CN106018805B - 一种非诊断目的的hiv抗体免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法及试剂盒,该方法包括:使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体,然后加入生物素标记二抗,孵育形成抗原‑抗体‑生物素标记二抗复合物;在链霉亲和素存在的条件下,加入生物素化引物Biotin‑I,孵育使所述复合物与Biotin‑I结合,然后加入生物素化的发卡链Biotin‑H1和发夹链H2进行杂交反应;加入亲和素标记的辣根过氧化物酶,催化底物液显色,通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测。本发明将HCR引入了ELISA,利用HCR进行信号放大,实现了HIV抗体的超灵敏检测,检测下限低至9.5pg/mL,比传统ELISA约提高2个数量级。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域,尤其涉及一种非诊断目的的检测HIV抗体的方法及试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是引起获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)的病原体。HIV抗体是HIV病毒进入人体后由人体免疫应答反应所产生,这种抗体对HIV病毒基本无效,但可一定程度上反应HIV的感染状态,是人体一项生理指标。
检测血液中的HIV抗体是目前最常用的检测艾滋病病毒感染的实验室方法,一般要经过两个步骤:首先做初筛试验,如果为阳性,再做确认试验,确认试验阳性才可诊断为艾滋病病毒感染。
目前,用于HIV抗体筛查试验的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)、化学发光免疫分析技术(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)、明胶颗粒凝集试验(gelatin particles agglutinate experiment,GPAT)、斑点免疫胶体金快速试验等。GPAT和斑点免疫胶体金快速试验等方法通过肉眼判断结果较为主观,且价格昂贵、结果不易保存。CLIA缺点在于标记催化酶或化学发光分子的发光反应不稳定,为间断的、闪烁性发光,而且在反应过程中易发生裂变,导致反应结果不稳定。此外,检测时需对结合相、游离相进行分离,操作步骤多,测试成本高。ELISA仍是临床上最常用的检测HIV抗体的方法,它具有灵敏、特异、快速等优点,然而ELISA的检测下限仍具有局限性,不能满足感染早期低浓度的HIV抗体水平的检测。
杂交链反应(hybridization chain reaction,HCR)是一种新型高效的核酸扩增方法,HCR可以在无酶的条件下实现DNA的扩增。中国发明专利申请CN103940989A公开了一种基于HCR和单分子计数的免疫荧光技术检测TNF-α。已有HIV抗体筛查方法仍存在诸多问题,需要建立检测灵敏高、便捷的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种HIV抗体免疫检测方法及试剂盒,以降低HIV抗体的检测下限浓度,提高检测灵敏度。
为了解决上述技术问题,本发明通过HCR体系引入ELISA进行信号放大来实现HIV抗体的检测。该方法利用间接法ELISA捕获血清中的HIV抗体,通过生物素-亲和素***引入HCR体系,HCR体系在常温下进行扩增,形成DNA双链聚合物。该聚合物标记了生物素,可以和亲和素标记的辣根过氧化物酶结合,从而进行显色检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法,包括:
使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体,然后加入生物素标记二抗,孵育形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物;
在链霉亲和素存在的条件下,加入生物素化引物Biotin-I,孵育使所述复合物与Biotin-I结合,然后加入生物素化的发卡链Biotin-H1和发夹链H2进行杂交反应;
加入亲和素标记的辣根过氧化物酶,催化底物液显色,通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测;
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTTT-biotin-3’;
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCTCAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’;
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCCTTG AGA ACT TTG-3’。
在一个具体实施方式中,将HIV抗原包被于酶标板上,用封闭液处理后,将含有HIV抗体的检测样本加入微孔板,36~38℃温育,使HIV抗原特异性地捕获HIV抗体;加入生物素化羊抗人IgG在36~38℃温育,在微孔板上形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物。
所述生物素标记二抗可以为生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。
在一个具体实施方式中,Biotin-H1和H2先经下述预处理:经95~98℃水浴1~3min后,立即冰浴。
在一个具体实施方式中,免疫反应之后,向微孔板中加入链霉亲和素在36~38℃温育,甩去孔中液体后拍干,加入Biotin-I在36~38℃温育,使所述复合物与Biotin-I结合。
在一个具体实施方式中,加入Biotin-H1和H2,室温下反应1~3h,使Biotin-H1和H2打开发夹结构、交替杂交,形成有缺口的双链DNA聚合物。
在一个具体实施方式中,加入亲和素标记的辣根过氧化物酶在36~38℃温育后倒出液体,加入底物缓冲液及底物液在36~38℃温育,再加入终止液,混匀后比色。
本发明还提供一种HIV抗体免疫检测试剂盒,包括:
HIV抗原、生物素标记二抗、链霉亲和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的发卡链Biotin-H1、发夹链H2和亲和素标记的辣根过氧化物酶;
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTTT-biotin-3’;
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCTCAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’;
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCCTTG AGA ACT TTG-3’。
在一个具体实施方式中,所述HIV抗原浓度为80~120ng/mL;
所述生物素标记二抗浓度为1.0~2.0μg/mL;
所述链霉亲和素浓度为0.8~1.2μg/mL;
所述Biotin-I浓度为4~6nM,配置时加入SPSC缓冲液;
所述Biotin-H1和H2浓度均为80~120nM,配置时加入SPSC缓冲液;
所述亲和素标记的辣根过氧化物酶浓度为18~22μg/mL。
在一个具体实施方式中,还包括包被液、封闭液、洗液、底物液、底物缓冲液和终止液;包被液为含80~120ng/mL HIV抗原的8~12mM PBS缓冲液;封闭液为含鲑鱼精DNA 40~60μg/mL的0.8~1.2%BSA溶液。
本发明相比现有技术具有如下优点:
(1)HCR是利用一组互补的、动力学受限的发夹探针来实现杂交的链反应,它是在等温、无酶的条件下进行的,稳定而廉价。本发明将HCR引入了ELISA,本发明中抗体与酶是一对多的关系,在利用抗原抗体反应保证检测特异性的同时,利用HCR进行信号放大,实现了HIV抗体的超灵敏检测,检测下限低至9.5pg/mL,比传统ELISA约提高2个数量级。
(2)本方法操作简便,无需特殊仪器,且具有易于自动化、稳定性强、毒性低等特点。
附图说明
图1是本发明HCR-ELISA检测HIV抗体的原理示意图;
图2是传统ELISA和HCR-ELISA定量检测不同浓度HIV抗体的结果对比;
图3是40例临床标本检测结果。
具体实施方式
本发明所述“室温”具有本领域公知的含义,具体是指20-30℃,优选20-25℃。
图1是本发明HCR-ELISA检测HIV抗体的原理示意图。HIV抗原包被于微孔板上,特异性地捕获血清中的HIV抗体。加入生物素化的羊抗人IgG(免疫球蛋白G)后,在微孔板上形成了抗原-抗体-生物素羊抗人IgG复合物。在链霉亲和素存在的条件下,通过生物素-亲和素之间的作用,这些复合物可进一步与生物素标记的引发链I(Biotin-I)结合。加入发夹H1和H2,引发链可催化H1和H2打开发夹结构,H1和H2交替杂交,形成有缺口的双链DNA聚合物,加入SA-HRP,该酶催化底物液显色,使信号得以放大显色。因此利用简易的紫外分光光度计即可对血清中的抗体进行定量检测。
在一个具体的实施方式中,本发明的一种基于杂交链反应的HIV抗体免疫检测方法,包括以下步骤:
(1)间接法ELISA捕获检测样本中的HIV抗体:将HIV抗原包被于微孔板上,冷藏过夜。加入封闭液室温放置2~4h后弃去封闭液,拍干冷藏备用。将检测样本加入微孔板,36~38℃温育0.5~1h,HIV抗原可特异性地捕获血清中的HIV抗体。加入生物素化羊抗人IgG 36~38℃温育0.5~1h后,在微孔板上形成抗原-抗体-生物素鼠抗人IgG复合物。每步反应之后均用PBST洗液洗板,以除去未结合的试剂;
(2)基于HCR信号放大的免疫检测技术:免疫反应之后,向微孔板中加入的链霉亲和素,36~38℃温育20~40min。甩去孔中液体后拍干,加入Biotin-I,36~38℃温育20~40min后洗板,加入Biotin-H1和H2,混匀,室温下放置使其反应1~3h。洗板除去未结合的发夹链;
(3)显色及信号检测:加入亲和素标记的辣根过氧化物酶,36~38℃温育20~40min,洗板后充分拍干,加入底物缓冲液及底物液,36~38℃温育20~40分钟。加入终止液,混匀后比色。
其中,HIV抗原浓度为80~120ng/mL;生物素标记二抗浓度为1.0~2.0μg/mL;链霉亲和素(SA)浓度为0.8~1.2μg/mL;Biotin-I浓度为4~6nM,配置时加入SPSC缓冲液;Biotin-H1和H2浓度为80~120nM,配置时加入SPSC缓冲液;亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)的浓度为18~22μg/mL。
所述生物素化引物(Biotin-I)的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTCTAC TTT TTT TTT T-biotin-3’,如SEQ ID NO.1所示;
所述生物素化的发卡链H1(Biotin-H1)的碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGGTCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’如SEQ ID NO.2所示;
所述发夹链H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGGTGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’如SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中Biotin-H1和H2需如下预处理:经95~98℃沸水浴1~3min后,立即冰浴,冷藏保存备用。煮沸可使发夹结构打开成为单链DNA。
下面结合附图和一个具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
实施例中用到的各种溶液配方如下:
磷酸钠-氯化钠缓冲溶液(sodium phosphate-sodium chloride buffersolution,SPSC)(50mM Na2HPO4/1.0M NaCl):17.9g的Na2HPO4·12H2O,58.5g的NaCl加少许超纯水溶解,用盐酸调pH至7.5,定容至100mL。
10mM磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)(pH=7.4):8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4溶解到1L超纯水中,用盐酸调节pH=7.4,高压灭菌后4℃保存备用。
Biotin-I的配制:将按已知序列合成的3.3nmol Biotin-I用33μl超纯水溶解至100μM,并用SPSC缓冲液稀释至5nM。分装,-20℃冷冻保存备用,使用前避免反复冻融。
Biotin-H1和H2的配制:将按已知序列合成的2.1nmol H1用21μl超纯水溶解,2.2nmol H2用21μl超纯水溶解,用SPSC缓冲液稀释至100nM。-20℃冷冻保存备用,使用前避免反复冻融。
所用到的洗液、底物缓冲液、底物液和终止液,为ELISA的常用试剂。
本实施例的基于杂交链反应的HIV抗体免疫检测方法,具体步骤如下:
(一)间接法ELISA捕获检测样本中的HIV抗体:
(1)Biotin-H1和H2预处理:100nM的Biotin-H1和H2经98℃沸水浴2min后,立即冰浴,保存在4℃备用;
(2)将100ng/mL的HIV抗原溶液(含有HIV抗原100ng/mL的10mM PBS溶液)注入96孔聚苯乙烯微孔板中,每孔200μL,4℃过夜;甩去包被液,每孔加入封闭液(含鲑鱼精DNA 50μg/mL的1%BSA溶液)200μL,室温放置2h后弃去封闭液,拍干4℃冷藏备用;
(3)将100μL含有不同浓度的HIV抗体的样本加入微孔板,37℃水浴箱温育1h;
(4)甩去孔中液体后,PBST洗板1次,浸泡60s,拍干,加入100μL 1.5μg/mL(1:4000)生物素化羊抗人IgG溶液,37℃水浴箱温育1h;
(二)基于HCR信号放大的免疫检测技术:
(5)甩去微孔中液体后,PBST洗板1次,浸泡60s,拍干,加入100μL 1μg/mL的SA,37℃水浴箱温育30min;
(6)甩去孔中液体后拍干,加入100μL 5nM的Biotin-I,37℃温育30min;
(7)甩去孔中液体后,常规洗液洗一遍,浸泡60s,拍干,加入40nM的Biotin-H1和H2各50μL,混匀,室温下放置使其反应1h;
(三)显色及信号检测:
(8)甩去孔中液体后,PBST洗板1次,浸泡60s,拍干,加入100μL 20μg/mL的SA-HRP,37℃温育30min后倒出液体;
(9)将含2%的Tween 20的PBS洗液注满各孔,静置60s后弃去孔内洗液,重复5次后拍干即可;
(10)加入底物缓冲液(含过氧化脲的柠檬酸-磷酸盐缓冲液)及底物液(含TMB的溶液)各50μL,轻轻振荡混匀,置37℃水浴箱温育30分钟。再加入终止液(2mol/L硫酸溶液)50μL,混匀后比色;
(11)反应溶液450nm处的吸光度值(OD)使用RT 6100微孔板分光光度计进行测定。室温下利用UV-2450紫外可见吸收分光光度计测量溶液300-700nm波长范围内的吸收光谱。
对该实施例所建立方法进行检测性能考察,结果如下:
配制不同浓度的HIV抗体样本,使浓度分别为0、10-11、10-10、10-9、10-8g/mL,检测方法同实施例1,考察450nm处OD值与HIV抗体浓度之间的关系。结果表明,当HIV抗体浓度在10-11g/mL至10-8g/mL的范围时,HIV抗体浓度与450nm处吸光度的吸光度值呈拟线性关系(附图2)。若将空白对照的三倍标准差定义为检测下限,该方法检测HIV抗体的下限为9.5pg/mL。对HIV抗体浓度分别为10-11g/mL、10-10g/mL、10-9g/m和10-8g/mL的血清进行3次平行测定,450nm处吸光度值的相对标准偏差(RSD)分别为1.1%、5.3%、4.3%和4.7%。因此,HCR-ELISA法定量检测HIV抗体具有较高的灵敏度和可重复性。
采用本发明实施例1实验步骤对40例临床患者血清标本进行检测,同时与商品化的HIV抗体ELISA检测试剂盒(珠海丽珠试剂股份有限公司)进行对比,结果如附图3所示,两种方法检测结果基本一致,说明本发明检测HIV抗体具有较好的准确性。
Claims (2)
1.一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法,其特征在于包括:
使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体,然后加入生物素标记二抗,孵育形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物;
在链霉亲和素存在的条件下,加入生物素化引物Biotin-I,孵育使所述复合物与Biotin-I结合,然后加入生物素化的发卡链Biotin-H1和发夹链H2进行杂交反应;
加入亲和素标记的辣根过氧化物酶,催化底物液显色,通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测;
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’;
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAAGGA CCA CCG CAT-biotin-3’;
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTGAGA ACT TTG-3’;
所述生物素标记二抗为生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG;
将HIV抗原包被于酶标板上,用封闭液处理后,将含有HIV抗体的检测样本加入微孔板,36~38℃温育,使HIV抗原特异性地捕获HIV抗体;加入生物素标记二抗在36~38℃温育,在微孔板上形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物;
所述Biotin-H1和H2先经下述预处理:经95~98℃水浴1~3min后,立即冰浴;
免疫反应之后,向微孔板中加入链霉亲和素在36~38℃温育,甩去孔中液体后拍干,加入Biotin-I在36~38℃温育,使所述复合物与Biotin-I结合;
加入Biotin-H1和H2,室温下反应1~3h,使Biotin-H1和H2打开发夹结构、交替杂交,形成有缺口的双链DNA聚合物;
加入亲和素标记的辣根过氧化物酶在36~38℃温育后倒出液体,加入底物缓冲液及底物液在36~38℃温育,再加入终止液,混匀后比色。
2.一种HIV抗体免疫检测试剂盒,其特征在于包括:
HIV抗原、生物素标记二抗、链霉亲和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的发卡链Biotin-H1、发夹链H2和亲和素标记的辣根过氧化物酶、包被液、封闭液、洗液、底物液、底物缓冲液和终止液;
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’;
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAAGGA CCA CCG CAT-biotin-3’;
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTGAGA ACT TTG-3’;
所述HIV抗原浓度为80~120 ng/mL;
所述生物素标记二抗浓度为1.0~2.0 μg/mL;
所述链霉亲和素浓度为0.8~1.2 μg/mL;
所述Biotin-I浓度为4~6 nM,配置时加入SPSC缓冲液;
所述Biotin-H1和H2浓度均为80~120 nM,配置时加入SPSC缓冲液;
所述亲和素标记的辣根过氧化物酶浓度为18~22 μg/mL;
所述包被液为含80~120 ng/mL HIV抗原的8~12 mM PBS缓冲液;封闭液为含鲑鱼精DNA40~60 μg/mL的0.8~1.2%BSA溶液。
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