JPH0253490A - アルギニン・デイミナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なアルギニン・デイミナーゼ遺伝子およ
び該遺伝子を用いたアルギニン・デイミナーゼの製造法
に関する。

〔従来の技術〕

アルギニン・デイミナーゼ（酵素分類番号３゜５．３．
６）は、Ｌ−アルギニンと水からし−シトルリンとアン
モニアを生成する酵素反応を触媒する酵素であり、動物
、細菌、酵母類にその存在が知られている〔酵素ハンド
ブック、６０２頁。

朝食書店、　１９８４年版、第１版第３刷〕。

これらの酵素のうち、精製されたと報告のあるものとし
ては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　、マイコプラズマ・ホミ
ニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイ
コプラズマ・アルスリティディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ　ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）が知られている〔カキモ
ト、ティー、ら（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、　Ｔ、ｅｔａｌ）
フェプス　レター（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）　　ＶＯＬ
、１９．　Ｐ　１６６４６８、　（１９７１）　；シム
ケ、アール、ティ、　（Ｓｈｉｍｋｅ、ＲｌＴ、）　　
メソッド　オブ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　ＶＯＬ、１７八、Ｐ　３１０−３
１３．　（１９７０）　；ワイクマン、ジエー、エル、
アンド　ファルニー、デイ−イー、　（Ｗｅｉｃｋｍａ
ｎ、Ｊ、Ｌ、　＆　Ｆａｈｒｎｅｙ＋Ｄ、Ｅ、）　　ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　ＶＯＬ、２５２．Ｐ２６１５
−２６２０．（１９７７））。

〔発明が解決しようとする問題点〕

腫瘍細胞増殖阻害剤として有用であるアルギニン・デイ
ミナーゼは、従来、アルギニン・デイミナーゼ生産菌に
より生産していたが、これらの製造法にはいくつかの問
題点があった。すなわち、これらのアルギニン・デイミ
ナーゼ生産菌は、アルギニン・デイミナーゼ生産性が低
いこと；マイコプラズマに属するマイコプラズマ・ホミ
ニス（門ｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイ
コプラズマ・アルスリティディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ　ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）から採取する場合は培養
管理が煩雑であり、該酵素の大量生産における酵素源と
して用いるには難点があること；精製純化するのに極め
て困難である等である。

アルギニン・デイミナーゼをコードする詳細な遺伝子の
一次構造及び構成するタンパク質のアミノ酸配列の一次
構造は未だ報告されておらず、上記問題点の具体的解決
法が求められていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、先に動物腫瘍細胞ＴＲＣ−２９Ｒの培養
中、顕著に増殖阻害を示す細胞株を見出し、その株につ
いて、種々研究を行った結果、その株に寄生したマイコ
プラズマ属に属する菌株マイコプラズマ・オラーレ（Ｔ
ＯＩＦ）（微工研菌条寄第１９７０号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１９７０）〕が、アルギニン・デイミナーゼを産生
ずることを見出した。

さらに、本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結
果、アルギニン・デイミナーゼをコードする詳細な遺伝
子ＤＮＡの一次構造及び構成する該酵素のアミノ酸配列
の一次構造を決定することに成功し、該Ｄ　Ｎ　Ａを保
持するベクターおよび形質転換体を得、該形質転換体を
培養するアルギニン・デイミナーゼの製造法を確立し本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下に示す通りである。

アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。

アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持す
ることを特徴とするベクター宿主にとって外来性である
アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持す
ることを特徴とする形質転換体、 Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残基または水
素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはＯＨを示す〕で
表されるポリペプチドを構成成分とするアルギニン・デ
イミナーゼ、および宿主にとって外来性であるアルギニ
ン・デイミナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転
換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該
培養物からアルギニン・デイミナーゼを構成するポリペ
プチドを採取することを特徴とするアルギニン・デイミ
ナーゼの製造法。

本発明のアルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
は新規物であり、本発明においてアルギニン・デイミナ
ーゼとは前述の通りＬ−アルギニンと水からＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒するものを
示すが、特に例えば下記の理化学的性状を有するものを
挙げることができる。

（ａ）　　作用；Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリ
ンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒する、 （ｂ）　　基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を
有する、 （ｃ）　　至適ｐＨ；７゜０〜７．５、（ｄ）ｐＨ安定
性；５．０〜１０．０゜また、アルギニン・デイミナー
ゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ末端側
より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を
°″示し、Ｂはアミノ酸残基または−ＯＨを示す］で表
されるものであってもよい。該ポリペプチドのアミノ酸
配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては、図中
のＡ、Ｂがアミノ酸残基を示す場合であり、Ａ、Ｂを含
め各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか
１個のコドンからなるＤＮＡ　（ポリデオキシリボ核酸
）であればよい。

アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列の代表例として、５°
末端側より第２図〔図中、＊＊＊はＴＧＡまたはＴＧＧ
を示す〕で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げるこ
とができる。該塩基配列を含むＤＮＡは、該塩基配列の
５′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有
したものでもよく、好ましくはＡＴＧまたはシグナルペ
プチドに対応するコドンを有したものを挙げることがで
きる。３　末端側には、アミノ酸をコードするコドンを
１個以上有するかまたは翻訳終止コドンを有するかのい
ずれでもよく、更に、その３゜末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸
をコードするコドンの３″末端に翻訳終止コドンを有Ｖ
ることが好ましい。

これらの塩基配列は以下の如く決定した。即ち、予め、
後記の精製法により精製したアルギニン・デイミナーゼ
のＮ末端アミノ酸配列の一部を、液相プロティン　シー
ケンサ−（ベックマン社製：ＢＢＣＫＭＡＮ　　Ｓｙｓ
ｔｅｍ　　８９０ＭＥ）で決定し、該アミノ酸配列を基
にして合成されたプ・ローブを作製する。次いでこのプ
ローブを用い、後記の方法により作成された遺伝子ライ
ブラリーとコロニーハイブリダイゼーションを行い、ク
ローニングを行い、アルギニン・デイミナーゼを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を
含むＤＮＡを保持する形質転換体′を得、該形質転換体
より、アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを
採取する。その塩基配列は、５ｃｉｅｎｃｅ　２１４　
１２０５〜１２１０　（１９８１年）に示されているジ
デオキシ法で解読し、またアルギニン・デイミナーゼの
全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定し、本発明の
アルギニン・デイ制限酵素で切断し、該ＤＮＡ断片をベ
クターに挿入し、得られた組換えプラスミドで宿主微生
物を形質転換しライブラリーを作製する方法が挙げられ
る。

分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ　、旧ｎｄｌｌＩ　
、　Ｂａｍ１１１などの■型制限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適している。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場
合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用できる
。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２。

ｐＢＲ３２５、ｐＡｃＹｃ１８４．　　ｐＵｃ１２．　
　ｐｌＪｃ１３．　　ｐＵｃ１８ｐＵｃ１９．　ｐＵｃ
１１８などが、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ）を宿主微生物とする場合には
ｐＵＢｌｌｏ　、ｐｃ１９４などが使用でき、さらに、
エシェリヒア・コリおよびサツカロマイセス・セレビシ
アなどの二種以上の宿主微生物体内で自律的に増殖可能
なシャトルベクターを利用することもできる。このよう
なベクターを、先に述べたアルギニン・デイミナーゼ遺
伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵
素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ること
が好ましい。

微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。

宿主微生物としては、・組換えＤＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできる
ものであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア
・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１，エシェリヒ
ア・コリＨＢ　１。（１１゜エシェリヒア・コリＷ３１
１０．エシェリヒア・コリＣ６００，変異株としてエシ
ェリヒア・コリＣＡＪ６４等が利用出来る。

宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの
移入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には
、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採
用することができ、さらにマイクロインジヱクション法
を用いてもよい。

前述のＤＮＡを採取するには以下の如く行う。

即ち、ＤＮＡの供与微生物を、例えば、液体培地で約１
〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離し
て集菌し、次いでこれを溶菌させることによってアルギ
ニン・デイミナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を調製する
。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナ
ーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要に
よりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリ
ウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理
的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の
溶菌法との組み合せで行ってもよい。

このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。

ＤＮＡの供与微生物は、アルギニン・デイミナーゼ産生
能を有する微生物であればよく、例えば、マイコプラズ
マ属、シュードモナス属に属する生産菌等の群から適宜
選ばれ、好ましくは、マイコプラズマ属に属するアルギ
ニン・デイミナーゼ生産菌が挙げられる。また、後記の
分類学的性状を有する新規なマイコプラズマ・オラーレ
（ＴＧＩＦ）（Ｍｙｃｏｐ　ｌａｓｍａ　　ｏｒａ　ｌ
ｅ　（ＴＧＩＦ）、微工研菌条寄第１９７０号（ＦＥＲ
ＭＢＰ−１９７０）を利用することが好まく、さらに、
遺伝子組換え技術を駆使して、アルギニン・デイミナー
ゼをコードする塩基配列を保持する形質転換体をＤＮＡ
の供与微生物として利用してもよい。

前述のマイコプラズマ・オラーレ（ＴＧＩＦ）の分類学
的性状は以下のとおりである。

■、培地における生育状態 マイコプラズマ・オラーレ（ＴＧＩＦ）の液体培地〔培
地組成；培地１２中にＰＰＬＯブロスＷ１０（ＤＩＦＣ
Ｏ社製）１５ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩５ｇ、ウマ血清
２００ｍｊ！、酵母エキス２５ｇ。

酢酸タリウム０．２５　ｇ　、ペニシリンＧカリウム１
０万単位、フェーノールレッド５ｍｇを含有する）に於
ける増殖は、種菌として１Ｘ１０’ｃＦＵ／ｍｊ！（ｃ
ＦＵは集落形成単位（ｃｏｌｏｎｙ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　
Ｕｎｉｔ）を示す〕接種し、３７°Ｃで、静置培養した
結果。

誘導期に続いて対数増殖期に入り、培養開始４〜５日後
に菌数が最大になる定常期に至る。定常期の期間は短く
、培養によって異なり、且つほぼ数時間で、減数期に入
る生育形態をとる。

■、生理的諸条件 生育し得るｐＨ；６〜８、 至適ｐＨ；７．４〜７，６、 生育し得る温度；３０〜３７゛Ｃ１ 至適生育温度；３７“Ｃ０ ■、顕微鏡下における形態的特徴 寒天培地〔培地組成；培地１１中に、バタトアガ−（Ｄ
ＩＦＣＯ社製）Ｌｏｇ、ＰＰＬＯブロス匈１０　ｃＶ　
（ＤＩＦＣＯ社製）１４．５ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩
５ｇ、Ｌ−グルタミン３ｇ、ＤＮＡ（粗製）　２０ｍｇ
、　　ＮＡＤ　１５０ｍｇ、　グルコース１０ｇ、イー
グルビタミン液（ＸＬＯＯ）ＩＯｍ　１　、　ウマ血清
２００ｍ１．酵母エキス２５ｇを含有する］に於ける集
落の大きさは、１０〜５００μｍであり、中心部が濃く
、周辺が薄く、いわゆる目玉焼状を呈する。染色はＤｉ
ｅｎｅｓ　（ディエネス）液〔メチレンブルー　２．５
ｇ；　アズールＵ　　１．２５ｇ；マルトース１０゜０
ｇ；　ＮａｚＣＯ＋　０．２５ｇ；蒸留水　１００ｍｆ
ｆ）を用いて行った。染色液を寒天面に流し、１〜２分
後に余分の液を捨て、顕微鏡観測した。集落の中心部は
濃青色に周辺部は淡青色に染まって見えた。

１００倍の顕微鏡倍率下では、周辺部は顆粒状に見えた
。

■、抗体による発育阻害 ワラス（Ｗａｌｌａｃｅ　Ａ、Ｃ１ｙｄｅ、ＪＲ）著の
文献〔ジャーナル　オプ　イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、）　ＶＯＬ、９２．　Ｐ、　９５８−９６５
．　（１９６４）　）に従い、各マイコプラズマ種に対
する抗血清を含む培地上の発育阻害よりマイコプラズマ
・オラーレと同定された〔東京大学医学部付属動物実験
施設による〕。

■、グルコース、アルギニン、尿素の分解試験被検菌を
１０％（Ｖ／ν）ウマ血清添加ハートインツユジョンプ
ロス（Ｈｅａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ）　
〔Ｄ　ｉ　ｆｃｏ社製）で、２４時間培養し、その１ｍ
！！、をそれぞれグルコース、アルギニン、尿素を含む
被検培地および対照培地に接種した。培養試験管を密栓
して、３７°Ｃで１週間培養した。被検物質を含まない
対照と０，５以上のｐＨの下降または上昇のみられたも
のを陽性として、判定した結果は以下の通りであった。

グルコース分解活性；陰性、 アルギニン分解活性；陽性、 尿素分解活性；陰性、 以上の結果から、細胞壁の完全欠如、直径０．１〜０．
２μｍの基本小体を有し、集落形態として、寒天培地に
くい込んで増殖し、目玉焼状集落を形成する特徴を有し
、発育に血清を必要とすることからマイコプラズマ属に
属する。そこで、抗体による増殖阻害試験により、本菌
株は、マイコプラズ？−オラーレ（ＴＧＩＦ）（Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａｏｒａ　ｌｅ　（ＴＧＩＦ）、微工研菌
条寄第１９７０号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１９７０）と同
定命名した。

宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐
性マーカーとアルギニン・デイミナーゼとを同時に発現
し得る微生物を検索すればコ１４・例７″・集卵１耐性
′−”−°°基１４択培地で生育し、且つアルギニン・
デイミナーゼを生成する微生物を選択すればよい。

かくして得た形質転換体を具体的に例示すれば、マイコ
プラズマ・オラーレ（ＴＧＩＦ）より採取したアルギニ
ン・デイミナーゼをコードするＤＮＡをプラスミドｐＵ
ｃ１１８　（宝酒造社製）に組み込み、宿主微生物エシ
ェリヒア・コリＤ　Ｈ１（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、、ｅ
ｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　（１９８２）　、
　５０４−５（１６）にトランスフォーメーションし遺
伝子ライブラリーを作製し、予め合成したプローブによ
りコロニーハイブリダイゼーションを行い、クローニン
グを行って得たエシェリヒア・コリＤＨＩ−ＰＵＣＩ　
１Ｂ−ＴＧＩＦ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ　　ＤＨＩ−ＰＵＣｌｌＢ−ＴＧＩＦ、微工研菌条寄
第１９６９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１９６９）が挙げら
れる。

アルギニン・デイミナーゼをコードするＤＮＡを含むベ
クターを製造するに当たっては、前述の如く得た遺伝子
ライブラリーをプローブによりコロニーハイブリダイゼ
ーションを行い、クローニングを行って得た形質転換体
より通常の方法により抽出すればよい。アルギニン・デ
イミナーゼをコードするＤＮＡを含むベクターの具体的
な例示としては、エシェリヒア・コリＤＨＩ−ＰＵＣ１
１Ｂ−ＴＧＩＦより採取したプラスミド（ｐｃＴＧＩＦ
ｌと命名）が挙げられる。プラスミドｐｃＴＧＩＦ１の
制限酵素開裂地図は、第３図に示される通りであった。

アルギニン・デイミナーゼを製造するに当だ、っては、
宿主微生物と同一のコドンニーセージを有する微生物を
ＤＮＡの供与微生物とした場合とそうでない場合とに分
け、それぞれに応じて操作を行う必要がある。即ち、も
ともと同一のコドンニーセージを有する場合かあるいは
供与微生物と同一のコドンニーセージを有するような変
異株を宿主微生物とした場合には、前記に記載の如く、
採取したアルギニン・デイミナーゼのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとアル
ギニン・デイミナーゼの活性とを指標としてスクリーニ
ングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持する微
生物を培養しアルギニン・デイミナーゼを採取すればよ
い。

宿主微生物と同一のコドンニーセージを有しない微生物
をＤＮＡの供与微生物とした場合には、例えば、供与微
生物がマイコプラズマ属に属する微生物であり、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を宿
主微生物とするような場合には、マイコプラズマ属にお
いてトリプトファンをコードするコドンＴＧＡが通常の
エシェリヒア・コリにおいては終止コドンであるので、
ＴＣＡをトリプトファンとして認識する様にナンセンス
サプレッションのかかうた変異株エシェリヒア・コリＣ
ＡＪ　６４　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ
ＡＪ６４）　　（京都大学理学部生物物理学科　小関治
男教授より分与を受けた〕等を使用してアルギニン・デ
イミナーゼの発現を行えばよい。具体的には、エシェリ
ヒア・コリＣＡＪ６４株をプラスミドｐｃＴＧＩＦ１で
形質転換して得たエシェリヒア・コリＣＡＪ６４−ＰＵ
Ｃ１１８−ＴＧＩＦを培養してアルギニン・デイミナー
ゼの発現を行えばよい。

また、例えば、供与微生物がマイコプラズマ属に属する
微生物であり、通常のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とするような場
合には、予めマイコプラズマ属等の供与微生物から採取
したＤＮＡまたは組換えＤＮＡベクター中のコドンＴＧ
Ａを例えばトリプトファンをコードするＴＧＧとするポ
イントミューチージョンを行った後、得られた変換ＤＮ
Ａを含むベクターにて再度のエシェリヒア・コリを形質
転換し、アルギニン・デイミナーゼの製造をせしめても
よい。

ＴＧＡをＴＧＧとなすポイントミューチージョンとして
は以下の方法が例示される。

前述のエシェリヒア・コリＤＨ１−ＰＵＣ１１Ｂ　−Ｔ
Ｃ，Ｉ　Ｆに、Ｍ１３ＫＯ？ファージを感染させ、ｐｃ
ＴＧＩＦの一本鎖環状ＤＮＡを得る。次いで、この−本
鎖環状ＤＮＡに相補的で、かつＴＧＡコドンのうちの一
つの相補配列を含むオリゴヌクレオチドを設計し、その
ＴＧＡに相補的な部分の３”ＡＣ７５′のＴをＣに換え
たものを作製する。続いて、−本鎖環状ＤＮＡに、オリ
ゴヌクレオチドをアニーリングさせ、これをプライマー
としてＤＮＡ合成を行い、−本鎖環状ＤＮＡを二本鎖環
状ＤＮＡとし、エシェリヒア・コリヘトランスフォーメ
ーションする。先のオリゴヌクレオチドを放射能ラベル
し、プローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを
行い、ポジティブ株を目的の変異ＤＮＡ形質転換体とし
て選択する。同様な操作を順次繰り返すことにより全て
のＴＧＡコドンをＴＧＧとなすことができる。

このようにして−度選択されたアルギニン・デイミナー
ゼ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形ミナーゼ遺伝子
であるＤＮＡを切り出し、これと同様な方法により切断
して得られる他のベクター断片とを結合させて、他の宿
主微生物に移入することも容易に実施できる。

かくして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地
に培養されることにより多量のアルギニン・デイミナー
ゼを安定して産生し得る。

形質転換体である微生物の培養形態はその栄養生理的性
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気撹拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素
源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばグルコース、シュクロース、ラクトース、マルトース
フラクトース、糖蜜、などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン
、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネ
シウム、カルシウムミナーゼを生産する範囲で適宜変更
し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０
〜４２°Ｃ程度である。培養時間は、条件によって多少
異なるが、アルギニン・デイミナーゼが最高収量に達す
る時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく
、通常は１２〜４８時間程度である。

培地ｐＨは菌が発育し、アルギニン・デイミナーゼを生
産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６
，０〜８．０程度である。

培養物中のアルギニン・デイミナーゼは、菌体を含む培
養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般
には常法に従って、アルギニン・デイミナーゼが培養液
中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりアル
ギニン・デイミナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離し
た後に利用される。アルギニン・デイミナーゼが菌体内
に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠心
分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体
を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊
し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／
または界面活性剤を添加してアルギニン・デイミナーゼ
を可溶化し水溶液として分離採取する。

この様にして得られたアルギニン・デイミナーゼ含有溶
液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナ
トリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例
えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別
沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を
、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量
の不純物を除去することができる。また吸着剤あるいは
ゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、これ
らの手段を用いて得られるアルギニン・デイミナーゼ含
有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより精製され
たアルギニン・デイミナーゼを得ることができる。

以上の製造法により得られるアルギニン・デイミナーゼ
として例えば下記の諸物性を有する新規なアルギニン・
デイミナーゼが例示される。

（１）アルギニン・デイミナーゼ活性測定法基質溶液の
調整： ２００ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，２）　２０
０ｕｌに５０ｍＭＤＴＴ（デイチオスレイトール）８０
μｆｆｉ、１００ｍＭアルギニン・塩酸付加物４０μ尼
を溶解して、基質溶液を調整する。

酵素溶液の調整： 後述の実施例により得ら乳た本発明アルギニン・デイミ
ナーゼ溶液を１１０ｆｆ１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）でＯＤ２．。＝０．００５になるように希釈して酵
素溶液とした。

活性測定： 前記の基質溶液３２０μｌを小試験管に取り、３７°Ｃ
１水浴中に２分間静置した後、酵素溶液８０μ２添加し
、反応を開始する。正確に３０分間３７°Ｃで反応した
後、５Ｍ過塩素酸１００μｌを添加し反応を停止する。

その後、反応液に、酸化還元緩衝液（９，Ｏｇ　ＮＨ４
Ｆｅ（ＳＯ４）　ｚ　・１２ｔｌｚＯ，１１，０ｇ（Ｎ
Ｆ１４）ｚＦｅ（ＳＯ４）ｚ　・６ＨｚＯをＩＮ硫酸溶
液に溶解し１００ｍＩ！、とじた溶液〕１２５μｌを加
え、その後酸混合液〔蒸留水２００　ｍ　ｌ、　ＨｚＰ
Ｏａ（ｄ＝１．７４）　３００ｍＣＨｔＰＯｎ（ｄ□１
．８４）　　１００ｍｊり　　６２５　ｕ２を加え、ジ
アセチルモノキシム溶液〔ジアセチルモノキシム０．７
５ｇを蒸留水に溶解し１００ｍ／！とじた溶液〕２５０
μｌを加え、遮光下、２０分間沸騰水中で加熱し、その
後冷却し、４９０ｎｍの吸光度を測定する。シトルリン
生成量を算定するための標準線は、１Ｍ過塩素酸で調整
した種々の濃度（０，。（１１〜０．０５μｍｏｌｅ／
　ｍ　ｌ　）のＬ−シトルリン溶液へ００μ２を用い、
上記酸化還元緩衝液１２５μ！添加以降の操作を行って
シトルリン濃度に対する４９０ｎｍの吸光度の関係をプ
ロットして作成し、直線領域を標準検量線として使用し
た。

（２）基質特異性： 遊離アミノ酸に対する反応の特異性を調べるために、ア
ミノ酸混合液（ｌｆｆｉの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液　
（ｐｌ＋７．０　　）　　にＬ−フルギニン２００ｍｇ
　　、Ｌ−アスパラギン、Ｈ，８５６，８ｍｇ、ｔ、−
ｙスパラギン酸２０ｍｇ、Ｌ−シスチン５０ｍｇ、Ｌ−
グルタミン酸２０ｍｇ、Ｌ−グルタミン３０。（１１Ｔ
１ｇ　　１グリシンＩＱｍｇ、Ｌ−ヒスチジン１５ｍｇ
＋Ｌ−ヒＦｏキシブｔ＋＋Ｊ：ｚ２抛ｇ、Ｌ−イソＵイ
シシ５０ｍｇ、Ｌ−０イシン５０ｍｇ、Ｌ−リグｙ−Ｉ
Ｃ１４０ｍｇ、ＬＪｆｔ：ン１５ｍｇ、Ｌ−７ｚ：ｆ＆
ｙ５：：ｚ１５ｍｇ、ＬＪｏリン２０ｍｇ＋Ｌ−セリン
３０ｍｇ、Ｌ−スレオニン２０ｍｇ、Ｌ−チロシン２０
ｍｇ、Ｌ−バリン２０ｍｇ、Ｌ−トリプト７ｙン５ｍｇ
　　を含有する）　　８００　　ｕ　ｊ２　に２　。

Ｏμ２の本発明アルギニン・デイミナーゼ溶＊＜０Ｄｚ
ｓ。、＝０．。（１１６　）を添加し、３７℃、１８時
間インキュベートした後、アミノ酸濃度の変化をアミノ
酸自動分析装置（日立　Ｌ−８５００型）を用いて解析
した。対照として、本発明アルギニン・デイミナーゼ溶
液の代わりに１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝た。

第１表 Ｌ−アルギニン　十　Ｈ，Ｏ→ シトルリン　十　Ｎ　Ｈ３ （４）ｐＨ安定性： １０μ２の本発明酵素溶液（ＯＤ　ＺＩＯ−＝　０　。

８）を４０μｌの試験ｐＨ緩衝液と混合し、３７°Ｃ１
３時間インキュベートした後、９５０μｌのＰＢＳを加
えて、２０倍に希釈し、残存する酵素活性を前記酵素活
性測定法に従って計測した。その結果、ｐＨ５，０〜１
０．０まで安定であった。

尚、試験ｐＨ緩衝液は、ｐＨ３，０〜６．０まではＯ，
１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０
〜９．０までは０９１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ１０，
０はＯ，１Ｍグリシン−Ｎａ　ＯＨ緩衝液を用いた。

（５）至適ｐＨ： （３）酵素作用： 次の反応を触媒する。

４７０００モ５０００　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）５５０
００±５０００　（ゲル濾過法）（７）等電点： アンフオライン　ビーエージ−プレート（ＡＭＰＨＯＬ
ＩＮＥ　ＰＡＧＰＬＡＴＥ　；　Ｌ　Ｋ　Ｂ社製）を用
いる等電点電気泳動法により測定した結果、ｐ１７．４
±０゜５に等電点を有する。

（８）Ｎ末端アミノ酸配列解析 後述の実施例に基づいて得られた本発明酵素（総ＯＤ、
、。、、＝０．。（１１）を用いて液相プロティン　シ
ーケンサ−（ベックマン社製：　ＢＢＣＫｌ’ｌＡＮ　
ＳＶｓｔｅｍ　８９０Ｍ　Ｅ　）によりＮ末端側からの
アミノ酸配列を解析した結果、まず、以下の如く５番目
までの配列が明らかとなり、 Ｘ−３ｅｒ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ（式中
、Ｘは水素原子又はＭｅｔを示す）更に、総０Ｄｚｓｏ
、、−＝０．　０５のサンプルで解析の結果、以下の如
く３００番目での配列が明らかとなった。

Ｘ−３ｅ　ｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−３ｅ　ｒ　−Ｉ　　
　ｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　　　ｕ
−１１ｅ−Ｃ１ｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−３ｅｒ
−Ｖａ　　１−Ｌｅｕ−Ｖａ　　１−Ｈ’　　５−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｇ　　　ｕ　− （式中、Ｘは水素原子又はＭｅｔを示す）（９）アミノ
酸組成分析 精製した本発明酵素標品（ＯＤｚｓ。、、＝０．（１８
）１ｄに１２Ｎ塩酸を等量加え、１０５°Ｃ，２４時間
加水分解した後、アミノ酸自動分析装置（日立Ｌ−８５
００型）を用いて解析した。本発明酵素の分子量はＳＤ
Ｓ電気泳動から約４７０００であり、アミノ酸の平均分
子量を１１０とすると構成アミノ酸は約４２７残基とな
ることから、分析結果を４２７残基当たりのアミノ酸残
基数で表し、その結果を第２表に示す。

第２表 考えられる。以下に本発明酵素の腫瘍細胞に対する理化
学的諸性状を示す。

（ａ）　　細胞増殖抑制活性の測定法 測定に用いる細胞二本発明酵素に対し阻害感受性の高い
細胞としてＣＣＲｔ−ＣＥＭ細胞（ヒト以上の諸性質を
公知のアルギニン・デイミナーゼと比較すると、いずれ
の酵素とも異なることが判る。

また、本発明酵素は腫瘍細胞にたいする強い増殖阻害活
性を示すことから抗癌剤としての用途がび硫酸ジヒドロ
ストレプトマイシンを含む）。

測定方法二上記培養用培地で培養された対数増殖期にあ
るＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を集め、新鮮な培養用培地に懸
濁し、細胞濃度を１゜１１×１０４個／　ｍ　ｌに調整
する。その後、得られた細胞含有溶液を２４穴マルチプ
レート（ＭＵＬＴＩＤＩＳＩＩ　　；　ＮＵＮＣ社製）
に９００μ２／穴（ｗｅｌｌ）づつ均質な細胞懸濁液を
播種する。フィルター（ＭＴＬＬＥＸ　ＧＶフィルター
；ミリポア社製）で濾過滅菌した試験溶液を１００μｆ
ｆｉ／ｗｅｌｌ添加し、ゆるく攪拌する。

コントロールとしてＰＢＳ　（リン酸緩衝液生理食塩水
）１００μＬへｅｌｆ添加する。細胞懸濁液を播種した
２４穴マルチプレートそれぞれを、・５％ＣＯ□、９５
％空気、’　ｔ　ｏ　ｏ％温湿度３７°Ｃのインキュベ
ーターで４日間培養した後、各−ｅｌｆ内の細胞数をコ
ールタ−カウンター（米国；コールタ−社製）を用いて
計測する。

％阻害する活性を１単位（ｕ）とした。

（ロ）細胞増殖抑制に対するｐＨ安定性１０μｆの本発
明酵素溶液（１００００ｕ／ｍりを４０μｌの試験ｐＨ
緩衝液と混合し、３７°Ｃ１３時間インキュベートした
後、９５０μｌのＰＢＳを加えて、２０倍に希釈し、残
存する細胞増殖抑制活性を前記細胞増殖抑制活性の測定
法に示した方法に従って計測した。その結果、ｐＨ５０
〜１Ｏ００まで安定であった。

尚、試験ｐＨ緩衝液は、ｐＨ３，０〜６．０まではＯ，
１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０
〜９．０まではＯ，ＩＭＩ−リス塩酸緩衝液、ｐＨ１０
，ｏは０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた。

（ｃ）細胞増殖抑制に対する熱安定性 １０μ２の本発明酵素溶液（１００００ｕ／ｍｆ）を９
９０μｌの０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に加え、３７°Ｃで２４時間、６０°Ｃで１時間、１０
０°Ｃで５分間処理した後水冷し、残存する細胞増殖抑
制活性を測定することにより（ｄ）細胞増殖抑制作用の
各種酵素に対する安定性各種の酵素を用い、それぞれの
至適ｐＨで３７゛Ｃ１６時間反応した後、残存する細胞
増殖抑制活性を測定することにより評価した。以下にそ
の結果を第４表に示す。

第４表 ００ｕ／ｍ１になる様に調整した後、残存する細胞増殖
抑制活性を測定することにより評価した。以下にその結
果を第５表に示す。

第５表 （ｅ）細胞増殖抑制作用の各種の有機酸および有機溶媒
に対する安定性 本発明酵素溶液（２０００ｕ／ｍｆ）に各種の有機酸お
よび有機溶媒を各添加濃度（Ｖ／Ｖ％）で添加し、２５
°Ｃ１１時間反応した。その後反応液をＰＢＳを用いて
希釈し、本発明酵素濃度を１（ｆ）各種腫瘍細胞に対す
る増殖抑制作用各種培養系の腫瘍細胞に対する本発明酵
素の増殖抑制作用について、ヒトリンパ球系白血病由来
細胞株（ｃＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＣＲＦ−Ｈ３Ｂ２゜ＣＣ
ＲＦ−３Ｂ、ＲＰＭＩ−８２２６）、ヒト骨髄系白血病
由来細胞株（Ｋ−５６２，ＨＥＬ９２・１・７）、ヒト
腎癌由来細胞株（ＴＲＣ−２９Ｒ）、ヒト肺癌由来細胞
株（ＴＬＣ−７ＮＣ３）。

マウス乳癌由来細胞株（ｃ−１２７１）を用い、これら
の細胞株の増殖に及ぼす影響を調べた。

培養に用いた培地は、Ｃ−１２’７Ｉ細胞株には、Ｅ−
ＭＥＭ培地に１０％牛脂児血清を添加した培地を使用し
、それ以外の細胞株は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０
％牛脂児血清を添加した培地を使用した。それぞれの細
胞株を各培地で培養し、対数増殖期にあるこれらの腫瘍
細胞株を集め、新鮮な培養用培地に懸濁し、細胞濃度を
１×１０４個／　ｍ　ｌになる様に調整した。２４穴マ
ルチプレートに均一に懸濁した細胞浮遊液を１ｍｊ２／
ｗｅｌｌに播種した後、ＰＢＳに溶解した本発明酵素の
種々の濃度の希釈液１００μｆ／ｗｅｌｌ添加し、５％
ＣＯ□９５％空気、１００％湿度、３７°Ｃのインキュ
ベーターで４日間培養した。対照として本発明酵素の希
釈液の代わりにＰＢＳを添加して培養した。

培養後の細胞数の測定は、浮遊系の細胞（白血病由来細
胞）は、ｌ５ＯＴＯＮＩＩ＠　（米国；コールタ−社製
）で２０倍に希釈し、付着性細胞は、培地を吸引除去し
た後０．１％トリプシン溶液１ｍｌで、培養基質から細
胞を剥離し、ｌ５ＯＴＯＮＵ＠で２０倍に希釈して測定
用サンプルとし、コールタ−カウンター（米国；コール
タ−社製）を用いて計測した。更に以下の式に従い増殖
抑制Ｂ；播種細胞数 Ｃ；対照溶液の細胞数 その結果、試験に供したすべての腫瘍細胞株で増殖抑制
作用が認められ、５０％の増殖阻害をしめす本発明酵素
濃度は第６表に示す如く、２８０ｎｍに於けるＯＤ値が
１０−５〜１０−”の領域にあり、極めて微量で作用す
ることが明らかとなった。

第６表 （８）一般正常細胞に対する本発明酵素の影響マウス３
Ｔ３細胞は長期***増殖可能であるが、造腫瘍能を有さ
ないことから、正常細胞に近い細胞として、細胞変異及
び細胞毒性の研究に広く用いられており、今回一般正常
細胞に対する本発明酵素の影響の指標として用いた。マ
ウス３Ｔ３細胞を１０％牛脂児血清を含むイーグルＭＥ
Ｍ培地に懸濁し、５Ｘ１０’個／ｍｌになるように調整
し、φ３５ｍｍの組織培養用プラスチックデイシュに２
ｍ１−づつ播種した。更にＰＢＳに溶解した０Ｄ２１１
゜、、、値４．７Ｘ１０−’の本発明酵素溶液を終濃度
が０Ｄｚｓｏ＋ｓｍ値２．３５ｘｌＯ−’（１０，２ｕ
　／　ｍ　ｌ　）になるように添加し、５％ＣＯ□、９
５％空気、１００％湿度、３７’Ｃのインキュベーター
で培養した。対照として本発明酵素溶液の代わりにＰＢ
Ｓを添加して培養した。２日間及び４日間培養した後、
０．１％トリプシン溶液を用いて細胞を剥離し、再度培
養用培地に懸濁させて単細胞浮遊液とした。細胞浮遊液
１容にＰＢＳに溶解した０、１％トリバンブルー溶液９
容を加えた後、ノイバウエル氏血球計測盤を用いて細胞
数を計測した。トリパンブルーにより青色に染まる細胞
は死細胞、染まらない細胞は生細胞であるので、その数
を計測した結果、第７表に示す如く、本発明酵素添加培
養と無添加培養の場合に於いて、細胞生存率に有意な差
は認められず、本発明酵素が、正常細胞に対して直接的
な毒性を有さないことを示した。

第７表 また本質的にアルギニン・デイミナーゼ活性のあるアル
ギニン・デイミナーゼムテインのＤＮＡは、本発明のア
ルギニン・デイミナーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法に
より作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異
遺伝子は上述の種々なる遺伝子工学的方法を使用して得
られ、特に優れた性質を有するアルギニン・デイミナー
ゼムテインＤＮＡは、最終的には、このムティンＤＮＡ
をベクターに挿入せしめて組換えＤＮＡを作成し、これ
を宿主微生物に移入させることによって、アルギニン・
デイミナーゼムテインの製造が可能である。

本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：　　デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　：　　リボ核酸 Ａ　　：　アデニン Ｔ　　：　チミン Ｇ　　：　グアニン Ｃ：　シトシン Ａｌａ　　：　　アラニン Ａｒｇ　　：　　アルギニン Ａｓｎ　　：　　アスパラギン Ａｓｐ　　：　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　：　　システィン Ｇｌｎ　　：　　グルタミン Ｇｌｕ　　：　　グルタミン酸 ｃｒｙ　　：　　グリシン Ｈｉｓ　　：　　ヒスチジン １１ｅ　　：　　イソロイシン Ｌｅｕ　　：　　ロイシン Ｌｙｓ　　：　　リジン Ｍｅｔ　　：　　メチオニン Ｐｈｅ　　：　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　：　　プロリン Ｓｅｒ　　：　　セリン Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｔｒｐ　　：　　　トリプトファン Ｔｙｒ　　：　　チロシン Ｖａｌ　　：　　バリン 〔実施例〕 以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発
明はこれらによって何ら限定されるものではない。

実施例 １）マイコプラズマからのＤＮＡの抽出ＰＰＬＯフロス
（ＤＩＦＣＯ社製）７容、ウマ血清２容、酵母エキス１
容、ペニシリンＧＩＯ００ｕ／ｍｊ２．酢酸タリウム５
００μｇ　／　ｍ　ｌを加えた液体培地１２に、Ｉ　Ｘ
　１０ｈＣＦＵ／ｍｊ２のマイコプラズマ・オラーレ（
ＴＧＩＦ）を１０ｍ１接種し、３７°Ｃ，５日間静置培
養した。培養液を高速冷却遠心分離機（日立５ＣＲ−２
０ＢＡ型）を用い、１４．ＯＯＯｒｐｍ（２５，０００
Ｇ）で１５分間遠心分離し、２．８ｇのマイコプラズマ
菌体を得た。マイコプラズマからのＤＮＡの抽出は、Ｊ
、Ｍａｒｍｕｒの方法（ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　（１
９６１）３．２（１８−２１８）により行った。即ち、
マイコプラズマ菌体を５０ｍｊ！のＯ，ＩＭ　　ＥＤＴ
Ａ含有生理食塩水に懸濁し、先と同じ条件で菌体を遠心
分離した後、再度２５ｍ１の０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ含有
生理食塩水に懸濁した。これに２０％ＳＤＳを加え、６
０°Ｃで１０分間処理し、細胞を破壊した後、最終濃度
がＩＭになるように過塩素酸ナトリウムを加え蛋白を変
性せしめ、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール
＝２４：１混合液を加え３０分分間中かに振盪した後、
１０．００Ｏｒｐｍ（１３，０ＯＯＧ）で１０分間遠心
し、分離した水層を他の容器に移し、２倍量のエタノー
ルを加え析出してくる染色体をガラス棒にからめて取得
した。

この染色体を生理食塩含有クエン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）１０ｍｆｆｉに溶解し、再度クロロホルムにて処理し
、２．５倍量のエタノールを加え、３０００ｒｐｍ　（
２，０ＯＯＧ）で１５分間遠心した。沈澱した染色体を
７５％エタノールで洗い、乾燥後、再び生理食塩含有ク
エン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５ｍ／！に溶解し、最終濃
度５　Ｑ　ｕ　ｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）
を加え、３７°Ｃ１３０分間ＲＮＡを分解した。次いで
これを再度クロロホルムにて処理しエタノール沈澱した
後、染色体を０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有０．３Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した。これに０゜５４倍量
のイソプロパツールを加え、析出してきた染色体を再び
ガラス棒にからめて取得した。

この染色体を再び（１６３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＦ（７０）
に溶解し、０．５４倍量のイソプロパツールを加え３．
ＯＯＯｒｐｍ（２，０ＯＯＧ）で１５分間遠心し、沈澱
した染色体を７５％エタノールで洗い、乾燥せしめ、染
色体標品１７９μｇを得た。

２）マイコプラズマ遺伝子ライブラリーの作成マイコプ
ラズマ染色体２μｇを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３
ＡＩ　（東洋紡績社製）６ｕで１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−
ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ
　　ＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＤＴＴ１０μｇ／ｍＩ！、　Ｂ
ＳＡ（ヘーリンガー・マンハイム社製）存在下３７°Ｃ
５２時間切断処理した。

また、ベクタープラスミドｐＬＩｃ１１Ｂ　（ｃｏＩＥ
ｌ　ｏｒＬ加ビ　Ｍ１３［Ｇ　；全酒造社製）２μｇを
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ旧　（東洋紡績社製）６
ｕで５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｆｆｉ　（ｐＨ’
７．　５）、１００ｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＱ□、１ｍＭＤＴＴ、１０μｇ／ｍｆｆ１　　ＢＳ
Ａ（ヘーリンガー・マンハイム社製）存在下、３７°Ｃ
１１６時間切断処理した後、フェノール処理、フェノー
ル・クロロフォルム処理を行い、エタノール沈Ｓした。

この直鎖状になったｐＨｃ１１８を大腸菌由来アルカリ
フォスファターゼ（東洋紡績社製）で、５ＱｍＭＴｒ　
ｉ　５−ＨＣ（！　（ｐＨ８，０）、ＬｍＭＭｇｃｉ□
存在下、６５°Ｃ１１時間反応させ、５末端のリン酸基
を除去した。

以上の操作を行ったｐｌＪｃ１１８１００　ｎ　ｇ、マ
イコプラズマ染色体２００ｎｇをＴ４ＤＮＡライゲース
（全酒造社製）１００ｕで、６６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＱ　（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ　　ＭｇＣ１２，１
０ｍＭ　　ＤＴＴ、６６０ｕＭ　　ＡＴＰ（ヘーリンガ
ー・マンハイム社製）存在下１６°Ｃ１１６時間ライゲ
ーションした。これをに、Ｓｈ　ｉｇｅｓａｄａの方法
（細胞工学（１９８３）　２，６１６−６２６）によっ
てコンピテント細胞としたＩＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ（Ｆ
−＋ｒｅｃＡ１＋ｅｎＡ１．ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ−
１，ｈｓｄＲ１７（７ｈ−＋ｍｋ”　）、５ｕｐＥ−４
４−＋ｒｅｌｌ＋λ−）　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、、
ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌ。

ｎｉｎｇ、ｃｏＸｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）Ｉａｒｂｏｒ（１
９８２）、５０４−５（１６）にトランスフォーメーシ
ョンし、５０μｇ　／　ｍ　Ｒアンピシリン含有し平板
寒天培地（バタトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）２０ｇ
／ｊ！、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｆｆｉ、
Ｎ　ａ　ＣＱ　５　ｇ　／　Ｉｔ、バタトアガ−（Ｄ１
’ＦＣＯ社製）１５ｇ／ｉＶ、）にて−夜培養し約３０
，０００のアンピシリン耐性コロニーを得、マイコプラ
ズマ遺伝子ライブラリーとした。

３）放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製判明して
いるアルギニン・デイミナーゼのＮ末端側の３０アミノ
酸配列を基に、その遺伝子の５゛末端側から９０塩基配
列を予想した。この予想配列の中から１７塩基配列２ケ
所を選び、その配列を持つオリゴヌクレオチド２種を設
計した。この際予想される塩基配列は複数であり、それ
に対応するオリゴヌクレオチドも複数の配列のものの混
合物とした。

このオリゴヌクレオチドをアール・エル・レンシンジャ
ーらの方法（Ｒ几ルｅｔｓｉｎｇｅｒ、　、Ｗ、Ｂ、Ｌ
ｕｒｓｆｏｒｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、５
ｏｃｉｅｔｙ　９８＋３６５５　）に基づきＤＮＡシン
セサイザー（ベックマン社製：　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｙ
ｓｔｅｍｌ　ｐｌｕｓ）を用いて作製した。

完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　　Ｍｇｃｆｆｉ□、１
０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール）および、２０μ
Ｃｉのγ”Ｐ−ＡＴＰ　（アマシャムジャパン社製）存
在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）
８．５ｕで３７°Ｃ１３０分間反応せしめ、アイソトー
プ！ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブ
とした。

４）アルギニン・デイミナーゼ遺伝子含有クローンのス
クリーニング 前述の如くにより得た遺伝子ライブラリー即ち平板寒天
培地上のアンピシリン耐性コロニー上にナイロンメンブ
レンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）を重
ね、フィルター上に該コロニー菌体の一部を移行させた
。さらに、同じ平板寒天培地より同一の操作で該コロニ
ー菌体の一部を移行させたもう一枚のフィルターを作成
し、以後の操作を並行して行った。該コロニー菌体の一
部を移行させたフィルターを別の５０μｇ　／　ｍ　１
アンピシリン含有し寒天平板培地上に重ね、フィルター
上の菌体を３７°Ｃで１６時間培養した。培養後、この
フィルターをアルカリ変性溶液（０゜５Ｎ　　ＮａＯＨ
，１，５Ｎ　　ＮａＣｊ２）に５分間浸し、さらに３Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５５）に５分間浸した後乾
燥した。このフィルターを８０°Ｃで１時間加熱し、菌
体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに固定した
。

さらにこのフィルターをプレハイブリダイゼーション溶
液（ＮａＣｆｆｉ　　５２．６ｇ／ｆ、クエン酸三ナト
リウム　２６．５ｇ／／！、ピロリン酸ナトリウム　０
．５ｇ／ｊ！、ドデシル硫酸ナトリウム　１　ｇ／ｌ、
フィコール（ファルマシア社製）１　ｇ／ｌ、ポリビニ
ルピロリドン　Ｉｇ／ｆｆｉ、ＢＳＡ（ベーリンガー・
マンハイム社１りＩｇ／ｆ、サケ***ＤＮＡ（ファルマ
シア社製）１００ｍｇ／ｌ＞に浸し、３７’ＣＴ：１６
時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、フ
ィルターをパイプリダイゼーション溶液（上記プレハイ
ブリダイゼーション溶液の組成中より、ドデシル硫酸ナ
トリウムおよびサケ***ＤＮＡを除き、ｔＲＮＡ（ベー
リンガー・マンハイム社製）２０ｍｇ／！を加えたもの
）に浸し、先に用意した放射性オリゴヌクレオチドプロ
ーブ２種を、二枚のフィルターにそれぞれ１種ずつ加え
、３５〜４０°Ｃで２４時間ハイブリダイゼーションを
行った。

ハイブリダイゼーション後、洗浄液（ＮａＣｆｆｉ５２
．６ｇ／ｆ、クエン酸三ナトリウム　２６゜５　ｇ／Ｉ
！、、ピロリン酸ナトリウム　０．５ｇ＃）でフィルタ
ーを３回洗浄し、次いでこのフィルターを３８〜４２°
Ｃの洗浄液に１０分間浸し、余分なプローブを洗い落と
した。フィルターは風乾後Ｘ線フィルム（富士写真フィ
ルム社製：　ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）　に重ね、遮光下、−
７０°Ｃで２４時間オートラジオグラフィーを行った。

オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、２
種のプローブの両方にポジティブシグナルが観察された
コロニーを確認した。該コロニーを、アルギニン・デイ
ミナーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体（エシェ
リヒア・コリＤＨＩ−ＰＵＣ１１８−ＴＧ　Ｉ　Ｆ）と
して取得した。

５）組換えプラスミドの抽出 エシェリヒア・コリＤＨＩ−ＰＵＣＩ　１８−ＴＧＩＦ
よりティー、マニアテイスらの方法（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、、ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８
２）、８６−９４）によって、アルギニン・デイミナー
ゼをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドｐｃＴＧ
ＩＦ１を抽出した。このプラスミド中のマイコプラズマ
染色体由来の部位をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ肚　
１２０５〜１２１０　（１９８１年））により塩基配列
を決定し、アルギニン・デイミナーゼをコードする全Ｄ
ＮＡが含まれていることを確認すると共にその全塩基配
列を決定した。ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　５ａ
ｕ３ＡＩを用いてこのプラスミドの制限酵素開裂地図を
作成し、その結果を第３図に示す。

６）トランスフェクション Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＡＪ６４株を２ＸＹＴ培地（１，６χ
Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｉｐｔｏｎ（ＤＩＦＣＯ社製）　１．
ＯＸ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）
０．５χＮａｃｌ　）を用いて３７°Ｃで培養し、ＯＤ
３．。、、＝０．５に達したときの菌体を使用した。

集菌した菌体をｌＯｍ！！、の５０　ｍＭ　　Ｃａ　Ｃ
ｌ　ｔに懸濁し、０°Ｃで２０分間静置した後集菌し、
再度２ｍｌの５０　ｍＭ　　Ｃａ　Ｃｌ　ｚに懸濁し、
０°Ｃで３０分間静置した。この懸濁液１００μ！にプ
ラスミドｐｃＴＧＩＦ１溶液１　ｔｔｌ、（１ｎｇ／ｐ
ｉ）を添加し０゛Ｃで３０分間静置した後、４２℃９０
秒間、０°Ｃ９０秒間のヒートショックを加え、続いて
９００μｆのし培地（２，０χＢａｃｔｏ　Ｔｒｉｐｔ
ｏｎ（ＤＩＦＣＯ社製）０．５χＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒ
ａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）０．５χＮａｃ１　）を添加
して３７°Ｃ５０分間インキュベートした。インキュベ
ート後、菌体を５ｃＩｇ　／　ｍ　１アンピシリン含有
し寒天平板培地（Ｌ培地＋１．５χＢａｃｔｏ　Ａｇａ
ｒ（ＤＩＦＣＯ社製））上に播種し、３７°Ｃで１晩培
養しコロニーを形成した菌株をエシェリヒア・コリＣＡ
Ｊ６４−ＰＵＣＩ　１Ｂ−ＴＧＩＦとして得た。

７）培養と細胞抽出物の調製 ｐｃＴＧＩＰｌで形質転換した菌株を５０μｇ／ｍ！ア
ンピシリン含有し培地（１，０χＢａｃｔｏ　Ｔｒｉｐ
ｔｏｎ（ＤＩＰＣＯ社製）　０．５％　Ｙｅａｓｔ　Ｅ
ｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）１．０χＮａｃｌ　）
　１５　ｍｌ中で３７°Ｃ１１８時間培養した後、遠心
分離（６０００ｒｐｍ　、１０分間）により集菌し３０
０ｕｆのＴ　Ｅ　（１０ｍＭＴｒｉｓ−）１ｃＩ（ＤＩ
ＦＣＯ社製）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）に懸濁
した。

超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、１４００Ｏｒ
ｐｍ、５分間遠心分離し、上清を取得して細胞抽出物と
した。

８）細胞抽出物のアルギニン・デイミナーゼ活性の確認 ｐｃＴＧＩＦｌで形質転換したＥ、ｃｏｌｉ　ＣＡＪ６
４でのＴＧＩＦ１遺伝子の発現を確認するために、形質
転換後の細胞抽出物中のアルギニン・デイミナーゼ活性
を測定した。

細胞抽出物１６０μ℃に２００ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ
７，２）を４００ｕｌ、５０ｍＭ　　ＤＴＴ（ジチオス
テイトール）を１６０ｕＩ２．１００ｍＭ　　Ｌ−アル
ギニン溶液を８０μ！添加した後ポアサイズ０．２２μ
ｍのメンブランフィルタ−（Ａｍｉｃｏ社製）で濾過滅
菌し、無菌的に３７°Ｃで１８時間インキュベートシた
。インキュベート後の反応液４００μ！に５Ｍ過塩素酸
１００μｌを添加して反応を停止させ、次いで酸還緩衝
液（ＩＮＨ□ＳＯａ　１００ｍ１　中にＮＩｌ、Ｆｅ（
５０４）Ｚ　・１２１１２０を９．０ｇおよび（ＮＨａ
）　ｚＦｅ（Ｓｏｎ）　２　・６ＨｚＯを１１．０ｇを
含む）１２５μ２、酸混合液（Ｉｚｏ　２００ｍ１，８
３Ｐ０４（ｄ＝１．７４）３００ｍ１、Ｈ２Ｓ０４（ｄ
＝１．８４）１００＋ａｌの混合液）、ジアセチルモノ
オキシムン容液（０，７５ｇ／１００＋＋＋１ＨｚＯ）
　　２５０　ｔｌ　ｉ、を順次添加した後、遮光して沸
騰水上で２０分間加熱した。冷水で温度を室温に戻した
後４９０ｎｍの吸光度を測定し、標準検量線からシトル
リンの生成量を算定した。

形質転換していないＥ、ｃｏｌｉ　ＣＡＪ６４の抽出物
について、上記と同じ操作を行い対照とした。

表８に示した結果から明らかな様に、ｐｃＴＧＩＦ１プ
ラスミドの移入により、アルギニン・デイミナーゼ活性
の発現が確認された。

表８ 殖阻害剤として有用である該酵素を大量に提供すること
が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す。第２図は、アルギニン・
デイミナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むＤＮＡを示す。第３図は、プ
ラスミドｐｃＴＧｒＦｌの制限酵素開裂地図である。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチ
   ドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
2. （２）アルギニン・デイミナーゼが下記の理化学的性状
   を有するものである特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ
   、 （ａ）作用；Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリンと
   アンモニアを生成する酵素反応を触媒する、 （ｂ）基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を有す
   る、 （ｃ）至適ｐＨ；７．０〜７．５、 （ｄ）ｐＨ安定性；５．０〜１０．０。
3. （３）アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチ
   ドのアミノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａは
   アミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基
   または−ＯＨを示す〕で表されるものである特許請求の
   範囲第１項記載のＤＮＡ。
4. （４）塩基配列が、５′末端側より第２図〔図中、＊＊
   ＊はＴＧＡまたはＴＧＧを示す〕で表されるものである
   特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
5. （５）アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチ
   ドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを
   保持することを特徴とするベクター。
6. （６）アルギニン・デイミナーゼが下記の理化学的性状
   を有するものである特許請求の範囲第５項記載のベクタ
   ー、 （ａ）作用；Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリンと
   アンモアを生成する酵素反応を触媒する、 （ｂ）基質特異性：Ｌ−アルギニンに基質特異性を有す
   る、 （ｃ）至適ｐＨ；７．０〜７．５、 （ｄ）ｐＨ安定性：５．０〜１０．０。
7. （７）アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチ
   ドのアミノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａは
   アミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基
   または−ＯＨを示す〕で表されるものである特許請求の
   範囲第５項記載のベクター。
8. （８）塩基配列が、５′末端側より第２図〔図中、＊＊
   ＊はＴＧＡまたはＴＧＧを示す〕で表されるものである
   特許請求の範囲第５項記載のベクター。
9. （９）ベクターが、プラスミドである特許請求の範囲第
   ５項記載のベクター。
10. （１０）ベクターが、プラスミドｐｃＴＧＩＦ１である
    特許請求の範囲第５項記載のベクター。
11. （１１）宿主にとって外来性であるアルギニン・デイミ
    ナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコード
    する塩基配列を含むＤＮＡを保持することを特徴とする
    形質転換体。
12. （１２）アルギニン・デイミナーゼが下記の理化学的性
    状を有するものである特許請求の範囲第１１項記載の形
    質転換体、 （ａ）作用：Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリンと
    アンモアを生成する酵素反応を触媒する、 （ｂ）基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を有す
    る、 （ｃ）至適ｐＨ；７．０〜７．５、 （ｄ）ｐＨ安定性；５．０〜１０．０。
13. （１３）アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプ
    チドのアミノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａ
    はアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残
    基または−ＯＨを示す〕で表されるものである特許請求
    の範囲第１１項記載の形質転換体。
14. （１４）塩基配列が、５′末端側より第２図〔図中、＊
    ＊＊はＴＧＡまたはＴＧＧを示す〕で表されるものであ
    る特許請求の範囲第１１項記載の形質転換体。
15. （１５）形質転換体が、エシェリヒア属に属する微生物
    である特許請求の範囲第１１項記載の形質転換体。
16. （１６）形質転換体が、エシェリヒア・コリに属する微
    生物である特許請求の範囲第１１項記載の形質転換体。
17. （１７）形質転換体が、エシェリヒア・コリＤＨ１−Ｐ
    ＵＣ１１８−ＴＧＩＦ、エシェリヒア・コリＣＡＪ６４
    −ＰＵＣ１１８−ＴＧＩＦおよびその突然変異体よりな
    る群から選ばれたものである特許請求の範囲第１１項記
    載の形質転換体。
18. （１８）Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残基
    または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基または−ＯＨ
    を示す〕で表されるポリペプチドを構成成分とするアル
    ギニン・デイミナーゼ。
19. （１９）宿主にとって外来性であるアルギニン・デイミ
    ナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコード
    する塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転換体を培養
    して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物から
    アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチドを採
    取することを特徴とするアルギニン・デイミナーゼの製
    造法。
20. （２０）アルギニン・デイミナーゼが下記の理化学的性
    状を有するものである特許請求の範囲第１９項記載の製
    造法、 （ａ）作用；Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリンと
    アンモニアを生成する酵素反応を触媒する、 （ｂ）基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を有す
    る、 （ｃ）至適ｐＨ；７．０〜７．５、 （ｄ）ｐＨ安定性；５．０〜１０．０。
21. （２１）アルギニン・デイミナーゼがＮ末端側より第１
    図〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂ
    はアミノ酸残基または−ＯＨを示す〕で表されるポリペ
    プチドを構成成分とするものである特許請求の範囲第１
    ９項記載の製造法。