JPH0310674A - 細胞培養用多孔質膜およびそれを用いた細胞培養器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は細胞培養用多孔質１模及びそれを用いた細胞培
養器に関する。さらに詳しくは、接若依存性の動物細胞
を高密度で長期間培養するための細胞培養用多孔質膜と
それを用いた細胞培養器に関するものである。

「従来技術」 動物細胞の培養技術は、インターフェロン・リンフ才力
イン・各種の成長ホルモンや細胞増殖因子などの生理活
性物質や生体由来材料あるいは治療用ワクチンなどの生
産手段として欠かせぬものであり、近年これらの物質を
高効率かつ大量に生産する高密度培養法が注目されてい
る。動物細胞の培養において、生存、増殖、目的物質の
生産のために人工もしくは天然の基質に接着することが
必要なｒ接着依存性細胞」の高密度培養では、細胞との
接着性・増殖性の優れた表面がまず必要となってくる。

また、細胞の生存や目的物質の生産能を維持するために
は細胞にとって良好な環境をいかに維持するかが重要と
なり、栄養素や酵素の供給・老廃物の除去を連続的に行
なうことが重要となってくる。

前者の細胞接着に関しては、高分子材料表面に低温プラ
ズマ処理・スパッタリング処理・紫外線処理・電子線処
理・単分子累積膜の被覆処理などの表面処理を施した材
料（特公昭５８−３２５８９号、特開昭６３−１９８９
７６号、特開昭６３−１９８９７７号など）や、コラー
ゲン、フィブロネクチン・ビトロネクチン・ラミニン等
の細胞接着因子や細胞増殖因子などで処理した材料（例
えば、Ｖｅｌ、ＸＸＸＩＩＩ　　Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓ
ｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｏｒｇａｎｓ　　１９８７．　　ｐ
６６、　５ｃｈｏ１ａｒｌｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　”Ｃｅ
１ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａ
ｓｓ”）が研究・開発されている。

一方、高密度培養細胞の成育環境維持については、多孔
質膜を用いる方法が優れていると考えられている。すな
わち、多孔質平膜を積層したり中空糸を束ねることによ
り限られた容積内に多くの表面積を確保でき、生命活動
に必要な物質の供給や異物の除去を多孔質膜の微小な孔
を介して連続的に拡散、もしくは膜間の圧力差により強
制的に行なうことで良好な生育環境を維持することがで
きる。そのような例としては、特開昭６３−１７６８６
号（中空糸型）や特開昭６０−２１０９８２号（積層型
）などがある。

「本発明が解決しようとする問題点」 １Ｎ型細胞培養装置では、シャーレやマイクロキャリア
ーを用いる細胞培養法に比べると高密度に細胞を培養す
ることができるが、接着依存性の動物細胞を培養したと
きに本発明者らはしばしば以下の問題点に遭遇した。す
なわち、細胞を膜上で高密度で培養するために「細胞の
接着・伸展・増殖性の優れた表面を有する膜」を用いて
細胞培養を行なったにもかかわらず、必ずしも高い生産
物質回収率や細胞の機能維持能が得られないことである
。本発明者らが鋭、は研究した結果、この原因は増殖し
た細胞自身や該細胞により合成された細胞外物質（コラ
ーゲンなど）により、膜の孔が閉塞され必要物質の供給
や異物の除去・有用物質の回収がスムーズにいかなくな
ったことに起因していることが分かった・ 本発明は、このような従来の問題点を顧みてなされたも
のであって、細胞の接着・増殖に優れた膜表面構造を有
し、かつ必要物質の供給や異物の除去・有用物質の回収
に関しても優れている細胞培養用膜及びそれを用いた細
胞培養器を提供することを目的とする。

ｒ問題点を解決するための手段」 上記目的は、細胞非接着性領域と細胞接着性領域を少な
くとも細胞培養側の膜表面に有することを特徴とする細
胞培養用多孔質膜によって達成される。さらに、上記目
的は、前記細胞培養用多孔質膜を用いた細胞培養器によ
って達成される。細胞培養用膜の形状は特に限定されず
、平膜状、中空糸状、チューブ状などが例示できる。ま
た、細胞培養側の表面とは、実際に細胞と接する面のこ
とである。

細胞培養側表面の各領域比・領域形状は任意であるが、
好ましくは、細胞非接着性領域／細胞接着性領域の面積
比が０．０２〜２０、好ましくは０．１〜１．０の範囲
にあり、両者は例えば格子状・縞状、海鳥状に分前して
いたほうがよい。また、１１！２　Ｊ’！Ｘが１〜５０
０μｍ、とくに１０〜２００μｍ、空孔率が２０％以上
、とくに３０％〜８０％、孔径０．０１〜１．０μｍ、
とくに０．０５〜０．５μｍであることが好ましい。膜
厚が５００μｍを越えると膜を介しての物質移動能力が
低下し、５μｍ以下となるとピンホールや強度的な問題
が生じてくる。空孔率に関しても、２０％未満であると
物質移動能力が低下し膜の目詰まりが起こりやすくなり
、細胞の成育や有用物質の回収に支障が生じてしまう。

本発明の細胞培養用多孔質膜は、ポリオレフィン及び一
部もしくはすべての水素がハロゲン化されたポリオレフ
ィンを主成分とすることを特徴とする。例を挙げると、
エチレン、プロピレン、塩化ビニリデン、塩化エチレン
、フッ化ビニリデン、６フツ化プロピレン、テ１〜ラフ
ルオロエチレン、メチルペンテン、ブタジェンなどによ
り構成される高分子（ホモまたはコポリマを含む）であ
る。これらポリオレフィンは分子内に官能基を有してい
ないため、膜表面の細胞接着性領域や細胞非接着性領域
の分子構造をデザインし合成する場合には、ポリオレフ
ィンは分子の影響が少なくてすむという利点を有する。

また、低温プラズマ処理やオゾン処理等で表面に極性基
を導入していない未処理のポリオレフィンは、細胞の接
着・伸展性が悪くその性質を逆に細胞非接着性領域に利
用することができ、その場合は細胞非接着性領域がポリ
オレフィン及び一部もしくはすべての水素がハロゲン化
されたポリオレフィンを主成分とすることが好ましい。

また１本発明の細胞非接着性領域はハイドロゲル様表面
とすることもできる。ハイドロゲル様表面とは、吸水性
に優れた高分子や水溶性の高分子を不溶化して膜表面に
固定化することによって得られるもので含水ゲル構造が
膜表面に形成されたものである。具体的含水ゲル構造の
形成方法としては、多孔質膜の細胞接着性領域をマスク
した後、非接着性領域に例えばアクリルアミド誘導体や
（メタ）アクリル酸エステル類をグラフトさせる方法や
、ポリエーテル類やポリビニルエーテル類を塗布し、共
有結合で結合させたり架橋不溶化処理を行い塗膜を不溶
化する方法等がある。前記含水ゲルを構成する成分の例
を挙げると、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド
、モノメチルアクリルアミド、エチルアクリルアミド、
イソプロピルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導
体を構成成分とするポリマーやポリエチレングリコール
などのポリエーテル類、ポリビニルメチルエーテルなど
のポリビニルエーテル類、アクリル酸エステルやメタク
リル酸エステル類を構成成分とし吸水ゲルを構成するポ
リマーなどが挙げられる。

細胞接着性領域の分子構造については、細胞非接着性領
域と比べて細胞の接着・増殖が優れていれば特に限定さ
れず公知の方法で表面設計を行なって良い。−例を挙げ
ると、細胞接着性の蛋白質やペプチドあるいは糖蛋白質
を表面に固定化したり、弱カチオン性の極性基を導入し
たりする方法などがある。実用性の点から、好ましくは
細胞接着性領域が含窒素複素環を分子内に有する化合物
を構成成分としている細胞培養用膜がよい。含窒素複素
環とは、ピリジン、ピリミジン、ピペリジン、ピロリド
ン、インドール、プリン、チアゾールなどのように複素
環内に窒素を有する化合物のことであり、含窒素複素環
を分子内に有する化合物とし、では、１−ビニルピラゾ
ール、５−ビニルピラゾリン、１−ビニルイミダゾール ン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、２−ビ
ニル−４〜メチルピリジン、５−ブロモ−３−ビニルピ
リジン、３−ビニルピペリジン、４−ビニルピペリジン
、１−ビニル−２−ピペリドン、ビニルピロリドンなど
がある。

「作　　用」 本発明の細胞培養用多孔質膜に細胞を播種すると，細胞
は細胞接着面に選択的に接着し、伸展・増殖することと
なる。従って、細胞非接着面においては、細胞や該細胞
により合成された細胞間物質などによる膜の閉塞が起こ
りにくくなる。その結果、本発明の細胞培養用膜は必要
物質の供給や異物の除去・有用物質の回収に関して優れ
た性能を発揮することとなり，本発明の細胞培養用膜を
用いた細胞培養器で細胞培養を行なうと長期間にわたっ
て細胞の機能が維持され、高い生産物質回収率が得られ
ることとなる。また、細胞接着性領域と細胞非接着性領
域を所望の形状で膜表面に分離形成させることで、効率
よく細胞の代謝が行なわれることとなる。

細胞培養用多孔質膜がポリオレフィンを素材としている
場合には，セルロース系の膜と異なり水系溶媒での膨潤
や酵素分解が起こりにくく寸法安定性・強度に優れた細
胞培養用多孔質膜となる。また、ポリオレフィン自体の
細胞の接着・増殖が悪いことから、表面処理を行なわな
いところを細胞非接着領域として利用することができる
。更には、疎水性膜なのでガス交換能も合わせ持つ細胞
培養用膜として、ガス交換側の細胞培養用膜としても使
用することもできる。

細胞非接着性領域がハイドロゲル様表面であると、細胞
のみならず蛋白質・生理活性物質などの膜への吸着や膜
の目詰まりが抑制され、有用物質の供給・回収が効率よ
く行なわれることとなる。

細胞接着性領域が含窒素複素環を分子内に有する化合物
を構成成分とすると、コラーゲン等の天然物質と比較し
て取り扱いが容易となる。

オートクレーブ滅菌処理においても変性することもなく
、また芳香族性複素環を分子内に有している化合物を用
いると、耐γ線性が向上しγ、線滅菌も可能となる。

本発明の細胞培養器は、上記の細胞培養用多孔質膜のメ
リットを全面的に享受することとなる。

ｒ実施例」 実施例１ 肉厚５０μｍのポリプロピレンシート（ＦＯＰ６０：二
相化学工業）に３ｍ間隔で太さ３ｍのスリットを縞状に
打ち抜いたポリプロピレンシート（Ｆ、　ＯＰ　６０）
を重ね、低温プラズマ（Ａｒ、　０，１ｔｏｒｒ）を１
５秒間照射した後、４−ピリジルエチレンガスを供給し
２８８にの温度で３分間表面グラフト重合を行った。重
ねていたポリプロピレンシートをはがした後、該膜を溶
媒（Ｍ硝子（株）製しジソルブ）で２日間洗浄し乾燥さ
せ試料とした。

このようにして得られた試料をφ２９ｍに打ち抜き、ク
ツ８５週令オスよりコラゲナーゼ潅流法により分離した
肝実質細胞を５×１０４個播種し、５％炭酸ガス、９５
％空気雰囲気下、３７℃、牛胎児血清１０％を含むＤＥ
（極東製薬）培地で４日間培養を行ない位相差顕微鏡に
て細胞の増殖状況を観察した結果、約３　＋ｎ間隔で細
胞接着領域と細胞非接着領域とが縞状に分離形成されて
いた。本実施例においては、細胞接着領域が含窒素複素
環であるピリジン基を表面に導入した領域であり、細胞
非接着領域は、重ねていたポリプロピレンシートにより
マスクされピリジン基が導入されなかった領域であった
。

実施例２ 肉厚５０μｍのポリプロピレンシート（ＦＯＰ６０：二
相化学工業）の表面全体に実施例１と同様に４−ピリジ
ルエチレンによる表面処理を施した後、φ５ｍの穴を１
０ａｍ間隔となるように水玉模様状に打ち抜いたポリプ
ロピレンシート（ＦＯＰ６０）を重ね、再び低温プラズ
マ（Ａｒ、　０．１ｔｏｒｒ）を１０秒間照射し、Ｎ、
Ｎ−ジメチルアクリルアミドガスを供給し２８８にの温
度で０．８ｔｏｒｒ、　３分間表面クラフト重合を行っ
た。重ねていたポリプロピレンシートをはがした後、該
膜を溶媒（旭硝子（株）製しジソルブ）で２日間洗浄し
乾燥させ試料とした。

このようにして得られた試料をφ２９冊に打ち抜き、ク
ツ８５週令オスよりコラゲナーゼ潅流法により分離した
肝実質細胞を５Ｘ１０’個播種し、５％炭酸ガス、９５
％空気雰囲気下、３７°Ｃ１牛脂児血清１０％を含むＤ
Ｅ（極東製薬）培地で４日間培養を行ない位相差顕微鏡
にて細胞の増殖状況を観察した結果、約φ５１ＩＩ１１
の細胞非接着領域とそのまわりの細胞接着領域とが海島
状に分離形成されていた。本実施例においては、細胞接
着領域が含窒素複素環であるピリジン基を表面に導入し
た領域であり、細胞非接着領域は、ポリ（Ｎ　、　Ｎ−
ジメチルアクリルアミド）のグラフト鎖により形成され
たハイドロゲル様表面であった。比較例１〜３ ポリプロピレンシート（ＦＯＰ６０）及び全面実施例２
と同様のポリ（Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド）のグ
ラフト鎖により形成されたハイドロゲル様表面を有する
ポリプロピレンシートを用いて肝実質細胞の培養を行な
ったが、細胞は接着しなかった。

また、実施例１と同様に４−ピリジルエチレンガスを供
給し２８８にの温度で３分間表面グラフト重合をポリプ
ロピレンシート全面に行ったサンプルでは、肝細胞が接
着・増殖するものの細胞非接着領域は形成されなかった
。

実施例３ メルトフローインデックスが３０及び０．３のポリプロ
ピレン混合物（混合重量比１００　：　４０）１００重
量部当り、４００重量部の流動パラフィン（数平均分子
量３２４）及び０．３重量部の結晶核形成剤としての１
，３．２，４−ビス（ｐ−エチルベンジリデン）ソルビ
トールを二軸型押出機により溶融混練しペレット化した
。このペレットを上記押出機を用いて１５０〜２００℃
で溶融し、スリット０　、６　＋＋ｎのＴダイより空気
中に押し出し、Ｔダイ直下に置かれた冷却液相のガイド
ローラーの回転によって冷却固化液中に導き冷却固化し
た後巻取った。

巻取ったフィルム状物を一定長に切断し、縦横両方向を
固定し、１，１．２−トリクロロ−１，２，２−トリフ
ルオロエタン中にｌＯ分間計４回浸漬して流動パラフィ
ンの抽出を行い、次いで１３５℃の空気中で２分間熱処
理を行なって、孔径０．４５μｍ、膜厚１２０μｍ、空
孔率６２％のポリプロピレン製多孔質膜を得た。このよ
うにして得られた多孔質膜に、実施例１と同様に３　ｎ
＊間隔で太さ３　ａｎのスリットを縞状に打ち抜いたポ
リプロピレンシートを重ね、低温プラズマ（Ａｒ、　０
．１ｔｏｒｒ）を１５秒間照射した後、４−ビニルピリ
ジンガスを供給し２８８にの温度で３分間表面グラフト
重合を行った。次いで１重ねていたポリプロピレンシー
トをはがし、溶媒（旭硝子（株）裂しジソルブ）で２日
間洗浄し乾燥させた。４−ビニルピリジンがグラフトし
た部分は細胞接着領域４であり、未処理のポリプロピレ
ン表面が細胞非接着領域５である。このようにして作っ
た細胞培養用多孔質膜１を用いて第１図に示したような
ミニモジュール（有効膜面積約２８２）を使用して肝細
胞の高密度膜培養を試みた。すなわち、第１の膜１とし
て本実施例の膜を、第２の膜２として孔径０．０５μｍ
のポリプロピレン復のガス交換膜を用いて、第２の室１
２に肝実質細胞４′を封入し、液状の培地（ｉｏ％牛脂
児血清を含むＤＥ培地）を第３の室１３に３Ａ→３Ｂと
流し、２Ａ、２Ｂより液状の培地を回収した。第１の室
１１には、ＩＡ→ＩＢと５％炭酸ガス、９５％空気の混
合ガスを流した。培養開始後１週間経過しても、細胞は
良好に細胞接着部位で成育しておりＴ　Ｍ　Ｐ（膜間圧
力差）約２０ｍｎ＋Ｈｇの条件で膜が目詰まりすること
もなく培地の流れはスムーズであった。

比較例４ 実施例３と同様の実験を全面に４−ピリジルエチレンの
グラフト鎖を導入したポリプロピレン多孔質膜を用いて
行なった結果、培養５日日に膜の目詰まりが発生し２Ｂ
、２Ａからの培地の回収が、ＴＭＰ（膜間圧力差）２０
ｍｍＨｇでは不可能となった。

実施例４ ポリフッ化ビニリデン粉末（三菱油イＬ（株）製、ｋｙ
ｎａｒ　Ｋ　３０１）１８重量部を、アセトン７３．８
重量部およびジメチルホルムアミド８．２重量部に溶解
してなる溶液を、ポリエチレンテレフタレートフィルム
上にキャスト成形して、ボリフｙ化ビニリデン膜を得た
。ついでこの膜を１．１．２−トリクロロトリフルオロ
エタン浴中に５分間浸漬し、乾燥して膜厚１２５μｍ、
平均孔径０．４５μｍのポリフッ化ビニリデン多孔質膜
を得た。該膜に実施例３と同様に表面グラフト重合を行
った。ついで実施例１と同様に３ｍｍ間隔で太さ３　ｎ
ｗｎのスリットを縞状に打ち抜いたポリプロピレンシー
トを重ね、低温プラズマ（Ａｒ、　０．１ｔｏｒｒ）を
１５秒間照射した後、１−ビニル−２−イミダシリンガ
スを供給し２８８にの温度で３分間表面グラフト重合を
行った。次いで、重ねていたポリプロピレンシートをは
がし、溶媒（フレオン１１３−メタノール共沸混合物）
で２日間洗浄し乾燥させた後、実施例３と同様の肝細胞
培養試験を行なった。

培養開始後１週間経過しても、細胞は良好に細胞接着部
位で成育しておりＴＭＰ（膜間圧力差）約２０ｍｍＨｇ
の条件で膜が目詰まりすることもなく培地の流れはスム
ースであった。

「発明の効果」 以上の説明より明らかなように、本発明の細胞培養用多
孔質膜は細胞非接着性領域を膜表面に有しているので、
膜に接着した細胞や細胞の生産物質により膜の孔が閉塞
し膜の機能が損なわれ、必要物質の供給や回収に支障が
生じるといったことがなくなる。従って、本発明の細胞
培養用多孔質膜を用いた細胞培養装置は、高密度で長期
間効率よく細胞の培養・有用物質の回収を行なうことが
可能となり、各種の生理活性物質の細胞による生産シス
テムや生物学・医学４゜ の研究用や高分子と細胞が共存したハイブリッドタイプ
の人工肝臓や人工膵臓として効果を発揮することとなる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養用多孔質膜を装備した細胞培
養器の１例を示す断面図である。 １・・・第１の膜（本発明の細胞培養用多孔質Ｓ）２・
・・第２の膜　　　４・・・細胞接着領域４′・・・細
胞　　　　　５・・・細胞非接着領域１１・・・第１の
室　　　１２・・・第２の室１３・・第３の室

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞非接着性領域と細胞接着性領域を少なくとも細
   胞培養側の膜表面に有することを特徴とする細胞培養用
   多孔質膜。 ２、細胞培養表面における細胞非接着性領域／細胞接着
   性領域の面積比が０．０２〜２０であって両者は格子状
   ・縞状、海島状に分離してなり、膜厚が１〜５００μｍ
   、空孔率が２０％以上である請求項１記載の細胞培養用
   多孔質膜。 ３、請求項１ないし２のいずれか記載の細胞培養用多孔
   質膜を用いた細胞培養器。