))。オリゴサッカリド鎖は、
末端シアル酸残基で修飾されていることが示されてい
る。全シアル酸残基を除去するためのグリコシル化エリ
スロポエチンの酵素処理は、インビボ活性の損失を結果
として生じさせるが、インビトロ活性には影響しない
(Lowy等Nature185,102(1960年);Goldwasser等J.Bio
l.Chem.249,4202(1974年))。この性質は、肝アシア
ログリコプロテイン結合蛋白質との相互作用により循環
系からアシアロエリスロポエチンが速やかに除去される
ことにより説明される(Morrell等J.Biol.Chem.243,155
(1968年);Briggs等,Am.J.Physiol.227,1385(1974
年);Ashwell等Methods Enzymol.50,287(1978年))。
このように、エリスロポエチンはシアル化され、肝結合
蛋白質による結合を避けた場合のみインビボ生物学的活
性を有する。
分の役割は明らかではない。非グリコシル化エリスロポ
エチンは、グリコシル化型に比較してインビボ活性が非
常に減少するが、インビトロ活性は保持することが示さ
れてきた(Dordal等Endocrinology116,2293(1985
年);前記Lin特許)。だが、他方の研究によると、グ
リコシレーション部位に存在するアスパラギン又はセリ
ン残基の突然変異によるN−結合又はO−結合オリゴサ
ッカリド鎖の単一又は同時除去は、哺乳動物細胞に於て
生産される変化したエリスロポエチンのインビトロ活性
を著しく減少させる(Dube等J.Biol.Chem.263,17516(1
988年))。
(IEF)の如き技術を用いて異なった荷電体に分離させ
ることができる。多数の研究者達が、未精製及び部分精
製したエリスロポエチン調製物のIEF研究について報告
している(Lukowsky等;J.Biochem50,909(1972年);She
lton等Biochem.Med.12,45(1975年);Fuhr等Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.98,930(1981年)。エリスロポエチン
活性を有する多くて3又は4個のフラクションがこれら
の研究のIEFにより分類されたが、いずれも炭水化物含
有量に関しては特徴づけられていない。さらに、フラク
ションの等電点とその生物学的活性との間には何ら関連
付けがなされなかった。
リスロポエチンの精製中、II及びIII Aと命名されたヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの二個のエリ
スロポエチンフラクションは、同じ比活性を有すること
が報告された。後のフラクションII及びIII Aの炭水化
物分析は、フラクションIIが、フラクションIII Aより
平均シアル酸含有量が多いことを示した(前述のDordal
等)。
学的活性を有するエリスロポエチンの単離したイソフォ
ームを提供することである。かかる分子を含む医薬用組
成物は、治療効果を有する。
精製したエリスロポエチンを調製用等電点電気泳動に供
し、ゲルから単一のイソフォームを溶出させる段階から
成るエリスロポエチンイソフォームの製法も又提供され
る。エリスロポエチンイソフォームを含む医薬的に許容
可能な組成物も提供される。本発明は、又、これらの組
成物の治療学的に許容可能な量を投与して網状赤血球及
び赤血球の生産を増加させることから成る哺乳動物に於
るヘマトクリットレベルの増加法に関する。
クロマトグラフィーに供することから成る、分子当り所
定数より多い又は少ないシアル酸を有するエリスロポエ
チン分子の混合物の製法に関する。又、本発明は、エリ
スロポエチンを含む物質を等電点クロマトグラフィーに
供することから成る、分子当り所定数より多い又は少な
いシアル酸を有するエリスロポエチン分子の混合物の製
法を包含する。
[Thr125]EPO;及び[Pro124,Thr125]EPOのように、ヒ
トエリスロポエチンより数の多い炭水化物鎖結合部位を
有するヒトエリスロポエチンの類似体も包含する。
ームの分析用等電点電気泳動ゲルを示す。ゲルレーン1
−11は、レーン1のより非酸性(高pI)からレーン11に
於るより酸性(低pI)までのイソフォームを示す。イソ
フォーム9−14の混合物を含む精製した組み換えエリス
ロポエチンも、ゲルの左右両端のレーンに示される。
ニットとして表される各イソフォームのインビボ比活性
と、エリスロポエチンイソフォーム当りのシアル酸の数
の相関関係を示す。図2Aに於る各エリスロポエチンイソ
フォーム濃度は、ブラッドフォード蛋白質アッセイによ
り決定し、2Bに於る濃度は280nmの吸収により決定し、2
Cに於る濃度はRIAにより決定した。
ーにより調製した組み換えエリスロポエチンイソフォー
ムの限定した混合物の分析用等電点電気泳動ゲルを示
す。1−6のゲルレーンは、それぞれ、150mM酢酸pH4.
7,150mM酢酸(非緩衝),200mM酢酸pH4.7,250mM酢酸pH4.
7,300mM酢酸pH4.7又は300mM酢酸(非緩衝)でQ−セフ
ァロース高速フローカラムを洗浄した後高塩濃度溶出液
で溶出したエリスロポエチンイソフォームを表す。DEAE
−アガロースクロマトグラフィーをQ−セファロースク
ロマトグラフィーに代えることを除いては前述のLai等
の実施例2に記載された手法を用いて得たイソフォーム
の混合物を含む精製した組み換えエリスロポエチンも、
ゲルの左端レーンに示される。
培地をpH減少及びイオン強度増加勾配に供することによ
り達成した8ないし12個のエリスロポエチンイソフォー
ムの分離を示す。フラクション2からフラクション40ま
での偶数番号のフラクションを分析用等電点電気泳動に
供した。DEAE−アガロースクロマトグラフィーをQ−セ
ファロースクロマトグラフィーに代えることを除いては
前述のLai等の実施例2に記載された手法を用いて得た
イソフォームの混合物を含む精製した組み換えエリスロ
ポエチンも、ゲルの左端レーンに示される。
す。四角は、炭水化物鎖が結合するアスパラギン残基を
示し、星印は、炭水化物で修飾されるスレオニン及びセ
リン残基を示す。実施例6の類似体に於て提供された追
加グリコシレーション部位は、アスパラギン、セリン及
びスレオニンへの突然変異により示される。
築及び分析用のプラスミド生成に用いた一連のクローニ
ングステップを示す。これらの類似体は、図5に示すよ
うに追加グリコシレーション部位を提供する変化したア
ミノ酸を有する。
チン類似体のCOS細胞上澄液のウェスタンブロット分析
を示す。類似体の[Asn9,Ser11],EPO,[Asn69]EPO,
[Asn125,Ser127]EPO,及び[Pro124,Thr125]EPOは、
実施例6に記載した通りに構築される。追加炭水化物鎖
を含まない類似体の[Pro125,Thr127]EPO,[Asn126,Se
r128]EPO及び[Thr125,Ser127]EPOを比較のために示
す。
チン類似体のCOS細胞上澄液のN−グリカナーゼ処理後
のウェスタンブロット分析を示す。類似体の[Thr125]
EPO及び[Pro124,Thr125]EPOは、実施例6に記載した
通りに構築した。類似体の[Val126]EPO,[Pro124]EP
O,[Pro125]EPO,[Thr127]EPO,[Pro125,Ser127]EPO
及び[Thr125,Ser127]EPOを比較のために示す。
cDNAでトランスフェクトしたCHO細胞の成長を支持した
細胞培地をQ−セファロース及びC4逆相クロマトグラフ
ィーにかけることにより得たプール2,3及び4の等電点
電気泳動ゲルを示す。イソフォームの混合物を含む精製
した組み換えエリスロポエチンは、DEAE−アガロースク
ロマトグラフィーをQ−セファロースクロマトグラフィ
ーに代えたことを除いては前述のLai等の実施例2に記
載した手法により得られ、これも、やはりゲルの左右の
レーンに示される。
供される。等電点電気泳動(IEF)は、電荷に基づいて
蛋白質を分離する。pH勾配及び電場に供した場合、蛋白
質は実効電荷を持たない位置に移動しそこにとどまる。
これが、蛋白質の等電点(pI)である。IEF上に観察さ
れるそれぞれ明確なバンドは、特定のpI、従って同じ全
電荷を有する分子を表し、これをイソフォームと称す
る。ここで使用する用語「エリスロポエチンイソフォー
ム」とは、単一のpI及び同じアミノ酸配列を有するエリ
スロポエチン調製物を指す。
性宿主細胞の中にトランスフェクトされた外来性DNA配
列の発現の生成物である。即ち、好ましい態様に於るエ
リスロポエチンは、組み換えエリスロポエチンである。
組み換えエリスロポエチンは、参照により本明細書に含
めた共通所有のLin米国特許第4,703,008号に記載の手法
により有利に生産される。組み換えエリスロポエチン
は、参照により本明細書に含めた共通所有のLai等の米
国特許第4,667,016号の実施例2に記載の通常の手法、
又はDEAE−アガロースクロマトグラフィーをQ−セファ
ロースクロマトグラフィーに代えることを除いては実施
例2に記載の手法により有利に精製される。Q−セファ
ロースカラム変法に於て、カラムを中性のpHにするため
に用いる緩衝液において25mM NaClから55mM NaClに代
え、カラムからエリスロポエチンを溶出させるために用
いる緩衝液において75mM NaClから140mM NaClに代え
る。この物質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分析すると、単一種(即ち、
バンド)として移動する。精製エリスロポエチンをIEF
に供すると、糖蛋白質の異なる電荷型が存在することを
示す複数のバンドが現れる。
る組み換えエリスロポエチンの別々のイソフォームは、
1から14のシアル酸を有するエリスロポエチン分子に対
応し、精製した組み換えエリスロポエチンに存在する各
イソフォームは、イソフォームが所有するシアル酸の数
に従ったインビボ活性を有することを見いだした。ここ
で使用した用語「エリスロポエチン」とは、天然に存在
するエリスロポエチン、即ち尿由来のヒトエリスロポエ
チン、及び骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産を増
加させるインビボの生物学的特質を有するのに十分に、
天然に存在するエリスロポエチンのアミノ酸配列及びグ
リコシレーションに類似する天然に存在しないポリペプ
チドを含むものとする。
を有するが、例えば前述のLai等の特許の実施例2のよ
うに精製した物質は、IEFにより分析した場合主に6個
のイソフォームを含む。さらに、実施例4に記載のクロ
マトグラフィーの手法を用いて、少なくとも1個の他の
高酸度イソフォームが検出されている。(IEFゲル上で
シアル酸14個以上の位置に移動するこの高酸性型は、シ
アリダーゼ消化に対する電荷の抵抗性により示されるよ
うにシアル酸の他の負の電荷を含むことができる)。こ
れらのイソフォームは、シアル酸含有量により相互に異
なる。実施例に示すように、これは、調製用IEFにより
イソフォームの10個を分離し、そのうち5個についてシ
アル酸含有量を決定することにより証明される。シアル
酸含有量を分析したイソフォームについて、5個のイソ
フォームは9,10,11,12又は13個のシアル酸残基のいずれ
かを含むことを見いだした。
リスロポエチン分子当りのシアル酸の数により命名し
た)のエリスロポエチン分子当りのシアル酸残基の数
と、エリスロポエチンの相対インビボ比活性の間には相
関関係がある。イソフォーム11から14は、ほぼ同じ相対
インビボ比活性を有する。イソフォーム5から14は、低
酸素赤血球増加症マウスバイオアッセイ法によりインビ
ボ活性を分析し、存在する各イソフォームの量は、ブラ
ッドフォード蛋白質分析、280nmに於る吸収又はエリス
ロポエチンに対するラジオイムノアッセイ(RIA)によ
り決定した。U/mlとして表されるRIA測定値(Egrie等Im
munobiology172,213,(1986年)は、212,770U/mgエリス
ロポエチンポリペプチド(RIAにより決定された精製エ
リスロポエチンの平均比活性)で除することによってmg
エリスロポエチンポリペプチド/mlとして表される単離
したイソフォーム又はイソフォーム混合物の蛋白質濃度
を与える。実施例に示すように、相対インビボ比活性は
イソフォーム5からイソフォーム11まで段階的に増加し
ている(表2参照)。
の測定値をいい、絶対インビボ比活性の測定値ではな
い。この出願の目的として、比活性は、同じ分析法、同
じ内部標準を含む同じ条件、同じ型の動物、比活性を計
算するために使用する同じ分析データ、蛋白質含有量を
決定するための同じ分析法を用いて分析したイソフォー
ムの相対活性を比較するためにのみ使用する。イソフォ
ームについて報告されるインビボ比活性はどれも、その
イソフォームの個有値又は絶対値を表すものではない。
る。本発明により得られるエリスロポエチンの特定のイ
ソフォーム及びその性質は、出発物質の源により変化す
る。例えば、尿由来のヒトエリスロポエチンのイソフォ
ームは、組み換えエリスロポエチンのイソフォームと異
なる。本発明は、好ましい態様に於て、エリスロポエチ
ン分子当り特定の数(即ち、0より大きい一定の数)の
シアル酸(当該数は1−14から成る群から選択される)
を有するエリスロポエチンイソフォームに関する。有利
な当該数は、9,10,11,12,13又は14である。他の態様に
於て、当該数は14を超え、有利には16−23である。
フォームを含む組成物を提供する。一つの態様に於て、
この組成物は、エリスロポエチン分子当り所定数以上の
シアル酸、例えばエリスロポエチン分子当り11個を超え
るシアル酸又は分子当り12個を超えるシアル酸を有する
イソフォームの混合物、例えばイソフォーム12,13及び1
4の混合物を含む。他の態様に於て、この組成物は、エ
リスロポエチン分子当り所定の数のシアル酸、例えば分
子当り12個未満であるが8個を超えるシアル酸を有する
イソフォームの混合物、例えばイソフォーム9,10及び11
の混合物を含む。本発明はまたイソフォームの相対量が
同じ又は異なるエリスロポエチンイソフォームの組成物
を提供する。例えば、イソフォーム9,10及び11の混合物
は、1:1:1,2:3:1又は20:20:1のように割合を変えること
ができる。
えばイソフォーム11,12及び13の混合物又は12及び14の
混合物又は7及び13の混合物を含むことが有利である。
めに、本発明は、選択するエリスロポエチンイソフォー
ムを同時に単離する方法も提供する。これらの方法は、
調製用等電点電気泳動のような技法による個々のイソフ
ォームの単離、又はイオン交換クロマトグラフィー又は
等電点クロマトグラフィーのような技法による分子当り
所定数のシアル酸(例えば11超)を有するイソフォーム
混合物の調製を含む。これらの全ての技法は、その基本
として電荷による蛋白質の分離を有する。
マトグラフィーは、一部又は全部のエリスロポエチンイ
ソフォームの樹脂への結合を可能にする条件下で、粗ヒ
トエリスロポエチン(細胞ならし培地)又は精製した物
質のいずれかを樹脂のカラムにかけることを含む。粗エ
リスロポエチン調製物については、約pH7でこの蛋白質
をカラムに供することが好ましく、精製した調製物につ
いては、pH7から約pH4でこの蛋白質をカラムに供するこ
とができる。約pH4の緩衝液でカラムを洗浄した後、イ
オン交換カラムに結合しとどまったこれらのエリスロポ
エチンイソフォームを、緩衝液の塩濃度及びpHを増加さ
せることにより又は約pH4でイオン強度増加及びpH減少
勾配に供することにより溶出させる。等電点クロマトグ
ラフィーではpH減少勾配又は高塩濃度でカラムを洗浄す
ることによりカラムからイソフォームを溶出させる。
10超のシアル酸を有するエリスロポエチンイソフォーム
を選択的に合成する哺乳動物(例えばチャイニーズハム
スター卵巣、CHO)宿主細胞に関する。エリスロポエチ
ン分子は、分子のシアル酸含有量を制限することのでき
るN−結合又はO−結合オリゴサッカリド構造を有す
る。例えばテトラアンテナ(四分枝)N−結合オリゴサ
ッカリドは、最も普通に4ケ所のシアル酸結合可能部位
を提供し、一方、アスパラギン結合部位に於てテトラア
ンテナ型と置換することができる二分枝及び三分枝オリ
ゴサッカリド鎖は、通常、多くて2又は3ケ所のシアル
酸結合部位を有する。O−結合オリゴサッカリドは、通
常2ケ所のシアル酸結合部位を提供する。このように、
エリスロポエチン分子は、3個のN−結合オリゴサッカ
リドが全てテトラアンテナである場合、シアル酸残基計
14個を有することができる。組み換えエリスロポエチン
にテトラアンテナ鎖を選択的に付加することができ、そ
れによってシアル酸結合部位の数を最大限にすることが
できる細胞を得るために哺乳動物培養細胞を選抜する。
は、ガラクトースにα2,3及びα2,6結合両者のシアル酸
を含む(Takeuchi等、J.Biol.Chem.263,3657(1988
年))。典型的には、α2,3結合のシアル酸はマンノー
スα1,6分枝上のガラクトースに付加し、α2,6結合のシ
アル酸はマンノースα1,3分枝上のガラクトースに付加
する。これらのシアル酸を付加する酵素(β−ガラクト
シドα2,3シアリルトランスフェラーゼ及びβ−ガラク
トシドα2,6シアリルトランスフェラーゼ)は、それぞ
れマンノースα1,6及びマンノースα1,3分枝にシアル酸
を付加させるのに最も効果的である。
ハムスター卵巣(CHO)細胞は、組み換えエリスロポエ
チンを含む組み換え糖蛋白質の生産に通常宿主細胞とし
て用いられる。これらの細胞は、酵素β−ガラクトシド
α2,6シアリルトランスフェラーゼを発現しないことか
ら、これらの細胞内で生産される糖蛋白質のN−結合オ
リゴサッカリドにα2,6結合のシアル酸を付加しない。
(Mutsaers等Eur.J.Biochem.156,651(1986年);Takeuc
hi等J.Chromatogr.400,207(1987年))。従ってCHO細
胞で生産される組み換えエリスロポエチンには、ガラク
トースに2,6結合したシアル酸が欠けている(前述のSas
aki等(1987年);前述のTakeuchi等(1987年))。本
発明の他の態様に於て、イソフォームを生産するために
用いられるエリスロポエチンは、機能的β−ガラクトシ
ドα2,6シアリルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換
(トランスフェクション)し、ガラクトースにα2,6結
合したシアル酸を組み込むCHO細胞内で生成する。改変
したCHO細胞又は他の哺乳動物宿主細胞を作成する技法
の開示については、参照により本明細書に含めるLee等
J.Biol.Chem.264,13848(1989年)を参照。
る。ここで使用した「ヒトエリスロポエチンの類似体」
とは、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列が1個以上
変化しシアル酸結合部位の数が増加したエリスロポエチ
ンを称する。類似体は、グリコシレーションに有用であ
る部位に変える、アミノ酸残基の付加、欠失又は置換を
含む部位特異的突然変異により生じる。このような類似
体は、ヒトエリスロポエチンよりも多数の炭水化物鎖を
有する。
分子のシアル酸含有量を増加させることにより構築され
る。ヒトエリスロポエチンで見いだされたシアル酸より
も多くのシアル酸を有する類似体は、生物学的活性に必
要な二次又は三次構造を乱さないグリコシレーション部
位を付加することにより生じる。有利には、ヒトエリス
ロポエチンの類似体は、N−グリコシレーション又はO
−グリコシレーションのための1,2又は3個の追加部位
を有する。例えば、69の位置のロイシンを、アスパラギ
ンに置換しN−グリコシレーションのための四番目の部
位として供する配列Asn−Lue−Serを生じさせる。この
ような変化は、通常、分子当り4個までの追加シアル酸
を提供することができる。追加N−又はO−グリコシレ
ーション部位を生じさせる他の変化の例としては、125
及び127の位置のアラニンをそれぞれアスパラギン及び
セリンに、125の位置のアラニンをスレオニンに、124及
び125の位置のアラニンをそれぞれプロリン及びスレオ
ニンに変える例が挙げられる。本発明が、グリコシレー
ションのための追加部位を有するヒトエリスロポエチン
の他の多くの類似体を含むことは当業者に明白である。
ォームの混合物、及びエリスロポエチン治療に於て有用
な希釈剤、アジュバント及び/又は担体を含む医薬用組
成物も本発明に含まれる。ここで使用した「治療学上効
果的な量」とは、所定の条件及び投与計画で治療の効果
を提供する量をいう。エリスロポエチンイソフォームの
投与は、非経口的経路によるのが好ましい。特定の経路
の選択は、治療する状態による。エリスロポエチンイソ
フォームの投与は、好ましくはヒト血清アルブミンのよ
うな適切な担体、緩衝塩溶液のような適切な希釈液及び
/又は適切なアジュバントを含む剤形として行う。必要
用量は、患者のヘマトクリットを上昇させるのに十分な
量であり、それは治療を受ける患者の重症度、用いる投
与法等により変わる。
の実施例に限定されるものではない。実施例のインビボ
バイオアッセイに於て用いたエリスロポエチン標準は、
部分的に精製した尿性エリスロポエチン標準に対して標
準化した組み換えエリスロポエチン標準である。このよ
うに、相対インビボ比活性のみを測定する。又、用いた
エリスロポエチン標準が存在する国際規格と直接相関し
ないことから、インビボ比活性は、“U/ml",U/mg″,及
び“U/A280"で表し、“IU/ml",“IU/mg"及び“IU/A280"
とはしない。
通りに製造する。一回目及び三回目のイソフォーム単離
の出発物質として用いた組み換えエリスロポエチンは、
前述のLai等の実施例2に記載の手順により精製した。
二回目及び五回目のイソフォーム単離の出発物質は、前
述のLai等の、Q−セファロースクロマトグラフィーの
変法により精製した。これらの調製物は、尿由来のヒト
エリスロポエチンと同じアミノ酸配列を有する組み換え
エリスロポエチンのイソフォーム混合物を含み、主にイ
ソフォーム9−14を含む。四回目のイソフォーム調製の
出発物質は、Lai等の実施例2に於て陰イオン交換カラ
ムの洗液、5mM酢酸/1mMグリシン/6M尿素により溶出した
物質である。このフラクション(画分)は、9個以下の
シアル酸を有するイソフォームを含み、Lai等の実施例
2に記載されている通りに調製用等電点電気泳動の使用
に先立ちゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製
した。六回目のイソフォーム調製に於て、4から13個の
シアル酸残基を有する組み換えエリスロポエチンの精製
した調製物を出発物質として用いた。この物質は、出発
物質に存在するほとんどのイソフォームを保持できるイ
オン交換カラム(pH8.4の塩化ナトリウム勾配での組み
換えエリスロポエチンの溶出、及び酢酸/尿素洗浄の省
略)への改変を除いてはLai等の実施例2に従って精製
した。
ービー社の指示書番号198に従って、顆粒化ゲルベッド
(ウルトロデックス(Ultrodex)、エルケービー社)に
於る調製用等電点電気泳動により行った。ファルマライ
ト(Pharmalyte)(ファルマシア社)2.5−5アンフォ
ライト(ファルマシア社)を用い、ゲルベッドは5Mの尿
素を含む。
ム/100mM塩化ナトリウムpH7.0に溶解させた約20mgの組
み換えエリスロポエチンをゲルに供し、8ワットで約16
時間フォーカスした。等電点電気泳動後、ゲル中のイソ
フォームバンドをゲルベッドの紙接触プリントにより可
視化した。プリントした後、固定液(40%メタノール/1
0%酢酸/10% TCA/3.5%スルホサリチル酸)に3回(室
温でそれぞれ約10分)浸漬することにより固定し、40%
メタノール/10%酢酸(30−60℃)に一回(約10分)供
し、分離したイソフォームを可視化するために、60℃の
0.125%クマシーブルーR−250/40%メタノール/10%酢
酸中で15分間染色した後、7.5%メタノール/10%酢酸中
で脱色した。イソフォームを含む顆粒化ゲルベッド部分
(樹脂の約50%)を取り出し、水を加え(約16ml)、ス
ラリーを5.5×24.5インチのトレイに注ぎ、全重量が約4
0gになるまで蒸発濃縮した。この調製物を再度フォーカ
スし、ゲルベッドの接触プリントを前述の通りに作製し
た。6個の識別可能なイソフォームのそれぞれを含むゲ
ル部分をゲルベッドから取り出した。
ス−HCl pH7.0/5mM Chapsを含む溶液を各イソフォーム
に加え、スラリー状にした。このスラリーを小カラムに
移し、トリス−Chaps緩衝液で洗浄した。この通過液を
集め、20%エタノール/10mMトリス−HCl pH7.0で平衡化
したVydac C4逆相樹脂を充填した小カラム(開口型)に
それぞれ供した。このカラムは、20%エタノール/10mM
トリス−HCl,pH7.0、35%エタノール/10mMトリス−HCl,
pH7.0及び65%エタノール/10mMトリス−HCl,pH7.0を用
いて段階的に展開した。65%エタノール/10mMトリスで
溶出したフラクションを、10mMトリス−HCl,pH7.0を用
いて1:1に希釈し、濃縮に供した後、セントリコン(Cen
tricon)−10(アミコン社)微量濃縮器を用いて10mMト
リス−HCl,pH7.0にバッファー交換した。この調製物の
分析用等電点電気泳動を、5Mの尿素を含むポリアクリル
アミドゲル中で、セルバライト(Servalyte)−5アン
ホリン(セルバ社)を用いて、本質的に、エルケイビー
社の指示書番号250に記載されている通りに行った。
た約26mgの組み換えエリスロポエチンをゲルに供し、2.
5ワットで35分及び10ワットで約17時間フォーカスし
た。ゲルベッド中に観察することができるフォーカスし
た蛋白質のバンドを11の異なったプールとして取り出し
た。各プールを脱イオン水で約7.5mlにし、その結果で
きた各プールの上澄液20mlを前述の通りに分析用等電点
電気泳動に供した。各プールに5mlの1.5Mトリス−HCl,p
H8.8を加え、スラリーをそれぞれ小カラムに移し、液相
を通過させた。樹脂を約3倍容量の0.5Mトリス−HCl,pH
7で洗浄し、洗液を通過液と合わせた。この溶出液を濃
縮し、1万ダルトン分子量濾別用アミコン使い捨て限外
濾過装置を用いて20mMクエン酸ナトリウム/100mM塩化ナ
トリウムpH7.0にバッファー交換した。しかる後、この
濃縮液(約0.5ml)を0.22ミクロンカットオフの酢酸セ
ルロースフィルターを通過させた。分析用等電点電気泳
動に基づいて、5個のプールが単一のイソフォーム10,1
1,12,13及び14を主に含むことが判明した。
30mgの組み換えエリスロポエチンをゲルに供し、2ワッ
トで25分間、10ワットで20時間及び15ワットで15分間フ
ォーカスした。個々のイソフォームに対応する蛋白質の
バンドを肉眼的に観察し、ゲルベッドから取り出した。
ゲルから分離したイソフォームに蒸留水を加えてスラリ
ーを生じさせ、その結果できた上澄液を分析用等電点電
気泳動により分析した。各スラリーに等容量の1Mトリス
−HCl,pH7.2を加え、懸濁液をそれぞれ小カラムに移
し、このカラムに液相を通過させてイソフォームを溶出
させた。各通過液を濃縮し、1万ダルトン分子量カット
オフのアミコン使い捨て限外濾過装置を用いて20mMクエ
ン酸ナトリウム/100mM塩化ナトリウムpH7.0にバッファ
ー交換した。分析用等電点電気泳動ゲルにより、単一の
イソフォーム9,10,11,12,13及び14を主に含むプールが
得られたことが示された。
9を含むエリスロポエチン(前述の通りに調製)を出発
物質として用いた。調製用等電点電気泳動を本質的に前
述の調製1−3の通りに行うに先だって、等電点の低い
出発物質のためにより適切なアンホライトレンジを得る
ためにロトフォー(Rotofor、バイオラッド社、リッチ
モンド、カルフォルニア)液相等電点電気泳動セル中で
アンホライト(ファルマライト2.5−5)を前分画し
た。前分画は、6.7mlのファルマライト2.5−5を15gの
尿素と混合し、精製した水を加えて50ml容量にすること
により行った。この混合液は、ロトフォー中で10ワッ
ト、1℃で5時間半、陽極液及び陰極液としてそれぞれ
0.1M燐酸及び0.1M水酸化ナトリウムを用いて分画した。
4.5から約6の測定pHを有するアンホライトフラクショ
ンをフラットベッド等電点電気泳動に用いた。
デンバー、カサチューセッツ)及び10,000MWカットオフ
のセントリコン(アミコン社)を用い、以下のパラメー
ター、即ち、0.18トリス緩衝液pH8.8,100ボルト,25−30
mA,3時間で、イソフォームからアンホライトを取り除い
た。しかる後、セファデックスG−25(ファルマシア)
を用いてゲル濾過によりイソフォームを0.1M塩化ナトリ
ウムにバッファー交換した。この結果できた5個のプー
ルの分析用等電点電気泳動は、イソフォーム4,5,6,7及
び8を含むことを示した。イソフォーム4はいくつかの
バンドに分かれたが、これは分解を受けたことを示唆し
ている。
電気泳動の手法にプレフォーカシングステップを加える
ことにより改変した。この改変に於ては、電気泳動前に
アンホライト/尿素/ゲルの混合物に蛋白質を加えず、
ゲルベッドのpH勾配の形成の後に等電点電気泳動装置に
加える。75分間のプレフォーカシング(1500ボルト−時
間)後、カソード側から2.25−4.25cmのゲルベッド部分
を取り出し、エリスロポエチン溶液と混合し、ゲルベッ
ドにもどした。等電点電気泳動後、イソフォーム10,11,
12,13及び14をゲルベッドから溶出させ、セントリコー
ン−10(アミコン社)を用いて限外濾過によりアンホラ
イトから分離した。
外線吸収特性を出発組み換えエリスロポエチンのそれ
に、より類似させようとして考案した。スペクトル特性
に於るこの改良は、単離したイソフォームの280及び260
nmに於る吸収の比率に見いだすことができる。調製物2
及び3(プレフォーカスなし)のイソフォームの260nm
の吸収に対する280nmの吸収の平均比率(A280/A260)
は、1.36±0.11であり、一方、調製物5及び6(プレフ
ォーカスあり)のA280/A260の平均比率は1.68±0.20で
ある。イソフォーム#14を計算から除外した場合、調製
物2&3及び5&6の平均A280/A260比率は、それぞれ
1.39±0.11及び1.74±0.09である。(イソフォーム14
は、その存在が最も少量であり、そのためアンホライト
成分による痕跡量のコンタミネーションによって干渉さ
れやすいこと、又はフラットベッド等電点電気泳動操作
に於て電極に最も近接していることから最も不規則なス
ペクトルを有する。)Lai等の実施例2(前述したよう
に陰イオン交換樹脂としてQ−セファロースを用いるこ
とにより改変)に従って調製した組み換えエリスロポエ
チンの平均A280/A260比率は1.91±0.04である。
は、イソフォーム4−13を含む組み換えエリスロポエチ
ン調製物であった。アンホライトは四回目の調製と同様
にロトフォー装置内でプレフォーカスした。3.7から4.8
の測定pHを有するアンホライト分画をフラットベッド等
電点電気泳動に用いた。フラットベッドは#5と同様に
プレフォーカスし、限外濾過(セントリコーン−10)し
て担体としてのアンホライトを取り除いた後、イソフォ
ーム9,10,11,12及び13を得た。
ル酸含有量 実施例1に記載した通りに単離したイソフォーム及び
前述のLai等の手法に従って精製したエリスロポエチン
(イソフォーム9から14の混合物)は、0.10−0.15Mの
塩化ナトリウムにバッファー交換し、Jourdian等,J.Bio
l.Chem.246,430(1971年)の方法を改変してシアル酸含
有量を分析した。シアル酸残基は、0.35Mの硫酸を用い8
0℃で30分間の加水分解により糖蛋白質から切断し、分
析に先立ち、水酸化ナトリウムでこの溶液を中和した。
存在するエリスロポエチン蛋白質の量を算定するため
に、標準としてヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を
有する組み換えエリスロポエチンを用いて、ブラッドフ
ォード蛋白質アッセイ(Bradford Anal.Biochem.72,248
(1976年)を、バイオラッド社の分析試薬を用い、同社
の微量分析法に従って行った。エリスロポエチンのモル
当りのシアル酸のモルとして表した結果を表1に示す。
イソフォームは、分子当りのシアル酸の数に従って命名
し、低酸性(イソフォーム9)から高酸性(イソフォー
ム13)までの範囲であった。イソフォーム9−13は図1
のゲルレーン6−10に示される。イソフォーム14の量
は、正確にシアル酸含有量を測定するのに不十分であ
る。このイソフォームのシアル酸含有量は、他のイソフ
ォームとの相対的なIEFゲル上の移動により推定した。
イソフォーム5−8(調製物#4)のシアル酸含有量
は、測定しなかったが、同様にIEFゲル上の移動により
推定した。
280nmに於る吸収、ブラッドフォード蛋白質アッセイ及
びエリスロポエチンのRIAにより分析し、存在する組み
換えエリスロポエチンの量を決定した。低酸素赤血球増
加症マウスバイオアッセイ(Cotes等Nature191,1065(1
961年))を用いて、相対インビボ生物学的活性を決定
した。エリスロポエチンのラジオイミュノアッセイを用
いたエリスロポエチン蛋白質の定量は、一部のイソフォ
ームが高い相対インビボ比活性を有するという結果を生
じた。なぜならば、多数のシアル酸を含むイソフォーム
の見かけの減少した免疫反応性は、エリスロポエチン濃
度の過小評価をもたらし、従って最も負に荷電したイソ
フォームの相対インビボ比活性の過大評価をもたらした
からである。U/mgで表したマウスバイオアッセイの測定
値を対応する蛋白質濃度で除して、U/mgエリスロポエチ
ンペプチドで表したインビボ比活性をだした。これらの
比活性を表2に示す。
フォーム調製物の数を表す。ほとんどの場合、各イソフ
ォーム調製物に於て数回のインビボ分析をおこなった。
同じインビボデータが3個のカラム全ての比活性計算に
寄与し、U/mgエリスロポエチンポリペプチドは、280nm
の吸収、ラジオノムノアッセイ又はブラッドフォード蛋
白質アッセイの結果により決定した。イソフォーム9−
14を含む調製した組み換えエリスロポエチンをブラッド
フォード蛋白質アッセイの標準として用いた。“n"はブ
ラッドフォード蛋白質アッセイによる計算では、ブラッ
ドフォードアッセイを行った時点でいくつかの調製物は
利用不能になったので、少なくなっている。
から14の混合物を含むエリスロポエチンを、RIA及びイ
ンビボ分析の標準として用いた。
対比活性は、0.807mgエリスロポエチンポリペプチド/A
280を掛けることによりU/A280に変換することができ
る。変換係数は、エリスロポエチンの吸光定数(1.345m
g/A280)にエリスロポエチン糖蛋白質の蛋白質含有量
(約60%重量%、Davis等Biochemistry26,2633(1987
年))を掛けることにより求める。こうして求め、mgエ
リスロポエチンポリペプチド/A280(すなわち、1.345mg
エリスロポエチン/A280×0.60mgポリペプチド/mgエリス
ロポエチン=0.807mgポリペプチド/A280)を得る。さら
に、U/mgエリスロポエチンポリペプチドとして表される
比活性に、ファクター、0.60mgポリペプチド/mgエリス
ロポエチン糖蛋白質を掛けて、U/mgエリスロポエチン糖
蛋白質として表される比活性をだすことができる。
す。これらのデータは、エリスロポエチンの相対インビ
ボ活性がイソフォーム#11までシアル酸含有量の関数と
して増加することを示す。イソフォーム11−14は、本質
的に同じ相対的インビボ生物活性を有する。(これは、
イソフォーム14の濃度をブラッドフォードアッセイ値を
用いて表した場合最も明らかである。ブラッドフォード
値はイソフォーム14にとってより正確である。なぜな
ら、得られる量が通常少なくA280による決定が困難であ
り、既に述べた非常に負荷電型のRIAに於て最も見かけ
の反応性が減少したからである。)より多くのシアル酸
を有するエリスロポエチンイソフォームの相対インビボ
比活性が高いのは、これらのイソフォームの循環半減期
がより長いということが考えられる。イソフォーム9及
び13を放射性ヨウ素(125I)で標識し、そのラットに於
るクリアランス率を決定した。循環半減期は、イソフォ
ーム9よりイソフォーム13の方がかなり長かった。
み換えエリスロポエチンイソフォーム混合物の選出 前述のLinの手法による組み換えエリスロポエチンの
生産から得た細胞ならし培地を濃縮し、10mMトリス,pH
7.2で透析濾過した。蛋白質濃度は、標準としてウシ血
清アルブミンを用いてブラッドフォード微量蛋白質アッ
セイにより決定した。40mgの全蛋白質を含んだ19.6mlの
溶液に20μMになるようにCuSO4を加え、0.45ミクロン
カットオフのフィルターで濾過し、前もって10mMトリ
ス,pH6.8から7.0を用いて4℃で平衡化したQ−セファ
ロースファーストフロー(ファルマシア社)を充填した
ベッドボリューム4ml(高さ1.05cm,直径2.2cm)のカラ
ムに供した。試料供試後、カラム容量の2倍容量の同じ
緩衝液でカラムを洗浄した。カラムの流速は約1ml/分で
ある。この手法を用いて6個のカラムを別々に準備し、
限定したエリスロポエチンイソフォーム混合物を選出し
た。
なる低pH緩衝液、即ち、カラム#1は、150mM酢酸,1mM
グリシン,20μM CuSO4,6M尿素,NaOHでpH4.7に調整;カ
ラム#2は、200mM酢酸,1mMグリシン,20μM CuSO4,6M尿
素,NaOHでpH4.7に調整;カラム#3は、250mM酢酸,1mM
グリシン,20μM CuSO4,6M尿素,NaOHでpH4.7に調整;カ
ラム#4は、300mM酢酸,1mMグリシン,20μM CuSO4,6M尿
素,NaOHでpH4.7に調整;カラム#5は、150mM酢酸,1mM
グリシン,20μM CuSO4,6M尿素,カラム#6は、300mM酢
酸,1mMグリシン,20μM CuSO4,6M尿素で洗浄した。カラ
ムのpHは、各カラムをカラム容量の8から11倍の10mMト
リス−HCl,55mM NaCl,20μM CuSO4,pH7の緩衝液で洗浄
することにより約pH7に増加させた。限定したエリスロ
ポエチンイソフォーム混合物は、10mMトリス−HCl,140m
M NaCl,20μM CuSO4,pH7.0で洗浄することによりカラム
から溶出させた。
しアミコンセントリコーン−10微量濃縮装置を用いて溶
媒を水で置換した。これらの濃縮プールの分析用等電点
電気泳動の結果を図3に示す。ゲルレーン1−6は、そ
れぞれカラム1−6から溶出させた限定したエリスロポ
エチンイソフォーム混合物を表す。図3の右端のゲルレ
ーンに示される“イソフォーム混合物”は、前述した通
りにQ−セファロースカラムに供した細胞培地を表す。
このカラムを5mM酢酸,1mMグリシン,20μM CuSO4及び6M
尿素を含む溶液で洗浄し、エリスロポエチンイソフォー
ム混合物を、前述の手法を用いてカラムから溶出させ
た。分析用等電点電気泳動に先立ち、この溶出したイソ
フォーム混合物をさらに前述のLai等の手法により精製
した。
エリスロポエチンイソフォームの分画 他の手法に於ては、エリスロポエチンイソフォームは
pHが減少しイオン強度が増加する勾配を用いて分離す
る。濃縮した透析濾過エリスロポエチン含有培地を、約
40mgの全蛋白質/mlゲルの割合でQ−セファロースカラ
ムに供した。しかる後、カラムを、カラム容量の約2倍
の10mMトリス−HCl,pH7.0で、次にカラム容量の約10倍
の2mM酢酸/1mMグリシン/20μM CuSO4/6M尿素(pH約4.
8)で洗浄し、混入蛋白質及び約7未満のシアル酸残基
を有するエリスロポエチンイソフォームを取り除いた。
約8個から約12個のシアル酸を含むイソフォームを、約
2mM酢酸/6M尿素/1mMグリシン/20μM CuSO4から始まって
40mM酢酸/6M尿素/1mMグリシン/20μM CuSO4(pH約4)
までの勾配を用いてカラムから溶出させた。勾配の全容
量はカラム容量の約40倍であり、カラム容量とほぼ同量
の各フラクション(分画)を、集めたフラクションを長
時間低pHにさらすのを避けるためpHを6−8.5の範囲に
するのに十分な量のトリス緩衝液を含む容器に集めた。
フラクションの一部を分析用等電点電気泳動に供し分離
をモニターした。図4は、この手法により達成すること
ができるイソフォーム8−11の分離を示す。勾配を終え
た時点でカラムに結合したままのイソフォーム12−14を
10mMトリス−HCl,140mM NaCl,20μM CuSO4(pH7.0)か
ら成る緩衝液で洗浄することにより溶出した。Lai等の
実施例2に記載したように、逆相クロマトグラフィー、
続いてゲル濾過クロマトグラフィーにより、混入蛋白質
をイソフォーム(勾配中に分離又は塩化ナトリウム溶液
により溶出)から除去した。
スロポエチンの類似体 A.ヒトエリスロポエチン類似体の構築 エリスロポエチンのアミノ酸配列の既存及び計画の炭
水化物結合部位を図5に示し、これらの追加グリコシレ
ーション部位作出の手法を、図6A−C及び以下に示し
た。
突然変異用に合成した。
生型のアミノ酸と置き変わった不適正部分を示す。
部位を付加させるために構築した。[Asn9,Ser11]EPO
は、Asn9にN−グリコシレーション部位を付加させるた
めに構築した。[Asn69]EPOは、Asn69にN−グリコシ
レーション部位を付加させるために構築した。[As
n125,Ser127]EPOは、Asn125にN−グリコシレーション
部位を付加させるために構築した。[Thr125]EPO及び
[Pro124,Thr125]EPOは、Thr125にO−グリコシレーシ
ョン部位を付加させるために構築した。
突然変異用に合成した。
クレオチドプライマー5′ AGATCCGACCACCGCTGCTCCA
C 3′を用いて[Pro124,Thr125,Thr126]EPOを作出し
た。しかる後、オリゴヌクレオチドプライマー5′ TGC
TCCACTCACAACAATCACTG 3′を用いて[Pro124,Thr125,
Thr126,Thr131]EPOを作出した。[Asn69,Thr71]EPO及
び[Ser68,Asn69,Thr71]EPOはAsn69にN−グリコシレ
ーション部位を付加させ、この部位のN−グリコシレー
ションを促進するために構築した。[Asn125,Thr127]E
PO,[Asn125,Thr127,Thr131]EDO,[Pro124,Asn125,Ser
127]EPO及び[Pro124,Asn125,Thr127]EPOはAsn125に
N−グリコシレーション部位を付加させ、この部位のN
−グリコシレーションを増加させるために構築した。
[Thr125,Thr126]EPO,及び[Pro124,Thr125,Thr126,Se
r131]EPOはThr125にO−グリコシレーション部位を付
加させ、この部位のグリコシレーションを増加させるた
めに構築した。
は、pUC8中のヒトエリスロポエチンcDNAクローン、プラ
スミドHu13(Law等Proc Natl.Acad.Sci.83,6920(1986
年))である。Hu13から誘導されたプラスミドDNAは、B
etE II及びBgl II制限酵素で切断し、その結果できたDN
Aフラグメントをアガロースゲル電気泳動に供し、ジェ
ネクリーン(GeneClean、TM)キット及び製造元(BIO 1
01社)から供された手法を用いて810塩基対(bp)エリ
スロポエチンDNAフラグメントをゲルから分離した。プ
ラスミドpBRgHuEPOは前述のLin特許に記載があるよう導
体に挿入したBamH Iフラグメントのようなエリスロポイ
エチンゲノム遺伝子を含む。pBRgHuEPOは又BstE II及び
Bgl IIで消化し、6517bpベクターフラグメントを回収し
た。この2個のフラグメントの連結によってIGT1を得
た。pEC−1を構築するために、pDSVL(Lin特許に記載
があり、又図5Bに示す)をBamH Iで切断し、エリスロポ
エチンcDNAを含むIGT1から単離した2.8キロベース(k
b)BamH Iフラグメントをこれに連結した。
EC−1をBamH I及びBgl IIで切断し、820bpエリスロポ
エチンcDNAフラグメントを単離した。これをm13mp18のB
amH Iサイトに連結しm13−EC−1を作出した。Kunkel等
Methods in Enzymol.154,367(1987年)及びMessing,Me
thods in Enzymol.101,20(1983年)により記載されて
いる通りに、m13−EC−1に感染させた大腸菌RZ1032株
の上澄液から一本鎖DNAを回収した。インビトロ突然変
異のために、約1μgの一本鎖DNA及び0.2pmoleの前述
の合成プライマーの1種を6mlの緩衝液(250mMトリスpH
7.8,50mM MgCl2及び50mMジチオスレイトール)と混合し
た。鋳型にプライマーをアニーリングをするために、反
応容量を水で10μlに調整し、この混合液を65℃で5分
間加熱した後室温まで冷却した。鎖延長反応のために、
dTTP,dATP,dGTP,dCTP及びATP(全て10μM)の各2.5ml
を加え、引き続き1μl(1ユニット)大腸菌DNAポリ
メラーゼ(クレノウフラグメント)及び1μl(1ユニ
ット)のT4DNAリガーゼを加えた。しかる後、この混合
液を14℃で一晩保温し、前述のMessingのように大腸菌J
M109(Yanisch−Perron等Gene33,103(1985年))を形
質転換するために用いた。
ーション法による突然変異クローンを同定するために、
普通寒天培地上のプラークをジーンスクリーンフィルタ
ー(ニューイングランドヌクレアー社)に移した。この
フィルターを加熱灯で乾燥させた後、1%SDSを含む60
℃の6×SSC中で1時間保温した。ハイブリダイゼーシ
ョンのために、前記のオリゴヌクレオチドプライマー
(8pmoles)にT4ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ32P標
識ATPで末端標識し、フィルターと共に、[Asn124]突
然変異については37℃で、[Asn4,Ser6]突然変異につ
いては55℃で、[Thr125]及び[Pro124,Thr125]突然
変異については65℃で、及び[Asn9,Ser11]及び[Asn
163,Ser165]突然変異については70℃で6×SSC、0.5%
SDS及び100mg/mlサケ***DNA中で一晩保温した。翌
日、フィルターを室温にて6×SSCを用いて3回洗浄
し、オートラジオグラフィーに供した。必要に応じて、
この後、本来のエリスロポエチンcDNA配列を有するプラ
ークにハイブリダイセーションがほとんど又は全く検出
されなくなるまで、温度を上げてフィルターを6×SSC
で洗浄した。これらの条件下で陽性のハイブリダイセー
ションシグナルを示すクローンを同定し、JM109に再感
染させて純粋なクローンを単離した。ジデオキシチェイ
ンターミネーション配列分析は、アスパラギン、セリ
ン、スレオニン及びプロリン残基への突然変異が存在す
ることを示した。[Asn4,Ser6],[Asn9,Ser11],[A
sn69],[Asn124],[Asn125],[Ser127],[Asn
163,Ser165],[Thr125]及び[Pro124,Thr125]の変
化を担持する二重鎖m13 EC−1 DNAは、煮沸法(Holmes
等Anal.Biochem117,193(1981年)によりJM109形質転換
細胞から回収した。このDNAをBstE II及びXho IIで切断
し、810bpエリスロポイエチンDNAフラグメントを単離し
た。pEC−1は、Bst IIで切断し次にBgl IIで部分切断
し、その結果できたフラグメントの5′末端を、細菌ア
ルカリホスファターゼを用いて10mMトリス、pH8中で60
℃で60分間脱リン酸した。810bp BstE II−Bgl IIフラ
グメントを欠いた7kbベクターフラグメントを分離し、
上記のエリスロポエチンフラグメントに連結した。この
結果できたプラスミド(pEC−Xと命名、ここでXは個
々の突然変異を表す)は、示した位置で変更したアミノ
酸残基を有するヒトエリスロポエチンを含む。
9,Ser11],[Asn69],[Asn124],[Asn125,Se
r127],[Asn163,Ser165],[Thr125]及び[Pro124,
Thr125]エリスロポエチンcDNAクローンに対応する類似
体のcDNAクローンは、エレクトロポレーションによりCO
S−1細胞(ATCC No.CRL−1650)にトランスフェクトし
た。COS−1細胞は、半集密的皿から回収し、培地(5
%牛胎児血清及び1% L−グルタミン/ペニシリン/ス
トレプトマイシン(アービンサイエンティフィク社)を
含むダルベッコ(Dulbecoo)の改変必須培地)で洗浄
し、4×106cells/mlの密度で再懸濁させた。1mlの細胞
を、エレクトロポレーションキュベット(バイオラッド
社)に移し、100から200μgの担体DNA及びエリスロポ
エチン類似体をコードした2から20μgのプラスミドDN
Aの存在下、バイオラッドジーンパルサー(Bio−Rad Ge
ne Pulser、TM)を用いて、25マイクロファラッド及び1
600ボルトでエレクトロポレーションした。エレクトロ
ポレーションした細胞を、組織培養皿(直径60mm)当り
2×106個で5mlの培地中に接種した。接種の2から4時
間後、5mlの新鮮な培地で置き換えた。エレクトロポレ
ーションの3から5日後、ならし(conditioned)培地
を集めた。
ポエチン類似体のインビボ生物学的活性は、低酸素赤血
球増加症マウスバイオアッセイ(Cotes等、前述)によ
り測定した。
Physiol.83,309−320(1974年)により記載されている
赤芽球コロニー形成分析法を改変して測定した。ヒト骨
髄細胞由来の単核化細胞を、フィコール/パクークッシ
ョン(ficoll−paque cushion)上で部分精製した後、
プレーティングに先立ち吸着性細胞を除くためにIscove
の培地中で洗浄した。培養培地は、0.9%メチルセルロ
ースを含むが、牛血清アルブミンは含まなかった。培養
の8から10日後、赤芽球コロニーを計数した。
フェクトし発現したエリスロポエチン類似体は、RIA及
び赤芽球コロニー形アッセイにより、未精製のCOS細胞
上澄液中で分析した。ヒト由来配列のエリスロポエチン
は、前記の分析により決定したRIA活性に比するインビ
トロ活性を有した。類似体の[Asn69]EPO,[Asn125,Se
r127]EPO,[Thr125]EPO,及び[Pro124,Thr125]EPO
は、RIA活性に比するインビトロ活性を示し、(セクシ
ョンCで決定するように)追加炭水化物鎖を有すること
を証明した。これらの類似体は、エリスロポエチン類似
体をコードしているcDNAクローンをCHO細胞にトランス
フェクトし、エリスロポエチン類似体を精製し、精製類
似体のインビボ生物学的活性を測定することにより更に
分析した。
体cDNAでトランスフェクトしたCOS細胞から得た5−20U
を含む一定量の上澄液を、ウサギ抗エリスロポエチンポ
リクローナル抗体を用いて室温で一晩免疫沈降させた。
リン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解させたプロテインA−
セファロース1:1の20−80μlを免疫沈降物に加え、室
温で1時間保温した。この試料を遠心し、PBSで洗浄
し、特に指示する場合は、ペレットをN−グルカナーゼ
で処理しN−結合炭水化物鎖を除去した。この試料を15
%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
し、ニトロセルロースに移して、マウス抗エリスロポエ
チンモノクローナル抗体の混合物を用いて、Burnette等
Anal.Biochem.112,195−203(1981年)及びElliot等Gen
e79,167−180(1989年)に記載されている通りにウエス
タン分析に供した。このような抗体の一つとして9G8Aが
Elliot等(1989年)Blood74,Supp.1,A.1228に記載され
ている。
ンスフェクトしたCOS細胞上澄液の分析は、ヒト由来配
列のエリスロポエチンと比較して蛋白質のサイズが増加
していることを示した。このサイズの増加は、追加N−
結合炭水化物鎖を示唆している(図7)。[Thr125]EP
O,及び[Pro124,Thr125]EPO cDNAでトランスフェクト
したCOS細胞から得た上澄液のN−グリカナーゼを用い
た処理は、ヒト由来配列のエリスロポエチンと比較して
蛋白質のサイズが増加していることを示した。このサイ
ズの増加は、追加O−結合炭水化物鎖を示唆している
(図8)。
ンAの記載通りに構築した。[Thr125)突然変異を担持
する810bpのエリスロポエチンcDNAフラグメントは、[T
hr125]突然変異を含むプラスミドpECをBstE II及びBgl
IIで切断することにより単離し、pDS α2の誘導体で
あるpDECΔにこのフラグメントを連結した。pDS α2
は、参照により本明細書に含めた共通所有の米国特許出
願番号501,904に記載されている。pDEC Δは、以下の段
階によりpDS α2から誘導した: (1)pDS α2のHind III部位は、Hind IIIでpDS α2D
NAを切断し、大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノウフラグ
メント)及びdNTPsでHind III付着末端を処理し、ブラ
ントエンド化したベクターに再連結することによって欠
落させた。この結果できたプラスミドがpDS α2 ΔHで
ある。
イスシグナルの3′末端に付加したSal Iリンカーを含
むSV40スプライスシグナルを有する合成オリゴヌクレオ
チドに連結した。合成オリゴヌクレオチドは、以下の配
列を有した。
である。
Aポリメラーゼ及びdNTPsで付着末端を処理することによ
りブラントエンド化した。820bp.BamH I−Bgl IIヒトエ
リスロポエチンcDNAフラグメントは、同じ方法によりブ
ラントエンド化し、プラスミドに連結した。この結果で
きたプラスミドがpDECである。
(mungbean)ヌクレアーゼで付着末端を処理することに
よりブラントエンド化した。切り出したKpn I−Pvu II
フラグメントを欠落させるために再連結し、この結果で
きたプラスミドがpDECΔである。
ECΔをDHFR−欠損CHO細胞にトランスフェクトした。CHO
細胞でならした培地770mlを1万ダルトン分子量カット
オフのメンブレンを用いて濃縮し、10mMトリス−HCl,pH
8.6で最終容量34mlになるまで透析濾過した。濃縮液の
一部(17ml)を、同じ緩衝液で平衡化したQ−セファロ
ースファーストフローカラム(5mlベッドボリューム)
に供し、10mMトリス−HCl,pH8.6中のO−250mM NaClの
直線勾配によって溶出させた。カラムフラクションの一
部を、未処理で又はN−グリカナーゼで切断して、SDS
−PAGE又はIEFで分析し、プール(2,3及び4と命名)を
フラクションの炭水化物及び/又はイソフォームの組成
に基づいて集めた。各プールをビダク(Vydac)C4カラ
ム(214TPB2030;直径1cm;1.8−2.5mlベッドボリューム;
0.34ml/分)に供し、10mMトリス−HCl,pH7.0に溶解させ
た20%エタノールのカラム容量の2倍量で洗浄した。こ
のカラムを20−94%エタノールの10mMトリス−HCl,pH7.
0の直線勾配で溶出した。プールを集め、10mMトリス−H
Cl,pH7.0で希釈し、Q−セファロースファーストフロー
カラムに供した。10mMトリス−HCl,pH7.0で洗浄した
後、試料を20mMクエン酸ナトリウム、250mM NaCl,pH7.0
で溶出させた。精製した[Thr125]プールをIEFにより
分析し、図9に示した。EPO類似体は、前述(Cotes等、
前述)したようにインビボ生物学的活性を分析した。
したが、これらの態様に限定されるものではない。添付
のクレームの精神及び範囲に包含される変形物及び等価
物は本願発明に含まれるものであり、クレームの範囲は
このような変形物の及び等価物を全て含むように最も広
い解釈によるべきである。
Claims (8)
- 【請求項1】1分子当たり10、11、12、13または14個の
シアル酸数を有し、かつ、天然型ヒトエリスロポエチン
のアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製さ
れたエリスロポエチンイソフォーム。 - 【請求項2】ヒト以外の真核宿主細胞中での外来性DNA
配列の発現生成物である請求項1に記載のエリスロポエ
チンイソフォーム - 【請求項3】真核宿主細胞がCHO細胞である請求項2に
記載のエリスロポエチンイソフォーム。 - 【請求項4】請求項1〜3のいずれかに記載のエリスロ
ポエチンイソフォームの混合物。 - 【請求項5】シアル酸数11〜14又は12〜14のエリスロポ
エチンイソフォーム混合物である請求項4に記載の混合
物。 - 【請求項6】治療学上効果的な量の請求項1〜3のいず
れかに記載のエリスロポエチンイソフォーム又は請求項
4もしくは5に記載の混合物と、医薬的に許容可能な希
釈剤、アジュバント又は担体を含む、ヘマトクリットレ
ベルを増加させるための医薬組成物。 - 【請求項7】請求項1〜3のいずれかに記載のエリスロ
ポエチンイソフォームの製造方法であって、精製したエ
リスロポエチンを調製用等電点電気泳動に供し、1分子
当たりシアル酸数10、11、12、13または14の単一のイソ
フォームを該泳動ゲルより溶出させることからなる、前
記方法。 - 【請求項8】請求項4または5に記載のエリスロポエチ
ンイソフォーム混合物の製造方法であって、エリスロポ
エチンを含有する物質をイオン交換クロマトグラフィー
に供することからなる、前記方法。
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