JPH02503950A - ヒトの抗原及び／又は抗体を検出するための同時エンザイム イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの抗原及び／又は抗体を検出するための同時エンザイム　イムノアッセイ 且」（分」１一 本発明は、循環抗原及び／又は抗体を有り得るヒト生理学的流体試験サンプル中 の単一の結合対の抗原及び／又は抗体を同時に検出する単一のイムノアッセイを 提供する。

この発明の好適例では、単一のヒト血漿若しくは血清試料又は培養細胞上清中で 旧Ｖ、　ＨＩＶフラグメント、旧Ｖ怒染細胞及び／又はこの旧Ｖ微生物に結合し たヒト抗体、又は）ＩＩＶ抗原担持フラグメントを検出するために実施できる特 異なエンザイムイムノアッセイを提供する。本発明を体現するイムノアッセイは 、その場合に応じて、陽性抗体、陽性抗原又は“陰性”の試験結果を与え、特に 旧ν抗原を従来実現されていたものよりも逼かに精確に又は敏感に、−成性をも ってかつ短い時間の間に検出する。

宜嘗Ｕ貨− ここでＨＩＶ感染として参照する）ＩＴＬＶ　Ｉ［Ｉ感染は、通常ＡＩＤＳ（後 天性免疫不全症候群）を起こす。米国内においてＡＩＤＳ患者数が増大しつつあ るとの報告は、この病気が治療法やワクチンが知られないまま流行病比率へと接 近しつつあるとの認識を生じさせた。ＡＩＤＳの発生は、この病気が性的活動、 麻薬乱用、移植手術における器官汚染及び輸血を通して移動するのに従い、世界 のヨーロッパ及びアフリカ諸国で最初に増大した。　ＨＴＬＶ■のようなＨＩＶ の他の系統はこのウィルスの突然変異を通して発生している。

ＩｔｌＶ抗体又は旧■抗原の存在試験が別個に、アメリカ予防衛生研究所の科学 者を含む研究者によって開発された。血漿及び血清中のＨＩＶ抗体を検出するア ッセイは商業化に際して臨床的に受は入れられた。Ｈ，ＩＶ抗原を検出するアッ セイは研究用には知られているが、我々の知る所では商業化されて臨床的に受は 入れられたものはない。これらの試験は、ＨＩＶ抗原又はこのＩＩＩＶ抗原に結 合するヒト抗ＨＶ抗体含量のため、別個、独立にスクリーンした固体の血漿、血 清又は血液細胞培養菌上清を分析する。幾つかのこうした別個の試験を比較した 最近の総覧記事として、「抗ＨＩＶ試験ニスクリーニング及び確認試験（Ａｎｔ ｉ−ＨＩＶＴｅｓｔｉｎｇ：　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｎｆｉｒｍａ ｔｉｏｎ　Ｔｅ５ｔｓ）」（メディカルラボラトリ−プロダクツ、　１９８７年 ４月、第１６〜１８頁）を参照。

性支、輸血、移植を通じた器官汚染又は麻薬乱用者による汚染針を通して旧Ｖに 曝された人々の７０〜８０％にヒト抗体が４〜６週で発生する。曝された人々の うち残りの２０〜３０％は最長穴箇月の間侵入ウィルスに対して抗体を発生させ ず、社会に非検出キャリアとして留まり得る。従って、もしＡＩＤＳの拡散を含 む血液及び器官提供者、固体又は血液製品を効果的にスクリーンするためには、 ）ＩＩＶ抗体だけでなく旧シウィルス自体及び／又はこのウィルスを担持する感 染細胞をもまた検出できるスクリーニング　イムノアッセイが不可欠である。

これまで、従来の試験の望ましい感度よりも小さくなるのを克服するのに通常必 要であるように充分な量でウィルス粒子を含む上清を得るために用いる支持細胞 培養菌中の不特定の抗体や正常細胞抗原に対して向けられた抗体に起因し、偽陽 性結果が作り得るという困難に遭遇していた。

我々は生理学的流体試験試料の単一部分の分析を通して、例えば、ヒト血液試料 中の抗）ＩＩνＩν、Ｈｒｖ微生物又はＨＩν惑染血染血液細胞うな単一の結合 対の双方の要素を同時に検出する実験的又は臨床的イムノアッセイを知らない。

本発明を体現するアッセイは、ウィルス、ウィルス感染細胞及びこの旧Ｖ微生物 に結合する抗体を双方共に成功裡に試験する。このアッセイはマイクロタイター 平板ウェルのような単一の容器中で実施できる。好ましくは、患者の試験試料は ヒト血漿、即ち最初にすべての細胞が除去された全血、又は血清、即ちすべての 凝固因子が除去された血漿からなる。このアッセイは、エンザイムイムノアッセ イ（ＥＩＡ）によって、その場合により「陽性」又は「陰性」の結果をあたえる 。　ＡＩＤＳ惑染患感染同定するのにこの発明のアッセイを使用することの適性 は、末梢血液のような生理学的試料中のＨＩＶ抗体のみをイムノアッセイで追跡 することでこれまで実現されたものよりも顕著に大きい、この試験結果は約４時 間で得られる。

電気泳動を用いてポリアクリルアミド　ゲル上にウィルス性タンパク質、即ち、 抗原を拡散させるのに先立ってウィルスの溶菌が濃縮してウィルス性タンパク質 を放出することは、ウェスタンプロット法に関して、抗原ではなく抗層Ｖ抗体の みの存在を確認するのに知られており、従って患者がたとえ）ＩＩνに感染して いたとしても抗体が存在しない先立つ時期の間には実際上役立たない。同様に、 ポリスチレンから形成されたマイクロタイター平板のような固相支持体へと粘着 する固相タンパク質のような旧Ｖ溶菌液を使用することは、ＥＬＩＳＡ技術に関 して、ＨＩＶ感染後抗体が存在しない期間の間、抗原ではなく、抗層Ｖ抗体をス クリーニングするのに知られている。しかし、単一の結合対の要素からなるビオ チニレーテッド抗体の存在下で試験試料を培養するのに先立ち、抗体コート固相 と接触する試料中の旧Ｖを既知量のＨＩＶ抗原の存在下に溶菌することで、単一 の試験試料中の抗体と抗原との双方の比較的急速、敏感な定量測定を提供できる ことは認識されなかった。

発明の開示 血漿や血清や細胞培養液上清のようなヒト生理学的流体試験試料中の単一結合対 の抗原及び／又は抗体を検出するためのエンザイム　イムノアッセイを提供する 。本発明の好適例では、イムノアッセイを用いて単一の試料の旧■抗原及び／又 は抗体を同時に試験し、ここで使用する方法論は固相アッセイ、即ち、マイクロ タイター平板、マイクロタイクー　ストリップ、ポリスチレン　ビーズ、又は第 一鉄ビーズを、例えば、支持媒体として使用する酵素結合抗体免疫吸着アッセイ （ＥＬＩＳＡ）の方法論である。特に好ましい実施例では、２００マイクロリツ トル（μで）のような所定容量の試験サンプル又は試料を、適当な高力価ヒト、 ヤギ、又は他の哺乳動物の血清又は血漿源から調製した精製抗層Ｖ抗体でコート したマイクロタイター平板のウェル内へと導入する。例えばヤギからの抗）１１ Ｖ抗体は、Ｐ２４　、ＧＰ１２０及びＧＰ１６０ウィルス性タンパク質又はウィ ルス性糖タンパク賞を供給する精製層Ｖの使用によって通常の注入及び出血スケ ジュールによって得ることができる。ヤギ内の抗層Ｖ抗体が充分な力価に達した 後、抗）１１Ｖ抗体を回収、精製する。この試料を、選択された発育剤を用いる 培養手順へと供する。

このアッセイ手順は顕著な態様として、試験試料を含有するコーテッドウェル内 へと、アッセイされる単一の結合対の抗原を、与えられた容量に対して予め定め た既知量導入する工程を含む。このアッセイの最終工程で、一般に例えば指定ピ コグラム濃度の使用抗原の光学密度値のような予め定めた定量値で既知量の抗原 を検出可能であり、「陰性」試験結果を与える「ベースライン」を提供するだけ でなく、更に注目すべきことには、この単一のアッセイ試料で抗体陽性及び／又 は抗原陽性決定の双方の定量的測定もまた可能とする。

本発明のこの注目すべき態様で導入し、又はこの試験を実施するためのキット内 に備えた不活性化又は非感染性ウィルス抗原を、「スパイク」と呼ぶ。後で説明 するように、この抗原スパイクを使用することで、単一のウェル内で試験した試 料中の、ウィルス性抗原と抗体との双方、又はこれらの不存在を測定することが 可能となる。この開示の目的には、このスパイクの抗原は抗原部位、又はＩＩＩ Ｖの膜又はエンベロープがら突き出すスパイクからなっているものに制限する必 要はないものと理解され、実際には旧Ｖコアタンパク質を含むウィルス性タンパ ク質の混合物からなる。好ましい使用固相アッセイは、可視化反応体の光学密度 測定によって免疫学的反応の可視化を可能とするために採用されたＥＬＩＳＡ技 術である。種々のウィルス及び抗体含有生理学的流体及び組織についての種々の 方法による免疫学的反応の可視化については、「ラジオイムノアッセイ及び飽和 分析（Ｒａｄｉｏｉｎ＋ｍｏｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎ　 Ａｎａｌｙｓｉｓ）　」と題した一連の総覧記事（英国医学速報：　Ｂｒ１ｔｉ ｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｉｅｔｉｎ。

第３０巻、Ｎα１．１９７４年１月）を参照。

最も広い意味では、この発明の方法の二重抗体／抗原試験作用は、試験試料中の 特異的抗体がウィルス性抗原スパイクへと特異的に結合するという事実から来る ものと理解される。もしこの免疫学的反応検出又は可視化手順により、幾分か又 はすべての既知量のウィルス性抗原が試験試料中の特異的抗原Ｖ抗体へと結合し てより少ない抗原がスパイクから検出されたことが決定すれば、この試験結果は 「抗体陽性」であるとして解釈される。他方、試験試料中の抗原が、スパイクに より添加された既知量の抗原へと加わる。もし検出手順がこの付加効果を示せば 、この試験結果は「抗原陽性」であるとして解釈される。しかし、もしこの試験 結果の免疫学的反応の可視化が、例えば、スパイクによって添加された所定ピコ グラム量の抗原の光学密度に対応する光学密度であれば、この試験結果は抗原及 び抗体の双方共に「陰性」であるとして解釈される。

Ｈを　方　るための最　の”ζ 本発明の好適例では、血漿や血清のようなヒト生理学的試験試料中の旧Ｖ抗原及 び／又は旧Ｖ抗体を同時に検出するための単一試料のアッセイを提供する。マイ クロウェル　ストリップを有するマイクロタイター平板からなるようなマイクロ ウェルを高力価の抗日Ｖ抗体を示す血清から得られた抗日Ｖ抗体でコートする。

固相支Ｊ寺媒体、即ち、マイクロタイター平板を、ヒト、ヤギ又は他の種のよう な高力価哺乳類血清又は血漿源から由来する精製抗原Ｖ抗体で前記ウェルをコー トすることによってアッセイのために調製する。

試験試料を一つのコーテッドマイクロウェルへと加え、又は重複試験が好ましい ので、好ましくは幾つかのコーテッドマイクロウェルへと加える。対照用ウェル を正常な、即ち抗原及び抗体陰性の生理学的流体、例えば、正常ヒト血漿又は血 清用に提供する。抗原陽性対照用ウェルもまた使用することが好ましい。既知量 のＨＩＶ抗原、即ち「スパイクＪを各試料マイクロウェル及び各比較用ウェルへ と加え、このように配合した試料と添加した抗原とを溶菌緩衝液へと供し、試験 試料中に存在するウィルスをその構成部分へと確実に破壊する。身体温度での単 一の培養工程の後、このマイクロタイター平板を洗浄して信号発生システムを阻 害しうる物質を除去し、次いで捕捉抗原をビオチンと接合した抗日Ｖ抗体と反応 させる。ストレプトアビジンペルオキシダーゼ試薬で続いて培養した後、結合酵 素の発色を適当な基質を用いて示す。こうして得た光学密度は、試験試料中及び 抗原陽性対照試料中で発生するＨＩＶ抗原、及び／又は抗日Ｖ抗体の相対量、又 は試験試料及び対照試料中のこれらの不存在に比例する。

通例のように、抗体コート固相支持体と一般的にアッセイを実施するのに必要な すべての試薬とをキット形に備える。この発明の好適例を実施するには、こうし たキットは、Ａ　９６ウエル　ポリスチレン　マイクロタイター平板（ウェルを 抗）１１Ｖ抗体でコート）； 平板カバーの供給部； 溶菌緩衝液： 抗原試薬「スパイク」； 抗原稀釈剤； 抗原Ｖ抗体−ビオチン試薬； ビオチン試薬稀釈剤； 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）接合体；３、３’　、　５．５’−テ トラメチルベンジジエン（Ｔ？ＩＢ）試薬；ＴＭＢ　ｆｉｉ釈剤緩衝液； 正常ヒト血漿対照試料； 正常ヒト血清対照試料； 抗原陽性対照試料（２０μβ当たりＳＯｐｇ抗原）；１０Ｘ洗浄緩衝液； 過酸化水素溶液；及び停止溶液 を有する。

試薬のまとめ −Ｃに試薬は、例示する好適なイムノアッセイ手順を実施するうえで適切な工程 で入手できるように前もって調製しておく必要がある。これらは次記の通りであ る：堺■扱１痰 過酸化物のないオクチルフェノール ポリ（エチレングリコールエーテル） 例えば、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，ボーリンゲルマンハイムバイオ 　ケミカルス（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ）　　　　　　　　　　　　　５％ポリオキシエチレンソルビトン　モノラ ウレート、例えばツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ　２０）、シグマ　ケミカルコーポ レーション　　　　　　　　　　　　　　　　２％エチル水銀チオサリチル酸ナ トリウム、例えばチメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）シグマ　ケミカル　コー ポレーション　　　　　０．０５％染料、ＦＤＣブルーＮＣＬＩ　　　　　　　 　　　　　　Ｏ，９ｒｕｇ／ｒｒｄｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　Ｑ、Ｓ、Ｉ　ＬＵＬ成果 １（ＩＶ抗原含量は、抗原稀釈剤で稀釈したときに稀釈した試薬２０μ℃当たり ５０ピコグラ１、のＨＩＶ抗原のスパイクを与えるのに充分である。このスパイ ク中の抗原の濃度は、デュポンＰ２４ラジオイムノアッセイ（１？ＴＡ）を用い ることでＰ２４当量を基礎として測定できる。

坑厚−楡択剋 リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中のプロテアーゼのないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）　　　　　　　　　１．０χアジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　 ０．１χ染Ｅ、ＦＤＣレッドＮａ　３　　　　　　　　　　　０．５　ｒｒｒｇ ／ｍｌ−肛り胱体二互オ、ヂン試条 ヒト抗層Ｖ抗体−ビオチン接合体（好ましくは凍結乾燥）ビオチン試薬稀釈剤　 】Ｌ用トリトンＸ−１０００，５χ 正常ヒト血清（熱不活性化）０．５χ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　　　　　　　　　　　　　　０．２χチメロサール 　　　　　　　　　　　　　　　０．５χ１０Ｘ　ＰＢＳ　（１００ｍＦＩ　　 ホスフェートの１．４５５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ７，２）　　　　　　　　　　　　 １００ｉｄ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｑ、Ｓ、　Ｉ　Ｌンワサ ビ−ＨＲＰＯ人 カルバイオケミカルーベーリング コーポレーション（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ＢｅｈｒｉｎｇＣｏｒｐ、）ＴＭＢ 試薬 ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０χＤＭＳＯ（ジメチル スルホキシド）　　　　　　Ｑ、Ｓ、　］、ＯＯ，Ｏ戚ご１１！旧１痰 ＮＡ２ＨＰＯ４７Ｈ２０２４，１３ｇ クエン酸−水和物　　　　　　　　　　　］、１．３８　ｇクロルアセトアミド 　　　　　　　　　　　１．００　ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｑ、Ｓ、　Ｉ　Ｌｐ、Ｈを４．４に言周整 正上惟護 １８Ｍ　濃１＋Ｚｓｏ４　　　　　　　　　　　　　　　１００．ＯｍＲ蒸留水 　　　　　　　　　　　　　　　　８００．００成」Ｌ瞠Ｊ（動１辰 ３０χＨ２０゜ １０Ｘ　　ン　２−　季　′１１１′　　１〜１０イずＬ手ツィ―ン２０　　　 　　　　　　　　　　　１０　、’　Ｏｍ１１、ＯＸ　ＰＢＳ　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　Ｏ，！ｌ１９．Ｌ１％クロルアセトアミド　　　　　　 　　　　１０．０　ｇこれらの試薬の性質に従い、プロトコルだけでなく、この イムノアッセイ技術に習熟した者であれば評価するであろうように、各試薬の濃 度は広範に変化させることができ、この発明の注目すべきＭ様は、アッセイされ る単一の結合対の既知量の抗原からなるスパイクを加える工程に存することが評 価される。

イムノアッセイ手順： 本発明を体現するイムノアッセイは、良く知られたマイクロタイター平板ウェル 内で実施することが好ましい。好適例では、２００マイクロリツトル（μり患者 試料を試験する。この患者試料は、細胞を遠心分離によって除去した全血に由来 するヒト血漿、血清、又は培養細胞からなっていてよい。２００μ！の試験試料 を、熱不活性化精製抗ＨＩＶ抗体でコートしたマイクロタイター平板のウェル内 へと導入する。・精製した抗層Ｖ抗体は高力価血清又は血漿源に由来する。こう した源はヒトのものであってよい。ウェルを被覆するには、補乳類抗体、例えば 、ヒト旧Ｖ抗体をミリリットル当り２．５マイクログラムにいわゆる「平板緩衝 液」中で稀釈する。この平板緩衝液はｐＨ６，０の２５０ｍＭのリン酸カリウム からなる。２５０μ！の稀釈抗体をウェル内へとピペットで分注し、４°Ｃで約 １６時間貯蔵する。次いでこのウェルを排出し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　）洗 浄液中で三回洗浄する。次いで、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　 ）　　（プロテアーゼなし）、５％スクロース及び１％エチル水銀チオサリチル 酸エチルを０．２μｍフィルターに通して濾過してなる分画試薬３２５μ！によ り、ウェルを１時間室温で分画する。ついでこのウェルを排出し、急速真空乾燥 し、乾燥剤バッグとともにバッグ内に４°Ｃで貯蔵する。

単一のウェルに対するコーティング手順は記載したけれども、通常のマイクロタ イター平板は複数のウェルと共に入手できる。

また複数のウェルがコーティング用機器として入手できる。このように、本発明 を体現するイムノアッセイは、複数のウェルを有するこうした入手可能な機器を 使用して実施できる。

このウェル中の２００μ２の試験試料へと、膜フラグメントを溶菌するために２ ０μ２の溶菌緩衝液を加え、かつ２０μ２当り予め選択した５０ｐｇの抗原へと 抗原稀釈剤で稀釈した抗原試薬である２０μ！のヒト抗原作用溶液を加える。次 いでこのウェルを覆い゛、適当なシェーカー中で成分の混合を１分間実施する。

次いで混合した材料を１時間３７°Ｃで培養する。

培養の後、このウェルを吸引し、洗浄緩衝液によって通常の方法で三回洗浄する 。好ましくは凍結乾燥状態の抗層ν抗体−ビオチンを再構成し、ビオチン試薬の 稀釈剤によって５％溶液へと稀釈し、２００μ２をウェルへと加え、平板を３７ °Ｃで１時間培養する。

培養の後、このウェルを吸引し、洗浄緩衝液試薬を使用して三回洗浄する。次い で２００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体をウニ元へと加え、覆い、３ ０分間３７°Ｃで培養する。培養の後、このウェルを吸引し、洗浄緩衝液で三回 洗浄する。次いで、２００μ！のＴ？ｌＢ基質溶液をこのウェルへと導入し、覆 い、３０分間室温で培養する。

次いで４５０μ２の２モル硫酸をこのウェルへと加えて反応を停止する。次いで このウェル中の溶液の光学密度を、４５０ナノメートルの波長で参照として５７ ０ナノメートルを使用して二重波長能力が得られるマイクロタイター平板リーダ ーで読む。もし二重波長能力を利用しなければ、平板を双方の波長で読むことが でき、４５０ナノメートルの水数を５７０ナノメートルの水数を引くことによっ て補正する。

本発明を体現するイムノアッセイは、指定のピコグラム感度で検出可能であり、 抗体コートマイクロタイターウェル内へと導入されるべき、不活性他日Ｖウェル 抗原の所定量のスパイクを含む定量化患者サンプルを提供する。ヒトから由来し たような哺乳類種由来抗ＨＩＶ抗体へと共有的に結合したビオチンのような、既 述したヒト発育剤を用いて、種々の通常の培養が続く。

このカップリングにビオチン−アビジン接合ペルオキシダーゼ複合体を形成する 工程が続き、この後にＴＭＢ基質を加えてこの反応の比色法による可視化を与え る。抗原Ｖ抗体ビオチン接合体が長鎖ビオチンを使用するとき、本試験の特に好 ましい度合いの感度が記録された。次いでウェルの捕捉抗体をコートした壁へと 結合するスパイク抗原及びウェル内に収容される患者試料中の抗原を抗日Ｖ抗体 によって認識し、これをビオチン蒸化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｃ＋）　シ、次 いで複合体をアビジンペルオキシダーゼと反応させ、反応を可視化するためにＴ ＭＢ基質と反応させる。

この反応を停止した後、ＥＩＡ示数水数って対照指示水数に対して比較すること ができる。

患者試験試料から得た水数を、旧Ｖ抗原、抗ＨＩＶ抗体、又は非感染性ウィルス のない正常ヒト血漿のをイムノアッセイ手順へと供して得た水数のような対照水 数と比較する。我々は患者試料を用いた試験結果に対し、約３０％上昇又は減少 するものとして参照点を確立した。ここで、もし光学水数がスパイクのＯＤから ３０％を超えて減少すれば、測定は抗体陽性である。もしこの水数が約３０％を 超えて上昇すれば、測定は抗原陽性である。

免疫学的反応に検出可能な信号を与えるため、リガンドとレセプターとの組み合 わせ、即ち、ビオチン−アビジン　プロトコルを使用するＥ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ａを 好適な方法論として記載したが、評価すべきことに無数の他の方法論を、結果的 な免疫学的反応を可視化するために使用できる。この点で、結果的な免疫学的反 応を可視化するために、放射性核種、他の酵素、螢光種、化学ルミネセンス種、 酵素基質、粒子、例えば、磁性粒子、ビオチンとアビジン以外のりガントとレセ プターとの組み合わせのような、他の標識又はマーカーを使用できる。

単一の試験ウェル中で旧Ｖ抗原及び／又は抗ＨＩＶ抗体の双方を同時に測定する ための上記の改善されたＥＬＩＳＡプロトコルに関して一連の試験を実施した。

これらの試験は、旧Ｖに曝された疑いがあるか、ＡＲＣを有するか若しくは有し ている疑いがあるものと診断されたか、又はＡＩＤＳを有していると診断された 患者からの五つの医学研究所で得た血液試料に由来する血漿と血清に基づいて実 施した。これらの試験系で、三つの９６ウエルマイクロタイター平板を使用して ９９のアッセイを実施した。

マイクロタイター平板１について、３２回の試験を行い、２０μ！当り５０ｐｇ のスパイクを使用してベースラインを確立し、光学密度は０．８９４　＋０．０ ６１に等しい光学密度（ＯＤ）を示した。光学密度における０、８９４より低い 或いは高い３０％の偏差からなる任意ガイドラインを用い、アッセイの目的でＯ Ｄが０．６２６より小さいと抗）ＩＩＶ抗体陽性でありＯＤが１．１６より大き いと旧Ｖ抗原陽性であることを確立した。

同様に平板２に関しては、３４回の試験を行い、５０ｐｇのスパイクは０．７１ ５±０．５６のＯＤを有し、ＯＤ示水数０．５００よりも小さいと抗日Ｖ抗体陽 性であると考えられ、ＯＤが０．９３よりも大きいと旧Ｖ抗原陽性であると考え られた。

これと同じ理由により、平板３に関しては、３３回の試験を行い、５０９ｇ（７ ）スパイクが０．６５５　＋０．５９（７）００を存し、これによりｏＤが０． ４５９よりも小さいと抗ＨＩＶ抗体陽性であると考えられ、ｏＤが０．８５２よ りも大きいと）ＩＩＶ抗原陽性であると考えられた。

これらの試料をすべて、本発明のＥＩＪＳＡ技術以外のＥＬＩＳＡ技術によるス クリーニング試験に供し、また、旧Ｖタンパク質Ｐ２４とＧＰ１２０とを分析、 固定するためにウェスタンプロット法を用いた確認試験へと供し、この後試料へ と陽性又は陰性の「スコア」を与えた。９９個の試料のうち、７０個又は７０． ７％は旧Ｖ抗原と抗）１１Ｖ抗体とのいずれかに対して陽性であると決定され、 ２９個又は２９．３％はＨＩＶ抗原又は抗）ＩＩＶ抗体のいずれに対しても陰性 であると決定された。陽性であることを発見したこの７０個の試料のうち、６個 の試料又は約６．１％はＨＩＶ抗原と抗層ν抗体との双方に対して陽性であるこ とを発見した。しかし、本発明からなるイムノアッセイが特に注目すべきもので あることは、「陽性ｊであると決定された試料のうち１７個がＨ１ν抗原に対し てのみ陽性であることを発見したという事実から評価されるであろう。

イムノアッセイにおいて単一の試験容器中の生理学的流体試料を単一結合対の抗 原と抗体の双方に対して同時にスクリーンする能力を持つことは注目すべき進歩 である。本発明の好適例では、これは単一の試験ウェルを使用することによって 、提供血液からの血漿又は血清の試験試料を、抗ＨＩＶ抗体と旧Ｖ抗原との双方 に対して又は更に重要なことに１（ＴＶ抗原のみの存在に対して同時スクリーニ ングすることを可能とする。人が旧Ｖに感染してから旧Ｖ抗体が発生し又はスク リーニング試験によって検出されるのに充分なレベルにまで発生するときまでの 期間の間、Ｈ１ν抗原のみを含有する提供血液を固定することが決定的に必要で あることは、あえて強調する必要すらない。

ウェスタンプロット確認試験を実施した結果として収集した試験データは、本発 明の方法によって実施した試験の約１０％が偽陽性結果へと供され、約１５％が 偽陰性決定に供されていることを示すようである。この偽結果のパーセンテージ は、試験を実施し又はその結果を読む際の人的エラーのような、未決定の因子に 帰し得ることが評価されるであろう。このように、明白な偽結果のパーセンテー ジはここで記載した例示試験実施の有効性を真に反映するものではない。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成元年１２月１４８ ″ １゜特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１００８７７ ２、発明の名称 ヒトの抗原及び／又は抗体を検出するための同時エンザイム　イムノアッセイ ３、特許出願人 名称　　　クールター　コーポレーションＭ　　求　　の　　範　　凹 ことからなるイムノアッセイ。

子と結合する能力のある既知量の前記抗体が結合する固相表面と一工程で接触す るように、所定容量の前記試験試料、前記試験試料容量内へと導入したときに正 常陰性試験試料に対して指定ピコグラム濃度で有効に検出可能な測光信号を与え るように選択した所定量の前記抗原、及び前記試験試料内に存在しうる抗原を遊 離させる溶菌試薬を導入し、（５）前記表面と接触して前記試験試料と前記所定 量の抗原とを培養して結果物の抗原−抗体複合体を形成し；（Ｃ）　　この培養 した試料を洗浄し；及び（ｄ）　　この得られた複合体を培養し、前記抗原決定 子及び前記の得られた複合体の検出に適した基質へと結合する能力がありかつ培 養後に正常陰性試験試料に対する前記検出可能な信号に相関する色検出可能信号 を生じる標識抗体接合体へと前記複合体を供し、前記試験試料に対して前記所定 量の抗原の信号よりも低い信号によって抗原陽性を示すか、前記所定量の抗原の 信号よりも高い信号によって抗体陽性を示すか、又は前記正常陰性を示す ことからなるイムノアッセイ。

７、　前記抗原が旧Ｖ抗原であり、前記抗体が抗層Ｖ抗体である請求項６のイム ノアッセイ。

８、対応する抗原決定子と結合する能力があり、工程（ａ）の前記固相表面へと 結合した抗体が、ヒト及びヤギからなる群より選ばれた哺乳動物から由来する請 求項６のイムノアッセイ。

９、　工程（ｄ）の標識抗体が酵素標識抗体である請求項６のイムノアッセイ。

１０、分光測光測定によって試験試料中の単一結合対の抗原及び抗体を検出し、 ここで固相支持体へと結合した前記単一結合対の一方の要素と、酵素標識抗体と の存在下および接触下に単一工程で前記試験試料を培養する酵素結合抗体免疫吸 着アッセイにおいて、 正常陰性試験試料に対して有効に検出可能な測光信号を与えるよう選ばれた前記 単一結合対の所定量の前記抗原を前記試験試料の前記培養に先立ってこの試験試 料へと導入し、前記アッセイの完結の際に検出可能な色信号が与えられるように したことを特徴とするイムノアッセイ。

１１、前記抗原がＨＩＶ抗原であり、前記抗体が抗層Ｖ抗体である請求項１０の イムノアッセイ。

１２、対応する抗原決定子と結合する能力があり、工程（ａ）の前記固相表面へ と結合した抗体が、ヒト及びヤギからなる群より選ばれた哺乳動物から由来する 請求項１０のイムノアッセイ。

１３、前記酵素標識抗体が前記信号を与える酵素で標識される請求項１０のイム ノアッセイ。

１４、請求項１のイムノアッセイを実施するのに使用するキットであって、 （ａ）　　前記単一結合対の他方の要素からなる対応する抗原決定子と結合する 能力のある既知量の抗体が結合した固相表面；い）前記単一結合対の他方の要素 からなる、既知濃度の所定量の抗原； （Ｃ）　　試験試料中に存在しうる前記結合対の抗原を均一に分配するかなりの 量の溶菌剤； （ロ）酵素標識抗体； （ｅ）　　この酵素標識抗体とカップリングする標識酵素；及びげ）　このイム ノアッセイを実施するキットの使用から生じた免疫学的反応を可視化するのに必 要な、生物学的に適当な洗浄、培養及び精製試薬 の組み合わせからなるキット。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．循環抗原を有していてよいヒト生理学的流体試験試料中の単一結合対の抗原 及び／又は抗体を同時に検出する単一のイムノアッセイであって、 （ａ）前記単一結合対の他方の要素からなる対応する抗原決定子と結合能力のあ る抗体が結合している固相表面と前記試験試料とを接触させ、正常陰性試験試料 に対して有効に検出可能な信号を与えるよう選ばれた所定量の前記抗原を導入し 、及び （ｂ）この得られた複合体を培養し、これを、正常試験試料に対する信号と相関 して前記試験試料に対し抗原陽性、抗体陽性又は前記正常陰性を示す定量測定可 能な信号を与える能力のある、接合された信号生産配合へと供することからなる イムノアッセイ。
2. ２．工程（ａ）の前記試験試料と所定量の前記抗原とを溶菌試薬と接触させて前 記試験試料中に存在しうる抗原を均一に分配する工程を有する請求項１のイムノ アッセイ。
3. ３．前記単一結合対の抗原及び／又は抗体が、それぞれＨＩＶ抗原又は抗ＨＩＶ 抗体からなる請求項１のイムノアッセイ。
4. ４．対応する抗原決定子と結合する能力のある工程（ａ）の抗体がヒト及びヤギ からなる哺乳動物の群から由来する請求項１のイムノアッセイ。
5. ５．工程（ｂ）をＥＬＩＳＡ方法論によって実施する請求項１のイムノアッセイ 。
6. ６．試験試料中の単一結合対の抗原及び／又は抗体を検出する単一の酵素結合抗 体免疫吸着アッセイにおいて、（ａ）前記抗体が結合する固相表面と前記試験試 料とを接触させ、正常陰性試験試料に対して有効に検出可能な測光信号を与える よう選ばれた所定量の前記抗原と、前記試験試料中に存在しうる抗原を遊離させ る溶菌試薬とを導入し、及び（ｂ）この得られた複合体を培養し、これを、培養 の後に正常試験試料に対する前記の検出可能な信号に相関し前記試験試料に対し て抗原陽性、抗体陽性又は前記正常陰性を示す色検出信号を生じる糖タンパク質 結合抗体接合体及び適当な基質へと供する ことからなるイムノアッセイ。
7. ７．前記単一結合対の前記抗原及び／又は抗体が、それぞれＨＩＶ抗原又は抗Ｈ ＩＶ抗体からなる請求項６のイムノアッセイ。
8. ８．対応する抗原決定子と結合する能力のある工程（ａ）の抗体がヒト及びヤギ からなる哺乳動物の群から由来する請求項６のイムノアッセイ。
9. ９．工程（ｂ）をＥＬＩＳＡ方法論によって実施する請求項６のイムノアッセイ 。
10. １０．分光測光測定によって試験試料中の単結合対の抗原及び／又は抗体を検出 する酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、正常陰性試験試料に対して有効に 検出可能な測光信号を与えるよう選ばれた所定量の前記抗原をビオチニレーテッ ド抗体の存在下で試験試料の培養に先立ってこの試験試料へと導入し、前記アッ セイの完結の際に検出可能な色信号が与えられるようにしたことを特徴とするイ ムノアッセイ。
11. １１．前記単一結合対の抗原及び／又は抗体が、それぞれＨＩＶ抗原又は抗ＨＩ Ｖ抗体からなる請求項１０のイムノアッセイ。
12. １２．対応する抗原決定子と結合する能力のある工程（ａ）の抗体がヒト及びヤ ギからなる哺乳動物の群から由来する請求項１０のイムノアッセイ。
13. １３．工程（ｂ）をＥＬＩＳＡ方法論によって実施する請求項１０のイムノアッ セイ。
14. １４．請求項１のイムノアッセイを実施するのに使用するキットであって、 （ａ）前記単一結合対の他方の要素からなる対応する抗原決定子と結合する能力 のある抗体が結合した固相表面；（ｂ）正常陰性試験試料に対して有効に検出可 能な信号を与える前記単一結合対の他方の要素からなる、既知濃度のかなりの量 の抗原； （ｃ）試料試験中に存在しうる前記結合対の抗原を均一に分配するかなりの量の 溶菌剤；及び （ｄ）このイムノアッセイを実施するキットの使用から生じた免疫学的反応を可 視化するのに必要な物質の組み合わせからなるキット。