JP4563573B2 - 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球には存在しておらず、シアリダーゼ感受性であり、分子量が約１１０ｘ１０^３の糖タンパク質である新規なＨＳＣＡ−２抗原、並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体ＨＳＣＡ−２（以下、ＨＳＣＡ−２抗体と称する）に関する。本発明のＨＳＣＡ−２抗体は、１）抗体の標識によりイムノアッセイ、フローサイトメトリーへの利用、２）ヒト血液からのＴ細胞及びＮＫ細胞の分離精製、３）ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化、４）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からの、メモリーＴ細胞の測定又は分離に活用できる。また、本発明の抗原に対する新たな抗体を作製することによって、Ｔ細胞の活性化を阻害する、自己免疫疾患の治療薬としての抗体を見い出すこともできる。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤ４３分子（ロイコシアリン、シアロホリン、ロイコサイトシアログリコプロテイン）は、顆粒球、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などに発現し、循環（休止期）Ｂ細胞や赤血球には発現していないことが知られている膜抗原で、Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的には発現していない。その分子構造は、３８５のアミノ酸からなるＩ型膜貫通性糖タンパク質で、細胞外領域には多量のシアル化されたムチン様のＯ型糖鎖が付着する（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）。
【０００３】
成熟Ｔ細胞の同定に用いられるＣＤ抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３などが挙げられる。全ＮＫ細胞の同定に用いられるＣＤ抗原としては、ＣＤ５６、ＣＤ９４などがある（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）。Ｔ細胞の活性化に関連するＣＤ抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ７３などがある（笹月健彦監訳、免疫生物学、南江堂（１９９５））。
【０００４】
既存のＣＤ４３抗体でＴ細胞の活性化は報告されているが（メンツァーら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６５：１３８３（１９８７））、既存の抗体は単球とも反応するので、ＣＤ４３抗体の活性が、抗原提示細胞である単球を活性化した結果であるか否かは説明できていない。
ＮＫ細胞の活性化に関連するＣＤ抗原としては、ＣＤ１６、ＣＤ４３、ＣＤ５７などがある（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）。
【０００５】
メモリーＴ細胞のマーカー抗原としては、ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ４５ＲＯ^＋、ナイーブＴ細胞の場合は、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ４５ＲＯ⁻であることが知られている（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）。これまでに、メモリーＴ細胞を認識するＣＤ４５ＲＯ抗体の代わりになる抗体は知られていないし、ましてや、このＣＤ４５ＲＯ抗体以上に精密に、メモリーＴ細胞を認識する抗体は知られていない。
ＣＤ３４^＋造血幹細胞に高陽性率で発現している抗原としては、ＣＤ４３、ＣＤ４４などがある（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球には存在していない新規なＨＳＣＡ−２抗原、並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体を、１）抗体の標識によりイムノアッセイ、フローサイトメトリーへの利用、２）ヒト血液からのＴ細胞及びＮＫ細胞の分離精製、３）ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化、４）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からの、メモリーＴ細胞の、従来法よりも精密な測定又は分離に活用することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＫＧ−１細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫することにより調製したモノクローナル抗体が、新規なＨＳＣＡ−２抗原を識別することを見い出し、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、本抗体が、上記目的を満たし得るものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞を認識し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球を認識しないモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントである。また、これらモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントが結合してなる固体支持体でもある。
【０００８】
また、本発明は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞を認識し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球を認識しないモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ、又は、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞で免役した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られることを特徴とするハイブリドーマでもある。
さらに、本発明は、シアリダーゼ感受性であり、分子量が約１１０ｘ１０^３の糖タンパク質であり、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球には存在していないＨＳＣＡ−２抗原でもある。
【０００９】
さらにまた、本発明は、蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識によるイムノアッセイ又はフローサイトメトリーにおいて、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、上記抗原を測定する方法でもある。
さらにまた、本発明は、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、ヒト血液からＴ細胞及びＮＫ細胞を分離精製する方法でもある。
【００１０】
さらに、本発明は、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化する方法でもある。
また、本発明は、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からメモリーＴ細胞を測定又は分離する方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明においては、特に記載のない限り、当該分野で公知であるモノクローナル抗体の作製及び分析方法が採用される。
以下に、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
「ＨＳＣＡ−２抗原」とは、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球には存在していない、シアリダーゼ感受性であり、分子量が約１１０ｘ１０^３の糖タンパク質である新規な抗原である。
【００１２】
また、「ＨＳＣＡ−２抗体」とは、上記ＨＳＣＡ−２抗原を識別するモノクローナル抗体である。ＨＳＣＡ−２抗体は、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。ＨＳＣＡ−２抗体は、ＣＤ４３分子の一部のエピトープを認識し、それを既存のＣＤ４３抗体で阻害することができる。したがって、ＨＳＣＡ−２抗原は、ＣＤ４３アイソフォーム抗原ということもできる。
【００１３】
「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、巨核球などの骨髄細胞のみならず、Ｔ細胞、Ｂ細胞などのリンパ系を含めた全ての血液系への分化能を有する多能性の細胞であって、自己増殖可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性でかつＣＤ３８抗原が陰性である（ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻；以下ＣＤ抗原の陽性、陰性の記載は同様にして表記する）ことにより特徴付けられる。
【００１４】
「メモリーＴ細胞」とは、一度ある特定の抗原に感作された生体は、同一抗原による刺激に対して強力な免疫応答を引き起こすが、この際に必要な免疫記憶を司るＴ細胞のことである。
【００１５】
以下、さらに本発明の詳細について説明する。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＫＧ−１細胞を感作抗原として使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常のクローン化法を応用して、クローン化することによって作製することができる。
【００１６】
より具体的には、ＫＧ−１細胞を感作抗原として使用して、非免疫哺乳動物として、ヒト以外のマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの腹腔内、皮下、フットパッドなどに投与する。細胞融合相手となるミエローマ細胞が、通常はマウス由来のものであるため、特にマウスを免疫することが好ましい。免疫は、一般的な方法により、例えば、前記ＫＧ−１細胞をＰＢＳ（−）（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．２）や生理食塩水などで適当量に希釈、懸濁したものを、動物に毎週、１〜２ヶ月投与することが好ましい。
【００１７】
非免疫動物から、脾臓細胞、リンパ球、末梢血などの抗体産生細胞を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作製する。抗体産生細胞としては、上記ＫＧ−１細胞を最終投与後に摘出した脾臓細胞を使用するのが好ましい。ミエローマ細胞としては、公知の細胞株、例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（略称ＮＳ−１細胞）（ケーラーら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１（１９７６））、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（略称ＳＰ２細胞）（シュルマンら、Ｎａｔｕｒｅ、２７６：２６９（１９７８））、ＦＯ細胞（デサントグロスら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３５：１（１９８０））などがよく用いられる。ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体の取得を容易にするために、ミエローマ細胞としての固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが望ましい。この点で、ＮＳ−１細胞が望ましい。
【００１８】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には、通常の方法、例えば世界で最初に実施したケーラーとミルシュタインの方法（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））に準じて行うことができる。
【００１９】
より具体的には、細胞融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で実施される。
細胞融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルスなどが用いられる。細胞融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞との所定量を、例えばミエローマ細胞に対して抗体産生細胞を約１〜１０倍程度、用いて行われる。細胞融合時の培地としては、ミエローマ細胞の増殖に適した培地、例えばＲＰＭＩ １６４０培地、が例示できる。このような培地中で両細胞を混合し、３７℃に保ったポリエチレングリコール（例えば、平均分子量１，０００〜６，０００のもの）溶液を培地に３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することで細胞融合を開始する。さらに、適当な培地を添加し、遠心分離による上清の除去を繰り返すことにより、目的とするハイブリドーマが得られる。
【００２０】
このハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ培地で培養することにより選択される。ＨＡＴ培地では、目的のハイブリドーマ以外の細胞が死滅するまで数日間〜数週間培養する。ハイブリドーマのコロニーが確認できるようになったら、その培養上清中の抗体をスクリーニングする。培養上清中の抗体のスクリーニングは、例えば、固定した細胞を抗原とするエライザ（ＥＬＩＳＡ）法により培養上清中の抗体活性を測定することにより実施できる（安東民衛ら、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィック（１９９３）ｐｐ．１２６）。これによりスクリーニングした目的の抗体を産生するハイブリドーマは、常法により限界希釈法を繰り返すことにより、最終的に単一のハイブリドーマクローンからなるコロニーとして得ることができる。
【００２１】
こうして得られる本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常のハイブリドーマと同様に、公知の培地、例えば、ＲＰＭＩ １６４０や、ダルベッコ改変培地で、培養、継代できる。また、液体窒素中で長期間保存することもできる。
【００２２】
本発明のハイブリドーマを大量に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ １６４０培地で培養することにより、本発明のモノクローナル抗体を培養上清から調製することもできる。また、マウスの腹腔にハイブリドーマを注射して生じた腹水から、本発明のモノクローナル抗体を調製することもできる。
【００２３】
こうして調製したモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。抗体の精製方法としては、硫酸アンモニウムなどによる塩析、ジエチルアミノエステル（ＤＥＡＥ）誘導体及びカルボキシメチル（ＣＭ）誘導体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、プロテインＡ又はプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法があり、これらの方法を組み合わせて精製することができる。
【００２４】
上記のようにして得られる本発明のモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは、特に限定されるものではないが、ＩｇＧ１、カッパ鎖が例示される。
【００２５】
また、本発明のモノクローナル抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないタンパク質分解酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで消化し、さらに、タンパク質の単離精製を常法により行い得られた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）_２などの、抗体の免疫反応性フラグメントであっても、本発明のモノクローナル抗体と同様の性質を保持する限り、本発明のモノクローナル抗体と同様に使用することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体を抗原と反応させた後、さらに２次抗体として、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識物質、^１２５Ｉなどの放射性同位元素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素によって標識した免疫グロブリンを反応させることにより、抗原を検出することができる。また、本発明のモノクローナル抗体そのものを、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識物質、^１２５Ｉなどの放射性同位元素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素によって標識することにより、抗原を検出することもできる。
【００２７】
また、本発明のモノクローナル抗体を固体支持体（例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧを固定化したセファロースやアガロースなどの樹脂、又は、臭化シアン活性化セファロースやアガロースなどの樹脂）に固定化することにより、細胞分離用カラムを作製することができる。このカラムへ、ヒト血液を流してやると、Ｔ細胞及びＮＫ細胞はカラムに吸着したままになるので、血中の他の細胞と分離することができる。
【００２８】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化することができる。従って、ツベルクリンタンパク質（ＰＰＤ）を加えたヒト末梢血単球細胞を、ヒト血清（５６℃で３０分間処理したもの）を１０％含んだＲＰＭＩ １６４０存在下で培養し、そこにＨＳＣＡ−２抗体を添加することにより、ＨＳＣＡ−２抗体はＰＰＤ抗原に対するトリチウムチミジンの取り込み反応を促進できる。
【００２９】
また、本発明のモノクローナル抗体を用いて、驚くべきことに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞から、従来法よりも効率的に、メモリーＴ細胞を測定又は分離することができる。すなわち、臍帯血又は成人末梢血単核球細胞にＣＤ４及びＣＤ８抗体処理を行い、ＦＡＣＳｔａｒなどでＣＤ４^＋細胞及びＣＤ８^＋細胞を分取する。このようにして調製した臍帯血又は成人末梢血Ｔ細胞を、ＦＩＴＣ標識したＨＳＣＡ−２抗体及びＰＥ標識したＣＤ４５ＲＯ抗体で処理した後、ＦＡＣＳｃａｎなどで解析、又は、ＦＡＣＳｔａｒなどで分離することにより、ＨＳＣＡ−２^Ｈｉｇｈ画分のみにメモリー活性が検出できることを確認できる。メモリー活性の検出は、前述のＴ細胞活性化測定（ヒト末梢血単球細胞にツベルクリンタンパク質を加えた系）で行うことができる。
【００３０】
従来のＣＤ４５ＲＯ抗体を用いたメモリーＴ細胞の検出方法では、ＣＤ４５ＲＯ^＋ＨＳＣＡ−２^Ｌｏｗの画分及びＣＤ４５ＲＯ^＋ＨＳＣＡ−２⁻の画分も一緒に検出することになるので、本発明のＨＳＣＡ−２抗体を用いた方法のほうが、より精密に、認識できるという点で優れている。本発明のＨＳＣＡ−２抗体を用いたメモリーＴ細胞の検出方法は、種々の診断、検査に利用できる。
【００３１】
また、本発明のＨＳＣＡ−２抗体を用いたメモリーＴ細胞の分離により、種々の免疫関連疾患の治療効果が期待できる。例えば、アレルギーを引き起こす原因となっているメモリーＴ細胞を除去することにより、アレルギーを根治することも期待できる。逆に、本発明のＨＳＣＡ−２抗体を用いたメモリーＴ細胞の分離により、自己の造血幹細胞移植時に、ＨＳＣＡ−２抗体を用い分離したメモリーＴ細胞を一緒に戻してやることにより、以前の自己の免疫系に近い免疫系を構築してやることも期待できる。
【００３２】
本発明のＨＳＣＡ−２抗原に対する新たな抗体を、常法通り作製し、Ｔ細胞の活性化を阻害する抗体を見い出すこともできる。このような抗体は、自己抗体又は自己抗原感作リンパ球によって引き起こされる自己免疫疾患の治療薬になり得る。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明におけるＨＳＣＡ−２抗原（ＣＤ４３アイソフォーム抗原）及びこの抗原を識別するモノクローナル抗体についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１：ＨＳＣＡ−２抗体産生ハイブリドーマの調製、及び、ＨＳＣＡ−２抗体の産生）
（ａ）感作抗原
感作抗原として、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）を用いた。ＫＧ−１細胞培養を、細胞１．０×１０^５／ｍｌの濃度になるように、１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ １６４０培地（株式会社日研生物医学研究所製）１５ｍｌに懸濁し、カルチャーディッシュ（グライナー社製）（直径１０ｃｍ）に入れ、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で培養を行った。培養４〜５日目に、細胞を４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離して回収し、ＰＢＳ（−）（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．２；株式会社日研生物医学研究所製）で２回洗浄した後、１．０×１０^７個の細胞を２００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁した。これを感作抗原として用いた。
【００３５】
（ｂ）免疫
免疫するマウスは、ＢＡＬＢ／ｃのメス（８週齢）を用いた。上述のＫＧ−１細胞を感作抗原としてマウスに皮下注射した。以後、同様の細胞（１．０×１０^７個）を１０日目、１６日目、２３日目、そして３０日目に皮下注射し、最終免疫として、３７日目に同様の細胞（１．０×１０^７個）を腹腔内に注射した。
【００３６】
（ｃ）ハイブリドーマの調製
最終免疫から４日後すなわち最初の免疫から４１日目に、マウスから脾臓を摘出し、ＰＢＳ（−）を入れたディッシュに入れ、スライドグラス２枚のすりガラス部分を用いて、脾臓をつぶし、脾臓細胞を回収した。細胞をチューブに入れ、４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。
【００３７】
これに対し、融合相手のＸ６３細胞由来の骨髄腫細胞であるＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（略称ＮＳ−１細胞）を以下のように調製した。ＮＳ−１細胞培養を、細胞１．０×１０^５／ｍｌの濃度になるように、１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ １６４０培地（株式会社日研生物医学研究所製）１５ｍｌに懸濁し、カルチャーディッシュ（直径１０ｃｍ）に入れ、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で培養を行った。培養４〜５日目に細胞を、４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離して回収した。
【００３８】
次に、脾臓細胞及びＮＳ−１細胞をそれぞれＲＰＭＩ １６４０培地３０ｍｌで３回洗浄した後、脾臓細胞（合計２．８９×１０^８個）及びＮＳ−１細胞（合計８．０７×１０^７個）を混合した。ＲＰＭＩ １６４０培地を加え、１０ｍｌにし、ガラスチューブに入れ、４℃、１，５００回転／分で１０分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＥＧ溶液［ポリエチレングリコール４，０００をＰＢＳ（−）に溶解して５０％にしたもの（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍｌ＋ジメチルスルフォキシド０．１ｍｌ＋ＲＰＭＩ １６４０培地０．１ｍｌ］１ｍｌをガラスチューブに１分間かけて加え、１分間攪拌し、次にＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌを１分間かけて加え、さらに、ＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌを１分間かけて加え、最後に、ＲＰＭＩ １６４０培地７ｍｌを３分間かけて加え、１，０００回転／分、１０分間室温で遠心分離し、上清を完全に除去した。
【００３９】
こうして得られたペレットをほぐして、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を適量入れて、細胞濃度を１×１０^７個／ｍｌにした。この細胞を９６ウェル平底プレート（コーニング社製）に、１００μｌ／ウェルまいた。その翌日に、５０倍濃縮ヒポキサンチン＋アミノプテリン＋チミジン（ＨＡＴ）溶液（大日本製薬社製）を１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で希釈して２％にしたもの（ＨＡＴ２％溶液）を１００μｌ／ウェル加え、さらにその翌日、そのうち１００μｌを上記のＨＡＴ２％溶液１００μｌに交換した。同様にして、細胞融合の日から３、５、８、１１、１４日目に、ウェル中の１００μｌを上記のＨＡＴ２％溶液１００μｌに交換した。次に、下記のエライザ（ＥＬＩＳＡ）法により培養上清中の抗体活性を測定した。
【００４０】
（ｄ）エライザ法を用いた抗体アッセイ
以下に示すポリ−Ｌ−リジン処理エライザ用９６ウェルプレートを準備した。エライザ用９６ウェルプレートとしてＥＩＡ／ＲＩＡ高結合型平底プレート（コースター社製）を用い、ポリ−Ｌ−リジン溶液（５０μｇ／ｍｌ）５０μｌをプレートの各ウェルに入れた。プレートミキサーで攪拌後、室温で５〜３０分間放置し、ポリ−Ｌ−リジン溶液を吸引除去した。さらに、洗浄のために、滅菌超純水１００μｌをプレートの各ウェルに入れ、吸引除去した。この洗浄操作はさらに２回繰り返し、クリーンベンチ内にプレートを放置して乾燥させた。こうしてポリ−Ｌ−リジン処理エライザ用９６ウェルプレートを準備した。
【００４１】
次に、免疫原に用いたＫＧ−１細胞（４．８×１０^６個／９６ウェルプレート）をアールの緩衝塩類溶液（ＥＢＳＳ）（株式会社日研生物医学研究所製）で３回洗浄し、ＰＢＳ（−）で１×１０^６個／ｍｌの細胞濃度として、上記のプレートの各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で１５分間放置して、細胞が底面に接着するのを待ち、８００回転／分で遠心分離した。上清を吸引除去後、０．０５％のグルタルアルデヒド−ＰＢＳ（−）を５０μｌずつ静かに各ウェルに入れ、室温で３分間放置した後、ＰＢＳ（−）１００μｌを各ウェルに入れ、吸引除去した。さらに、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ブロッキング溶液（０．２％ゼラチン、０．１％ＢＳＡ、１００ｍＭグリシン、０．１％アジ化ナトリウム添加ＰＢＳ（−））１００μｌを各ウェルに入れ、吸引除去した。もう一度、ブロッキング溶液１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１時間静置した後、吸引除去し、ハイブリドーマの培養上清１００μｌを各ウェルに入れ、室温で２時間以上反応させた。ウェルを０．１％ゼラチン添加ＰＢＳ（−）−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１５０μｌで３回洗浄した。
【００４２】
次に、１，５００倍希釈したヤギＩｇＧ抗体（マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭに対する抗体；カッぺル社製）１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１時間以上反応させた。ここでウェルを０．１％ゼラチン添加ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１５０μｌで３回洗浄した。オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）−過酸化水素溶液（０．３％ＯＰＤ、０．０２％過酸化水素を０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したもの）１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１０分間放置し、発色を確認後、１Ｎ硫酸−２ｍＭアジ化ナトリウム溶液１００μｌをさらにウェルに加え、攪拌した。最後に、４９２ｎｍの波長の吸光度（ＯＤ４９２）をプレートリーダー（大日本製薬社製）で読み、発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。本実験の陽性対照として、ＫＧ−１細胞を免疫したマウスの脾臓細胞採取前の血清をＰＢＳ（−）で５００倍希釈した溶液を用い、陰性対照として、通常のマウスの血清をＰＢＳ（−）で５００倍希釈した溶液を用いた。ＨＳＣＡ−２抗体の培養上清のＯＤ４９２は、０．１３７、陰性対照のＯＤ４９２は０．０２６、陽性対照のＯＤ４９２は０．５４４であった。
【００４３】
（ｅ）シングルセルクローニング
上記実施例１（ｄ）で得られたＫＧ−１細胞結合活性を有するモノクローナル抗体ＨＳＣＡ−２を、限界希釈法によりシングルセルクローニングした。すなわち、ハイブリドーマが１個／ウェルとなるように、クローニング培地［１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に５％（ｗ／ｗ）の濃度になるようにブライクローン（大日本製薬社製）を添加したもの］に懸濁し、その懸濁液を１００μｌずつ、胸腺細胞をフィーダー細胞としてまいた９６ウェル平底プレート（コーニング社製）に分注して、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。
【００４４】
フィーダー細胞の調製の仕方は、以下のようにした。ＢＡＬＢ／ｃマウスから、胸腺を摘出し、ピペッティングで細胞をばらばらにして、ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）を含む１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。その細胞濃度を５×１０^６個／ｍｌに合わせ、１００μｌずつ各ウェルに分注した。
【００４５】
約２週間後に、ウェル当たり１個のハイブリドーマが生育している培養上清を１００μｌ回収して、抗体活性の有無を上記（ｄ）エライザ法を用いた抗体アッセイにて調べた。こうして陽性クローンに対して、上記と同様のシングルセルクローニングを合計５回行い、抗体産生が安定でかつ完全にＨＳＣＡ−２抗体を産生しているハイブリドーマクローンを得た。このＨＳＣＡ−２抗体産生ハイブリドーマは、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＨＳＣＡ−２として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８８である。
【００４６】
（ｆ）ＨＳＣＡ−２抗体の大量調製と精製
ＨＳＣＡ−２抗体を大量調製するために、ハイブリドーマをマウス腹腔に注射して、ＨＳＣＡ−２抗体を大量に含む腹水を調製した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０^７個／ＰＢＳ（−）１ｍｌのＨＳＣＡ−２ハイブリドーマを腹腔内に注射し、１〜２週間でマウスの腹部が肥大し、腹水が最大に達した頃に、腹水８．０ｍｌを採取した。これに等量のＰＢＳ（−）８．０ｍｌを加えた後、さらに等量のＳＡＳ溶液（７５ｇの硫酸アンモニウムを１００ｍｌの純水に５０℃に温めて溶かし、４℃に１晩放置して、過剰の硫酸アンモニウムを沈殿除去して、上清を使用した）１６．０ｍｌを添加し、氷中３０〜６０分放置した。１０，０００回転／分、１０分間、４℃で遠心分離後、沈殿にＰＢＳ（−）４．２ｍｌを加え懸濁し、ＳＡＳ溶液１．０５ｍｌも加え、氷中３０〜６０分放置した。１０，０００回転／分、１０分間、４℃で遠心分離した後、上清にＳＡＳ溶液２．３５ｍｌ加え（３３％飽和）、氷中３０〜６０分放置した。１０，０００回転／分、１０分間、４℃で遠心分離した後、沈殿を回収し、４ｍｌＰＢＳ（−）に溶解した。さらに、４℃にて、３ＬのＰＢＳ（−）に対して透析した。
【００４７】
この硫安分画法で精製した５２．４ｍｇ（／４ｍｌ）中、約１０ｍｇを使用して、プロテインＧセファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社製）２ｍｌでさらに精製した。プロテインＧセファロースカラムをバインディングバッファー（ＭＡＰＳＩＩキット；日本バイオラッドラボラトリーズ社製）１０ｍｌで平衡化した後、抗体サンプルをカラムにアプライし、３０ｍｌバインディングバッファーで洗浄した。カラムからの溶出は、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１０ｍｌで行った。クーマシーブリリアントブルー法のキット（日本バイオラッドラボラトリーズ社製）で回収した抗体溶液のタンパク質濃度を測定すると、１．２０ｍｇ／ｍｌで、合計１０．８ｍｇであった。
【００４８】
（実施例２：抗体のサブクラスの決定）
エライザ法により、ＨＳＣＡ−２抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスを決定した。そのために、マウスハイブリドーマサブタイピングキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。抗マウス免疫グロブリン（ヒツジ由来）をコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液／０．０１％アジ化ナトリウム（ｐＨ９．４−９．７））で５００倍に希釈し、９６平底プレートウェル当たり５０μｌを入れ、３７℃で３０分間放置し、洗浄溶液（０．９％塩化ナトリウム／０．１％ツイーン２０）２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。後コーティング緩衝液（ゼラチンの分解により得られたペプチドをトリス塩酸緩衝液と塩化ナトリウムで溶解したもの）２００μｌ／ウェルで、３７℃で１５分間放置した後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。
【００４９】
次に、ＨＳＣＡ−２抗体の培養上清を５０μｌ／ウェルアプライし、３７℃で３０分間放置した後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。さらに、サブクラス特異的抗マウス免疫グロブリン−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）コンジュゲート（抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ラムダ鎖及びカッパ鎖）を１０倍希釈して、５０μｌ／ウェルアプライし、３７℃で３０分間放置した後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。基質溶液［２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）タブレット１個を５ｍｌの基質緩衝液（過ほう酸塩をクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液に溶解）に溶解した］１００μｌ／ウェルアプライし、室温で３０分以内反応させた。陽性対照サンプル（抗マウスＩｇＧ１）が濃い緑色を呈したら、４ｍＭアジ化ナトリウム溶液１００μｌ／ウェル加えて、反応を停止させた。プレート各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｕ２０００；日立製作所製）で測定した。
【００５０】
結果は、陽性対照サンプルの抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は１．４２２、抗マウスＩｇＧ１では２．５２５、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０８７、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０４９、抗マウスＩｇＧ３では０．０６３、抗マウスＩｇＭでは０．０６４、抗マウスＩｇＡでは０．０５７、ラムダ鎖では０．０７７、カッパ鎖では０．５７２であった。それに対して、陰性対照サンプルの抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は０．１０９、抗マウスＩｇＧ１では０．１２６、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０９３、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０５２、抗マウスＩｇＧ３では０．０６０、抗マウスＩｇＭでは０．０７９、抗マウスＩｇＡでは０．０６１、ラムダ鎖では０．０５８、カッパ鎖では０．１２２であった。ＨＳＣＡ−２抗体の抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は１．６５３、抗マウスＩｇＧ１では２．５６４、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０９１、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０４８、抗マウスＩｇＧ３では０．０５６、抗マウスＩｇＭでは０．０６１、抗マウスＩｇＡでは０．０５５、ラムダ鎖では０．０６４、カッパ鎖では０．２６１であった。すなわち、ＨＳＣＡ−２抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスは、ＩｇＧ１であり、軽鎖（Ｌ鎖）のタイプは、カッパ鎖であった。
【００５１】
（実施例３：ＨＳＣＡ−２抗体反応抗原の免疫沈降による解析）
１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で培養した、対数増殖期にあるＫＧ−１細胞を５．０×１０^７個集めて、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。ヒト末梢血単核球細胞もＫＧ−１細胞と同様にして実施した。ヒト末梢血単核球細胞は、以下のように調製した。すなわち、１５ｍｌポリプロピレン製チューブ（コーニング社製）にヘパリンナトリウム注射液（１０，０００Ｕ／ｍｌ）０．０５ｍｌを入れ、そこに採血したばかりの末梢血４ｍｌを加え、さらにＰＢＳ（−）／Ｈ［ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１，０００Ｕ／ｍｌ）を加えた］を５ｍｌ加え、よく混ぜた。そこに、リンフォサイトセパレーションメディウム（オルガノンテクニカ社製）３．５ｍｌをチューブ底に入れて、４００Ｇで３０分間、遠心分離した。ここで、単核球細胞層を集め、ＰＢＳ（−）／ＨＦ［ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び２．５％ＦＣＳを加えた］を１５ｍｌポリプロピレン製チューブに加えて１５ｍｌにして、５１０Ｇで１０分間、遠心分離した。沈殿にＰＢＳ（−）／ＨＦ１５ｍｌを加えて懸濁し、２４０Ｇで１０分間、遠心分離した。今度は沈殿に１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ １６４０に懸濁し、細胞数を約１×１０^７個／ｍｌにした。次に、１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ファルコン社製）に細胞のペレットを集め、そこに１５０μｌＰＢＳ（−）を入れて懸濁し、氷上に放置した。これは使用前に３０℃のインキュベーターで３０℃にした。
【００５２】
これをラクトペルオキシダーゼ（シグマ社製；ＰＢＳ（−）に溶解して、２ｍｇ／ｍｌにした）５０μｌと、０．５Ｍリン酸緩衝液［０．５Ｍリン酸二水素ナトリウム溶液１．９５ｍｌに対して、０．５Ｍリン酸水素二ナトリウム約３〜４ｍｌを加え、ｐＨ７．０にした］１０μｌを入れ、さらに、ヨウ化ナトリウム−１２５（ＮＥＮ社製；低ｐＨ、全２ｍＣｉ）約１ｍＣｉ分を入れ、速やかに、過酸化水素水（３０％過酸化水素水をＰＢＳ（−）で１，０００倍希釈した）２０μｌを加えて混合し、３０℃で、４分間インキュベーションした。そこに再度、過酸化水素水（３０％過酸化水素水をＰＢＳ（−）で１，０００倍希釈した）２０μｌを加え、混合し、室温で、１０分間放置した。次に、４℃に冷やした洗浄緩衝液（０．０２％アジ化ナトリウム／２ｍＭヨウ化カリウム／ＰＢＳ（−））５ｍｌを加え、１，５００回転／分で、７分間、室温で遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。遠心分離用のチューブに、牛胎児血清２ｍｌを入れて、その上に、洗浄緩衝液１ｍｌに懸濁した細胞懸濁液を静かに上層し、１，５００回転／分で１０分間遠心分離した。これを洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【００５３】
このヨウ化ナトリウム−１２５ラベルした細胞の遠心分離ペレットに、０．５ｍｌノニデットＰ（ＮＰ）−４０緩衝液（ＮＰ−４０ １ｇ、トリス塩酸０．１２ｇ、食塩０．８７ｇ、アジ化ナトリウム０．０２ｇに蒸留水８０ｍｌを入れて、塩酸でｐＨを７．２に調製し、１００ｍｌに合わせた）を入れて、ボルテックスミキサーで混合した（氷上で１５分間放置）。１３，５００回転／分で２０分間遠心分離し、上清を回収した。このヨウ化ナトリウム−１２５ラベルしたＫＧ−１細胞の抽出液を８０μｌ（／全量５００μｌ）取り、モノクローナル抗体ＨＳＣＡ−２を１．５μｇ、対照のＭＯＰＣ２１及びＣＤ４３抗体（ＤＦＴ１）も１．５μｇ用い、上記抽出液に加え、氷上で３０分間放置した。一方、プロテインＧ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社製）をＮＰ−４０緩衝液で３回洗浄した後、プロテインＧ−セファロース１０ｍｌに対してＮＰ−４０緩衝液１０ｍｌを加え、このうち２０μｌを、上記抗体を添加したＫＧ−１細胞の抽出液に添加して、氷上で２時間インキュベーションした。ＮＰ−４０緩衝液１ｍｌを加えて、１０，０００回転／分で３分間遠心分離して、上清を除去し、さらにこれを４回繰り返し洗浄した。
【００５４】
これにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプル溶解緩衝液（１５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、１４％グリセロール）３０μｌを加え、このうち１５μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％ポリアクリルアミドゲル）を作製し、上述のサンプル１５μｌをアプライした。レーン１には、ＨＳＣＡ−２抗体を添加したものをアプライし、レーン２には、ＣＤ４３（ＤＦＴ１）抗体を添加したものをアプライした。レーン３には、ネガティブ対照のＭＯＰＣ２１を添加したものをアプライした。１００ボルト一定電圧下、１時間電気泳動後、ゲルを５０％トリクロロ酢酸で３０分間固定化した後、蒸留水で３０分間ずつ、合計３回洗浄した。スタンダードタンパク質の電気泳動位置を確認し、ゲルをゲル乾燥機で乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。結果は、図１に示した。
【００５５】
左のオートラジオグラフィー図は、ＫＧ−１細胞を用いて細胞表面抗原の^１２５Ｉ標識を行ったもの、右のオートラジオグラフィー図は、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を用いて細胞表面抗原の^１２５Ｉ標識を行ったものである。それぞれ、左のレーンは、ＨＳＣＡ−２抗体を用いたときの、^１２５Ｉ標識細胞表面抗原及びプロテインＧ−セファロースと結合して沈降した抗原の分子量、真ん中のレーンはＨＳＣＡ−２抗体の代わりにＣＤ４３（ＤＦＴ１）抗体、右のレーンはネガティブ対照のＭＯＰＣ２１を用いた結果を示した。
【００５６】
ＫＧ−１細胞もヒト末梢血単核球細胞もともに、ＨＳＣＡ−２抗体は、分子量が約１１０ｘ１０^３のタンパク質分子を沈降させたが、既存のＣＤ４３抗体は、分子量が約１１０ｘ１０^３＋１１５ｘ１０^３の分子を沈降させた。このことより、本発明のＨＳＣＡ−２抗体は、ＣＤ４３分子群（アイソフォーム）の内、分子量が約１１０ｘ１０^３のアイソフォームを認識することがわかった。ＨＳＣＡ−２抗原は、シアリダーゼ処理（０．０１ユニット以上で、３７℃、３０分間）に感受性であることも示されているので、分子量が約１１０ｘ１０^３の分子に特異的なシアロ糖鎖を認識している。
【００５７】
（実施例４：ＨＳＣＡ−２抗体のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識）
ＦＩＴＣ全量（１００μｇ、シグマ社製）を炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ炭酸水素ナトリウムに０．５Ｍ炭酸ナトリウムを加えてｐＨ９．５にしたもの）０．０９ｍｌに溶解した。それにＨＳＣＡ−２抗体を０．８３ｍｌ（１．０ｍｇ）加え、室温で１．５時間攪拌を続けた。この溶液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）にアプライして、抗体タンパク質に結合していない遊離したＦＩＴＣを除去した。抗体−ＦＩＴＣ画分をＰＢＳ（−）／０．０２％アジ化ナトリウム１Ｌに対して３回透析した後、分光光度計（日立製作所製；Ｕ２０００）で２８０ｎｍ（ＯＤ２８０＝ｘ）と４９５ｎｍ（ＯＤ４９５＝ｙ）を測定し、抗体タンパク質濃度（Ｐ）とＦＩＴＣ結合量（Ｆ）から、Ｆ／Ｐ比率＝２．７ｙ／ｘ−０．３ｙを算出した。測定結果は、ＯＤ２８０＝ｘ＝０．５５６５、ＯＤ４９５＝ｙ＝０．４６０７で、Ｆ／Ｐ比率＝２．９７となった。こうして、ＨＳＣＡ−２抗体のＦＩＴＣ標識標品（ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体）は３９８μｇ／ｍｌ得られた。
【００５８】
（実施例５：ＨＳＣＡ−２抗体の各種株化細胞表面抗原認識）
種々の株化細胞２×１０^６個をＰＢＳ（−）（ＦＣＳ １％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体０．５μｇを加えて攪拌した後、氷上で３０分間放置した。陰性対照として、マウスイムノグロブリンＧ１−ＦＩＴＣ抗体を同様にして処理した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。染色された細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析（フローサイトメトリー）した。
【００５９】
実験に供した株化細胞は、（１）ＫＧ−１、（２）ＫＵ８１２、（３）ＫＵ８１２（ＣＤ３４^＋）、（４）ＨＥＬ、（５）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２^＋ＣＤ３４⁻）、（６）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２⁻ＣＤ３４^＋）、（７）ＭＯＬＴ１４、（８）ＭＯＬＴ４、（９）ＲＡＪＩ、（１０）ＮＡＬＭ６、（１１）ＤＡＵＤＩ、（１２）Ｋ５６２、（１３）ＴＨＰ−１、（１４）ＨＬ６０、（１５）Ｕ９３７、（１６）ＮＳ−１であった。
【００６０】
励起波長４８８ｎｍ、最大蛍光波長５３０ｎｍでの測定（ＦＬ１）結果は、マウスイムノグロブリンＧ１−ＦＩＴＣ抗体の平均値（Ａ）とＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の平均値（Ｂ）を併記する（Ａ：Ｂ）と、
（１）ＫＧ−１＝１２．７３：１０７６．０４、
（２）ＫＵ８１２＝１７．９１：２９８．０８、
（３）ＫＵ８１２（ＣＤ３４^＋）＝２０．４５：４２７．４８、
（４）ＨＥＬ＝１６．９６：２６０．４８、
（５）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２^＋ＣＤ３４⁻）＝１１．７０：２３８．８２、
（６）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２⁻ＣＤ３４^＋）＝１０．７０：５４．０２、
（７）ＭＯＬＴ１４＝７．００：４８．９９、
（８）ＭＯＬＴ４＝１０．０５：７０．５１、
（９）ＲＡＪＩ＝２５．２１：５３１．８４、
（１０）ＮＡＬＭ６＝５．２３：１０４．５４、
（１１）ＤＡＵＤＩ＝７．９８：１１．２８、
（１２）Ｋ５６２＝２０．９１：５７１．５４、
（１３）ＴＨＰ−１＝３０．２８：４５６．８９、
（１４）ＨＬ６０＝１２．１６：１１８．６０、
（１５）Ｕ９３７＝１１．８０：２０１．５８、
（１６）ＮＳ−１＝２３．８２：２９．３２であった。すなわち、ＤＡＵＤＩとマウスの株化細胞であるＮＳ−１以外とよく反応した。
【００６１】
（実施例６：ヒトリンパ球サブセットにおけるＨＳＣＡ−２抗原の発現）
末梢血単核球細胞は、実施例３に示したように調製した。調製した末梢血単核球細胞を約１×１０^５個ずつ、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）に懸濁した。これにＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体を０．１μｇずつ添加し、さらに、ＰＥ標識したモノクローナル抗体である、ＣＤ４−ＰＥ抗体、ＣＤ８−ＰＥ抗体、ＣＤ１９−ＰＥ抗体、ＣＤ５６−ＰＥ抗体をそれぞれ０．１μｇずつ添加し、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回細胞を洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析した。結果は、図２に示した。
【００６２】
ヒト末梢血単核球細胞をそれぞれの抗体で処理した結果を示している。４つのフローサイトメトリー図において、縦軸はそれぞれ、ＣＤ４−ＰＥ抗体、ＣＤ１９−ＰＥ抗体、ＣＤ８−ＰＥ抗体及びＣＤ５６−ＰＥ抗体の蛍光強度、横軸はＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度を示した。ドットは細胞を示している。十字の線は、ヒト末梢血単核球細胞をマウス免疫グロブリンＧ１−ＦＩＴＣ抗体及びマウス免疫グロブリンＧ１−ＰＥ抗体で処理して得られたフローサイトメトリー図に引いた縦軸と横軸の、それぞれの陽性陰性を区分する線を示している。
【００６３】
左上のフローサイトメトリー図で図の見方を説明すると、右下の象限は、ＨＳＣＡ−２^＋ＣＤ４⁻を示し、全体の細胞の４５．７％の細胞が存在することを示し、右上の象限は、ＨＳＣＡ−２^＋ＣＤ４^＋を示し、全体の細胞の３１．９％の細胞が存在することを示し、左上の象限は、ＨＳＣＡ−２⁻ＣＤ４＋を示し、全体の細胞の２．１％の細胞が存在することを示し、そして左下の象限は、ＨＳＣＡ−２⁻ＣＤ４⁻を示す。ＨＳＣＡ−２抗体はほとんどのＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞とは反応したが、Ｂ細胞とは反応しなかった。
【００６４】
末梢血単核球細胞の代わりに、エプシュタインバー（ＥＶ）ウイルスでトランスフォームしたＢ細胞を使って、上記の方法でＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体、ＣＤ１９−ＰＥ抗体処理したところ、今度はＢ細胞と反応した。これらヒトリンパ球との反応性は既存のＣＤ４３抗体を用いたときと同一の反応結果であった。
【００６５】
（実施例７：各ＣＤ４３抗体による抗原結合性の競争的阻害（フローサイトメトリーによる解析））
ＫＧ−１細胞２×１０^５個（１０^７個／ｍｌ、２０μｌ）に様々な濃度の阻害用ＣＤ４３抗体１０μｌを加え、氷上で１時間反応させた後、細胞を洗浄せずに、ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体又はＣＤ４３抗体（１Ｇ１０）−ＦＩＴＣ抗体をそれぞれ０．５μｇ（１００μｇ／ｍｌ、５μｌ）を加えた。氷上で１時間反応させ、洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎで解析した。結果は、図３に示した。
【００６６】
横軸は、ＫＧ−１細胞に加えた種々の阻害用ＣＤ４３抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は、上の図では、後からさらに加えたＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の結合率（％コントロール）を示し、下の図では、ＣＤ４３抗体（１Ｇ１０）−ＦＩＴＣ抗体の結合率（％コントロール）を示した。
【００６７】
ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の反応では、ＨＳＣＡ２抗体自身よりも、既存のＣＤ４３抗体であるＤＦ１０や１Ｇ１０の方が、むしろよく阻害した。１Ｇ１０−ＦＩＴＣ抗体の反応では、ＨＳＣＡ−２による阻害効果は弱かった。このことから、ＨＳＣＡ−２抗体は、ＣＤ４３分子の一部のエピトープを認識し、それを他のＣＤ４３抗体で阻害できることがわかった。
【００６８】
（実施例８：ヒト末梢血単球におけるＨＳＣＡ−２抗原及びＣＤ４３抗原の発現）
ヒト末梢血単球細胞は、実施例３に示したヒト末梢血単核球細胞調製の際に、単球細胞層のみを慎重に集めた。このヒト末梢血単球細胞約１×１０^５個をＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）に懸濁した。これに（ａ）ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体及びマウスイムノグロブリンＧ−ＦＩＴＣ抗体、又は、（ｂ）ＣＤ４３（１Ｇ１０）−ＦＩＴＣ抗体及びマウスイムノグロブリンＧ−ＦＩＴＣ抗体をそれぞれ０．１μｇずつ添加し、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回細胞を洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析した。前方散乱（ＦＳＣ）、後方散乱（ＳＳＣ）の単球の位置にゲートをかけて、ＦＡＣＳｃａｎで解析した。結果は、図４に示した。
【００６９】
上の図は、ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体及びマウスイムノグロブリンＧ−ＦＩＴＣ抗体処理したもの、下の図は、ＣＤ４３（１Ｇ１０）−ＦＩＴＣ抗体及びマウスイムノグロブリンＧ−ＦＩＴＣ抗体処理したものを示した。既存のＣＤ４３（１Ｇ１０）抗体は、既報の通り単球と反応したが（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）、ＨＳＣＡ−２抗体は単球と反応しなかった。
【００７０】
単球と同様にして、顆粒球に関して全く同様の実験を行ったところ、既存のＣＤ４３（１Ｇ１０）抗体は、既報の通り（新保敏和ら、ＣＤ分類ハンドブック（１９９５）、日本ＢＲＭ学会）、顆粒球と反応したが、ＨＳＣＡ−２抗体は反応しなかった。ＨＳＣＡ２抗体は、ＣＤ４３抗原の内、リンパ球にのみ発現する分子量が約１１０ｘ１０^３のアイソフォームを認識していることがわかった。
【００７１】
（実施例９：臍帯血又は成人末梢血Ｔ細胞におけるＨＳＣＡ−２抗原の発現）
臍帯血単核球細胞は、以下のように調製した。すなわち、１５ｍｌポリプロピレン製チューブ（コーニング社製）にヘパリンナトリウム注射液（１０，０００Ｕ／ｍｌ）０．０５ｍｌを入れ、産婦人科からインフォームドコンセントにて供与されたヒト臍帯血４ｍｌを加え、さらにＰＢＳ（−）／Ｈ（ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１，０００Ｕ／ｍｌ）を加えた）を５ｍｌ加え、よく混ぜた。そこに、リンフォサイトセパレーションメディウム（オルガノンテクニカ社製）３．５ｍｌをチューブ底に入れて、４００Ｇで３０分間、遠心分離した。ここで、単核球細胞層を集め、ＰＢＳ（−）／ＨＦ（ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１，０００Ｕ／ｍｌ）及び２．５％ＦＣＳを加えた）を１５ｍｌポリプロピレン製チューブに加えて１５ｍｌにして、５１０Ｇで１０分間、遠心分離した。沈殿にＰＢＳ（−）／ＨＦ１５ｍｌを加えて、懸濁し、２４０Ｇで１０分間、遠心分離した。今度は沈殿を１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ １６４０ ０．５ｍｌに懸濁し、細胞数を約１×１０^７個／ｍｌにした。これに凍結保存用培地（２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０）０．５ｍｌを加え、懸濁し、液体窒素中に凍結保存した。
【００７２】
これを使用開始時に凍結融解した後、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０にて洗浄して使用した。すなわち、細胞に、ＣＤ４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８（ＰＥ）各抗体処理を行い、成人末梢血Ｔ細胞は、上記の末梢血単核球細胞を調製した後、細胞に、ＣＤ４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８（ＰＥ）各抗体処理を行い、ＦＡＣＳｔａｒ（ベクトンディッキンソン社製）にて、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞を分取することにより調製した。
【００７３】
このようにして調製した臍帯血及び成人末梢血Ｔ細胞を約１×１０^５個ずつＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）に懸濁した。これにモノクローナル抗体ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣを０．１μｇずつ添加し、さらに、ＰＥ標識したモノクローナル抗体であるＣＤ４５ＲＯ−ＰＥをそれぞれ０．１μｇずつ添加し、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回細胞を洗浄後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析した。結果は、図５に示した。
【００７４】
縦軸はＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体の蛍光強度、横軸はＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度を示した。４つの図は、それぞれ、分離調製した成人ＣＤ４^＋細胞、臍帯血ＣＤ４^＋細胞、成人ＣＤ８^＋細胞又は臍帯血ＣＤ８^＋細胞を、ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体で処理したものを示した。
【００７５】
成人ＣＤ４陽性細胞においては、ＣＤ４５ＲＯ陰性の中に、ＨＳＣＡ−２^ｈｉｇｈ（ＨＳＣＡ−２高発現）、ＨＳＣＡ−２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}（ＨＳＣＡ−２中程度発現）及びＨＳＣＡ−２^{ｌｏｗ〜ｎｅｇａｔｉｖｅ}（ＨＳＣＡ−２低発現ないしＨＳＣＡ−２は発現していない）の３種類のサブセットが存在した。
成人ＣＤ８^＋細胞にＨＳＣＡ−２^ｈｉｇｈが存在した。一般に成人ＣＤ８^＋細胞のＣＤ４５ＲＯ⁻画分には、成熟したＣＤ８キラー細胞が存在するとされているので、このこととは矛盾しない。臍帯血には、ＨＳＣＡ−２^ｈｉｇｈの細胞は存在しなかった。また既報のように（クルースら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，１３（３）：２２１（１９９３））、ＣＤ４５ＲＯ^＋細胞もほとんど存在しなかった。これらのことから、ＨＳＣＡ−２抗体は、メモリーＴ細胞の新しいマーカーと考えられた。
【００７６】
（実施例１０：ＨＳＣＡ−２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進）
９６穴１／２プレート（コーニング社製）に、５×１０^４個のヒト末梢血単球細胞（実施例８に調製方法記載）に、終濃度５μｇ／ｍｌのツベルクリンタンパク質（ＰＰＤ）を加えて、ヒト血清（５６℃で３０分間処理したもの）を１０％含んだＲＰＭＩ １６４０存在下、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。ＨＳＣＡ−２抗体は終濃度５μｇ／ｍｌ添加した。トリチウムチミジンを１μＣｉ／ウエル加えて、さらに培養を続けて、１６時間後にハーベストし、シンチレーターを加えて、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定した。結果は、図６に示した。
【００７７】
縦軸にトリチウムチミジンの取り込み（×１０^−３ｃｐｍ）を、横軸に培養日数を示した。それぞれ、ＰＰＤ＋ＨＳＣＡ−２抗体（ＰＰＤ＋ＨＳＣＡ−２ Ａｂ）、ＰＰＤのみ（ＰＰＤ）、ＰＰＤを加えずにＨＳＣＡ−２抗体のみを加えたもの（ＨＳＣＡ−２ Ａｂ）、何も加えていないもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の１日毎のトリチウムチミジンの取り込みを示した。
【００７８】
ＨＳＣＡ−２抗体はＰＰＤ抗原に対するトリチウムチミジンの取り込み反応を促進した。ＰＰＤ単独とＰＰＤ＋ＨＳＣＡ−２抗体のトリチウムチミジンの取り込み反応は、そのピークレスポンスは同じであったが、反応を１日分前に加速した。ＰＰＤでの増殖反応の代わりに、抗ＣＤ３抗体を用いて同様の実験を行ったところ、ＨＳＣＡ−２抗体は抗ＣＤ３抗体に対するトリチウムチミジンの取り込み反応を促進した。これらのことより、ＨＳＣＡ−２抗体はｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子と考えられた。既存のＣＤ４３抗体でＴ細胞の活性化は報告されているが、既存の抗体は単球とも反応するので、ＣＤ４３抗体の活性が、抗原提示細胞である単球を活性化した結果であるか否かは、説明できていなかった。本実施例により初めて、ＨＳＣＡ−２抗体が、直接的なＴ細胞活性化能を持っていることが示された。
【００７９】
（実施例１１：ＨＳＣＡ−２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進におけるＣＤ２（Ｔ１１）抗体との相乗作用）
実施例１０の実験系にＣＤ２（Ｔ１１．１）抗体とＣＤ２（Ｔ１１．２）抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌずつ加えた。結果は、図７に示した。横軸の白抜きに、ＰＰＤに加えた抗体を示し、一方、黒抜きには、ＰＰＤを加えずに加えた抗体を示した。縦軸にそのトリチウムチミジンの取り込み（×１０^−４ｃｐｍ）を示した。培養日数は一律４日で実施した。縦のバーでそれぞれの標準偏差を示した。
【００８０】
既報のように（オリーブら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６（９）：１０６３（１９８６））、Ｔ１１．１抗体とＴ１１．２抗体を共存させると、ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ活性が確認できた。ＨＳＣＡ−２抗体は、Ｔ１１．１抗体＋Ｔ１１．２抗体の反応を相乗的に促進した。このことより、ＨＳＣＡ−２のシグナルパスウェイはＣＤ２からのシグナルパスウェイとオーバーラップしていることがわかった。免疫沈降実験の結果では、細胞膜上では、ＨＳＣＡ−２とＣＤ２の結合はないものと思われた。
【００８１】
（実施例１２：ＨＳＣＡ２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進におけるＣＤ２８抗体の影響）
実施例１１に示した実験系にＣＤ２８抗体も加えて実施した。結果は、図８に示した。横軸に、ＰＰＤの添加の有無及び添加した抗体を示した。縦軸にそのトリチウムチミジンの取り込み（×１０^−４ｃｐｍ）を示した。培養日数は一律４日で実施した。縦のバーで、それぞれの標準偏差を示した。
【００８２】
ＣＤ２８抗体は、ＰＰＤ刺激増殖反応を促進したが、ＣＤ２８抗体＋ＨＳＣＡ−２抗体では、ほとんどその反応を促進できなかった。一方、ＨＳＣＡ−２抗体は、実施例１１と同様に、Ｔ１１．１抗体＋Ｔ１１．２抗体の反応を相乗的に促進した。ＨＳＣＡ−２のシグナルは、ＣＤ２８のシグナルとは異なるパスウェイを通っていることが示唆された。
【００８３】
（実施例１３：ＨＳＣＡ−２抗原の発現レベルとＣＤ４メモリーＴ細胞サブセット）
ＭＡＣＳ磁気細胞分離システム（ダイナビーズ社製）を用いて、実施例３で示した成人末梢血単核球細胞から、ネガティブセレクションでＣＤ４^＋Ｔ細胞を約２×１０^７個分離し、そのうち約１×１０^５個をＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）に懸濁した。これにＨＳＣＡ２−ＦＩＴＣ抗体を０．１μｇ添加し、さらに、ＰＥ標識したモノクローナル抗体であるＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体を０．１μｇ添加し、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回細胞を洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析した。結果は、図９に示した。
【００８４】
縦軸はＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体の蛍光強度、そして横軸はＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度を示した。成人末梢血単核球細胞から調製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＨＳＣＡ−２−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体で処理したものを示した。
【００８５】
ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ４メモリーＴ細胞の約５５％は、ナイーブと同レベルのＨＳＣＡ−２抗原を発現していた（Ｍ２）。ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ４メモリーＴ細胞の約５５％は、ナイーブと同レベルのＨＳＣＡ−２抗原を発現していた（Ｍ２）。
ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ４メモリーＴ細胞の約３５％が、ＨＳＣＡ−２抗原を高発現していた（Ｍ１）。ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ４メモリーＴ細胞の約１０％は、ＨＳＣＡ−２抗原がダウンレギュレイトされていた（Ｍ３）。
【００８６】
（実施例１４：ＨＳＣＡ２抗原発現の異なるＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの抗原反応性）
実施例１３で示したＭＡＣＳを用いて採取したＣＤ４^＋Ｔ細胞（約２×１０^７個）を、ＨＳＣＡ２−ＦＩＴＣ抗体（１００μｇ／ｍｌ、２００μｌ）及びＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ抗体（２００μｇ／ｍｌ、５０μｌ）と１時間、氷上で反応させ、ＦＡＣＳｔａｒにて、それぞれ細胞分画Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３及びナイーブを分離した。９６穴１／２プレートに１×１０^４個のヒト末梢血単球細胞（Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＣＤ４）（分離方法は上述の実施例８に記載）を播き、それに各細胞分画Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３又はナイーブ５×１０^４個を加え、ＰＰＤ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）又は破傷風トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を添加し、ヒト血清（５６℃で３０分間処理したもの）を１０％含んだＲＰＭＩ １６４０ ２００μｌ存在下で、５％ＣＯ_２インキュベーターで、４日間又は７日間培養した。トリチウムチミジンを１μＣｉ／ウエル加えて、さらに培養を続けて、１６時間後にハーベストし、シンチレーターを加えて、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定した。結果は、図１０に示した。
【００８７】
横軸に、それぞれのトリチウムチミジンの取り込み（×１０^−４ｃｐｍ）を示した。黒抜きで、ＰＰＤ又はＴｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ及び抗体を加えたものを示し、一方、白抜きでは、ＰＰＤ及びＴｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄを加えずに、抗体だけを加えたものを示した。横のバーで、それぞれの標準偏差を示した。
【００８８】
Ｍ１にほとんどのメモリー活性が存在した。Ｍ３にはほとんどメモリー活性が存在しなかった。Ｍ２にはわずかにメモリー活性が認められた。ＰＰＤを添加した実験で、培養４日目ではなく、培養７日目にメモリー活性を評価すると、培養４日目時点のＭ１のｃｐｍの半分ぐらいまでのメモリー活性が認められた。同様にして、Ｍ３を培養７日目に評価したが、培養４日目と同じく、ほとんどメモリー活性が存在しなかった。これらのことより、メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＨＳＣＡ−２抗原を高発現していた。蛍光標識テロメアプローブを用いて、ＦＡＣＳｃａｎによりテロメア長を比較すると、ナイーブが最も長く、以下、Ｍ２、Ｍ１＝Ｍ３の順になっていたので、Ｍ２は、未熟なメモリーＴ細胞ではないかと考えられた。Ｍ３は培養後、アポトーシスで死んだので、ターミナルなメモリーＴ細胞ではないかと考えられた。以上のことより、ＨＳＣＡ−２抗体を用いて、Ｔ細胞中のＭ１画分に注目することにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞から、メモリーＴ細胞を測定又は分離することができ、種々の診断、検査などに利用できる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、末梢血Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在し、Ｂ細胞、単球及び顆粒球には存在していない新規な抗原、並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体を、１）抗体の標識によりイムノアッセイ、フローサイトメトリーへの利用、２）ヒト血液からのＴ細胞及びＮＫ細胞の分離精製、３）ヒトＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化、４）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からの、メモリーＴ細胞の、従来法よりも精密な測定又は分離に活用することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＳＣＡ−２抗体反応抗原の免疫沈降による解析を示したオートラジオグラフィー図
【図２】 ヒトリンパ球サブセットにおけるＨＳＣＡ−２抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図３】 各ＣＤ４３抗体による抗原結合性の競争的阻害を示したグラフ
【図４】 ヒト末梢血単球におけるＨＳＣＡ−２抗原及びＣＤ４３抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図５】 臍帯血又は成人末梢血Ｔ細胞におけるＨＳＣＡ−２抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図６】 ＨＳＣＡ−２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進を示したグラフ
【図７】 ＨＳＣＡ−２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進におけるＣＤ２（Ｔ１１）抗体との相乗作用を示したグラフ
【図８】 ＨＳＣＡ２抗体によるＰＰＤ刺激増殖反応の促進におけるＣＤ２８抗体の影響を示したグラフ
【図９】 ＣＤ４メモリーＴ細胞サブセットにおけるＨＳＣＡ−２抗原の発現レベルを示したフローサイトメトリー図
【図１０】 ＨＳＣＡ２抗原発現の異なるＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの抗原反応性を示したグラフ

Claims (2)

1. 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１７７８８であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを用いることを特徴とする、インビトロでヒトＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化する方法。
2. 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１７７８８であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントを用いることを特徴とする、インビトロでＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からメモリーＴ細胞を測定又は分離する方法。

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