JPH0331436B2 - - Google Patents

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JPH0331436B2
JPH0331436B2 JP63184556A JP18455688A JPH0331436B2 JP H0331436 B2 JPH0331436 B2 JP H0331436B2 JP 63184556 A JP63184556 A JP 63184556A JP 18455688 A JP18455688 A JP 18455688A JP H0331436 B2 JPH0331436 B2 JP H0331436B2
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arginine
arginine deiminase
enzyme
solution
cells
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Yutaka Sato
Junji Kobayashi
Kazuo Horyu
Makoto Nogawa
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Agency of Industrial Science and Technology
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Description

【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なアルギニン・デイミナーゼお
よびその製造法並びにその用途に関する。 〔従来の技術〕 アルギニン・デイミナーゼ（酵素分類番号
3.5.3.6）は、Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒する
酵素であり、動物、細菌、酵母類にその存在が知
られている〔酵素ハンドブツク、602頁、朝倉書
店、1984年版、第１版第３刷〕。これらの酵素の
うち、精製されたと報告のあるものには、シユー
ドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、マ
イコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma
hominis）、マイコプラズマ・アルスリテイデイ
ス（Mycoplasma ａ arthritidis）がある〔カ
キモト，テイー．ら（Kakimoto，T.etal）フエ
ブス レター（FEBS Lett.）VOL.19，Ｐ 166
−168、（1971）；シムケ，アール．テイー．
（Shimke，R.T.）メソツド オブ エンザイモ
ロジー（Meth.Enzymol.）VOL.17A，Ｐ 310−
313，（1970）；ワイクマン，ジエー．エル．アン
ド フアルニー，デイー．イー．（Weickman，
J.L.＆Fahrney，D.E.）ジヤーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）
VOL.252，P2615−2620，（1977）〕。 また、Ｌ−アルギニンを分解する酵素であるＬ
−アルギナーゼが抗腫瘍作用を有していることが
知られていることから、アルギニン・デイミナー
ゼへの同様な作用への期待はされていた〔特開昭
48−58187号〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、これら従来のアルギニン・デイ
ミナーゼ生産菌による生産にはいくつかの問題点
があつた。すなわち、これらのアルギニン・デイ
ミナーゼ生産菌は、アルギニン・デイミナーゼ生
産性が低いこと；マイコプラズマに属するマイコ
プラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、
マイコプラズマ・アルスリデイス（Mycoplasma
arthritidis）から採取する場合は培養管理が煩雑
であり、該酵素の大量生産における酵素源として
用いるには難点があること；精製純化するのに極
めて困難である等の問題があつた。 また、マイコプラズマ由来のアルギニン・デイ
ミナーゼが、腫瘍細胞増殖阻害を示す明確な報告
もない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、動物腫瘍細胞の中から、培養液
が顕著に増殖阻害作用を示す細胞株を見出し、そ
の株について、種々研究を行つた結果、その株に
寄生したマイコプラズマ属に属する菌株
（TGIF）が、産生する蛋白質が、腫瘍細胞増殖
阻害を示すことを見出した。また研究者らは、該
蛋白質を、前記マイコプラズマに属する菌株
（TGIF）を培養し、単離精製することにより均
質に得、この蛋白質が新規なアルギニン・デイミ
ナーゼであることも見出し本発明を完成した。 すなわち、本発明は下記の理化学的性状を有す
るアルギニン・デイミナーゼであり、 (a) 作用；Ｌ−アルギニンと水からシトルリンと
アンモニアを生成する酵素反応を触媒する (b) 基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を
有する (c) 至適PH；7.0〜7.5 (d) PH安定性；5.0以上 (e) 分子量；47000±5000（SDS−PAGE法によ
る） (f) 等電点；7.4±0.5 マイコプラズマ・オラーレに属するアルギニン・
デイミナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物より
該アルギニン・デイミナーゼを採取することを特
徴とするアルギニン・デイミナーゼの製造法であ
り、更にマイコプラズマ属に属する微生物由来の
アルギニン・デイミナーゼ活性を有する腫瘍細胞
増殖阻害活性物質を提供するものである。 本発明の新規なアルギニン・デイミナーゼ生産
菌の分類学的性状は以下の通りである。 培地における生育状態 マイコプラズマ・オラーレ（TGIF）の液体培
地〔培地組成；培地１中にPPLOブロスＷ／Ｏ
（DIFCO社製）15ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩５
ｇ、ウマ血清200ml、酵母エキス25ｇ、酢酸タリ
ウム0.25ｇ、ペニシリンＧカリウム10万単位、フ
エーノールレツド５mgを含有する〕に於ける増殖
は、種菌として１×105CFU／ml〔CFUは集落形
成単位（Colony Foming Unit）の略記号であ
る〕接種し、37℃で、静置培養した結果、誘導期
に続いて対数増殖期に入り、培養開始４〜５日後
に菌数が最大になる定常期に至る。定常期の期間
は短く、培養によつて異なり、且つほぼ数時間
で、減数期に入る生育状態をとる。 生理的諸条件 生育し得るPH；６〜８ 至適PH；7.4〜7.6 生育し得る温度；30〜37℃ 至適生育温度；37℃ 顕微鏡下における形態的特徴 寒天培地〔培地組成；培地１中に、バクトア
ガール（DIFCO社製）10ｇ、PPLOブロスＷ／
Ｏ CV（DIFCO社製）14.5ｇ、Ｌ−アルギニン
塩酸塩５ｇ、Ｌ−グルタミン３ｇ、DNA（粗製）
20mg、NAD150mg、グルコース10ｇ、イーグルビ
タミン液（×100）10ml、ウマ血清200ml、酵母エ
キス25ｇを含有する〕に於ける集落の大きさは、
10〜500μｍであり、中心部が濃く、周辺が薄く、
いわゆる目玉焼状を呈する。染色はDienes（デイ
エネス）液〔メチレンブルー2.5ｇ；アズール
1.25ｇ；マルトース10.0ｇ；Na2CO30.25ｇ；蒸
留水 100ml〕を用いて行つた。染色液を寒天面
に流し、１〜２分後に余分の液を捨て、顕微鏡観
測した。集落の中心部は濃青色に周辺部は淡青色
に染まつて見える。100倍の顕微鏡倍率下では、
周辺部は顆粒状に見える。 抗体による発育阻害 各マイコプラズマ種の抗血清を用い、ワラス
（Wallace A.Clyde，JR）著の文献〔ジヤーナル
オブ イムノロジー（J.Immunol.）VOL.92，
P.958−965，（1964）〕に従い同定の結果〔東京大
学医学部付属動物実験施設にて〕、マイコプラズ
マ・オラーレと同定された。 グルコース、アルギニン、尿素の分解試験被
検菌を10％（Ｖ／Ｖ）ウマ血清添加ハートインフ
ユジヨンブロス（Heart infusion broth）Difco
社製）で、24時間培養し、その１mlをそれぞれグ
ルコース、アルギニン、尿素を含む被検培地およ
び対照培地に接種した。培養試験管を密栓して、
37℃で１週間培養した。被検物質を含ませない対
照と0.5以上のPHの下降または上昇のみられたも
のを陽性として判定した結果以下の通りであつ
た。 グルコース分解活性；陰性 アルギニン分解活性；陽性 尿素分解活性；陰性 以上の結果から、細胞壁の完全欠如、直径0.1〜
0.2μｍの基本小体を有し、集落形態として、寒天
培地にくい込んで増殖し、目玉焼状集落を形成す
る特徴を有し、発育に血清を必要とすることから
マイコプラズマ属に属する。そこで、抗体による
増殖阻害試験により、本菌株（TGIF）は、マイ
コプラズマ・オラーレ（TGIF）〔Mycoplasma
orale（TGIF）〕と同定命名した。 なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研
究所にマイコプラズマ・オラーレ（TGIF）
〔Mycoplasma orale（TGIF）〕微工研菌条寄第
1970号（FERM BP−1970）として寄託されて
いる。 本発明のアルギニン・デイミナーゼを生産する
に当たつては、このアルギニン・デイミナーゼ生
産菌を酵素などを生産する通常の方法で培養す
る。培養の方法は、液体培養でも固体培養でもよ
いが、工業的にはアルギニン・デイミナーゼ生産
菌をその生産用培地に接種し、静置培養を行うの
が有利である。アルギニン・デイミナーゼを培養
するための培地組成は、微生物、特にマイコプラ
ズマを培養するのに通常用いられるものが広く用
いられる。窒素源として利用可能な窒素化合物で
あればよく、例えば酵母エキス、ラクトアルブミ
ン水解物、尿素、ペプトン、肉エキスなどが使用
される。炭素源としては資化可能な炭素化合物で
あればよく、例えばブドウ糖などが使用される。
その他マイコプラズマの培養に必須である血清ま
たはステロール類を適宜添加すればよく、また
種々の無機塩が必要に応じて使用される。培養温
度は菌が発育し、アルギニン・デイミナーゼを生
産する範囲内で適宜変更し得るが、30〜37℃、好
ましくは35〜37℃である。培養時間は、条件によ
つて多少異なるが、通常４〜８日、好ましくは５
〜６である。しかしながら、本菌株の増殖が最高
力価に達する時期を見計らつて適当な時期に培養
を終了するのは当然のことである。 培養終了後、該培養物より本酵素を採取するに
は通常の酵素採取手段を用いることができる。な
お、本酵素は、菌体内酵素であるので、超音波処
理、凍結菌体衝撃破砕法（低温細胞破砕法）、各
種薬剤による方法等菌体内よる酵素を採取する通
常の手段を用いて、粗酵素液を得る。このように
して得られた粗酵素液は、さらに公知の蛋白質、
酵素などの単離、精製手段を用いて精製し、精製
されたアルギニン・デイミナーゼが得られる。例
えば、粗製のアルギニン・デイミナーゼ含有液
を、トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液で緩衝化し、
これをカルボキシ−セルロース、カルボキシメチ
ル−デキストランゲル、スルホプロピル−デキス
トランゲルなどのイオン交換樹脂やデキストラン
ゲルやポリアクリルアマイドなどのゲル濾過剤に
よるクロマトグラフイーを適宜組み合わせて精製
し、ついで、必要に応じて濃縮し緩衝液に溶解し
た溶液としてし、精製アルギニン・デイミナーゼ
溶液を得ることができる。 このようにして得られたアルギニン・デイミナ
ーゼの理化学的性質は以下に述べる通りである。 (1) アルギニン・デイミナーゼ活性測定法 基質溶液の調整： 200mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）200μ
に50mMDTT（デイチオスレイトール）80μ、
100mMアルギニン・塩酸付加物40μを溶解し
て、基質溶液を調整する。 酵素溶液の調整： 後述の実施例により得られた本発明アルギニ
ン・デイミナーゼ溶液を10mMトリス塩酸緩衝
液（PH7.0）でOD280＝0.005になる様に希釈し
て酵素溶液とした。 活性測定： 前記の基質溶液320μを小試験管に取り、
37℃、水浴中に２分間静置した後、酵素溶液
80μ添加し、反応を開始する。正確に30分
間、37℃で反応した後、5M過塩素酸100μを
添加し反応を停止する。その後、反応液に、酸
化還元緩衝液〔9.0ｇ NH4Fe（SO4）2・
12H2O、11.0ｇ（NH4）2Fe（SO4）2・6H2Oを
1N硫酸溶液に溶解し100mlとした溶液〕125μ
を加え、その後酸混合液〔蒸留水200ml、
H3PO4（ｄ＝1.74）300ml、H2PO4（ｄ＝1.84）
100ml〕625μを加え、ジアセチルモノキシム
溶液〔ジアセチルモノキシム0.75ｇを蒸留水に
溶解し100mlとした溶液〕250μを加え、遮光
下、20分間沸騰水中で加熱し、その後冷却し、
490nｍの吸光度を測定する。シトルリン生成
量を算定するための標準線は、1M過塩素酸で
調整した種々の濃度（0.01〜0.05μmole／ml）
のＬ−シトルリン溶液500μを用い、上記酸
化還元緩衝液125μ添加以降の操作行つてシ
トルリン濃度に対する490nｍの吸光度の関係
をプロツトして作成し、直線領域を標準検量線
として使用した。 (2) 基質特異性： 遊離アミノ酸に対する反応の特異性を調べる
ために、アミノ酸混合液（１の10mMトリス
塩酸緩衝液PH7.0）Ｌ−アルギニン200mg、Ｌ−
アスパラギン・H2O 56.8mg、Ｌ−アスパラギ
ン酸20mg、Ｌ−シスチン50mg、Ｌ−グルタミン
酸20mg、Ｌ−グルタミン300mg、グリシン10mg、
Ｌ−ヒスチジン15mg、Ｌ−ヒドロキシプロリン
20mg、Ｌ−イソロイシン50mg、Ｌ−ロイシン50
mg、Ｌ−リジン・HCl40mg、Ｌ−メチオニン15
mg、Ｌ−フエニルアラニン15mg、Ｌ−プロリン
20mg、Ｌ−セリン30mg、Ｌ−スレオニン20mg、
Ｌ−チロシン20mg、Ｌ−バリン20mg、Ｌ−トリ
プトフアン mgを含有する）800μに200μ
の本発明アルギニン・デイミナーゼ溶液
（OD280om＝0.016）を添加し、37℃、18時間イ
ンキユベートした後、アミノ酸濃度の変化をア
ミノ酸自動分析装置（日立 Ｌ−8500型）を用
いて解析した。対照として、本発明アルギニ
ン・デイミナーゼ溶液の代わりに10mMトリス
塩酸緩衝液を添加して同じ操作を行つた。その
結果第１表に示す如く本発明アルギニン・デイ
ミナーゼは、Ｌ−アルギニンに特異的に作用し
てシトルリンを生成する反応を触媒する酵素で
あることがわかつた。
【表】
【表】 (3) 酵素作用： 次の反応を触媒する。 Ｌ−アルギニン＋H2O→シトルリン＋NH3 (4) PH安定性： 10μの本発明酵素溶液（OD280om＝0.8）を
40μの試験PH緩衝液と混合し、37℃、３時間
インキユベートした後、950μのPBSを加え
て、20倍に希釈し、残存する酵素活性を前記酵
素活性測定法に従つて計測した。その結果、PH
5.0〜10.0まで安定であつた。 尚、試験PH緩衝液は、PH3.0〜6.0までは0.1M
クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、PH7.0
〜9.0までは0.1Mトリス塩酸緩衝液、PH10.0は
0.1Mグリシン−NaOH緩衝液を用いた。 (5) 至適PH： 種々のPH値の緩衝液を用いて、前述の酵素活
性測定法に従い、測定した結果、PH7.0〜7.5の
範囲に至適PHを有していた。 (6) 分子量： 47000±5000（SDS−PAGE法） 55000±5000（ゲル濾過法） (7) 等電点 アンフオライン ピーエージープレート
（AMPHOLINE PAGPLATE；LKB社製）を
用いる等電点電気泳動法により測定した結果、
p17.4±0.5に等電点を有する。 (8) Ｎ末端アミノ酸配列解析 後述の実施例に基づいて得られた本発明酵素
（総OD280om＝0.01）を用いて液相プロテイン
シーケンサー（ベツクマン社製：
BECKMAN System 890ME）によりＮ末端
側からのアミノ酸配列を解析した結果、まず、
以下の如く５番目までの配列が明らかとなり、 Ｘ−Ser−Val−Phe−Ser−Asp− （式中、Ｘは水素原子又はMetを示す） 更に、総OD280om＝0.05のサンプルで解析の結
果、以下の如く30番目までの配列が明らかとな
つた。 Ｘ−Ser−Val−Phe−Ser−Asp−Lys−Phe
−Asn−Gly−Ile−His−Val−Tyr−Ser−
Glu−Ile−Gly−Asp−Leu−Glu−Ser−Val−
Leu−Val−His−Glu−Pro−Gly−Lys−Glu
− （式中、Ｘは水素原子又はMetを示す） (9) アミノ酸組成分析 精製した本発明酵素標品（OD280om＝0.08）
１mlに12N塩酸を等量加え、105℃、24時間加
水分解した後、アミノ酸自動分析装置（日立Ｌ
−8500型）を用いて解析した。本発明酵素の分
子量はSDS電気泳動から約47000であり、アミ
ノ酸の平均分子量を110とすると構成アミノ酸
は約427残基となることから、分析結果を427残
基当たりのアミノ酸残基数で表し、その結果を
第２表に示す。
【表】 以上の諸性質を公知のアルギニン・デイミナー
ゼと比較すると、いずれの酵素とも異なることが
判る。 また、本発明酵素は腫瘍細胞にたいする強い増
殖阻害活性を示すことから抗癌剤としての用途が
考えられる。以下に本発明酵素の腫瘍細胞に対す
る理化学的諸性状を示す。 (a) 細胞増殖抑制活性の測定法 測定に用いる細胞：本発明酵素に対し阻害感
受性の高い細胞としてCCRF−CEM細胞（ヒ
トリンパ球系白血病細胞；大日本製薬(株)から購
入）を選定し、検定に使用した。 培養用培地：10％牛胎児血清（FCS）添加
RPMI−1640培地（100mg／のペニシリンＧ
及び硫酸ジヒドロストレプトマイシンを含む）。 測定方法：上記培養用培地で培養された対数
増殖期にあるCCRF−CEM細胞を集め、新鮮
な培養用培地に懸濁し、細胞濃度を1.11×104
個／mlに調整する。その後、得られた細胞含有
溶液を24穴マルチプレート（MULTIDISH；
NUNC社製）に900μ／穴（well）づつ均質
な細胞懸濁液を播種する。フイルター
（MILLEX GV フイルター；ミリポア社製）
で濾過滅菌した試験溶液を100μ／well添加
し、ゆるく撹拌する。コントロールとして
PBS（リン酸緩衝液生理食塩水）100μ／well
添加する。細胞懸濁液を播種した24穴マルチプ
レートそれぞれを、５％CO2、95％空気、100
％湿度、37℃のインキユベーターで４日間培養
した後、各well内の細胞数をコールターカウン
ター（米国；コールター社製）を用いて計測す
る。 以下の式に従い増殖抑制率（％）を算出す
る。 増殖抑制率（％）＝１−Ａ−Ｂ／Ｃ−Ｂ×100 Ａ；試験液細胞数 Ｂ；播種細胞数 Ｃ；コントロール溶液の細胞数 この系で、CCRF−CEM細胞の増殖を50％
阻害する活性を１単位（ｕ）とした。 (b) 細胞増殖抑制に対するPH安定性 10μの本発明酵素溶液（10000u／ml）を
40μの試験PH緩衝液と混合し、37℃、３時間
インキユベートした後、950μのPBSを加え
て、20倍に希釈し、残存する細胞増殖抑制活性
を前記細胞増殖抑制活性の測定法に示した方法
に従つて計測した。その結果、PH5.0〜10.0ま
で安定であつた。 尚、試験PH緩衝液は、PH3.0〜6.0までは0.1M
クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、PH7.0
〜9.0までは0.1Mトリス塩酸緩衝液、PH10.0は
0.1Mグリシン−NaOH緩衝液を用いた。 (c) 細胞増殖抑制に対する熱安定性 10μの本発明酵素溶液（10000u／ml）を
990μの0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH7.0）に
加え、37℃で24時間、60℃で１時間、100℃で
５分間処理した後氷冷し、残存する細胞増殖抑
制活性を測定することにより評価した。以下の
第３表にその結果を示す。
【表】 (d) 細胞増殖抑制作用の各種酵素に対する安定性 各種の酵素を用い、それぞれの至適PHで37
℃、６時間反応した後、残存する細胞増殖抑制
活性を測定することにより評価した。以下にそ
の結果を第４表に示す。
【表】 (e) 細胞増殖抑制作用の各種の有機酸および有機
溶媒に対する安定性 本発明酵素溶液（2000u／ml）に各種の有機
酸および有機溶媒を各添加濃度（Ｖ／Ｖ％）で
添加し、25℃、１時間反応した。その後反応液
をPBSを用いて希釈し、本発明酵素濃度を
100u／mlになる様に調整した後、残存する細
胞増殖抑制活性を測定することにより評価し
た。以下にその結果を第５表に示す。
【表】 (f) 各種腫瘍細胞に対する増殖抑制作用 各種培養系の腫瘍細胞に対する本発明酵素の
増殖抑制作用について、ヒトリンパ球系白血病
由来細胞株（CCRF−CEM、CCRF−HSB2、
CCRF−SB、RPMI−8226）、ヒト骨髄系白血
病由来細胞株（Ｋ−562、HEL92・１・７）、
ヒト腎癌由来細胞株（TRC−29R）、ヒト肺癌
由来細胞株（TLC−7NC3）、マウス乳癌由来
細胞株（Ｃ−1271）を用い、これらの細胞株の
増殖に及ぼす影響を調べた。培養に用いた培地
は、Ｃ−1271細胞株には、Ｅ−MEM培地に10
％牛胎児血清を添加した培地を使用し、それ以
外の細胞株は、RPMI−1640培地に10％牛胎児
血清を添加した培地を使用した。それぞれの細
胞株を各培地で培養し、対数増殖期にあるこれ
らの腫瘍細胞株を集め、新鮮な培養用培地に懸
濁し、細胞濃度を１×104個／mlになる様に調
整した。24穴マルチプレートに均一に懸濁した
細胞浮遊液を１ml／wellに播種した後、PBS
に溶解した本発明酵素の種々の濃度の希釈液
100μ／well添加し、５％CO2、95％空気、
100％湿度、37℃のインキユベーターで４日間
培養した。対照として本発明酵素の希釈液の代
わりにPBSを添加して培養した。 培養後の細胞数の測定は、浮遊系の細胞（白血
病由来細胞）は、ISOTON （米国；コール
ター社製）で20倍に希釈し、付着性細胞は、培地
を吸引除去した後0.1％トリプシン溶液１mlで、
培養基質から細胞を剥離し、ISOTON で20
倍に希釈して測定用サンプルとし、コールターカ
ウンター（米国；コールター社製）を用いて計測
した。更に以下の式に従い増殖抑制率（％）を算
出する。 増殖抑制率（％）＝１−Ａ−Ｂ／Ｃ−Ｂ×100 Ａ；試験液細胞数 Ｂ；播種細胞数 Ｃ；対照溶液の細胞数 その結果、試験に供したすべての腫瘍細胞株で増
殖抑制作用が認められ、50％の増殖阻害をしめす
本発明酵素濃度は第６表に示す如く、280nｍに
於けるOD値が10-5〜10-6の領域にあり、極めて
微量で作用することが明らかとなつた。
【表】 (g) 一般正常細胞に対する本発明酵素の影響 マウス3T3細胞は長期***増殖可能である
が、造腫瘍能を有さないことから、正常細胞に
近い細胞として、細胞変異及び細胞毒性の研究
に広く用いられており、今回一般正常細胞に対
する本発明酵素の影響の指標として用いた。マ
ウス3T3細胞を10％牛胎児血清を含むイーグル
MEM培地に懸濁し、５×104個／mlになるよ
うに調整し、φ35mmの組織培養用プラスチツク
デイシユに２mlずつ播種した。更にPBSに溶
解したOD280om値4.7×10-3の本発明酵素溶液
を終濃度がOD280om値2.35×10-4（10.2u／ml）
になるように添加し、５％CO2、95％空気、
100％湿度、37℃のインキユベーターで培養し
た。対照として本発明酵素溶液の代わりに
PBSを添加して培養した。２日間及び４日間
培養した後、0.1％トリプシン溶液を用いて細
胞を剥離し、再度培養用培地に懸濁させて単細
胞浮遊液とした。細胞浮遊液１容にPBSに溶
解した0.1％トリパンブルー溶液９容を加えた
後、ノイバウエル氏血球計測盤を用いて細胞数
を計測した。トリパンブルーにより青色に染ま
る細胞は死細胞、染まらない細胞は生細胞であ
るので、その数を計測した結果、第７表に示す
如く、本発明酵素添加培養と無添加培養の場合
に於いて、細胞生存率に有意な差は認められ
ず、本発明酵素が、正常細胞に対して直接的な
毒性を有さないことを示した。
〔実施例〕
次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明はこ
れらによつて何ら限定されるものではない。 実施例 １ PPLOブロス（DIFCO社製）７容、ウマ血清
２容、酵母エキス１容、ペニシリンG1000u／ml、
酢酸タリウム500μｇ／mlを加えた液体培地500ml
に、１×106CFU／mlのマイコプラズマ・オラー
レ（TGIF）を10ml接種し、37℃、５日間静置培
養した。培養液を高速冷却遠心分離機（日立
SCR−20BA型）を用い、４℃、11000r.p.m、30
分間遠心し、ペレツト状に集菌した。 得られたマイコプラズマ・オラーレTGIFの菌
体１ｇ（湿重量）を30mlのPBSに懸濁した後、
氷冷下超音波処理（120秒、４〜５回）により菌
体を破砕した。破砕液を４℃、18000r.p.mで40分
間遠心分離し、上清を分離した。沈澱物は、再度
30mlのPBSに懸濁した後、上記と同一の操作を
行い、上清液を分離し、先に得た上清と混合して
透折用セルロースチユーブ（米国、VISKASE社
製）に入れ、10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）
３に対し４℃での透折を24時間づつ２回くり返
した。 得られた菌体抽出液を、予め同一緩衝液
〔10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）〕で平衡化し
たDEAE−Sepharoseカラム（φ16×200mm）に吸
着させ、カラム容量の３倍の同一緩衝液で洗浄し
た後、同一緩衝液に溶解したNaClによる０から
200mMの直線的濃度勾配で溶出を行つた。溶出
液は６mlごとの分画に集め、各分画の細胞増殖抑
制活性を前記の活性測定法に示した方法により調
べた結果、NaCl濃度20mMから100mMまでの分
画に活性の溶出が認められた。 DEAE−Sepharoseのイオン交換クロマトグラ
フイーで精製された細胞増殖抑制活性画分を集
め、限外濾過膜（YM−10；米国アミコン社製）
を用いて9.5ml濃縮した後、予め50mMのNaClを
含む10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）で平衡化
したゲル濾過（UltrogelAcA44；スウエーデン、
LKB社製）のカラム（φ26×930mm）にチヤージ
し、同一緩衝液を用いて溶出した。溶出液は５ml
の分画に集め、各分画の細胞増殖抑制活性を前記
の活性測定法に示した方法により調べた結果、溶
出液量の240mlから310mlの範囲に細胞増殖抑制活
性の溶出が認められた。 ゲル濾過によつて精製された細胞増殖抑制活性
画分を集めることにより61mlの溶液が得られた。
得られた溶液を限外濾過膜（YM−10；米国アミ
コン社製）を用いて５mlに濃縮した後、透折用セ
ルロースチユーブ（米国、VISKASE社製）を用
いて10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）２に対
し、４℃で２回（48時間）透折した。透折後の溶
液の一部を予め10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）
に平衡化したイオン交換クロマトグラフイー
（MonoQ HR5／５カラム；スウエーデン、フア
ルマシア社製）に吸着させた後、同一緩衝液に溶
解したNaClによる０から200mMの直線的濃度勾
配で溶出した。流速１ml／分で20mlの溶媒を使用
した。溶出液の蛋白濃度変化を280nｍの紫外線
吸収で観測しながら、蛋白質溶出ピーク毎に分画
し、各分画の細胞増殖抑制活性を前記の活性測定
法に示した方法により調べた結果、NaCl濃度が
55mMから65mMに溶出する蛋白ピークに存在す
ることが明らかとなつた。 前記のイオン交換クロマトグラフイー
（MonoQ HR5／５カラム；スウエーデン、フア
ルマシア社製）によつて精製された活性蛋白ピー
ク画分をさらに精製するために、得られた活性蛋
白ピーク画分を集め、この溶液を透折用セルロー
スチユーブ（米国、VISKASE社製）を用いて
10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）３に対し、
４℃で24時間透折した後、透折後の溶液の一部を
予め10mMトリス塩酸緩衝液（PH7.0）に平衡化
したイオン交換クロマトグラフイー（MonoS
HR5／５カラム；スウエーデン、フアルマシア
社製）に吸着させた。吸着した蛋白質の溶出は、
同一緩衝液に溶解したNaClによつて行い、流速
１ml／分で20分後からNaClの濃度を０から
100mMまでの直線的濃度勾配で溶出させた。溶
出液の蛋白濃度変化を280nｍの紫外線吸収で観
測しながら、蛋白質溶出ピーク毎に分画し、各分
画の細胞増殖抑制活性を前記の活性測定法に示し
た方法により調べた結果、NaCl濃度が60mM付
近にある単一ピークに局在して溶出することがわ
かり、その分画を採取した。 イオン交換クロマトグラフイー（MonoQ
HR5／５カラム；スウエーデン、フアルマシア
社製）およびイオン交換クロマトグラフイー
（MonoS HR5／５カラム；スウエーデン、フア
ルマシア社製）を用いる精製操作を繰り返し全試
料の処理を行つた結果、本発明酵素標品として約
３mgを得た。 試験例（純度検定） (1) 逆相高速液体クロマトグラフイーによる検定 本発明酵素の0.1％トリフルオロ酢酸溶液
（100μｇ／ml）500μをシリカゲルを担体とした
逆相クロマトグラフイー用カラム（ODS）にか
けて高速液体クロマトグラフイーをおこなつた。
溶出は流速１ml／分で0.1％トリフルオロ酢酸を
溶媒とし、アセトニトリル（CH3CN）の濃度を
０〜60％まで１％／分の速度の直線的濃度勾配で
溶出させた。その結果43〜45％のアセトニトリル
濃度に単一のピークとして溶出されることから、
均一な物質であることがわつた。 (2) ポリアクリルアミドゲル電気泳動による検定 本発明酵素の12％ポリアクリルアミドスラブゲ
ルを用いたSDS電気泳動を常法〔電気泳動学会
編、電気泳動実験法 208頁、（1976年）文光堂〕
に従つて行つた。泳動に供した本発明酵素標品は
１％SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）存在下で
0.1M2−メルカプトエタノール添加及び無添加
で、37℃、20時間インキユベートして変性させる
ことにより調製した。泳動終了後、日本バイオラ
ツドラボラトリーズ社製の銀染色キツトを用い、
これに添付されている処方に従つて泳動蛋白染色
を行つた。その結果本発明酵素標品は、還元剤の
存在下でも非存在下でも単一なバンドになること
から、均一な蛋白質であることが明らかになつ
た。また同時に泳動した分子量マーカーとの相対
泳動度から本発明酵素の分子量は約47000である
ことがわかつた。 〔発明の効果〕 本発明は新規なアルギニン・デイミナーゼを提
供するもので、また本アルギニン・デイミナーゼ
は、腫瘍細胞増殖阻害作用を示し、抗腫瘍剤とし
ての用途が期待されるものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記の理化学的性状を有するアル
    ギニン・デイミナーゼ。 (a) 作用；Ｌ−アルギニンと水からシトルリンと
    アンモニアを生成する酵素反応を触媒する (b) 基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を
    有する (c) 至適PH；7.0〜7.5 (d) PH安定性；5.0以上 (e) 分子量；47000±5000（SDS−PAGE法によ
    る） (f) 等電点；7.4±0.5 ２ マイコプラズマ属に属する菌株に由来した酵
    素である特許請求の範囲第１項記載のアルギニ
    ン・デイミナーゼ。 ３ Ｎ末端側より少なくとも Ｘ−Ser−Val−Phe−Ser−Asp− （式中、Ｘは水素原子又はMetを示す） のアミノ酸配列を有するポリペプチドを構成成分
    としてなる特許請求の範囲第１項記載のアルギニ
    ン・デイミナーゼ。 ４ マイコプラズマ・オラーレに属するアルギニ
    ン・デイミナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物
    より該アルギニン・デイミナーゼを採取すること
    を特徴とするアルギニン・デイミナーゼの製造
    法。 ５ アルギニン・デイミナーゼが特許請求の範囲
    第１項記載のアルギニン・デイミナーゼである特
    許請求の範囲第４項記載の製造法。 ６ マイコプラズマ・オラーレに属するアルギニ
    ン・デイミナーゼ生産菌が、マイコプラズマ・オ
    ラーレ（TGIF）（FERM BP−1970）である特
    許請求の範囲第４項記載の製造法。 ７ 少なくとも下記の理化学的性状のアルギニ
    ン・デイミナーゼ活性を有する腫瘍細胞増殖阻害
    活性物質。 (a) 作用；Ｌ−アルギニンと水からシトルリンと
    アンモニアを生成する酵素反応を触媒する (b) 基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を
    有する (c) 至適PH；7.0〜7.5 (d) PH安定性；5.0以上 (e) 分子量；47000±5000（SDS−PAGE法によ
    る） (f) 等電点；7.4±0.5
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FR2919804B1 (fr) 2007-08-08 2010-08-27 Erytech Pharma Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral
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