JPH0236238B2 - Arufuaaamiraazekatsuseisokuteishaku - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、共役酵素法を利用するα―アミラー
ゼ活性測定試薬に関するものである。 血清、尿、膵液等の体液を対象とするα―アミ
ラーゼ活性の測定は臨床診断上重要な意義を有し
ており、特に急性或は慢性の膵炎、膵臓癌、更に
は流行性耳下腺炎等の鑑別診断に当つては必須の
測定項目となつている。 従来提供されているα―アミラーゼ活性の測定
試薬は、次に示す様な測定原理を利用するものと
して分類することができる。 (1) ヨードデンプン反応を利用するアミロクラス
チツク法 (2) デンプンより生成する還元糖量を測定するサ
ツカロジエニツク法 (3) 色素結合デンプンからの遊離色素を測定する
クロモジエニツク法 (4) デンプンによる濁りを測定するタービドメト
リツク法 これらの方法における使用基質は、デンプン、
その修飾体、或はデンプンから誘導されるアミロ
ースやアミロペクチン等であり、いずれの場合も
天然のデンプンに頼るものである。しかし天然デ
ンプンの場合はその品質、性状が一定せず、α―
アミラーゼ活性測定値に対する信頼性が低くなら
ざるを得ないという欠点があると共に、α―アミ
ラーゼによる鎖切断と測定される特性値との間の
量的関係が不明確であり、更には測定操作が繁雑
であるという問題もあつた。 そこでこれらの欠点を伴わない方法として、共
役酵要法が注目され、次に述べる様な測定方法が
考えられている。 (A) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断を行なつた
後、追随酵素系としてα―グルコシダーゼを作
用させることによつてフラグメントからグルコ
ースを遊離させ、このグルコースを公知の手段
によつて測定する方法。 (B) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断で生成する
マルトースを、追随酵素(マルトースホスホリ
ラーゼ)の作用によつて分解し、生成したグル
コース―1―燐酸を更にホスホグルコシダーゼ
の作用によつて分解し、ここに生成したグルコ
ース―6―燐酸の量を、グルコース―6―燐酸
脱水素酵素及び補酵素の存在下、紫外部吸光度
測定法によつて測定する方法。 (C) ホスホリラーゼ及びβ―アミラーゼを用いて
調製したリミツトデキストリンを基質とし、α
―アミラーゼの作用で生成したフラグメントに
マルトデキストリンホスホリラーゼを作用させ
てグルコース―1―燐酸を遊離せしめ、これを
上記(B)の方法で測定する方法。 (D) カルボキシメチル化等の修飾を施したデンプ
ンを基質とし、α―アミラーゼの作用で生成し
たフラグメントにグルコアミラーゼを作用さ
せ、ここに生成したグルコースを公知の手段に
よつて測定する方法。 (E) p―ニトロフエニル基を還元末端にグルコシ
ド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、α―
アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素として
グルコシダーゼを作用させ、ここに生成したp
―ニトロフエノールを比色定量する方法。 (F) 置換或は非置換フエニル基を還元末端にグル
コシド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、
α―アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素と
してグルコシダーゼを作用させ、ここに遊離し
たフエノール類に4―アミノアンチピリン等の
色原体を酸化縮合させ、生成した色素を比色定
量する方法。 上記(A)〜(F)の共役酵素法においても、天然デン
プンを利用するもの(デキストリン、リミツトデ
キストリン或は修飾デンプン等を基質とする場合
を含む)では、前記(1)〜(4)において述べたのと同
様の欠陥がある。しかしオリゴ糖自体、若しくは
これの末端基に発色基(アグリコン)をグルコシ
ド結合させたものを基質とする場合は、構造式が
明確に把握され且つ高度に精製されたものを使用
するので、天然デンプンの場合に述べた様な変動
がなく、α―アミラーゼによる鎖切断回数と計測
特性値との間の化学量論的な関係も明確となり、
高精度で信頼性の高い結果を得ることができる。
この様な観点からすると、(A),(B),(E)及び(F)法が
良いことになるが、体液特に血清及び尿中にはグ
ルコースやマルトースが存在する為、これらを反
応中間体として経由する方法〔(A),(B)及び(D)〕で
は、計測特性値が高めにあらわれ、レート法
(RateAssay)等の特殊な消去法を用いてもそれ
らの影響を完全に解消することは困難である。従
つてこれらを勘案すれば、(E)法及び(F)法が残され
るが、これらについても次に述べる様な欠陥があ
る。即ち(E)法の場合、体液中に存在するα―アミ
ラーゼの至適PHが、アイソザイムによつて異なる
ものの、一般的には6.8前後であるのに対し、p
―ニトロフエノールの410nmにおける吸光度がPH
6.5〜7.5の範囲で急激に変化する為、発色の変動
が顕著になるという欠点がある。又(F)法の場合α
―アミラーゼの反応を連続的に追跡するというレ
ート法には適さないという欠点がある。 本発明者等は、これら従来法の欠点に鑑み、基
質による不安定さがなく、レート法による連続的
な反応追跡が可能であり、更に吸光度がPHによつ
て急激な変動を見せない様な測定を行なうことの
できるα―アミラーゼ活性測定試薬の提供を目的
として種々検討を行なつた結果本発明を完成する
に至つた。 上記目的に適う本発明の測定試薬とは、共役酵
素法による測定を行なう様に構成されたものにお
いて、カルボキシフエニル基が還元末端にα―グ
ルコシド結合してなるマルトオリゴ糖を基質成分
として含有し、更に追随酵素系として、グルコシ
ダーゼ、ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素並びに還
元型補酵素(必要により更にプロトカテキユ酸ジ
オキシゲナーゼ)を含有するものであることを要
旨とするものである。 本発明試薬によるα―アミラーゼ活性の測定原
理は、α―アミラーゼの作用及びグルコシダーゼ
の作用によつて遊離されたヒドロキシ安息香酸
を、次式で示す様に、ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素及び還元型補酵素によつてヒドロキシ安息香
酸に変換する時の吸光度変化を追跡することから
なるものである。 但し上記化学式において、カルボキシル基はオ
ルト、メタ、パラのいずれの位置にあつてもよい
ものとする。尚ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素と
しては、p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やサ
リチル酸水酸化酵素等があり、これらはいずれも
本発明に適用できるが、以下の説明においては、
便宜上p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を用い
る場合の構成について述べる。従つてマルトオリ
ゴ糖における還元末端に結合されるカルボキシフ
エニル基としては、p―カルボキシフエニル基で
ある場合を述べることになるが、該フエニル基に
おける置換基の種類、数及び位置が変更されると
きは、ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の種類もそ
れに応じて変更すべきであることは言う迄もな
い。 この場合用いられるマルトオリゴ糖は、次の一
般式()で示される様に、還元末端にp―カル
ボキシフエニル基がグルコシド結合してなるもの
である。 (但しn=2〜10であり、マルトオリゴ糖の還元
末端とp―カルボキシフエニル基とは、α―及
び/又はβ―グルコシド結合しているものとす
る) この基質に対し、α―アミラーゼ含有試料を作
用させると、マルトオリゴ糖鎖におけるいずれか
のα―グルコシド結合が切断され、p―カルボキ
シフエニル基を有するフラグメントが生成する。
これに対して追随酵素であるグルコシダーゼを作
用させると、非還元末端側から遂次グルコースを
遊離していき、最後に()式で示される構造の
化合物を生成する。 (但しグルコース単位とp―カルボキシフエニル
基とは、α―及び/又はβ―グルコシド結合して
いるものとする) そしてグルコシド結合がα―結合の場合はα―
グルコシダーゼを作用させ、β―結合の場合はβ
―グルコシダーゼを作用させることにより、p―
ヒドロキシ安息香酸を遊離する。 次いでこのp―ヒドロキシ安息香酸に、p―ヒ
ドロキシ安息香酸水酸化酵素及び還元型補酵素を
作用させると、次の反応式によりプロトカテキユ
酸が生成する。 そしてこの反応を、還元型補酵素の吸光度変化
(NADPHやNADHでは340nm)を追跡すること
によつてα―アミラーゼ活性を測定する。 上記が、本発明における共役酵素反応の概略で
あるが、次に基質及び追随酵素群について説明を
加える。 まず基質として用いる物質、即ちマルトオリゴ
糖の還元末端にp―カルボキシフエニル基がグリ
コシド結合した物質〔以下単に基質()とい
う〕は、p―ヒドロキシ安息香酸とマルトオリゴ
糖を常法に準じて反応させることによつて製造す
る。例えば丸善発行、日本化学会編:実験化学講
座第24巻生物化学の第304頁(1958年)に記載
された方法に従つてマルトオリゴ糖をアセチル化
し、次いで触媒の存在下p―ヒドロキシ安息香酸
メチルエステルを還元性末端に結合させ、最後に
保護アセチル基及びメチル基を温和な条件下で加
水分解すれば、上記の基質()を製造すること
ができる。但し該反応におけるグルコシド結合の
形成を、α―結合又はβ―結合の一方のみ選択的
に進行させることは困難であるから、基質()
として両者を混合状態で使用することが推奨され
る。従つて追随酵素として用いられるグルコシダ
ーゼについても、α―グルコシダーゼとβ―グル
コシダーゼを併用することが推奨される。もつと
も、上記反応又はその後の処理によつて、α―結
合体又はβ―結合体が選択的に得られるならば、
夫々に対応してα―又はβ―グルコシダーゼを利
用すればよい。このようなα―グルコシダーゼ及
びβ―グルコシダーゼについては、動物起源、植
物起源或は微生物起源等の如何を問わないが、特
に好適なものを説明すると、α―グルコシダーゼ
については、基質特異性の面から見て酵母起源の
ものが有利である。即ち酵母起源のものは一般に
基質特異性が広範囲に及びアグリコンによる影響
が少ないと共に、マルトトリオシド以下のグルコ
シドには良く作用するが、マルトテトラオシド以
上のグルコシドには作用しないという特性があ
り、アミラーゼ活性の測定という本発明の趣旨に
適合し有利である。一方β―グルコシダーゼにつ
いても、同様の趣旨から見て、例えばアーモンド
起源のものがもつとも強く推奨される。尚α―グ
ルコシダーゼとβ―グルコシダーゼは、前述の様
にしばしば併用され、この場合における配合割合
は、基質の種類及び、該基質におけるグルコシド
結合のα/β比等によつて異なるが、一般的に言
えばα―アミラーゼによつて生成したマルトトリ
オースやp―カルボキシフエニル化マルトースを
非常に早く分解する量であれば十分であり、通常
はα―グルコシダーゼを20単位/ml以上、β―グ
ルコシダーゼを4単位/ml以上存在させることが
望まれる。 次にp―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは、
フラビン関与の外部電子供給体要求性一原子酸素
添加酵素に属し、酵素番号EC1.14.13.2で示され
るものを含む。該酵素の起源についても格別の限
定を受ける訳ではないが、もつとも好ましいのは
細菌起源殊にシユードモナス属に属する菌を起源
とするものであつて、より具体的に述べるなら
ば、シユードモナス・デスモリテイカ、シユード
モナス・フルオレツセンス、シユードモナス・プ
チダ等から得られるものが本発明に適している。 又同じく追随酵素系の一員を構成する還元型補
酵素としては、一般にNADPHやNADH等が好
んで用いられる。 本発明に係る測定試薬は、原則的に上記基質及
び追随酵素群から構成されるが、必要によりプロ
トカテキユ酸ジオキシゲナーゼを含有させておく
方が良い場合もある。即ち上述のp―ヒドロキシ
安息香酸測定系において、既知量のアミラーゼを
作用させて種々実験していたところ、p―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の添加量が多くなるにつ
れてα―アミラーゼ活性の測定値が高めに現われ
てくるという現象に気が付いた。そこでその原因
を種々の角度から検討したところ、酵素反応によ
つて生成したプロトカテキユ酸が、p―ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素に対する脱共役剤(アンカ
プラー)として作用し、還元型補酵素の酸化を更
に促進させその結果として測定値を正誤差の方向
に誤らせるという背景を見出した。そこでその様
な不都合を解消することを目的にして更に検討を
行ない、プロトカテキユ酸―3,4―ジオキシゲ
ナーゼ或はプロトカテキユ酸―4,5―ジオキシ
ゲナーゼの様なプロトカテキユ酸ジオキシゲナー
ゼを作用させてプロトカテキユ酸の影響を消失さ
せるという構成に到達した。即ち上記基質及び追
随酵素系からなる測定用組成物にプロトカテキユ
酸ジオキシゲナーゼを添加しておけば、反応系中
に生成してくるプロトカテキユ酸が消失され、α
―アミラーゼ活性の測定精度が向上するというこ
とを見出した。 ところで上記プロトカテキユ酸―3,4―ジオ
キシゲナーゼとは、プロトカテキユ酸を、3―カ
ルボキシ―シス―ムコン酸(β―カルボキシムコ
ン酸)に変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二
原子酵素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.1.3の
ことである。該酵素の作用は下記式で示される。 該酵素としては細菌、特にシユードモナス属、
ノカルジア属の菌およびノイロスポアから得られ
たものが好ましい。又プロトカテキユ酸―4,5
―ジオキシゲナーゼとはプロトカテキユ酸を2―
ハイドロキシ―4―カルボキシムコン酸セミアル
デヒドに変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二
原子酸素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.11.8
のことである。該酵素の作用は下記式で示され
る。 該酵素としては、細菌、特にシユードモナス属
の菌から得られたものが好ましい。 本発明の測定試薬組成物は上記の如く構成され
るが、これを用いてα―アミラーゼ活性の測定を
行なうに当つては、次の様に行なう。即ち測定試
薬を適当な緩衝液に溶解し、該試薬に検体を加え
て混合し、25℃〜37℃に亘る一定の温度条件下で
340nmの波長における吸光度の変化速度(ΔE/
mm)を測定し、次式によつてα―アミラーゼ活性
値を算出する。 α―アミラーゼ活性値(単位/) =(ΔE/min)×(試薬量+検体量)/6.22×検体量
×1000 尚測定試薬液は上記の如く1液型としても良い
が、時に応じて2液型にすることも可能である。
特に基質()が、同式においてn≦4の場合
は、試薬保存中にα―グルコ.シダーゼによつて
基質()が分解されることがあり、測定誤差の
原因となるので、この様なことが恐れられる場合
には、基質()とα―グルコシダーゼを分ける
べく2液型とすることが望まれる。反応液のPH
は、6.2〜7.4に調整するのが良く、特に6.5〜7.1
に調整することが望まれる。又反応液中における
各成分の好適濃度範囲は次の通りである。 基質:0.4〜20mM、好ましくは1.0〜4.0mM グルコシダーゼ:既述 ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素:0.01〜50単
位/ml、好ましくは0.2〜5単位/ml 還元型補酵素:遊離又は塩として0.05〜
1.0mM、好ましくは0.1〜0.3mM プロトカテキユ酸ジオキシゲナーゼ:0.001〜
10単位/ml、好ましくは0.02〜1単位/ml 本発明のα―アミラーゼ活性測定試薬は上記の
様に構成されているので、以下要約する様な効果
が発揮される。 (1) α―アミラーゼの作用を連続的に追跡するこ
とができる。 (2) 測定時のPHによる吸光度の変動が少ない。 (3) 基質の特性が既知であり、且つ安定している
から、測定値に対する信頼性が高い。 (4) α―アミラーゼによる鎖切断と計測特性(紫
外部吸光度)を、化学量論的に正確に対応させ
ることができる。 次に本発明の実施例を示す。 実験例 〔ヒト唾液アミラーゼの部分精製〕 ヒトの唾液(31ml)に、2―オクタノール数滴
と蒸留水10mlを添加し、10000rpmで15分間遠心
分離した。その上澄み40mlに、氷冷アセトン40ml
を添加し、更に10000rpmで15分間遠心分離した。
得られた上澄み72mlに再び氷冷アセトン168mlを
添加し、10000rpmで15分間遠心分離した。沈殿
物を分離し、0.07Mの酢酸ナトリウム水溶液を加
え、部分精製液3.2mlを得た〔参考文献:P.
Bernfeld:Methods in Enzymogy Voll.1p151
(1955)Academic Press Inc.〕。 実施例 1 下記溶液を混合調製し、アミラーゼ活性測定試
薬とした。 〔試薬A〕 p―カルボキシフエニル―β―マルトペンタオ
シド 2.0mM MES緩衝液PH7.0 50mM 〔試薬B〕 α―グルコシダーゼ 50単位/ml β―グルコシダーゼ 10単位/ml p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素 4単位/ml プロトカテキユ酸3,4―ジオキシゲナーゼ
0.2単位/ml NADPH 0.5mM NaCl 3mg/ml CaCI2 0.05mg/ml トリトンX―100 0.2% 前記実験例で得たα―アミラーゼ部分精製品溶
液を、5%牛血清アルブミン液で2000倍に希釈し
た液を原液とし、別途5%牛血清アルブミン液を
用いて、5/5,4/5,3/5,2/5,1/
5,0/5の各希釈系列液を調製した。 まず試料50μlと試薬B1.0mlを混合し、37℃で5
分間予備加温した後、試薬A1.0mlを添加した。
そして37℃に保持し、340nmにおける吸光度の変
化を5分間追跡測定した。吸光度は、0.5〜1.0分
間のラグタイムを置いてその後急激に低下した。
この時の直線部分における変化速度(ΔE/min)
から、次式を用いてα―アミラーゼ活性を算出し
た。 α―アミラーゼ活性(u/ml) =(ΔE/min−ΔEb/min)×0.25/6.22×0.05×1
000 =6592×ΔE/min (但しΔEb/minは試薬の代りに水を添加した試
薬ブランク値で、0.011であつた。結果は第1表
に一括して示す通りであつた。
ゼ活性測定試薬に関するものである。 血清、尿、膵液等の体液を対象とするα―アミ
ラーゼ活性の測定は臨床診断上重要な意義を有し
ており、特に急性或は慢性の膵炎、膵臓癌、更に
は流行性耳下腺炎等の鑑別診断に当つては必須の
測定項目となつている。 従来提供されているα―アミラーゼ活性の測定
試薬は、次に示す様な測定原理を利用するものと
して分類することができる。 (1) ヨードデンプン反応を利用するアミロクラス
チツク法 (2) デンプンより生成する還元糖量を測定するサ
ツカロジエニツク法 (3) 色素結合デンプンからの遊離色素を測定する
クロモジエニツク法 (4) デンプンによる濁りを測定するタービドメト
リツク法 これらの方法における使用基質は、デンプン、
その修飾体、或はデンプンから誘導されるアミロ
ースやアミロペクチン等であり、いずれの場合も
天然のデンプンに頼るものである。しかし天然デ
ンプンの場合はその品質、性状が一定せず、α―
アミラーゼ活性測定値に対する信頼性が低くなら
ざるを得ないという欠点があると共に、α―アミ
ラーゼによる鎖切断と測定される特性値との間の
量的関係が不明確であり、更には測定操作が繁雑
であるという問題もあつた。 そこでこれらの欠点を伴わない方法として、共
役酵要法が注目され、次に述べる様な測定方法が
考えられている。 (A) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断を行なつた
後、追随酵素系としてα―グルコシダーゼを作
用させることによつてフラグメントからグルコ
ースを遊離させ、このグルコースを公知の手段
によつて測定する方法。 (B) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断で生成する
マルトースを、追随酵素(マルトースホスホリ
ラーゼ)の作用によつて分解し、生成したグル
コース―1―燐酸を更にホスホグルコシダーゼ
の作用によつて分解し、ここに生成したグルコ
ース―6―燐酸の量を、グルコース―6―燐酸
脱水素酵素及び補酵素の存在下、紫外部吸光度
測定法によつて測定する方法。 (C) ホスホリラーゼ及びβ―アミラーゼを用いて
調製したリミツトデキストリンを基質とし、α
―アミラーゼの作用で生成したフラグメントに
マルトデキストリンホスホリラーゼを作用させ
てグルコース―1―燐酸を遊離せしめ、これを
上記(B)の方法で測定する方法。 (D) カルボキシメチル化等の修飾を施したデンプ
ンを基質とし、α―アミラーゼの作用で生成し
たフラグメントにグルコアミラーゼを作用さ
せ、ここに生成したグルコースを公知の手段に
よつて測定する方法。 (E) p―ニトロフエニル基を還元末端にグルコシ
ド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、α―
アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素として
グルコシダーゼを作用させ、ここに生成したp
―ニトロフエノールを比色定量する方法。 (F) 置換或は非置換フエニル基を還元末端にグル
コシド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、
α―アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素と
してグルコシダーゼを作用させ、ここに遊離し
たフエノール類に4―アミノアンチピリン等の
色原体を酸化縮合させ、生成した色素を比色定
量する方法。 上記(A)〜(F)の共役酵素法においても、天然デン
プンを利用するもの(デキストリン、リミツトデ
キストリン或は修飾デンプン等を基質とする場合
を含む)では、前記(1)〜(4)において述べたのと同
様の欠陥がある。しかしオリゴ糖自体、若しくは
これの末端基に発色基(アグリコン)をグルコシ
ド結合させたものを基質とする場合は、構造式が
明確に把握され且つ高度に精製されたものを使用
するので、天然デンプンの場合に述べた様な変動
がなく、α―アミラーゼによる鎖切断回数と計測
特性値との間の化学量論的な関係も明確となり、
高精度で信頼性の高い結果を得ることができる。
この様な観点からすると、(A),(B),(E)及び(F)法が
良いことになるが、体液特に血清及び尿中にはグ
ルコースやマルトースが存在する為、これらを反
応中間体として経由する方法〔(A),(B)及び(D)〕で
は、計測特性値が高めにあらわれ、レート法
(RateAssay)等の特殊な消去法を用いてもそれ
らの影響を完全に解消することは困難である。従
つてこれらを勘案すれば、(E)法及び(F)法が残され
るが、これらについても次に述べる様な欠陥があ
る。即ち(E)法の場合、体液中に存在するα―アミ
ラーゼの至適PHが、アイソザイムによつて異なる
ものの、一般的には6.8前後であるのに対し、p
―ニトロフエノールの410nmにおける吸光度がPH
6.5〜7.5の範囲で急激に変化する為、発色の変動
が顕著になるという欠点がある。又(F)法の場合α
―アミラーゼの反応を連続的に追跡するというレ
ート法には適さないという欠点がある。 本発明者等は、これら従来法の欠点に鑑み、基
質による不安定さがなく、レート法による連続的
な反応追跡が可能であり、更に吸光度がPHによつ
て急激な変動を見せない様な測定を行なうことの
できるα―アミラーゼ活性測定試薬の提供を目的
として種々検討を行なつた結果本発明を完成する
に至つた。 上記目的に適う本発明の測定試薬とは、共役酵
素法による測定を行なう様に構成されたものにお
いて、カルボキシフエニル基が還元末端にα―グ
ルコシド結合してなるマルトオリゴ糖を基質成分
として含有し、更に追随酵素系として、グルコシ
ダーゼ、ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素並びに還
元型補酵素(必要により更にプロトカテキユ酸ジ
オキシゲナーゼ)を含有するものであることを要
旨とするものである。 本発明試薬によるα―アミラーゼ活性の測定原
理は、α―アミラーゼの作用及びグルコシダーゼ
の作用によつて遊離されたヒドロキシ安息香酸
を、次式で示す様に、ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素及び還元型補酵素によつてヒドロキシ安息香
酸に変換する時の吸光度変化を追跡することから
なるものである。 但し上記化学式において、カルボキシル基はオ
ルト、メタ、パラのいずれの位置にあつてもよい
ものとする。尚ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素と
しては、p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やサ
リチル酸水酸化酵素等があり、これらはいずれも
本発明に適用できるが、以下の説明においては、
便宜上p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を用い
る場合の構成について述べる。従つてマルトオリ
ゴ糖における還元末端に結合されるカルボキシフ
エニル基としては、p―カルボキシフエニル基で
ある場合を述べることになるが、該フエニル基に
おける置換基の種類、数及び位置が変更されると
きは、ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の種類もそ
れに応じて変更すべきであることは言う迄もな
い。 この場合用いられるマルトオリゴ糖は、次の一
般式()で示される様に、還元末端にp―カル
ボキシフエニル基がグルコシド結合してなるもの
である。 (但しn=2〜10であり、マルトオリゴ糖の還元
末端とp―カルボキシフエニル基とは、α―及
び/又はβ―グルコシド結合しているものとす
る) この基質に対し、α―アミラーゼ含有試料を作
用させると、マルトオリゴ糖鎖におけるいずれか
のα―グルコシド結合が切断され、p―カルボキ
シフエニル基を有するフラグメントが生成する。
これに対して追随酵素であるグルコシダーゼを作
用させると、非還元末端側から遂次グルコースを
遊離していき、最後に()式で示される構造の
化合物を生成する。 (但しグルコース単位とp―カルボキシフエニル
基とは、α―及び/又はβ―グルコシド結合して
いるものとする) そしてグルコシド結合がα―結合の場合はα―
グルコシダーゼを作用させ、β―結合の場合はβ
―グルコシダーゼを作用させることにより、p―
ヒドロキシ安息香酸を遊離する。 次いでこのp―ヒドロキシ安息香酸に、p―ヒ
ドロキシ安息香酸水酸化酵素及び還元型補酵素を
作用させると、次の反応式によりプロトカテキユ
酸が生成する。 そしてこの反応を、還元型補酵素の吸光度変化
(NADPHやNADHでは340nm)を追跡すること
によつてα―アミラーゼ活性を測定する。 上記が、本発明における共役酵素反応の概略で
あるが、次に基質及び追随酵素群について説明を
加える。 まず基質として用いる物質、即ちマルトオリゴ
糖の還元末端にp―カルボキシフエニル基がグリ
コシド結合した物質〔以下単に基質()とい
う〕は、p―ヒドロキシ安息香酸とマルトオリゴ
糖を常法に準じて反応させることによつて製造す
る。例えば丸善発行、日本化学会編:実験化学講
座第24巻生物化学の第304頁(1958年)に記載
された方法に従つてマルトオリゴ糖をアセチル化
し、次いで触媒の存在下p―ヒドロキシ安息香酸
メチルエステルを還元性末端に結合させ、最後に
保護アセチル基及びメチル基を温和な条件下で加
水分解すれば、上記の基質()を製造すること
ができる。但し該反応におけるグルコシド結合の
形成を、α―結合又はβ―結合の一方のみ選択的
に進行させることは困難であるから、基質()
として両者を混合状態で使用することが推奨され
る。従つて追随酵素として用いられるグルコシダ
ーゼについても、α―グルコシダーゼとβ―グル
コシダーゼを併用することが推奨される。もつと
も、上記反応又はその後の処理によつて、α―結
合体又はβ―結合体が選択的に得られるならば、
夫々に対応してα―又はβ―グルコシダーゼを利
用すればよい。このようなα―グルコシダーゼ及
びβ―グルコシダーゼについては、動物起源、植
物起源或は微生物起源等の如何を問わないが、特
に好適なものを説明すると、α―グルコシダーゼ
については、基質特異性の面から見て酵母起源の
ものが有利である。即ち酵母起源のものは一般に
基質特異性が広範囲に及びアグリコンによる影響
が少ないと共に、マルトトリオシド以下のグルコ
シドには良く作用するが、マルトテトラオシド以
上のグルコシドには作用しないという特性があ
り、アミラーゼ活性の測定という本発明の趣旨に
適合し有利である。一方β―グルコシダーゼにつ
いても、同様の趣旨から見て、例えばアーモンド
起源のものがもつとも強く推奨される。尚α―グ
ルコシダーゼとβ―グルコシダーゼは、前述の様
にしばしば併用され、この場合における配合割合
は、基質の種類及び、該基質におけるグルコシド
結合のα/β比等によつて異なるが、一般的に言
えばα―アミラーゼによつて生成したマルトトリ
オースやp―カルボキシフエニル化マルトースを
非常に早く分解する量であれば十分であり、通常
はα―グルコシダーゼを20単位/ml以上、β―グ
ルコシダーゼを4単位/ml以上存在させることが
望まれる。 次にp―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは、
フラビン関与の外部電子供給体要求性一原子酸素
添加酵素に属し、酵素番号EC1.14.13.2で示され
るものを含む。該酵素の起源についても格別の限
定を受ける訳ではないが、もつとも好ましいのは
細菌起源殊にシユードモナス属に属する菌を起源
とするものであつて、より具体的に述べるなら
ば、シユードモナス・デスモリテイカ、シユード
モナス・フルオレツセンス、シユードモナス・プ
チダ等から得られるものが本発明に適している。 又同じく追随酵素系の一員を構成する還元型補
酵素としては、一般にNADPHやNADH等が好
んで用いられる。 本発明に係る測定試薬は、原則的に上記基質及
び追随酵素群から構成されるが、必要によりプロ
トカテキユ酸ジオキシゲナーゼを含有させておく
方が良い場合もある。即ち上述のp―ヒドロキシ
安息香酸測定系において、既知量のアミラーゼを
作用させて種々実験していたところ、p―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の添加量が多くなるにつ
れてα―アミラーゼ活性の測定値が高めに現われ
てくるという現象に気が付いた。そこでその原因
を種々の角度から検討したところ、酵素反応によ
つて生成したプロトカテキユ酸が、p―ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素に対する脱共役剤(アンカ
プラー)として作用し、還元型補酵素の酸化を更
に促進させその結果として測定値を正誤差の方向
に誤らせるという背景を見出した。そこでその様
な不都合を解消することを目的にして更に検討を
行ない、プロトカテキユ酸―3,4―ジオキシゲ
ナーゼ或はプロトカテキユ酸―4,5―ジオキシ
ゲナーゼの様なプロトカテキユ酸ジオキシゲナー
ゼを作用させてプロトカテキユ酸の影響を消失さ
せるという構成に到達した。即ち上記基質及び追
随酵素系からなる測定用組成物にプロトカテキユ
酸ジオキシゲナーゼを添加しておけば、反応系中
に生成してくるプロトカテキユ酸が消失され、α
―アミラーゼ活性の測定精度が向上するというこ
とを見出した。 ところで上記プロトカテキユ酸―3,4―ジオ
キシゲナーゼとは、プロトカテキユ酸を、3―カ
ルボキシ―シス―ムコン酸(β―カルボキシムコ
ン酸)に変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二
原子酵素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.1.3の
ことである。該酵素の作用は下記式で示される。 該酵素としては細菌、特にシユードモナス属、
ノカルジア属の菌およびノイロスポアから得られ
たものが好ましい。又プロトカテキユ酸―4,5
―ジオキシゲナーゼとはプロトカテキユ酸を2―
ハイドロキシ―4―カルボキシムコン酸セミアル
デヒドに変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二
原子酸素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.11.8
のことである。該酵素の作用は下記式で示され
る。 該酵素としては、細菌、特にシユードモナス属
の菌から得られたものが好ましい。 本発明の測定試薬組成物は上記の如く構成され
るが、これを用いてα―アミラーゼ活性の測定を
行なうに当つては、次の様に行なう。即ち測定試
薬を適当な緩衝液に溶解し、該試薬に検体を加え
て混合し、25℃〜37℃に亘る一定の温度条件下で
340nmの波長における吸光度の変化速度(ΔE/
mm)を測定し、次式によつてα―アミラーゼ活性
値を算出する。 α―アミラーゼ活性値(単位/) =(ΔE/min)×(試薬量+検体量)/6.22×検体量
×1000 尚測定試薬液は上記の如く1液型としても良い
が、時に応じて2液型にすることも可能である。
特に基質()が、同式においてn≦4の場合
は、試薬保存中にα―グルコ.シダーゼによつて
基質()が分解されることがあり、測定誤差の
原因となるので、この様なことが恐れられる場合
には、基質()とα―グルコシダーゼを分ける
べく2液型とすることが望まれる。反応液のPH
は、6.2〜7.4に調整するのが良く、特に6.5〜7.1
に調整することが望まれる。又反応液中における
各成分の好適濃度範囲は次の通りである。 基質:0.4〜20mM、好ましくは1.0〜4.0mM グルコシダーゼ:既述 ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素:0.01〜50単
位/ml、好ましくは0.2〜5単位/ml 還元型補酵素:遊離又は塩として0.05〜
1.0mM、好ましくは0.1〜0.3mM プロトカテキユ酸ジオキシゲナーゼ:0.001〜
10単位/ml、好ましくは0.02〜1単位/ml 本発明のα―アミラーゼ活性測定試薬は上記の
様に構成されているので、以下要約する様な効果
が発揮される。 (1) α―アミラーゼの作用を連続的に追跡するこ
とができる。 (2) 測定時のPHによる吸光度の変動が少ない。 (3) 基質の特性が既知であり、且つ安定している
から、測定値に対する信頼性が高い。 (4) α―アミラーゼによる鎖切断と計測特性(紫
外部吸光度)を、化学量論的に正確に対応させ
ることができる。 次に本発明の実施例を示す。 実験例 〔ヒト唾液アミラーゼの部分精製〕 ヒトの唾液(31ml)に、2―オクタノール数滴
と蒸留水10mlを添加し、10000rpmで15分間遠心
分離した。その上澄み40mlに、氷冷アセトン40ml
を添加し、更に10000rpmで15分間遠心分離した。
得られた上澄み72mlに再び氷冷アセトン168mlを
添加し、10000rpmで15分間遠心分離した。沈殿
物を分離し、0.07Mの酢酸ナトリウム水溶液を加
え、部分精製液3.2mlを得た〔参考文献:P.
Bernfeld:Methods in Enzymogy Voll.1p151
(1955)Academic Press Inc.〕。 実施例 1 下記溶液を混合調製し、アミラーゼ活性測定試
薬とした。 〔試薬A〕 p―カルボキシフエニル―β―マルトペンタオ
シド 2.0mM MES緩衝液PH7.0 50mM 〔試薬B〕 α―グルコシダーゼ 50単位/ml β―グルコシダーゼ 10単位/ml p―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素 4単位/ml プロトカテキユ酸3,4―ジオキシゲナーゼ
0.2単位/ml NADPH 0.5mM NaCl 3mg/ml CaCI2 0.05mg/ml トリトンX―100 0.2% 前記実験例で得たα―アミラーゼ部分精製品溶
液を、5%牛血清アルブミン液で2000倍に希釈し
た液を原液とし、別途5%牛血清アルブミン液を
用いて、5/5,4/5,3/5,2/5,1/
5,0/5の各希釈系列液を調製した。 まず試料50μlと試薬B1.0mlを混合し、37℃で5
分間予備加温した後、試薬A1.0mlを添加した。
そして37℃に保持し、340nmにおける吸光度の変
化を5分間追跡測定した。吸光度は、0.5〜1.0分
間のラグタイムを置いてその後急激に低下した。
この時の直線部分における変化速度(ΔE/min)
から、次式を用いてα―アミラーゼ活性を算出し
た。 α―アミラーゼ活性(u/ml) =(ΔE/min−ΔEb/min)×0.25/6.22×0.05×1
000 =6592×ΔE/min (但しΔEb/minは試薬の代りに水を添加した試
薬ブランク値で、0.011であつた。結果は第1表
に一括して示す通りであつた。
【表】
第1図はこれをグラフ化したものであり、希釈
系列値とα―アミラーゼ活性値の間には、ほぼ完
壁な直線関係が認められた。
系列値とα―アミラーゼ活性値の間には、ほぼ完
壁な直線関係が認められた。
第1図は希釈系列値とα―アミラーゼ活性の関
係を示すグラフである。
係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 カルボキシフエニル基が還元末端にグルコシ
ド結合してなるマルトオリゴ糖を基質成分として
含有し、更にグルコシダーゼ、ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素並びに還元型補酵素を含有するもの
であることを特徴とするα―アミラーゼ活性測定
試薬。 2 カルボキシフエニル基が還元末端にグルコシ
ド結合してなるマルトオリゴ糖を基質成分として
含有し、更にグルコシダーゼ、ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素、還元型補酵素並びにプロトカテキ
ユ酸ジオキシゲナーゼを含有するものであること
を特徴とするα―アミラーゼ活性測定試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19491682A JPH0236238B2 (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | Arufuaaamiraazekatsuseisokuteishaku |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19491682A JPH0236238B2 (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | Arufuaaamiraazekatsuseisokuteishaku |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5985300A JPS5985300A (ja) | 1984-05-17 |
JPH0236238B2 true JPH0236238B2 (ja) | 1990-08-16 |
Family
ID=16332471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19491682A Expired - Lifetime JPH0236238B2 (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | Arufuaaamiraazekatsuseisokuteishaku |
Country Status (1)
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JP (1) | JPH0236238B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP1947191A1 (en) | 2007-01-17 | 2008-07-23 | FUJIFILM Corporation | Method for measuring animal alpha-amylase |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61124397A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 |
-
1982
- 1982-11-06 JP JP19491682A patent/JPH0236238B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1947191A1 (en) | 2007-01-17 | 2008-07-23 | FUJIFILM Corporation | Method for measuring animal alpha-amylase |
US8906641B2 (en) | 2007-01-17 | 2014-12-09 | Fujifilm Corporation | Method for measuring animal α-amylase |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JPS5985300A (ja) | 1984-05-17 |
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