JPH0259527A - スクシニル化トロンビンを有効成分とする血栓症治療・予防剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はトロンビン（ｔｈｒｏｍｂ　１ｎ　）を化学的
に修飾した化合物を有効成分とする抗血栓作用及び線溶
促進作用を有する医薬組成物に関する。即ち、本発明は
医療分野において血栓の形成の阻害や血栓を原因とする
疾患の治療及び予防、更には再発の防止に用いられる新
規な化学修飾トロンビンを有効成分とする医薬組成物に
関するものである。

（従来の技術） 人間の血管内では様々な原因で血栓が形成されることが
あり、それが血流を阻害し、更には遮断し、遮断部下流
の臓器への血液供給を制限してその臓器の疾病を引き起
こす。その例として、心筋梗塞、脳梗塞（脳血栓）、肺
梗塞、深部静脈血栓などがあり、これらの病気は主要先
進国における死亡原因の上位を占めている。また癌の末
期や重症感染症などの場合には、体中の血管のあらゆる
ところで血栓が形成される非常に致命率の高い症状であ
るＤＩＧ　（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　［ｎｔｒａｖ
ａｓｃｕｌａｒ　Ｃｏ−ａｇｕｌａｔｉｏｎｉ播種性血
管内凝固症候群）が起きる。

（本明細書ではこれらのような血管内での血栓形成が原
因となって起こる疾病を以下、血栓症と総称する。） これらの血栓症を治療するために、血栓を構成している
フィブリンを分解する酵素であるプラスミンの前駆体の
プラスミノーゲンを活性化する、ストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−
ＰＡ）　、或いは血液凝固を阻害する作用を持つヘパリ
ンなどが現在臨床に用いられている。

本発明に係るトロンビン誘導体の原料であるトロンビン
は古くから血液凝固系の中の一因子として知られている
。血液中には不活性型のプロトロンビンとして存在して
おり、活性型の凝固第Ｘ因子により活性化されてトロン
ビンとなる。トロンビンはフィブリンの前駆体であるフ
ィブリノーゲンに作用してフィブリンを形成させる。こ
のフィブリンが血栓を形成するのである。

トロンビンは以上のように血液凝固において中心的な役
割を担う一方、血液凝固阻害０線溶促進にも関係してい
ることが知られている。すなわち、トロンビンは血管内
皮細胞上に存在する糖蛋白質の一種であるトロンボモジ
ュリン（ｔｈｒｏｍｂｏ−ｍｏｄｕｌｆｎ）に結合する
と、血液中のプロティンＣ（以下ＰＣという）を活性化
プロティンＣ（以下ＡＰＣという）に変換する。こうし
て形成されたＡＰＣは、血液凝固カスケードの中の凝固
因子である活性化凝固筒■因子及び活性化凝固第■因子
を分解拳失活させて血液凝固を阻害する。またＡＰＣは
組織プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを中和す
ることにより、線溶系を冗進させる効果もある。

つまりトロンビンは一方で血液凝固系の中の重要な因子
でありながら、他方ではＰＣを活性化することにより血
液凝固の阻害及び線溶亢進に働くという全く反対の方向
の作用を合わせ持っているのである。

そこでトロンビンのもつＰＣの活性化能、即ち血液凝固
阻害や線溶促進に関する活性を残存させたまま、血液凝
固作用を減弱化すれば、新しいタイプの血栓症治療拳予
防剤を創製することが出来ると考えられる。

一方、トロンビンがＰＣを介して線溶系に関係している
ことが証明される以前に、アセチル化されたトロンビン
はフィブリノーゲンをフィブリンに変換する作用を失い
、逆にｉｎ　ｖｌｖｏでは線溶を冗進させる作用を有す
るようになるという現象が知られていた（Ｌａｎｄａｂ
ｕｒｕ、　Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、：　Ｃａｎ、　Ｊ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３７．１３６１
（１！３５Ｂ）、Ｓｅｅｇｅｒｓ。

Ｗ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、：　５ｃｉｅｎｃｅ、　１３１．
７２６（１９５９））。しかしながら、これらの文献が
発表された当時は血液凝固・線溶系に関する知識が十分
に蓄積されていなかったこともあって、この知見を基礎
として新しい血栓症治療・予防剤の開発が行なわれるこ
とはなく、単に学術的な興味が持たれたのみであった。

（発明の概要） 本発明者らはかねてから血栓症治療・予防剤の開発に鋭
意注力してきたが、単に学術的な興味に留まりそれ以上
の産業的利用への試みが行なわれずにいた、化学修飾に
よってトロンビンが血液凝固・線溶に関する機能のバラ
ンスを変換させる現象を、新規な血栓症治療・予防剤の
開発に利用することに想到した。

すなわち、ＬａｎｄａｂｕｒｕやＳｅｅｇｅｒｓらの見
い出した現象を現在の技術水準から見直すことにより、
トロンビンのもつ血栓凝固阻害・線溶促進に関する活性
が残存されたまま血液凝固に関係する作用が減弱化され
た、新しいタイプの血栓症治療・予防剤を創製すること
を試みたのである。

そして、本発明者らはトロンビンの凝固活性が消失し、
ＰＣ活性化能を残存させているアセチル化トロンビンを
調製し、これをウサギに静脈内投与してみたところ、血
液凝固作用は全く見られず、抗凝固作用のみが見られる
ことを発見し、この事実を第１θ回日本血栓止血学会（
１９８７年）で発表した。即ちここに、ＰＣ活性化能を
残存させたまま血液凝固活性のみが消失するように化学
修飾されたトロンビンは、ＰＣを介した抗血液凝固剤と
して使用され得ることが明らかにされたのである。

本発明者らは以上の知見を元にして、更に鋭意研究して
きた結果、無水コハク酸でスクシニル化されたトロンビ
ンがアセチル化トロンビンよりも更にＰＣ活性化能が高
いことを見い出し、本発明を完成するに至った。

以下に本発明に係るスクシニル化トロンビンの製造例を
記す。

（製造例） 製造例１　（スクシニル化トロンビンのＩ製）蛋白質重
量９．３１ｍｇの凍結乾燥トロンビン（持田製薬製のも
のを精製して用いた）を　１艷の炭酸水素ナトリウム−
炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ１ｐ８８．０）にゆっくり
と加えてトロンビンを溶かし、無水コハク酸１０ｍｇを
７回に分けて加えた。田を８．０に保つために、０．１
１１１のＮａＯＨで調整した。マグネットスターラーに
より２０分間撹拌した。以上はすべて水中で行なった。

その後４℃に保った状態で０．９％の食塩水に対して１
５時間透析し、１．６ｍ１ｌのスクシニル化トロンビン
溶液を得た。

Ｗ造例２　（比較のためのＮ−アセチル化トロンビンの
調製） 蛋白質重量４．８ｍｇの凍結乾燥トロンビン（持田製薬
製のものを精製して用いた）を、２．４−の水に懸濁し
た。更に２．４−の飽和酢酸ナトリウム溶液を徐々に加
えた。次いでエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）
ピペットを用いて田が７．０となるように無水酢酸を点
滴して加えた。以上はすべて水中で行なった。’　ｐｉ
（が７．θとなった時点で直ちに４℃に保った状態で０
．９％の食塩水に対して透析を開始して、１５時間後に
９．９＋ｄのＮ−アセチル化トロンビンを得た。

製造例３（比較のためのΩ−アセチル化トロンビンの調
製） トロンビン１０．２ｍｇとぎ一アセチルイミダゾール１
０ｍｇを、５ＩＴ１ｇの２５ｍＭバルビッール酸ナトリ
ウム緩衝液（ｍ７．５）に溶解し、室温で１時間攪拌後
、４°Ｃに保った状態で０．９％の食塩水に対して透析
を開始して、１８時間後に５．１５ｍＱのΩ−アセチル
化トロンビンを得た。

本発明に係る血栓症治療Φ予防剤の有効成分スクシニル
化トロンビンの患者への投与量は、症状の軽重や患者の
年齢、性別、スクシニル化トロンビンに対する忍容性な
どにより異なるが、通常成人１日当たり１ｍｇ〜ｌＯｇ
であり、これを１回或いは何回かに分けて投与する。本
発明の血栓症治療拳予防剤は単独で用いてもよく、他の
血栓症治療台予防剤と併用して投与してもよい。

投与方法は経口投与、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射
など任意の方法を取ることが出来る。

製剤化に際しては周知慣用の方法により製薬用の担体や
補助剤を用いて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シ
ロップ剤、注射剤などを調製すればよい。すなわち固形
剤の場合、乳糖、蔗糖、デキストリン、燐酸カルシウム
、ソルビットなどの賦形剤、アラビアゴム、ゼラチン、
ポリビニルピロリドン、トラガカントなどの結合剤、澱
粉などの崩壊剤等が使用され、必要に応じて保存剤、安
定化剤等を混合する。液剤の場合は、補助剤としてシロ
ップ、メチルセルロース、ゼラチン、カルボキシメチル
セルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル等が適宜有
効成分に添加して製剤化する。

ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ソルビン酸などの防腐
剤も併せて用いることも考慮されてよい。

更に注射剤の場合は必要に応じて有効成分とｐＨ緩衝剤
、可溶性化剤、防腐剤、安定化剤等を混合して注射剤と
する。

続いて本発明に係るスクシニル化トロンビンの生理活性
の試験結果を実施例により示す。

（実施例） 実施例１（アミダーゼ活性の測定） アミダーゼ活性の測定は、１５μ２の試料溶液（７．５
ｍＨのＥＤＴ　Ａと１７５ｍＭのＭａｉｌを含む田８．
４の５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に溶解させたもの）
に対し、Ｓ−２２３８　（）Ｉ−Ｄ−フェニルアラニル
−Ｌ−ピペコリルーＬーアルギニルーｐ−＝トロアニリ
ド；　ＫａｂｆＶｉｔｒｕｍ社製）の０．１ｍＭ溶液（
緩衝液の組成は試料溶液に用いたものと同じ）７３５μ
９を基質として３７°Ｃで４０秒間反応させ、１５０μ
２の氷酢酸で反応を停止させ、遊離されるバラニトロア
ニリンの量を分光光度計（島津製作所製ｔｌＶ−１６０
）用いて４０５ｎｍに於ける吸光度を測定し、標準曲線
から活性を読み取った。

標準曲線は以下の条件で作成した。

即ち、θ〜５０ユニット／−の各種既知濃度のトロンビ
ン溶液１５μ９に対し、Ｓ−２２３８溶液７３５μ９を
基質として上と同じ条件で反応させ、４０５１１１１に
於ける吸光度を測って標準曲線を得た。

実施例２（フィブリン形成活性の測定）フィブリン形成
能は、２ＩＩ１ｇ／ｌＴ１５１のウシフィブリノーゲン
溶液（０，１５ＨのＭａｉｌを含むｐＨ７，５の０．１
Ｍのトリス−塩酸緩衝液に溶解させたもの）２００μ９
に試料１００μｌｌ　（０，１ＭのＮａＣ１１３，５ｍ
ＭのＣａＣ１２及び１０＋ｎｇ／−のウシ血清アルブミ
ンを含む田７．５の２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液に溶
解させたもの）を加えて３７℃で反応させ、フィブリン
塩が形成されるまでの所要時間をコアグロメーター（ｃ
ｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）で測定し、標準曲線から活性
を読み取った（単位はトロンビンユニット／艷）。

コアグロメーターは、レーザー・コアグロメーター（和
光純薬社製ＬＣ−１０１）又はアメラング・コアグロメ
ーター（バクスター社製ＫＯ−４Ａ）を使用した。

標準曲線は以下の条件で作成した。

即ち、０．８２５〜ＩＯユニット／−の各種既知濃度の
トロンビン溶液（０，１ＭのＮａＣ１１３，５ｍＭのＣ
ａＣｌ２及び１０ｍｇ／１１１１１のウシ血清アルブミ
ンを含むｐＨ７，５の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に溶
解させたもの）１００μ９を、上記のウシフィブリノー
ゲン溶液２００μ９に加えて３７℃で反応させ、フィブ
リン塩の形成所要時間をコアグロメーターで測定し、そ
の測定結果から標準曲線を作成した。

以下の表１に実施例１及び実施例２の結果を示す。

表１ 上の表１でＮ−Ａｃ、　０−Ａｃ及びＳｕｃはそれぞれ
、Ｎ−アセチル化、Ω−アセチル化、及びスクシニル化
を表わす。

実施例３　（ＰＣの活性化能の測定） ＰＣの活性化能の測定は、ＰＣを含む溶液に試料を加え
て形成されたＡＰＣの濃度を測定することによって行な
った。

ヒトＰＣ（アメリカン・ダイアグノスティック社製）を
活性化緩衝液（０，１ＭのＮａＣｌと０．１％のウシ血
清アルブミンを含む、ｐＨ８，０，５０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液）で希釈して濃度０．４ｍｇ／ｍＱとしたも
のｌＯμΩを１５μ９の試料溶液と混合し、更に７５μ
９の活性化緩衝液を加えて、３７°Ｃで１時間反応させ
た。

その後濃度０．３ｍＨの１−２５８１　（ダンシル−Ｎ
ａ−（ｐ−グアニジノ）−フェニルアラニン−ピペリジ
ド−塩酸塩）を１５０ｔｌＱ　（０，ｆｌｌ！のＮａＣ
１と２ｍＭのＣａＣｌ２を含む、田８．０．５０ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液；これを以下基質緩衝液という）を
加えて更に１５分間反応させてトロンビン活性を中和し
た。続いて、濃度０９１ｍＭのＢｏｃ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−７−メチルクマリン（基質緩衝液）
２５０μｓを加えて３７℃で反応させた。１０分後に濃
度２０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸５００μ９を加えて反応を中
止させた。そして遊離された７−アミノ−４−メチバク
メチルクマリンの濃度を蛍光光度計（島津製作所製ＲＦ
−５４０）を用いて励起波長３８０ｎｍ１発光波長４８
０ｎｍで測定した。

トロンボモジュリンを用いる測定では、濃度０゜４ｍｇ
／＋ＴｌＩ２のヒトＰＣＩＯμ９を試料５μ２に加え、
更にトロンボモジュリンとして濃度３０ユニット／−の
ウサギトロンボモジュリン１５μ９を反応液に加えて、
活性化緩衝液として上記の活性化緩衝液に更に３．５ｍ
ＭのＣａＣｌ２を含むもの７０μΩを混合して３７°Ｃ
で１時間反応させた。以下は上と同様に行なった。

なお本明細書に於いては、１ユニツトのＡＰＣとは毎分
１ｎＭの７−アミノ−４−メチバクメチルクマリンを遊
離させるＡＰＣの量であると定義した。

以下の表２に実施例３の結果を示す。なお表中でＴＭと
あるのはトロンボモジュリンの意味である。

（以下余白） 表２ （発明の効果） 表１が示すようにＮ−アセチル化トロンビン、Ω−アセ
チル化トロンビン及び本発明に係るスクシニル化トロン
ビンとも、非修飾のトロンビンと比べてアミダーゼ活性
については十分に保持されている。一方凝固活性は劇的
に減少してＮ−アセチル化トロンビン、Ω−アセチル化
トロンビン、スクシニル化トロンビンはそれぞれ０．０
０９９％、０゜０３７％、０．５５％しか保持されてい
なかった。

次にＰＣの活性化能は表２の中の生理的条件であるトロ
ンボモジュリン及びカルシウムイオンの存在下における
データから判るように、Ｎ−アセチル化トロンビン及び
Ω−アセチル化トロンビンがそれぞれ０．０４８％及び
０．１４％の活性しか保持していないのに対し、スクシ
ニル化トロンビンは２．８１％の活性を保持していた。

以上のデータからＮ−アセチル化トロンビン、Ω−アセ
チル化トロンビン及びスクシニル化トロンビンの、凝固
活性に対するＰＣ活性化能の比率は、それぞれトロンビ
ンの４．８倍、３．８倍、５．１倍であることが示され
た。

故に本発明に係るスクシニル化トロンビンは、Ｎ−アセ
チル化トロンビン及びΩ−アセチル化トロンビンよりも
より多くのＰＣ活性化能を保持していることが判明した
。

本発明は血栓が原因となって起こる様々な疾病を治療す
るための新しいタイプの血栓症治療φ予防剤として有用
である。

即ち、血栓症を治療するために既に臨床で使用されてい
る各種薬剤、例えば、血栓を構成しているフィブリンを
分解する酵素であるプラスミンの前駆体のプラスミノー
ゲンを活性化する、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ
、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）　、或
いは血液凝固を阻害する作用を持つヘパリンに加えて、
血液中のプロティンＣを活性化プロティンＣに転換させ
ることを作用機序とする新規なタイプの血栓症治療・予
防剤を提供するものである。本血栓症治療・予防剤単独
で、或いは血栓溶解剤と組み合わせて患者に投与するこ
とにより、治療効果が期待される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スクシニル化トロンビン（ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｈｒ
   ｏｍｂｉｎ）を有効成分とする血栓症治療・予防剤。 ２、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を無水コハク酸を
   用いてスクシニル（ｓｕｃｃｉｎｙｌ）化することによ
   り得られるスクシニル化トロンビンを有効成分とする血
   栓症治療・予防剤。