JPH08510746A - 改良型▲vii▼因子 - Google Patents

改良型▲vii▼因子

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JPH08510746A JP7500869A JP50086995A JPH08510746A JP H08510746 A JPH08510746 A JP H08510746A JP 7500869 A JP7500869 A JP 7500869A JP 50086995 A JP50086995 A JP 50086995A JP H08510746 A JPH08510746 A JP H08510746A
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viia
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JP7500869A
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エル. バークナー,キャスリーン
クリスチャン ペテルセン,ラルス
イー. ハート,チャールズ
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Novo Nordisk AS
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Abstract

(57)【要約】 凝血カスケードを有効に妨害する化合物を製造するためにVII因子の触媒活性部位を改良する。この改良はVIIa因子を、血漿X又はIX因子を実質的に活性化できないものにする。この改良型VII因子の薬理組成物は様々な凝固関連障害を処置するのに利用される。

Description

【発明の詳細な説明】 改良型VII因子 関連出願 本発明は引用することで本明細書に組入れる1993年5月21日提出のUSSNの一部 係属出願に係る。 発明の分野 本発明は抗凝固剤として有用なタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は 血液凝固及び組織因子を阻害するVII因子の改良型に関する。 発明の背景 血液凝固は、フィブリン凝塊を最終的にもたらす様々な血液成分又は因子の複 雑な相互作用より成る過程である。一般に、凝固「カスケード」と呼ばれている ものに関与する血液成分はプロ酵素又はチモゲン即ち、それ自体が凝固因子であ るアクチベーターの作用によりタンパク質分解酵素へと変換される酵素的に不活 性なタンパク質である。かかる変換を経た凝固因子は一般的に「活性因子」と呼 ばれており、そして小文字「a」の接尾辞の付加により命名されている(例えば VIIa因子)。 活性化X因子(「Xa」)はプロトロンビンをトロンビンに変換せしめるのに 必要であり、このトロンビンは次にフィブリン凝塊を形成する最終段階としてフ ィブリノーゲンをフィブリンに変換せしめる。X因子の活性化を促進する2つの 系又は経路がある。「内因性経路」とは、血漿の中にのみ存在している因子の利 用を通じてト ロンビン形成をもたらす反応を意味する。一連のプロテアーゼ媒介型活性化は最 終的にIXa因子をもたらし、それはVIIIa因子と協力して、X因子をXa因子へ と解裂せしめる。同じタンパク質分解がVIIa因子及びその補因子である組織因 子により、血液凝固の「外因性経路」において及ぼされる。組織因子は膜結合型 タンパク質であり、そして通常は血漿の中で循環していない。しかしながら、血 管の崩壊により、それはVIIa因子と複合してX因子の活性化又はIX因子の活性 化をCa++及びリン脂質の存在下で触媒する(Nemerson and Gentry,Biochem.25 :4020−4033(1986))。これら2つの凝固経路の止血における相対的な重要性 は明らかにされていないが、近年VII因子及び組織因子は血液凝固の調節におい て中枢的な役割を果たしていることが見い出せた。 VII因子は一本鎖チモゲンとして血液の中で循環する微量血漿糖タンパク質で ある。チモゲンは触媒的には不活性である(Williamsら、J.Biol.Chem.264: 7536−7543(1989);Raoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:6687−6691(1 988))。一本鎖VII因子はXa因子、VIIa因子、IXa因子又はトロンビンによ りインビドロにおいて二本鎖のVIIa因子へと変換されうる。Xa因子はVII因子 の主要生理学的アクチベーターであると信じられている。止血に関与するその他 のいくつかの血漿タンパク質と同様に、VII因子はその活性に関してビタミンK に依存している。その活性はタンパク質のアミノ末端において集合している複数 のグルタミン酸のγ−カルボキシル化にとって必要である。このようなγ−カル ボキシル化グルタミン酸はVII因子とリン脂質との金属関与相互作用にとって必 要である。 チモゲンVII因子の活性化二本鎖分子に至る変換はこの分子の中央にほぼ位置 している内部ペプチド結合の解裂により起こる。ヒトVII因子において、その活 性化解裂部位はArg152−Ile153である(Hage nら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2412−2416(1986);Thimら、Biochem 27:7785−7793(1988);共に引用することで本明細書に組入れる)。ウシ のVII因子は類似のArg152−Ile153結合においての解裂による活性化される(Tak eyaら、J.Biol.Chem.263:14868−14877,1988)。組織因子、リン脂質及び カルシウムイオンの存在下において、この二本鎖VIIa因子は直ちにX因子又はI X因子を限定されたタンパク質分解により活性化する。 患者における凝血カスケードを選択的に阻止することが往々にして必要とされ る。抗凝固剤、例えばヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン誘 導体又はその他の剤が、例えば腎臓透析の最中に、又は深遠静脈血栓、散在性血 管内凝固(DIC)、及びその他の数多くの医学的障害の処置のために利用されう る。例えば、ヘパリン処置又はクエン酸イオンによる体外処置(米国特許第4,50 0,309号)が、処置の際の凝固を防ぐために透析において利用されうる。ヘパリ ンは手術を受けている患者における深遠静脈血栓を防ぐのにも利用されている。 しかしながら、ヘパリン及び抗凝固剤による処置は望ましくない副作用を有す る。有用な抗凝固剤は一般に凝塊部位において特異的に作用するよりも、全身に わたって作用する。ヘパリンは例えば大量出血をもたらしうる。更に、約80分の 半減期により、ヘパリンは血液から迅速に消失し、頻繁な投与を必要とする。ヘ パリンは抗トロンビンIII(ATIII)にとっての補因子として働くため、そしてAT IIIはDIC処置においては迅速に枯渇するため、適正なヘパリン投与量を維持する ことは往々にして難しく、ATIII及びヘパリンレベルの連続モニターを必要とす る。また、ATIIIの枯渇が極端である場合、ヘパリンは有効でない。更に、ヘパ リンの長期利用は血小板の凝集を高めそして血小板計測数を減らすこともあり、 そして骨粗しょう症 の発症に関与する。インダンジオン誘導体も毒性副作用を有する。 上記に簡単に説明した抗凝固剤の他に、いくつかの天然タンパク質が抗凝固活 性を有することが見い出されている。例えば、Reutelingsperger(米国特許第4, 736,018号)はウシの大動脈及びヒトの臍静動脈から抗凝固性タンパク質を単離 した。Makiら(米国特許第4,732,891号)はヒト胎盤由来の抗凝固性タンパク質 を開示している。更に、ATIIIは治療用抗凝固剤として提案されている(Schippe rら、Lancet 1(8069);854−856(1978);Jordan,米国特許第4,386,025号 ;Bockら、米国特許第4,517,294号)。 脈管壁における平滑筋細胞(SMCs)の増殖は、アテローム症における血管損傷 の形成、血管の再構成後の又はその他の血管傷害に対する反応における重要な現 象である。例えば、アテローム症の処置はしばしば、血管形成術、動脈血管内膜 切除術もしくは整復アテローム切除術による閉塞血管の清掃又は、バイパス移植 が含まれ、それらの外科処置においては、アテローム症プラークをカテーテルに より圧搾もしくは除去する(血管形成術)、切開を介して動脈壁から取り除く( 動脈血管内膜切除術)、又は天然もしくは合成移植体でバイパスを施している。 これらの手順は血管の内皮を除去し、下にある内膜を乱し、そして内側のSMCsを 死に致らしめる。この傷害には内側SMC増殖及び内膜へと移動が続き、これは傷 害を受けて最初の数週間から6ケ月に至るまでに特徴的に生じ、そして上をかぶ さる内皮層が再樹立されたときに止まる。ヒトにおいては、このような損傷は約 20%の細胞と80%の細胞外マトリックスとより構成される。 血管形成術、動脈血管内膜切除術又はバイパス移植により処置した患者の約30 %以上において、内膜における血栓及び/又はSMC増殖は脈管の再閉塞を起こし 、従って再構成外科は失敗に至る。術後 の脈管の閉塞は再狭窄(restenosis)として知られている。 比較的低投与量において投与でき、そして伝統的な抗凝固性組成物に係る望ま れない副作用をもたらさない抗凝固活性を有する改良組成物が未だ当業界におい て要望されている。本発明は損傷部位において特異的に作用する抗凝固剤を提供 することによりこの要望を満足せしめ、そして更には関連の利点を提供する。 発明の概要 抗凝固活性を有する改良型VII因子を含んで成る新規組成物を提供する。この 改良型VII因子組成物は組織因子も阻害する。このVII因子配列は少なくとも1個 のアミノ酸改質を有し、ここでその改質は血漿X又はIX因子の活性化を触媒する 活性化VII因子の能力を実質的に低め、それ故凝塊活性を阻害できるように選ば れる。この新規のVII因子の少なくとも1個のアミノ酸置換により改質された活 性部位を有し、そしてその改良型は組織因子と結合することができる。この改良 型VII因子組成物は一般に実質的に純粋な形態である。 本発明の組成物は薬理組成物へと配合せしめたときに患者の処置のための方法 において極めて有用であり、ここでそれらは凝固関連症状を処置するために様々 な疾患状態に苦しむ個体に付与せしめることができる。組織因子に結合できるが 、凝塊カスケードにおけるその他の因子の活性化を触媒する実質的に低減された 能力を有するかかる改質型VII因子分子は、その他の抗凝固剤と比べたとき、長 めの血漿半減期を有し、それ故対応の長めの抗凝固活性期間を有しうる。課題の 組成物にとっての医学的用途には、抗凝固剤で一般的に処置されるもの、例えば 深遠静脈血栓、肺塞栓症、発作、散在性血管内凝固(DIC)及び心筋梗塞が挙げ られる。この組成物は血管再狭窄及び血小板沈着並びに関連の障害を阻止するの に利用できうる。 それ故に、凝固、血管再狭窄又は血小板沈着を阻止する方法は、例えば改良型VI I因子、例えばSer344,Asp242及びHis193の触媒性トリアドにおいて少なくとも 1個のアミノ酸置換を有するものを、凝固、血管狭窄又は血小板沈着のそれぞれ を阻害するのに有効な量において含んで成る組成物を患者に投与することを含ん で成る。 一般に、ヒトへの投与にとって、この薬理組成物は改良型ヒトVII因子タンパ ク質並びに薬理学的に許容される担体及びバッファーを含んで成るであろう。 ヒト及びウシVII因子の好適な態様において、その活性部位の残基Ser344は改 質、即ちGly,Met,Thr又はより好ましくはAlaにより置換されている。かかる置 換は慎重になされているか、又はHis193及びAsp242を含む触媒性トリアドにおけ るその他の部位においての(1又は複数の)置換との組合せにおいてなされてい てよい。 別の観点において、本発明は、ビタミンK依存性血漿タンパク質のプレープロ ペプチド及びglaドメイン並びにglaドメインレスVII因子タンパク質をそれぞれ エンコードする2本の作動連結した配列コード領域を含んで成るポリヌクレオチ ド分子に関連し、ここでその発現を経て、このポリヌクレオチドは血漿X又はIX 印を有意に活性化せず、且つ組織因子に結合することのできる改良型VII因子分 子をエンコードする。このポリヌクレオチドにより発現される改良型VII因子分 子は生物学的に活性な抗凝固剤であり、即ち、それは凝固カスケードを阻害でき 、それ故フィブリン沈着物又は凝塊の形成を阻害できる。この改良型VII因子を 発現させるため、このポリヌクレオチド分子を哺乳動物細胞系、例えばBHK,BHK 570又は293細胞系にトランスフェクトさせる。 図面の簡単な説明 図面はSer344→Ala改良型VII因子DNA配列のための発現ドクターの構築を示し ている。使用した記号は以下の通りである:0−1、アデノウィルス5由来の0 −1地図単位配列;E.SV 40エンリンサー;MLP、アデノウィルス2主要後期プ ロモーター;SS、一式のスプライス部位;そしてPA,SV 40由来のポリアデニル 化シグナル(遅い順〔late orientation〕)。 特定態様の詳細 抗凝固活性を有する新規の改良型VII因子を本発明により提供する。この改良 型VII因子はチモゲンの形態(即ち、一本鎖分子)であるか、又はその活性部位 において解裂されていてよい。この改良型VII因子の組成物は様々な哺乳類、特 にヒトに凝固カスケードを阻害するために投与するのに適する。改良型VII因子 は他の抗凝固性化合物と一緒に、又はそれらの代わりに患者に投与してよい。 VII因子は凝固カスケード、特に外因性経路に関与するものにおいて重要な役 割を果たす。不活性の一本鎖チモゲンタンパク質として循環血漿の中に存在して いるVIIa因子が組織因子及びカルシウムイオンとの組合せで活性化されると、 X因子をXa因子に活性化し、そしてIX因子をIXa因子に活性化し、フィブリン 凝塊の最終的形成が伴う。 本発明は、VIIa因子によりX及びIX因子の活性化を阻止又はそうでなければ 阻害することによりこの凝固カスケードにおけるこの一連の現象を阻害する能力 を提供する。本発明のVII因子タンパク質のVIIa因子の触媒活性を低め、同時に その分子が組織因子に対する結合能力を保持するように改質された触媒性部位を 有する。この改良型VII因子分子は組織因子に対する結合に関して天然のVII因子 及び/又はVIIa因子と競合する。その結果、X及びIX因子の活性化は阻害 される。 本発明の一の観点において、VIIa因子の触媒活性は触媒中枢又はトリアドの 化学的誘導化により阻害される。誘導化はVII因子を不可逆性インヒビター、例 えば有機燐化合物、スルホニルフルオリド、ペプチドハロメチルケトン又はアザ ペプチドとの反応により、又は例えばアシル化により成し遂げられうる。好適な ペプチドハロメチルケトンにはPPACK(D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン;米国 特許第4,318,904号;引用することで本明細書に組入れる)及びDEGRcK(ダンシ ル−Glu-Gly-Argクロロメチルケトン)が含まれる。 別の観点において、VIIa因子の触媒活性はアミノ酸を置換、挿入又は欠失す ることによっても阻害できる。好適な態様において、アミノ酸置換は、VIIa因 子触媒性部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書において定義するVI I因子触媒性トリアドのアミノ酸配列において施す。触媒性トリアドにおける置 換、挿入又は欠失は、この触媒性部位を構成するアミノ酸において、又はその隣 りとする。ヒト及びウシのVII因子タンパク質において、触媒性「トリアド」を 構成するアミノ酸はSer344,Asp242及びHis193である(添数字は配列における位 置を表示している)。その他の哺乳類に由来するVII因子における触媒性部位は 現状有用な技術、とりわけタンパク質単離及びアミノ酸配列分析を利用して決定 されうる。触媒性部位は配列を他のセリンプロテアーゼ、特にキモトリプシンで あってその活性部位が既に決定されているもの(Siglerら、J.Mol.Biol.,35: 143−164(1968);引用することで本明細書に組入れる)と整合させ、その整合 から類似である活性部位残基を決定することによっても決定することができうる 。 アミノ酸の置換、挿入又は欠失はX及び/又はIX因子のVIIa因子による活性 化を阻止又はそうでなければ阻害するように施す。しか しながら、VII因子は凝固カスケードにおける組織因子に対する結合について真 性のVII因子及び/又はVIIa因子と競合する能力も保持するように改質されてい るべきである。かかる競合は例えば本明細書に記載の凝塊アッセイにより、又は 例えばヒトの膀胱癌細胞系J28の如くの細胞表層組織因子を有する細胞系(Saka iら、J.Biol.Chem.264:9980−9988(1989):引用することで本明細書に組 入れる)を用いる競合結合アッセイにより、簡単に決定できうる。 VII因子における触媒性部位を構成するアミノ酸、例えばヒト及びウシのVII因 子におけるSer344,Asp242及びHis193は置換又は欠失のいづれかを行ってよい。 本発明においては、1個のアミノ酸のみを変え、それ故分子の抗原性の増強する 傾向を最少限にする、又は組織因子に結合するその能力を阻害する傾向を最少限 にすることが好ましいが、2個以上のアミノ酸の変化(置換、付加又は欠失)を 施してもよく、そして置換、付加及び欠失の組合せを施してもよい。ヒト及びウ シのVII因子にとっての好適な態様において、Ser344はAlaにより置換することが 好ましいが、Gly,Met,Thr又はその他のアミノ酸で置換してもよい。AspをGlu に置き換え、そしてHisをLys又はArgで置き換えることが好ましい。一般に、置 換は三次タンパク質構造の破綻を最少限にするように選ぶ。本明細書に引用する ことで組入れるDayhoffらのモデル(Atlas of Protein Structure 1978,Nat'l Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)はその他のアミノ酸置換を選ぶうえ での指針として用いられうる。ヒト、ウシ又はその他の種の適当なVII因子配列 の触媒性部位において上記の残基変化を導入し、そして得られるタンパク質を本 明細書に記載の通りにして所望の触媒活性阻害レベルについて及びその結果とし ての抗凝固活性について試験することができうる。改良型VII因子にとって、こ の触媒活性は実質的に阻害され、対応の種の野生型VII 因子の触媒活性の一般に約5%未満、より好ましくは約1%未満となるであろう 。 本発明のタンパク質は組換DNA技術の利用を介して製造することができうる。 一般に、クローンした野生型VII因子DNA配列は所望のタンパク質をエンコードす るように改良されている。この改良型配列を次に発現ベクターに挿入し、それを 次に宿主細胞の中に形質転換又はトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培 養哺乳動物細胞が宿主細胞として好ましい。ヒトVII因子にとっての完全なヌク レオチド及びアミノ配列が公知である。引用することで本明細書に組入れる米国 特許第4,784,950号を参照のこと。それにおいては、組換ヒトVII因子のクローニ ング及び発現が記載されている。ウシのVII因子配列は、引用することで本明細 書に組入れるTnkeyaらのJ.Biol.Chem.263:14868−14872(1988)に記載され ている。 アミノ酸配列の改変は様々な技術によって成し遂げられうる。DNA配列の改良 は部位特異的突然変異誘発によって施してよい。部位特異的突然変異誘発にとっ ての技術は当業界に公知であり、そして例えばZoller and Smith(DNA 3:479 −488,1984)に記載されている。即ち、VII因子のヌクレオチド及びアミノ酸配 列を利用することにより、選り抜きの改変を導入することができうる。 本発明に従って改良されたVII因子には、そのアミノ末端領域(glaドメイン) がビタミンK依存性血漿タンパク質IX因子、X因子、プロトロンビン、プロテイ ンC、プロテインS又はプロテインZのいづれかのglaドメインで置換されてい るものが含まれる。ビタミンK依存性血漿タンパク質のglaドメインは、ガンマ ーカルボキシグルタミン酸残基の存在を特徴とし、そして一般に長さが約30〜約 40個のアミノ酸であり、C末端は関連遺伝子におけるエクソン−イントロン境界 の位置に対応している。異種glaドメインを有するVII 因子の製造のための方法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,784, 950号に開示されている。 本発明において使用するためのDNA配列は一般に、宿主細胞から適正な後翻訳 プロセス(例えば、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化)及び分泌を得 るため、VII因子タンパク質のアミノ末端にあるプレープロペプチドをエンコー ドするであろう。このペレープロペプチドはVII因子又はその他のビタミンK依 存性血漿タンパク質、例えばIX因子、X因子、プロトロンビン、プロテインCも しくはプロテインSのそれであってよい。当業者にとって明らかな通り、この改 良型VII因子のアミノ酸配列において追加の改質を施してよく、この場合その改 質は抗凝固剤として働くそのタンパク質の能力を有意に損わないものとする。例 えば、触媒性トリアドにおいて改質されたVII因子はチモゲンVII因子からその活 性化された二本鎖形態に至る変換を阻害するようにその活性化解裂部位において 改質されていてもよい(これは一般に、引用することで本明細書に組入れる米国 特許第5,288,629号に記載されている)。 本発明の実施において利用する発現ベクターはクローン化遺伝子又はcDNAの転 写を指令できるプロモーターを含んで成るであろう。培養哺乳動物細胞において 利用するために好適なプロモーターにはウィルス性プロモーター及び細胞性プロ モーターが含まれる。ウィルス性プロモーターにはSV 40プロモーター(Snbrama niら、Mol.Cell.Biol.1:854−864,1981)及びCMV プロモーター(BoshartらCell 41:521−530,1985)が含まれる。特に好適なウィルス性プロモーターは アデノウィルス由来の主要後期プロモーターである(Kanfman and Sharp,Mol. Cell.Biol. 2:1304-1319,1982)。細胞性プロモーターにはマウスカッパー 遺伝子プロモーター(Bergmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7041−7045 ,1983 )及びマウスVHプロモーター(Lohら、Cell 33:85−73,1983)が含まれる。 特に好適な細胞性プロモーターはマウスのメタロチオネイン−Iプロモーターで ある(Palmiterら、Science 222:809−814,1983)。発現ベクターは、プロモ ーターの下流、且つVII因子配列自体にとっての挿入部位の上流に位置する一式 のRNAスプライス部位も含みうる。好適なRNAスプライス部位はアデノウィルス及 び/又はイムノグロブリン遺伝子から獲得できうる。発現ベクターの中に更に含 まれているのは挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルである。特に 好適なポリアデニル化シグナルには、SV 40由来の初期もしくは後期ポリアデニ ル化シグナル(Kanfman and Sharp、前掲)、アデノウィルス5Elb領域由来のポ リアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNotoら、Nu c.Acids Res, 9:3719-3730,1981)又はヒトVII因子遺伝子もしくはウシVII 因子遺伝子由来のポリアデニル化ジグナルが含まれる。この発現ベクターは更に 非コードウィルスリーダー配列、例えばこのプロモーターとこのRNAスプライス 部位との間に位置するアデノウィルス2三分節系リーダー;及びエンハンサー配 列、例えばSV 40エンハンサーを含みうる。 クローン化DNA配列を培養哺乳動物細胞に、例えばリン酸カルシウム媒介トラ ンスフェクションにより(Wiglerら、Cell 14:725−732,1978;Corsaro and P earson,Somatic Cell Genetics 7:603−616,1981;Graham and Van der Eb ,Virology 5201:456−467,1973)又はエレクトロポレーションにより(Neum annら、EMBO J.1:841−845,1982)導入する。外生DNAを発現する細胞を同定 及び選別するため、選択性表現型(選択マーカー)を授ける遺伝子を一般に課題 の遺伝子又はcDNAと一緒に細胞に導入する。好適な選択マーカーにはネオマイシ ン、ヒグロマイシン及びメトト レキセートの如くの薬剤に対する耐性を授ける遺伝子が含まれる。この選択マー カーは増幅性選択マーカーであってよい。好適な増幅性選択マーカーはジヒドロ フォレートリダクターゼ(DHFR)配列である。選択マーカーはThilly(Mammalia n Cell Technology, Butterworth Publishers,Stoneham,MA;引用することで 本明細書に組入れる)により論じられている。選択マーカーの選択は当業者にお いてよく知られている。 選択マーカーは課題の遺伝子と同時に独立のプラスミド上で細胞の中に導入す るか、又はそれらは同一のプラスミド上で導入することができうる。同一のプラ スミド上のとき、選択マーカー及び課題の遺伝子は異なるプロモーター又は同一 のプロモーターのコントロール下にあってよく、後者の配備は二重シストロン系 情報をもたらす(例えば、Levinson and Simonsen,米国特許第4,713,339号)。 「キャリヤーDNA」として知られる追加のDNAを、細胞に導入する混合物に加える ことが好都合であることもある。 細胞がDNAを取り込んだ後、それらを適当な増殖培地の中で一般に1〜2日間 増殖させて課題の遺伝子の発現を開始させる。本明細書で用いている「適当な増 殖培地」は栄養物並びに細胞の増殖及び改良型VII因子遺伝子の発現にとって必 要とされるその他の成分を含む培地を意味する。培地は一般に炭素源、窒素源、 必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び増殖因子を含 む。ガンマーカルボキシル化改良型VII因子の製造のためには、その培地はビタ ミンKを、好ましくは約0.1μg/ml〜約5μg/mlの濃度において含むであろ う。次いで安定な状態で選択マーカーを発現する細胞の増殖のために薬剤選択を 利用する。増幅性選択マーカーでトランスフェクトされた細胞にとっては、その 薬剤濃度は、増加したコピー数のクローン化配列を選択するため、それ故発現レ ベル を高めるために増大させてよい。安定的にトランスフェクトされた細胞のクロー ンを次に改良型VII因子の発現についてスクリーンにかける。 本発明における使用にとって好適な細胞系には(OS−1(ATCC CRL 1650)、 ベビーハムスター腎臓(BHK)及び293(ATCC CRL 1573;Grahamら、J.Gen.Vir ol. 36:59−72,1977)細胞系が含まれる。好適なBHK細胞系はtk- ts 13 BHK細 胞系である(Waechter and Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106− 1110,1982,引用することで本明細書に組入れる)。以降、これをBHK 570細胞 と呼ぶ。BHK 570細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、123 01 Parklawn Dr.,Rockville,MD 20852に、ATCC受託番号第CRL 10314で寄託さ れている。tk- ts 13 BHK細胞系もATCCから受託番号CRL 1632として入手できる 。更に、数多くのその他の細胞系も本発明において利用でき、それには以下のも のが含まれる。 ラットHep I(ラットの肝癌;ATCC CRL 1600),ラットHep II(ラットの肝 癌;ATCC CRL 1548),TCMK(ATCC CCL 139),ヒト肺(ATCC HB 8065),NCTC 1 469(ATCC CCL 9.1),CHO(ATCC CCL 61)及びDUKX細胞(Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220,1980)。 本発明に従って製造した改良型VII因子は抗VII因子抗体カラム上でのアフィニ ティークロマトグラフィーにより精製できうる。引用することで本明細書に組入 れるWakabayashiら J.Biol.Chem.261:11097−11108(1986)及びThimらBio chem. 27:7785−7793(1988)に記載のカルシウム依存性モノクローナル抗体の 利用が特に好ましい。追加の精製は慣用の化学精製手段、例えば高性能液体クロ マトグラフィーにより行われうる。その他の精製方法、例えばクエ ン酸バリウム沈殿が当業界に知られ、そして本明細書に記載の新規の改良型VII 因子の精製に適用することができうる(一般的には、Scopes,R.,Protein Puri fication,Springer,Verlag,N.Y.1982を参照のこと)。少なくとも約90〜95 %の均質性の、そして最も好ましくは98〜99%又はそれより高い均質性の実質的 に純粋な改良型VII因子が薬理学的用途にとって好ましい。部分的に、又は所望 の均質性にまで精製できたら、その改良型VII因子は治療的に利用できうる。 本発明の一の態様において、その改良型VII因子はその活性部位において解裂 されてその二本鎖形態へと変換する。活性化は当業界に公知の手順に従って行わ れることができ、その手順は例えば引用することで本明細書に組入れる、Osteru d,らBiochemistry 11:2853−2857(1972);Thomasの米国特許第4,456,591号; Hedner and Kisiel,J.Clin.Invest.71:1836−1841(1983);又はKisiel a nd Fujikawa,Behring Inst.Mitt. 73:29-42(1983)に記載されている。得ら れる改良型「VIIa因子」を以下の通りに配合して投与する。 本発明の改良型VII因子又はVIIa因子分子及びその薬理組成物は血管内凝固に 係る様々な症状を処置するためにヒトに投与するのに極めて有用である。例えば 、深遠血栓及び肺塞栓は慣用の抗凝固剤によって処置できうるが、本明細書に記 載の改良型VII又はVIIa因子は危険性が高いと認められた患者、例えば手術を受 ける者又はうっ血性心不全を有する者におけるトロンボ塞栓合併症の発症を予防 するのに利用できうる。更に、改良型VII又はVIIa因子は凝固の組織因子媒介誘 発にとっての拮抗薬として働き、その故トロンビンの生成及びその後のフィブリ ンの沈着を阻止することができる。従って、改良型VII又はVIIa因子は組織因子 活性を阻害するのに有用であり得、 凝血、血栓又は血小板沈着の阻害の如くの阻害をもたらす。 本発明の改良型VII又はVIIa因子は急性血管傷害に基づく内膜過形成及び再狭 窄の処置において極めて有用でありうる。急性血管傷害は、生活時にわたって発 症する慢性血管傷害(例えばアテローム症)とは対照的に、急速(即ち、数日か ら数ケ月)に起こる。急性血管傷害は往々にして外科処置、例えば血管形成術、 動脈血管内膜切除術、アテローム切除術、血管移植すえ付等を採用する技術であ る血管再構成に由来する。過形成は例えば移植すえ付又は器官移植に応答する遅 延型反応としても生じうる。改良型VII因子はヘパリンよりも選択性であり、一 般に傷害部において露出している組織因子のみに結合し、そして改良型VII因子 はその他の凝固タンパク質を破壊しないため、それに深遠静脈血栓の予防のため に予防的に使用する際、ヘパリンよりも有効、且つ出血の合併症を引き起こす傾 向が低いであろう。深遠静脈血栓の予防のための改良型VII因子の投与量は70kg の患者にとっては約50μg〜25mg/日、好ましくは1〜10mg/日の範囲とし、そ して投与は手続の少なくとも約6時間前から始め、そして少なくともその患者が 動き回れるようになるまで続けるべきである。再狭窄にとっての処置における改 良型VII又はVIIa因子の投与量は患者毎に変わるであろうが、一般に上記に提案 した範囲であろう。 冠状血管障害の処置における近年の進歩には、冠状動脈を通って流れる適度な 血流を再樹立するために邪魔なプラーク物質を排除又は除去する機械的介入の利 用が含まれる。バルーン血管形成術、整復アテローム切除、血管ステントの設置 、レーザー療法又はロトブレーターを含む様々な形式の機械的介入の利用にもか かわらず、これらの技術の有用性は、処置後6ケ月以内における約40%の再狭窄 率により制約され続けている。 再狭窄は、血小板沈着及び血栓形成、化学走性及びミトゲン因子の放出、並び に血管平滑筋細胞の拡張動脈セグメントの内膜に至る移動及び増殖を含む生物学 的過程の複雑な相互作用に由来するものと考えられている。 機械的傷害部位においての血小板蓄積の阻害はヒト対象体における再狭窄率を 抑えることができうる。血小板GpIIb/IIIaに対するモノクローナル抗体の治療 的利用はヒト対象体における再狭窄のレベルを抑えることができる(Califfら、N.Engl.J.Mcd. 330:956−961(1994))。この抗体は血小板の表層上のGpII b/IIIaレセプターに結合することができ、それ故血小板の蓄積を阻害する。こ のデーターは、ヒト冠状動脈における機械傷害の部位での血小板の蓄積の阻害が 、最終的な治癒応答が起こるのに有利であることを示唆する。血小板蓄積は急性 血管傷害部位において起こるが、これらの部位での血栓の発生は血小板の活性化 及びその後の蓄積にとっての原因となりうる。 以下の実施例において示している通り、本発明の改良型VIIa因子は細胞表層 組織因子に結合することができる。例えば、DEGR−VIIa因子は細胞表層組織因 子に、野生型VIIa因子と同等又は強い親和力で結合することができる。ところ で、DEGR−VIIa因子は酵素活性を有さないが、それは組織因子に結合して野生 型VIIa因子にとっての競合拮抗剤として作用し、それ故トロンビンの発生を招 く凝固の外因性経路におけるその後の段階を阻害する。 組織因子を維持する本発明の改良型VIIa因子分子は、トロンビンの生成及び その後のフィブリンの沈着を阻止することにより、血管傷害部位での血小板蓄積 を阻害する。 急性血管傷害部位においてトロンビン生成を阻止し、そして血小板沈着を抑え るDEGR−VIIa因子の能力に基づき、組織因子結合活性 は維持しているが、VIIa因子の酵素活性は失われている改良型VIIa因子は血管 再狭窄を阻止するのに利用できる。 確立された深遠静脈血栓及び/又は肺塞栓症において、患者の体重及び症状の 重度に依存して、改良型VII因子の投与量は約50μg〜25mgに範囲し、それに約5 00μg〜10mg/日に範囲する維持投与が続く。改良型VII因子点滴に由来する出 血合併症の傾向の低さを理由に、血栓症又は塞栓症に係る手術の最中又は後にお いて改良型VII因子はヘパリンにとって代わるか又はヘパリンの投与量を下げる ことができる。 本発明の改良型VII因子組成物は心臓の塞栓の予防及び血栓発作の処置におい てもかなりの有用性を有するであろう。出血合併症を起こす可能性の低さ及びそ の選択性を理由に、改良型VIIa因子は発作の患者に与えることができ、そして 閉塞性の動脈血栓の継続を阻止することができる。投与する改良型VII因子の量 は発作の性質及び重度に依存して患者毎に変わるであろうが、しかしその投与量 は一般に以下に提唱する範囲であろう。 ここに提供する改良型VII因子の薬理組成物はその改良型VII因子のインビボ凝 固を阻害する能力を理由に急性心筋梗塞における有用な処置をなすであろう。改 良型VII因子は急性心筋梗塞期の最中に組織プラスミノゲンアクチベーター又は ストレプトキナーゼと一緒に与えてよい。急性心筋梗塞において、その患者には 少なくとも約1〜25mgの改良型VII因子の投与量を与え、続いて約500μg〜約10 mg/日の維持投与量を与える。 本発明の改良型VII因子は散在性血管内凝固(DIC)の処置において有用である 。DICの特徴をもつ患者は広がり渡った微小循環血栓を有し、そして往々にして 必須の凝塊因子の消費をもたらす重度な出血の問題を有する。その選択性を理由 に、改良型VII因子は慣用の抗 凝固剤のようにDICに係る出血の問題を悪化させず、しかも更なる微小血管フィ ブリン沈着の形成を抑える又は阻害するであろう。 この薬理組成物は予防的及び/又は治癒的処置のための非経口的、局所的又は 局在的投与を意図する。好ましくは、この薬理組成物は非経口的に、即ち、静脈 内的に皮下的に、又は筋肉内的に投与する。即ち、本発明は許容の担体、好まし くは水性担体の中に溶解された改良型VII因子分子の溶液を含んで成る非経口投 与用の組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、0.4%の食塩水 、0.3%のグリシン等を使用してよい。この改良型VII因子分子は傷害部位に輸送 又はそれを標的化するためにリポソーム製剤へと処方してよい。リポソーム製剤 は一般に例えば引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,837,028号、米 国特許第4,501,728号及び米国特許第4,975,282号に記載されている。この組成物 は慣用のよく知られた滅菌技術によって滅菌してよい。得られる水性溶液を使用 のために包装するか、又は無菌条件下で濾過し、次いで凍結乾燥してよく、その 凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性溶液と混合する。この組成物は生理学的状態に 近づけるのに必要な薬理学的に許容されている補助剤、例えばpH調整剤及び緩衝 剤、等張性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム 、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含んでよい。これらの製剤中の改良型VII 因子の濃度は幅広く変えてよく、即ち約0.5重量%の低さから、通常は約1重量 %以上から、15又は20重量%の高さに至ってよく、そしてそれは主に選定した投 与の特定態様に従って流体容積、粘度等により選定されるであろう。 従って、静脈内点滴のための典型的な薬理組成物は250mlの滅菌Ringer溶液と 、10mgの改良型VII因子とを含むように調製してよい。非経口投与用化合物を調 製するための実際の方法は当業者に公知又 は自明であり、そして例えば引用することで本明細書に組入れるRemington's Pl armaceuticul Science 第16版、Mack Publishing Company−Easton,PA(1982 )に詳細されている。 改良型VII因子分子を含む組成物は予防的及び/又は治療的処置のために投与 してよい。治療的用途においては、既に障害に苦しんでいる患者に組成物を前記 の通りにして、その障害及び合併症を治癒又は少なくとも緩和するのに足り量で 投与する。これを成し遂げるのに適当な量を「治療的に有効な投与量」と定義す る。この用途にとって効果的な量は障害又は傷害の重度、並びに患者の体重及び 健康状態に依存するであろうが、しかし一般には70kgの患者にとっては1日当り 約0.05mg〜約25mgの改良型VII因子に範囲し、1日当り約0.5mg〜約10mgの改良型 VII因子の投与量がより一般的に利用される。本発明の材料は一般に重症な障害 又は傷害状況、即ち、生命が脅かされている又は潜在的に生命を脅かしている状 況において採用されうることを念頭に置かねばならない。かかるケースにおいて 、外因性物質の最少限化及びヒトにおける改良型ヒトVII因子の免疫原性の一般 的な欠如の観点から、処置医師は実質的に過剰な量のこれらの改良型VII因子組 成物を投与することが可能であり、そして所望しうる。 予防的用途においては、この改良型VII因子を含む組成物を障害又は傷害にか かり易い又はその危険性にある患者に、その患者自身の抗凝固能を高めるように 投与する。かかる量は「予防的に有効な投与量」と定義する。この用途において は、ここでもその正確な量は患者の健康状態及び体重に依存するが、しかし一般 には70kgの患者当り約0.1mg〜25mgに範囲し、より一般的には70kgの体重当り約0 .5mg〜約10mgであろう。 一回又は数回にわたるこの組成物の投与を、処置医師により選定 される投与レベル及びパターンで実施することができる。毎日の維持レベルを必 要とする動きまわれる患者にとっては、この改良型VII因子はポータブル式ポン プシステルの如くを用いる連続点滴により投与してよい。改良型VII又はVIIa因 子の局所導入は、例えばパーフュージョン、ダブルバルーンカテーテル、ステン ト又はその他のよく樹立された方法により実施できうる。いかなる状況において も、この薬理製剤は患者を効果的に処置するのに足り量の本発明の改良型VII因 子を供するべきであろう。 以下の実施例を、限定することなく例示のために提供する。 実施例I Ser344→Ala344VII因子の発現 Ser344→Ala VII因子活性部位突然変異体を作るため、プラスミドFVII(565+ 2463)/pDX(引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,784,950号;アメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号40205で寄託)をXba I及 びKpn Iで消化し、そして得られるセリン344についてのコード領域を含んで成る 0.6kbのフラグメントを回収した。このフラグメントを図に示しているXba I、Kp n I−消化M13mp19にクローンした。この操作及び以下に説明するその後の工程 は一般に標準のプロトコールに従って行った(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning,A Laboratory Mannal ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982);引用することで本明細書に組入れる;に記載 の通り)。 突然変異誘発はM13鋳型に基づき、Zoller and Smith前掲の方法に従い、突然 変異用オリゴヌクレオチドZC 1656(5′TGG GCC TCC GGC GTC CCC CTT 3′) 及び「可能」第二プライマーZC 87(5′TCC CAG TCA CGA CGT 3′)を用いて 行った。反応生成物をキナ ーゼ処理したZC 1656を用いてスクリーンした。陽性プラークを拾い、そして鋳 型DNAを用意し、そして1077にあるPst I部位から1213にあるKpn I部位に至るま で配列決定した。配列分析は所望の突然変異の存在を確証せしめた。この突然変 異クローンを1656と命名した。 次いで発現ベクターを1656クローンを用いて構築した。この突然変異配列をM 13ベクターから、〜0.14kbのPst I−Kpn Iフラグメントとして単離した。このフ ラグメントをFVII(565+2463)/pDX由来の1.7kbのHindIII−Xba Iフラグメン ト、FVII(565+2463)/pDX由来の0.5kbのXba I−Pst Iフラグメント及びFVI I(565+2463)/pDX由来の4.3kbのKpn I−HindIIIフラグメントに、図に示して いる通りにリゲートさせた。所望の突然変異配列の存在は突然変異体及び野生型 クローンをPst Iで消化し、そして突然変異VII因子をM13の中にKpn I及びXba I を用いて挿入し、消化DNAのサザンブロットを用意し、次いでそのブロットをラ ジオラベル化ZC 1656でプローブすることによって確認した。 ベビーハムスター腎細胞系BHK 570(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションに受託番号10314で寄託)に1656発現ベクターの2つの単離物(#544及 び#545と命名)をトランスフェクトした。この細胞はBHK 570細胞の集密10cmプ レートを非選択培地(10%の胎児牛血清及び1%のPSN抗生物質ミックス〔GIBCO Life Technologies,Gaithersburg,MD〕を含むDulbeccoの改良Eagle培地〔DME M〕)の中に5枚の10cmプレートに1:10で希釈することにより用意した。24時 間後、細胞が20〜30%の集密度に達したとき、それらを1656突然変異をエンコー ドする発現ベクターの一種の単離体プラスミドP486(アデノウィル5ori、SV 40 エンハンサー、アデノウィルス2主要後期プロモーター、アデノウィルス2三分 節系 リーダー、5′及び3′スプライス部位、DHFRr cDNA及びSV 40ポリアデニル化 ジグナル(pML−1〔Lusky and Botchan,Natnre,293:79−81(1981)〕中) を含んで成る)並びに10μgのキャリヤーDNA(音波処理したサケ***DNA)によ り、表1に示す通りに同時トランスフェクトした。DNAを15mlのチューブに入れ 、次いで0.5mlの2XHepes(25gのHepes,40gのNaCl,1.8gのKCl、0.75gのN a2HPO4・2H2O、5gのデキストロース;蒸留水で2.5lにまで希釈し、そしてpH 6.95〜7.0に調整)を加え、そしてそのチューブを混合した。各チューブ中のDNA を0.25MのCaCl2 0.5mlの添加、それと同時にそのDNA/Hepes溶液にパスツール ピペットを用いて空気を吹き込むことにより沈殿させた。そのチューブをボルテ ックスにかけ、室温で15分インキュベートし、そして再びボルテックスにかけた 。そのDNA混合物を次にピペットで細胞のプレート上に滴下した。そのプレート をゆらし、そして37℃で426時間インキュベートした。インキュベーション後、 トリス−食塩水(0.375gのKCl、0.71gのNa2HPO4、8.1gのNaCl、3.0gのトリ ス−HCl、0.5gのスクロース;全部で1リットルに希釈し、そしてpHをpH7.9に 調整)の中に希釈した20%のグリセロール2mlを各プレートに加えた。このプレ ートをゆらし、そして室温に2分放置した。次いでそのプレートから培地を除き 、そしてトリス−食塩水2mlに置き換えた。そのプレートを室温で2分放置し、 次いでトリス食塩水を除去し、そして10mlの非選択培地に置き換えた。そのプレ ートを37℃で2日間インキュベートした。 2日間のインキュベーション後、この細胞を選択培地(10%の透析胎児牛血清 、1%のPSN抗生物質ミックス及び150nMのメトトレキセートを含むDMEM)の中に 希釈し、そしてmaxiプレートの中に1:100、1:250及び1:500の希釈率でプ レートした。これらのプレートを37℃で1週間インキュベートした。1週間後、 その培地を選択培地に交換し、そしてそのプレートをコロニー形成についてチェ ックした。 8日後、コロニー形成を経て、12のコロニーを#544及び#545トランスフェク ションプレートの1:500の希釈プレートからランダムに選択した。各クローン を6穴プレートの1のウェルの中に入れ、そして選択培地の中で増殖させた。7 日後、それらのプレートは集密となり、そしてそれらのプレートを選択培地にお いて10cmのプレートにそれぞれ分割した。 上記のクローン及び野生型VII因子を発現するようにトランスフェクトされた コントロール細胞を35S−メチオニン−システインタンパク質ラベル用混合物( NEN Dupont Biotechnology Systems,Wilmington DE)で代謝ラベルした。これ らのクローンを選択培地の中で のパルスラベル実験のために増殖させて用意した。その細胞をリン酸緩衝食塩水 (Sigma,St.Louis,MO)ですすぎ、そして20μCi/mlの35S-Cys- 35S-Metの 中で4時間パルスに付した。4時間後、上清液及び細胞を回収した。その細胞を Lenk and Penman(Cell 16:289−302,(1979))に本質的に記載の通りに溶解 し、そして400μlづつのリゼートを50μlのstaph A(Sigma,St.Louis,MO )で予備清浄した。 代謝ラベルした細胞由来のサンプルを、まずそのサンプルを6μlの抗−VII 因子ポリクローナル抗血清と4時間インキュベートすることによりラジオ免疫沈 殿(RIP)させた。60μlの洗浄スタフィロコッカス・プロテインAを各サンプ ルに加え、そしてそのサンプルを4℃で1.5時間ゆうした。このサンプルを遠心 し、そしてその上清液を除去した。このペレットを0.7MのRIPAバッファー(10m Mのトリス、pH7.4、1%のデオキシコール酸〔Calbiochem Corp.,La Jolla,CA 〕、1%のトリトンX−100、0.1%のSDS、5mMのEDTA、0.7MのNaCl)で2回、 そして0.15MのRIPAバッファー(10mMのトリス、pH7.4、1%のデオキシコール 酸〔Calbiochem Corp.,La Jolla,CA〕、1%のトリトンX−100、0.1%のSDS 、5mMのEDTA、0.15MのNaCl)で1回洗った。100μlの1XのSDS染料(50mMの トリス−HCl、pH6.8、100mMのジチオスレイトール、2%のSDS、0.1%のブロモ フェノールブルー、10%のグリセロール)を各サンプルに加え、そしてそのサン プルを5分煮沸し、そして遠心してプロテインAを除いた。50μlづつの各サン プルを10%のポリアクリルアミドゲルで泳動させた。結果は、10クローンのうち 9クローンが改良型VII因子を分泌することを示した。 実施例II 改良型VII因子の抗凝固活性 改良型VII因子タンパク質の凝塊を阻害する能力をコントロールとして野生型V II因子を用いる一段凝塊アッセイで測定した。組換タンパク質は5μg/mlのビ タミンKを含む培地の中で培養した細胞から本質的に上記の通りに調製した。様 々な量の改良型VII因子(クローン544由来)又は組換野生型VII因子を50mMのト リスpH7.5、0.1%のBSAの中で100μlとなるように希釈した。その混合物を100 μlのVII因子欠損血漿(George King Bio-Medical Inc.,Overland Park,KS) 及び200μlのトロンボプラスチンC(Dade,Miami,FL;ウサギ脳トロンボプラ スチン及び11.8mMのCa++を含む)とインキュベートした。凝塊アッセイは自動凝 塊タイマー(MLA Electra800,Medical Laborator,Automation Inc.,Pleasant ville,NY)で行い、そして凝塊時間を1:5〜1:640の希釈率の正常プールヒ ト血漿(1単位/mlのVII因子活性を確実に含むようにしてある;健康なドナー 由来のクエン酸処理血清をプールすることにより調製)で作製した。標準曲線を 用いてVII因子活性単位に変換させた。このアッセイを利用すると、改良型VII因 子の調製品は検出可能な凝固活性を示さなかった。表2はコントロール(未トラ ンスフェクト)BHK細胞コンデイション化培地(+/−ビタミンK)、野生型VII 因子及び改良型VII因子を発現する2種の細胞単離体についての凝塊時間につい てのアッセイ結果を示す。VII因子活性はコントロールサンプルに比べて凝塊時 間を短縮するようである。 血漿因子基質に及ばす改良型VII因子の効果を調べるため、改良型VII因子及び 組換野生型又は天然VII因子の調製品をX因子又はIX因子のいづれかとインキュ ベートし、そしてその活性化を凝塊アッセイ又はポリアクリルアミドゲル電気泳 動によりモニターした。 実施例III 組織因子に結合する改良型VII因子の能力 改良型VII因子の、組織因子に対しての野生型VII因子と競合する能力及びその 凝塊活性を阻害する能力を規定量の組織因子(トロンボプラスチン)の存在下で の一段凝塊アッセイで評価した。 凝塊時間は実施例IIに記載と類似の一段アッセイにおいて決定した。規定量の 組織因子、一定量の野生型VII因子及び上昇していく量のVII因子変異体を混合実 験において用いた。VII/VIIa因子プロ凝固 活性の阻害は、上昇していく量のVII因子変異体を含むアッセイにおいて、凝塊 時間の増大として認められるであろう。 試験サンプル中のVII因子活性の値は、正常プール血漿中のVII因子活性を測定 せしめる標準曲線のパーセンテージとして計算した。VII因子活性についての標 準曲線は、1:5から1:640に範囲するリン酸緩衝溶液(PBS)中での正常プー ル血漿の希釈系列を用いて作製した。この目的のため、正常血漿が約500ng/ml のVII因子を含むことを確実にしておき、そしてこれを1単位の活性と考慮した 。100μlのVII因子欠損血漿、100μlの血漿希釈品及び200μlのトロンボプラ スチン−C(Dade,Miami,FL)の混合物をMLA Electra800自動タイマーで凝塊 時間を測定するために用いた。標準曲線を樹立するため、この結果を活性のパー センテージ(1:5=100%活性)対、秒における凝塊時間としてグラフにした 。 このアッセイは、野生型及びVII因子変異体を含む培地が1%未満の血清より 成ることを必要とする。希釈をPBSで行い、これによりその凝塊時間が標準曲線 に載るようにした。1:2の最少希釈率が一般的である。最終容量は100μlと した。クローン「#10」及び「#6」と命名する2種類のヒトVII因子Ser344→A la変異体をこの実験において試験した。以下の表に記載のその結果は、VII因子 の量が増大すると、VIIa因子の活性のパーセンテージが低下することも示した 。 これらの実験は、Ser344→Ala置換を有するVII因子の変異体が、投与量依存性 状況で天然VII因子と競合し、そして天然VII/VIIa因子のプロ凝固活性を阻害 することを示した。従って、Ser344→AlaヒトVII因子変異体は天然ヒトVIIa因 子と競合し、そして結果としてヒト血漿中のX及び/又はIX因子の活性化を阻害 するものと考えられ うる。 実施例IV PPACKとのVII因子の反応 組換VII因子をトランスフェクトベビーハムスター腎細胞の中で製造させた。 このタンパク質を引用することで本明細書に組入れるThimら(Biochemistry 27 :7785−7793,1988)、Brinkousら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1382-13 86,1989)及びBjoern and Thim(Res.Discl.No.269,564,1986)に記載の 通りにして精製及び活性化させた。その細胞培養培地を回収し、濾過し、そして 希釈して販売時の濃度を下げた。この希釈培地を次にCaCl2含有溶離用バッファ ーを用い、アニオン交換クロマトグラフィーにより分画した。VII因子画分を回 収し、そしてカルシウム依存性抗−VII因子モノクローナル抗体を用いるイムノ クロマトグラフィーにより更に精製した。更なる精製を2段式アニオン交換クロ マトグラフィー工程を利用して実施し、ここでVII因子をCaCl2及びNaClのそれぞ れを用いて溶離させた。VIIa因子を最終溶離液から回収した。 50mMのトリス−HCl、100mMのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.4中の組換VIIa因子( 1μM)を20μMのPPack(D−フュニルアラニル−プロリル−アルギニルクロ ロメチルケトン;Calbiochem,La Jolla,CA)と5.20及び60分インキュベートし た。次に発色原基質S2288(H−D−イソロイシン−L−プロリル−L−アルギ ニンP−ニトロアニリド;Kabi Vitrum AB,Molndal,Sweden)を含むバッファ ーを加えて2.5倍の希釈率及び0.3mMのS2288の最終濃度とした。p−ニトロアニ リンの生成を測定し、そしてコントロールとして未処理VIIa因子を用いた結果 と比較した。その結果は、VIIa因子がこれらの反応条件下で60分後に完全に失 活することも示した。 実施例V DEGR−VIIa因子の生成 組換ヒトVIIa因子を実施IVに記載の通りにして調製した。10mMのグリシンバ ッファー、pH8.0、10mMのCaCl2、50mMのNaCl中の組換VIIa因子を1.5mg/mlの濃 度に希釈した。蒸留H2Oに溶解しておいた10倍過剰モル量のダンシル−L−Glu-G ly-Arg-クロロメチルケトン、DEGRcK(Calbiochem.La Jolla,CA 92037)をVII a因子は加えた。37℃で2hのインキュベーション後、第2の10倍過剰モル量の DEGRcKをこの混合物に加え、そして37℃で更に2時間インキュベートした。第3 の10倍過剰モル量のDEGRcKをVIIa因子に加え、そして4℃で約16時間インキュ ベートした。次にDEGR−VIIa因子サンプルをトリス緩衝食塩水(0.05Mのトリ ス−HCl、0.1MのNaCl、pH7.5)に対して4℃で十分に透析して遊離のDEGRcKを 全て除いた。 この最終DEGR−VIIa因子混合物をXa因子発色原基質アッセイにおいて遊離D EGRcKの存在について試験した。このDEGR−VIIa因子混合物を精製ヒトXa因子 に、発色原基質S−2222と一緒に加えた。この混合物中の未結合DEGRcKはXa因 子に結合することができ、それ故Xa因子の発色活性を阻害できる。遊離DEGRcK をXa因子混合物にスパイクすることは、溶液中の遊離DEGRcKのレベル、対、X a因子発色活性の阻害を測定するための標準曲線をもたらす。DEGR−VIIa因子 混合物の分析は、遊離DEGRcK:DEGR−VIIa因子の比が長期透析を経て0.5%未満 となることを示し、それ故以下に記載の様々なアッセイ系におけるDEGR−VIIa 因子により認められる阻害は遊離DEGRcKの存在に基づくものでないことを保障す る。 実施例VI ラットの平滑筋細胞上でのXa因子の作製 血管の平滑筋細胞を細胞表層組織因子の存在について、X因子のXa因子への 変換を刺激するその細胞の能力をXa因子に特異的な 発色原基質を用いて測定することによって分析した。 ラットの血管平滑筋細胞(Clowesら、J.Clin.Invest,93:644−651(1994 ))を96穴培養ディッシュ(American Scientific Products,Chicago,IL)に 、増殖培地(表4)においてウェル当り8,000細胞でプレートした。 37℃で48時間のインキュベーション後、その培地を無血清培地と交換した(表 5)。 これらの細胞を37℃で7時間インキュベートした。インキュベー ション後、PDGF−BB(10ng/ml)又は10%の胎児牛血清を細胞に加えて組織因子 発現を刺激した(Taubmanら、J.Clin.Invest.91:547−552,1993)。一組の 平行セットの細胞には、未剌激細胞の固有活性についてモニターするため、PDGF 又は血清のいづれも与えなかった。6時間のインキュベーション後、組換ヒトVI Ia因子を細胞に10nMの最終濃度で加えた。一セットの細胞は陰性コントロール として、VIIa因子は加えていない。この細胞を37℃で2時間インキュベートし 、そしてHEPESバッファー(10mMのHEPES、137mMのNaCl、4mMのKCl、5mMのCaCl2 、11mMのグルコース、0.1%のBSA)で洗った。洗浄後、細胞を5mMのCaCl2の添 加したトリス緩衝食塩水中の50ml/ウェルの200nMの血漿精製ヒトX因子とイン キュベートした。25μlの0.5MのEDTA及び25μlの800μMのS−2222発色原基 質溶液(Kabi Pharmacia,Franklin,OH)を各ウェルに加えた。これらのプレー トを室温で40分インキュベートし、次いでTHERMO MAX Microplate Reader(Mole cular Devices,Menlo Park,(A)を用い405nmで分析した。 表6はVIIa因子処理ウェルの、コントロールウェル(VIIa因子を添加してい ない)に比しての吸収の上昇を示す。吸収の上昇はウェルの中で生成したXa因 子のレベル及び発色団を放出せしめる発色原基質のその後の解裂の測定値である 。このデーターは、PDGF−BB又は10%の胎児牛血清のいづれかに処理した細胞に おける発色活性のレベルが未剌激細胞より高いことも示している。 これらの結果は、ラットの血管平滑筋細胞の細胞表層上でX因子からXa因子 に至るVIIa因子存在性活性化があることを明確に示している。 実施例VII DEGR−VIIa因子による細胞表層発色活性の阻害 ラットの血管平滑筋細胞を上記の通りにして96穴培養ディッシュにプレートし た。これらの細胞を上記の無血清培地の中で72時間培養し、そして10%の胎児牛 血清を添加して6時間処理し、組織因子発現を刺激した。刺激後、バッファーの み(コントロール)、10nMのVIIa因子又は10nMのVIIa因子+100nMのDEGR−VII a因子を各ウェルに加えた。この細胞を37℃で2時間インキュベートし、次いで HEPESバッファーで洗った。洗浄後、これらの細胞を50μl/ウェルの200nMのX 因子(5mMのCaCl2の添加されたトリス緩衝食塩水中)と5分間インキュベート した。25μlの0.5MのEDTA及び25μlのS−2222(800μM)発色原基質(Kabi Pharmacia)を各ウェルに加えた。この細胞を室温で40分インキュベートした。 発色活性を上記の通りにして405nmで分析した。 表7は、VIIa因子のみで処理したウェルにおける発色活性の刺激、及びDEGR −VIIa因子をVIIa因子と一緒にインキュベートしたときの刺激の阻害を示す。 これらの結果は、DEGR−VIIa因子がVIIa因子結合にとっての競合的拮抗剤とし て働き、それ故X因子のXa因子 に至る活性化を阻害し、その後のS−2222発色現の解裂を阻害することを示して いる。 実施例VIII ラットの平滑筋細胞上での細胞表層発色活性のDEGR-VIIa因子による投与量依 存性阻害 ラットの血管平滑筋細胞を96穴培養皿の中に4,000細胞/ウェルにおいて、1 %の胎児牛血清の添加した増殖培地の中でプレートした(表4に記載の10%の 胎児牛血清でなく)、5日後、その培地を除去し、そして上昇していく濃度のVI Ia因子のみ、又は10nMのVIIa因子と上昇していく濃度のDEGR−VIIa因子を細 胞に加えた。この細胞をVII因子混合物と37℃で2時間インキュベートした。イ ンキュベーション後、その細胞を洗い、そしてトリス緩衝食塩水中の200nMのX 因子50μlと室温で5分インキュベートした。各ウェルに0.5MのEDTA25μl及 び800μMのS−2222(Kabi Pharmacia)25μlを加え、そしてそのプレートを 室温で40分インキュベートした。発色活性を上記の通りにしてマイクロタイター プレートリーダーで405nmで分析した。 表8は、ウェルに加えるVIIa因子の量の上昇に伴う発色活性の投与量依存性 上昇を示す。DEGR−VIIa因子と100nMのVIIa因子との混合物を細胞に加えると (表9)、発色活性における投与量依存性阻害が起こる。1:1のモル比のDEGR −VIIa因子:VIIa因子は約95%の発色活性を阻害した。これらのデーターは、 DEGR−VIIa因子が天 然VIIa因子よりも細胞表層組織因子に対する。有意に高い親和力を有している ことを示している。もしDEGR−VIIa因子及びVIIa因子が組織因子に対して同等 の親和力を有するなら、これらの2種の分子を等モル比で加えたときに観察され る阻害レベルはそれほど高くないであろう。 表9はDEGE−VIIa因子によるラットの平滑筋細胞上でのXa因子発色活性の 投与量依存性阻害を示す。上昇していく濃度のDEGR−VIIa因子を100nMのVIIa 因子と一緒にインキュベートし、そしてXa因子発色活性を発色原基質S−2222 を用いて決定した。 実施例IX 可溶性組織因子アッセイでのDEGR−VIIa因子によるXa因子生成 の阻害 精製組換可溶性組織因子を用いるX因子のXa因子に至る変換を発色アッセイ を用いて確立した。組織因子をサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae )(Shigematsnら、J.Biol.Chem.267:21329−21337,1992)から 発現及び精製した。可溶性組織因子はDr.Walt Kisiel(New Mexico大学、Albeq uerque,NM)により精製及び特性化されている、65.9μlの可溶性組織因子(2. 2μm)、29.0μlのPCPS(1mM,Sigma,St.Louis,MO)、29.5μlのヒトX 因子(4.1μM)、2.77mlのHankバッファー(25mMのトリス、pH7.4、150mMのNaC l、2.7mMのKCl、5mMのCaCl2、0.1%のBSA)を含む反応混合物を調製した。40μ lの組織因子/X因子混合物、TBSで希釈した25μlのVIIa因子、及びTBSで希 釈した25μlのDEGR−VIIa因子を96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに 加えた。10μlのS−2222(4mM)発色原基質をウェル中の反応混合物に加え、 そして室温で2〜10分インキュベートした。結果は上記の通りにしてマイクロタ イタープレートリーダーで405nmで分析した。 X因子のVIIa因子活性化についての標準曲線の決定を、DEGR−VIIa因子の非 存在下で加える上昇していく濃度のVIIa因子を用いて行った。表10に示す結果 は、反応混合物に加えるVIIa因子の量の増大に伴い、発色活性の投与量依存性 上昇があることを示す。様々な量のDEGR−VIIa因子及び100nMのVIIa因子の同 時添加は発色活性における投与量依存性低下を招いた(表11)。これらのデータ ーは、DEGR−VIIa因子が可溶性組織因子に対する天然VIIa因子の結合にとって の競合的拮抗剤として働き、それ故発色原基質S−2222に対する発色活性におけ る低下により測定される通り、Xa因子の生成を阻害することを示す。 実施例X DEGR−VIIa因子による凝固の阻害 凝塊時間に及ぼすDEGR−VIIa因子の効果をモニターする標準凝塊アッセイを 下記の通りに準備した: 抗凝固剤としてのクエン酸ナトリウムにより集めた100μlの正常ヒヒ血漿をT BS(20mMのトリス、pH7.4:150mMのNaCl)に希釈してある様々な濃度のDEGR−VI Ia因子100μlに加えた。このサンプルを混合し、そして37℃で簡単にインキュ ベートした。このサンプルをElectra 800自動Coagnlation Timer(Medical Labo ratorics Automation,Pleasantiville,NY)に加えた。インキュベーション後 、25mMのCaCl2を含む200μl組織因子調製品をDEGR−VIIa因子調製に加えた。 組織因子調製品は新鮮な凍結脳組織由来のヒヒ脳の食塩水抽出物として作り、そ してヒヒ血漿における凝固を開始する能力について特性化した。約40秒の凝塊時 間を付与する組織因子の濃度を選んだ。 表12に示すデーターは、DEGR−VIIa因子の添加に基づく凝塊時間の投与量依 存性増大を示す。血漿中の1μg/mlほど低いDEGR−VIIa因子の投与量が凝塊 時間の有意な増大をもたらした。 実施例IX DEGR−VIIa因子による血小板蓄積の阻害 DEGR−VIIa因子を、非ヒト霊長類における機械的傷害に基づく動脈血栓部位 での血小板蓄積を阻害する能力について分析した。動脈血管内膜切除術のモデル を本質的にLumsdenら(Blood 81:1762−1770,1993)に記載の通りにしてヒヒ において利用した。長さ1〜2cmのヒヒの動脈区域を取り出し、ひっくり返し、 そして動脈の内膜及び約50%の媒質を取り除くためにひっかいた。その動脈をそ の正しい向きに戻し、両端にカヌーレを施し、そしてヒヒの体外シャントに設置 し、これによりその機械的に傷害を受けた動脈をそのシャントを介してヒヒの血 液にさらされるようにした。シャントを循環血液に通じさせる直前に、111In− ラベル化自己血小板をその動物に静脈内注射した。傷害を受けた動脈部位での血 小板の蓄積レベルをリアルタイム・ガンマーカメライメージングにより決定した 。 血小板蓄積の阻害についてのDEGR−VIIa因子の評価はDEGR-VIIa因子又は食 塩水コントロールのボーラス注射を利用して行い、そしてシャントを通じさせる 直前に与えた。傷害を受けた動脈を60分間連続測定した。0.005mg/kgのDEGR−V IIa因子投与量が血小板蓄積を阻害した。1.0mg/kgのボーラス注射では、約90 %の血小板蓄積が薬剤投与の1時間後において阻害された。 これらのデーターは、DEGR−VIIa因子による組織因子の阻害が、急性血管傷 害の非ヒト霊長類モデルにおける血小板に富む血栓の発症を有意に阻害すること を示す。 以上より、改質された触媒部位を有する組織因子に結合し、しかもX及びIX因 子を実質的に活性化できないVII因子組成物又はVII因子が提供されることが明ら かである。改良型VII因子は凝塊因子を分解又は消費することなく凝塊カスケー ドを妨害できるため、改良型VII因子調製品の投与は現状の療法で経験するより も少ない望ましくな い副作用が伴うであろう。更に、本明細書に記載のこの改良型VII因子は組換手 段により簡単に作られうる。その薬効、慣用さ、並びに低投与量及び少ない投与 頻度の経済性、更には毒性の相対的欠如が本発明の組成物により供される利点で ある。 以上で本発明を例示の目的でかなり詳しく説明してきたが、本発明はその範囲 を逸脱すること変更及び改良されうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バークナー,キャスリーン エル. アメリカ合衆国,ワシントン 98199,シ アトル,トゥエンティセカンド アベニュ ウェスト 3032 (72)発明者 ペテルセン,ラルス クリスチャン デンマーク国,デーコー―ホエルスホル ム,ハベバイ 4 (72)発明者 ハート,チャールズ イー. アメリカ合衆国,ワシントン 98036,ブ ライアー,トゥエンティーファースト ア ベニュ ウエスト 21502

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.患者の組織因子活性を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中 枢において少なくとも一つの改良を有するVII因子を含んで成る治療的に有効な 投与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿X又はIX因 子を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、方法 。 2.前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応を含ん で成る、請求項1記載の方法。 3.前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである、請求項2記載の方法。 4.前記プロテアーゼインヒビターがD-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン又は ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチルケト ンである、請求項3記載の方法。 5.前記VII因子の改良が、Ser,Asp及びHisの触媒性トリアドにおける少なく とも1個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含んで成る、請求項1記載の方法。 6.患者の血管再狭窄を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中枢 において少なくとも一つの改良を有するVII因子を含んで成る治療的に有効な投 与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿X又はIX因子 を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、方法。 7.前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応を含ん で成る、請求項6記載の方法。 8.前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである 、請求項7記載の方法。 9.前記プロテアーゼインヒビターがD-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン又は ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチルケト ンである、請求項8記載の方法。 10.患者の血小板沈着を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中枢 において少なくとも一つの改良を有するVII因子を含んで成る治療的に有効な投 与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿X又はIX因子 を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、方法。 11.前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応を含ん で成る、請求項10記載の方法。 12.前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである、請求項10記載の方法。 13.前記プロテアーゼインヒビターがD-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン又は ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチルケト ンである、請求項12記載の方法。 14.前記VII因子の改良が、Ser,Asp及びHisの触媒性トリアドにおける少なく とも1個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含んで成る、請求項12記載の方法。 15.触媒中枢において少なくとも一つの改良を有する薬理学的に許容されるVI I因子の組成物の個体における血管再狭窄を阻害するための処置のための利用で あって、この改良は血漿X又はIX因子を活性化するこの改良型VII因子の能力を 実質的に阻害するものである、利用。 16.触媒中枢において少なくとも一つの改良を有する薬理学的に許容されるVI I因子の組成物の個体における血小板沈着を阻害するた めの処置のための利用であって、この改良は血漿X又はIX因子を活性化するこの 改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、利用。
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