JPH02303499A - ハロゲノプロピオン酸エステルの酵素による鏡像異性選択的分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はハロゲノプロピオン酸エステルの鏡像異性選択
的分離方法、さらに特定すれば２−クロロプロピオン酸
アルキルの２つの光学異性体のうちの１つを、酵素の作
用によってエステル交換して分離する方法に関する。

光学的に純粋なりロロブロピオン酸エステルは医薬およ
び農薬の分野において使用される。最終製品の医薬、除
草剤および殺菌剤などは１つの型鏡像異性体のみが活性
を有し、他の型は何らかの毒性を示すことがあっても活
性を有しない。

それ故クロロプロピオン酸エステルのような化学的に単
純な分子について、化学工業界は他の型の異性体を小量
にして、１つの型の異性体を大量に合成または分離する
方法を長年にわたって探求してきた。

フランス特許２４５９２２１号記載のクロロプロピオン
酸エステルの最も古い合成方法は、微生物学的方法によ
って光学的に純粋なように合成された乳酸（Ｒ）から出
発して、これをエステル化し、次にこの乳酸エステル（
Ｒ）に塩化チオニルを作用させる。

この方法は光学的に純粋な酸エステルを得ることができ
るが、経済的に最良な方法ではない。実際光学的に純粋
な乳酸の合成は高価であり、そのエステル化および塩化
の工程は、光学的純粋性の保持を要求されるので、これ
にも費用を要する。

これに反して、クロロプロピオン酸およびそのラセミ体
エステルは化学製品として販売されており、極めて有利
な価格で入手できる。

従って工業界は、光学的に純粋な乳酸から出発する従来
の方法と同等な有利さでクロロプロピオン酸またはその
誘導体を分離できる方法を長年にわたって探求してきた
。

ハロゲノプロピオン酸またはそのラセミ体誘導体を分離
するいくつかの方法がすでに記載されている。立体異性
選択的方法は３つの型、すなわち酵素的なエステル化方
法と、酵素的な加水分解方法と、酵素的な加水分解−説
ハロゲン化方法とに分けることができる。

酵素による立体異性選択的エステル化方法として、米国
特許４６０１９８７号の方法を挙げることができる。こ
れはＣａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａから由来
するリパーゼを使用して、炭素原子１〜４個を含むアル
コールでハロゲノプロピオン酸ヲエステル化スる。この
リパーゼはプロピオン酸（Ｓ）を残して、求める異性体
のエステル（Ｒ）を特に得ることができる。しかしエス
テルと酸との分離が常に容易でない。

プロピオン酸（Ｓ）は、水和後の水抽出によって望まな
いエステルから分離する。このエステルは有機相に残る
。次にこれを酸媒質で加水分解した後、プロピオン酸の
水素に対応する水素を有する酸でラセミ化し、次に立体
異性選択的エステル比相に再び導入する。この工程で、
リパーゼが異性体（Ｒ）に選択的に作用するので、生成
するエステルは常に望まない化合物であり、これを加水
分解し、ラセミ化して循環する必要がある。エステル（
Ｓ）を直接得て、酸（Ｒ）を循環させれば有利とな”る
が、酵素の作用の方向を逆転させることはできない。

エステル化が完全でない場合は、エステル化後の残留物
に対応する酸（Ｓ）を純粋に得ることができない。しか
るに、酵素的方法では転換率を１００％とすることは困
難である。この方法は所望の誘導体を選択的に得ること
ができない。

またこの方法は以前に開発された旧来の化学的方法と経
済的に競争することができない。

酵素的加水分解方法として、欧州特許１９６６２５号の
方法を挙げることができる。これはＣａｎｄｉｄａｃｙ
ｌｉｎｄｒａｃｅａから由来するリパーゼによってラセ
ミ体のハロゲノプロピオン酸エステルを立体異性選択的
に加水分解し、ハロゲノプロピオン酸エステル（Ｓ）を
残して、ハロゲノプロピオン酸異性体（Ｒ）を選択的に
得ることができる。

しかし加水分解が完全に行われず、その収率が１００％
より低い。異性体エステル（Ｓ）のなかに、出発物のラ
セミ体化合物が常にいくらか残り、これを分離すること
ができない。すなわち前記特許の方法と同様の問題が残
る。

それ故工業界は、ハロゲノプロピオン酸またはその誘導
体から出発し、ハロゲノプロピオン酸工ステル（Ｓ）を
合成してラセミ体混合物を反応媒質に残すことができる
方法を求めている。

ハロゲノプロピオン酸を分離できる方法の第３の型とし
て、欧州特許１７９６０３号の方法を挙げることができ
る。これはハロゲノプロピオン酸のハロゲンを選択的に
加水分解する方法である。この選択的加水分解はハリド
ヒドロラーゼによって行う少な（とも異性体（Ｒ）の一
部分は、構造の逆転によって、乳酸（Ｓ）とも呼ばれる
ヒドロプロピオン酸（Ｓ）に転換する。ハロゲノプロピ
オン酸（Ｓ）が反応媒質に存在し、異性体（Ｒ）の転換
率が前記２つの特許と同様に完全ではないが、この技術
によればハロゲノプロピオン酸（Ｓ）を純粋な状態で得
ることができる。

本発明は従来技術によって解決できなかった課題を解決
することができた。すなわち、ハロゲノプロピオン酸エ
ステルのラセミ体混合物から出発して、ハロゲノプロピ
オン酸エステルを構成する２つの異性体のうちの１つの
異性体のみを立体異性選択的に得ることができる。

出発物のハロゲノプロピオン酸エステルは炭素原子１〜
１２個を含むアルキルのエステルである。

エステルは炭素原子１〜４個を含むアルキルのエステル
を使用することが好ましく、ハロゲノプロピオン酸のメ
チルまたはエチルエステルを出発物とすることが最も好
ましい。

ハロゲノプロピオン酸エステルは、クロロまたはプロモ
プロピオン酸エステルが特に有利である。

反応は次式で示すことができる。

Ｃｔｈ　　Ｃｆｌ　　Ｃ０ＯＲ＋　＋　ＲｚＯＨ→（Ｓ
、Ｒ） （Ｓ）　　　　　　　　（Ｒ） （式中、Ｒ１およびＲ２は炭素原子１〜４個を含むアル
キル基が好ましく、Ｒ８はメチルまたはエチル基、Ｒｔ
はイソブチル基が特に好ましい。）求める異性体（Ｓ）
は、反応が定量的でなく、すなわち転換率が１００％よ
り低いときでも、蒸留によって容易に分離できる。これ
は、イソブチルエステルがメチルまたはエチルエステル
と比べて異る沸点を有するためである。

残りの反応媒質は光学的に純粋なイソブチルエステル（
Ｓ）を含む。蒸留物は強酸によって加水分解した後ラセ
ミ化する。

エステル交換は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏ
ｐｉｕｍおよびＧｅｏＬｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄ：ｄｕ
ｍから選ぶ微生物の培養から由来する酵素粉末によって
行われる。

Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ菌株はＣｅｎ
　ｔｒａａ　Ｉｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓ寄託番号１００−８９を使用するこ
とが好ましい。

この菌株は、植物油、好ましくは大豆油を含む古典的な
醗酵培養物で培養することが好ましい。

Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　ＣＢＳ　１
００−８９菌株の培養は、表面または深部で行うすべて
の好気性培養によって行うことができるが、深部で行う
方が便利であるので好ましい。この目的には、醗酵工業
で現在使用される播種、醗酵の技術、および多様な装置
を使用する。

醗酵媒質は、古典的な方法のように栄養源の炭素および
窒素、ミネラルを必須成分として含み、場合によっては
成長因子を含む。これらすべての因子は、明確に限定さ
れた生成物の形で、または多様な由来からの生物学的生
成物のなかに存在する複合混合物に含まれている形で使
用することができる。

炭素栄養源としては、グルコースのような含水炭素およ
び／または大豆油のようなグリセライドを使用すること
ができる。

便宜な窒素栄養源は極めて多様であり、無機酸のアンモ
ニウム塩のような極めて単純な化学物質であることがで
き、またコーンステイープのように含窒素有機物の形で
窒素を主要成分として含む複合物質に含まれているもの
を使用することができる。

添加するミネラルのうち、炭酸カルシウムのようにｉ街
剤または中和剤としての効果を有するものもある。その
他塩化コバルトのようにＧｅｏ　Ｌｒ　ｉ　ｃｈｕｍｃ
ａｎｄｉｄｕｍ　ＣＢＳ　１００−８９の生育に必要な
イオン平衡をもたらすものがある。

酵素は遊離または固定された形で使用することができ、
出発物のエステルに対して約０６１〜１００重量％を使
用する。

エステル交換に使用するアルコール、またはこのアルコ
ールに対して不活性な溶剤のなかで、酵素とハロゲノプ
ロピオン酸エステルとの反応がおきる。これらの溶剤の
うち、脂肪族または芳香族の炭化水素、ハロゲン化され
た脂肪族または芳香族の炭化水素から選ぶ非水溶性溶剤
を使用することが好ましい。

アルコールまたは溶剤に対するエステルの濃度はアルコ
ールまたは溶剤の１１に対してエステル０、１〜５モル
とする。本発明の良好な実施態様として、反応温度は５
〜６０°Ｃとし、３０〜５０°Ｃが好ましい。

次に、本発明をさらに詳しく説明するために実施例を示
すが、これが本発明を限定するものと考えてはならない
。

Ａ１面１ｌ１ １７０１の醗酵槽内に次の物質を導入した。

コーンステイープ（乾燥抽出物５０％）　　　４８００
ｇグルコース−水和物　　　　　　　　　　２４００　
ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　６００ｇ
硫酸マグネシウム穴水和物　　　　　　　１２０　ｇ水
道水（十分な量）　　　　　　　　　　　　１１０４２
１ＯＮソーダ溶液５５０ｄを加えてｐＨを７．５０に調
節した後、 炭酸カルシウム　　　　　　　　　　　　６００ｇを加
えて媒質のｐＨを７．５５とした。１２２°Ｃの蒸気を
４０分間通して滅菌した。冷却後、滅菌中に凝縮した蒸
気のために、媒質の体積は１２０！となり、ｐＨは６．
９６であった。

次に、エレンマイヤフラスコ内で撹拌しながら、Ｇｅｏ
ｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　ＣＢＳ　１００−
８９２００ｆｆｉｆを接種した。この培養物に、滅菌し
た空気を吹込み、撹拌しなから２８°Ｃで１２時間生育
させた。この培養物は生産用培養物の播種に便宜である
。

８００１の醗酵槽内に別に、次の物質を導入して生産用
培養物とした。

コーンステイープ（乾燥抽出物５０％）　　　　　７ｋ
ｇ大豆油　　　　　　　　　　　　　　　　　７１硫酸
アンモニウム　　　　　　　　　　　０．７０　ｋｇ塩
化コバルト六水和物２０ｇ／Ｉ！溶液　　　０．３５ｆ
水道水（十分な量）　　　　　　　　　　　　３１０　
ｆ１ＯＮソーダ溶液６００成を加えてｐＨを６．４０に
調節した後、 炭酸カルシウム　　　　　　　　　　　１．７５ｋｇを
加えて媒質のｐＨを６．６０とした。媒質に１２２°Ｃ
の蒸気を４０分間通して滅菌した。冷却後、滅菌中の蒸
気の凝縮によって、媒質の体積は３４０　ＩＩ！となり
、グルコース−水和物　　　　　　　　　３．５　ｋｇ
を含む滅菌水溶液１０２を加えて３５０　ｊ！とじた。

媒質のｐ）１は６．７５であった０次に、前述の１７０
２の醗酵槽内で接種された培養物３．５７！を播種した
。

培養物は２０Ｏｒｐｍで回転する撹拌機で撹拌しながら
、滅菌空気２０ｎ（／ｈを吹込み、２８°Ｃで３９時間
生育させた。この液は培養中に６Ｎ塩酸約０．５　Ａを
加えて、培養の終りにｐＨを７．００とした。

操作の終りに、培養液は３７０２となり、濾液のリパー
ゼ活性は１０．ＯＵ、　１．／ｄであった。　　１［Ｊ
、ｌは２５°Ｃで１分間につき１マイクロ当量の酸を遊
離する酵素の量である（Ｄｅｓｎｕｅｌｌｅ、　Ｃｏｎ
５ｔａｎｔｉｎ　Ｂａ１ｄｙ。

Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ、Ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｌ、３７．２８５
（１９５５）。

Ｂ、！ＬＪｉ 工程Ａで得られた１０．８Ｕ、　１．　／ｄの培養液３
７０！を撹拌機付き槽に移した。濾材シリカ２５ｋｇを
加え、３０分間撹拌した後、フィルタプレスで懸濁液を
濾過した。濾過ケーキは水８０２で洗浄した。濾液は全
量が３８０！であり、酵素活性は１０．５Ｕ、１．／−
であった、これを３５°Ｃで減圧濃縮し、３９Ｕ、ｆ、
／ｍｌの濃縮液６０ｊ２を得た。

この濃縮液に、ＩＱＮアンモニア水を加えてｐｌ＋を８
に保った硫酸アンモニウム３０ｋｇを加え、３０分間撹
拌した後、−晩４　’Ｃに保った。次に濾材５００ｇを
加えて濾過した。分離した活性沈澱および濾材を４°Ｃ
の蒸留水５２に懸濁させ、ｐＨを８に保って１５分間撹
拌した。懸濁液を濾過し、濾過ケーキを冷い蒸留水１５
００ｄで３回洗浄した。活性９４Ｕ、１．／ｍ２の濾液
０．１１を得た。

濾液は再生セルロース膜を通して、蒸留水５０ｆに対し
て４°Ｃで４８時間透析した。

得られた５７．５１１．１．／−の透析液１１２をｐＨ
８、温度４°Ｃに保って撹拌しながら、予め一２０°Ｃ
に冷却しておいたアセトン４．４Ｉ！、を加え、さらに
５分間撹拌した。活性沈澱を一２０°Ｃで５分間遠心分
離し、４°Ｃの蒸留水２５０戚に懸濁させた。懸濁液は
新たに４　’Ｃで１０分間遠心分離して沈澱を除去し、
残ったアセトンは２０°Ｃで２ｍｍＨｇの減圧蒸留を行
い、最終溶液は凍結乾燥した。

１８０００Ｕ、　１．　／　ｇの酵素２２．９ｇを得た
。

イソブタノール中のクロロプロピオン酸エチルエステル
（Ｒ、Ｓ）　２ｍｏｌ　？容？Ｆ１７ｍに、予め調製し
たＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍから由来す
る酵素３３０ｍｇを加えた。この混合物を３７°Ｃで４
７時間撹拌し、遠心分離して酵素を除去した後、混合物
を蒸留してガスクロマトグラフィで分析した。クロロプ
ロピオン酸エチルのエステル交換率は１０％であり、ク
ロマトグラフィでキラール相に過剰の鏡像異性体が測定
された。生成したイソブチルエステルの光学的純度はＳ
型構造の異性体につき６８％であった。この光学的純度
は次式による。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ハロゲノプロピオン酸エステルの２つの光学的異性
   体の分離方法であって、酵素の作用によって鏡像異性選
   択的エステル交換を行い、所望の光学的純粋なエステル
   を分離することを特徴とする方法。 ２、Ｓ型異性体を立体異性選択的にエステル交換する、
   請求項１記載の方法。 ３、ハロゲノプロピオン酸エステルがクロロまたはプロ
   モプロピオン酸エステルである、請求項１記載の方法。 ４、ハロゲノプロピオン酸エステルが、ハロゲノプロピ
   オン酸と炭素原子１〜１２個を含むアルコールとのエス
   テルである、請求項１記載の方法。 ５、ハロゲノプロピオン酸エステルが、クロロプロピオ
   ン酸エチルエステルである、請求項４記載の方法。 ６、炭素原子１〜１２個を含むアルコールでエステル交
   換する、請求項１記載の方法。 ７、イソブチルアルコール、エチルアルコールまたはメ
   チルアルコールでエステル交換する、請求項６記載の方
   法。 ８、クロロプロピオン酸エチルエステルとイソブチルア
   ルコールとの間でエステル交換する、請求項１記載の方
   法。 ９、酵素の作用によるエステル交換を、Ｐｅｎｉｃｉ−
   ｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍまたはＧｅｏｔｒｉｃ
   ｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍから由来するリパーゼによっ
   て鏡像異性選択的に行う、請求項１記載の方法。 １０、エステル交換を、脂肪族または芳香族の炭化水素
   から選ぶ非水溶性の不活性有機溶剤中で行う、請求項１
   記載の方法。 １１、望まないエステルをラセミ化して、エステル交換
   工程に循環させる、請求項１記載の方法。