JPH02265497A - 抗ヒトアポリポ蛋白ｃ−２抗体およびそれを用いたヒトアポリポ蛋白ｃ−２の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 歳果上皇利里分野 本発明は、抗ヒトアポリポ蛋白Ｃ−■モノクローナル抗
体、およびそれを用いたヒトアポリポ蛋白Ｃ−ＩＩの測
定法に関する。さらに詳しくは、ヒトアポリポ蛋白Ｃ−
■で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物のミエ
ローマ細胞との融合細胞により産生される、ヒトアポリ
ポ蛋白Ｃ−ＩＩを特異的に認識する抗ヒトアポリポ蛋白
Ｃ−ｎモノクローナル抗体、および該抗ヒトアポリポ蛋
白Ｃ−ｎモノクローナル抗体の１種または２種以上を用
いることを特徴とするヒトアポリポ蛋白Ｃ−ＩＩの測定
法に関する。

従来技術および発明が解決しようとする課題食糧事情の
高栄養化や高齢化社会の進展に伴い、脂質代謝異常によ
ってひきおこされる高脂血症、動脈硬化症等の疾患は、
近年ますます増加の傾向を強めている。これら疾患の診
断に当たって血中脂質、とりわけリポ蛋白やその蛋白成
分であるアポリポ蛋白の測定を行うことが臨床分野にお
いて広（行われている。

ヒトアポリポ蛋白ｃ−ｎ　＜以下、「アポＣ−■」とい
う）は、ヒト血中リポ蛋白のうちカイロミクロンや超低
比重リポ蛋白（以下、ｒＶＬＤＬＪという）中に主に存
在し、リポ蛋白リパーゼの強力な活性化因子であること
から特に注目されているアポリポ蛋白である。その血中
濃度の測定は、脂質代謝を把握する上で重要な指針とな
る。

現在、アポＣ−ＩＩの測定は、動物をアポＣ−■で免疫
して得られる抗血清を用いた種々の免疫学的測定法によ
り行われている。しかし、動物から得られる抗血清を用
いる免疫学的測定法では抗血清中に含まれるポリクロー
ナル抗体を利用するものであり、該抗体は免疫に用いる
抗原の精製度の違いや免疫される動物の個体差などに起
因するロフト間の特異性や力価等の差を生じ、一定した
測定値を得るのが困難であった。また試薬キットとして
応用した場合にも一定した性能の製品を製造することが
困難であった。

課題を解決するための手段 本発明者らは、ポリクローナル抗体の有する上記欠点を
改良すべく鋭意研究を重ねた結果、アポＣ−■に特異的
に反応するモノクローナル抗体の作製に成功するととも
に、該モノクローナル抗体がアポＣ−ＩＩの測定に有用
であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、アポＣ−Ｈに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体を用い
たアポＣ−Ｈの測定法を提供するものである。

本発明のアポＣ−■に対するモノクローナル抗体は、ア
ポＣ−■で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物
のミエローマ細胞との融合細胞（以下、「ハイブリドー
マ」という）により産生される。こうして得られた本発
明の抗アポＣ−■モノクローナル抗体（以下、「本発明
抗体」という）は、種々の免疫学的測定法における特異
抗体として使用することができ、簡便、迅速かつ高精度
なアポＣ−ＩＩの測定を可能とする。

つぎに本発明抗体を産生ずるノ＼イブリドーマの作製法
、本発明抗体の製造法および本発明抗体を用いたヒトア
ポＣ−ＩＩの測定法についてさらに詳しく説明する。

本発明抗体を産生ずるハイブリドーマは、（ｉ）哺乳動
物の免疫、（ｉｉ）細胞融合および（ｉｉｉ）クローニ
ングの各工程により作製することができる。

（ｉ）哺乳動物の免疫 精製したアポＣ−ＩＩを抗原として、哺乳動物に投与（
免疫）することにより行う。抗原として用いるアポＣ−
■は、ヒト血清または血漿を超遠心して得られるカイロ
ミクロン・ＶＬＤＬ画分を脱脂した後、セファクリルＳ
−２００などを用いたカラムクロマトグラフィーで精製
することにより得ることができる。免疫する哺乳動物と
しては、マウス、ヌードマウス、ラット等を使用するこ
とができるが、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスが特に好
ましい。

免疫方法は常法により行われ、抗原を哺乳動物の腹腔内
、背部、皮下等の適当な部位に投与免疫させる。投与量
は、哺乳動物の種類、投与部位等に応じて適宜決定され
るが、マウスに投与する場合は１回当たり１０μ９〜ｌ
　ｍｙ／マウス程度とするのが適当である。

（ｉｉ）細胞融合 上記工程（ｉ）で得た免疫哺乳動物の抗体産生細胞と哺
乳動物のミエローマ細胞とを用い、常法により行う。抗
体産生細胞としては、上記ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺細胞
が最も好適であるが、これ以外にも例えばマウスのリン
パ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ球等も使用す
ることができる。ミエローマ細胞としては、マウスのミ
エローマ細胞ＦＯが好ましいが、これ以外のミエローマ
細胞を用いることもできる。細胞融合法としては、ポリ
エチレングリコール法、ＨＶＪ法、電気融合法等を挙げ
ることができる。

この様にして得られたハイブリドーマを１．ＯＸｌｏ−
４Ｍヒボキサンチン、４．０Ｘ１０−’Ｍアミノプテリ
ンおよび１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンを含むダルベツコ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の適当な培地で培養す
れば、ハイブリドーマのみが増殖して（る。

（ｉｉｉ）クローニング 上記工程（ｉｆ）で増殖したハイブリドーマから本発明
抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした後、限界
希釈法等の公知の方法によって行う。ハイブリドーマの
スクリーニングは、ハイブリドーマの培養上清を、精製
したアポＣ−■やヒトカイロミクロン・ＶＬＤＬ画分を
抗原とした酵素免疫測定法やウェスタンプロット法で試
験し、培養上清中の本発明抗体の有無を調べることによ
り実施することができる。

ついで上記ハイブリドーマから本発明抗体を製造する。

すなわち、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を経て得られ
た本発明抗体産生ハイブリドーマを適当な培地で培養し
、その培養上清から分離精製するか（インビトロ法）、
あるいは本発明抗体産生ハイブリドーマをこれと適合性
のある１乳動物の腹腔内に投与し、増殖させ、その動物
の腹水より分離精製する（インビボ法）ことにより目的
とする本発明抗体が製造される。インビトロ法において
用いることのできる培地としては、ＤＭＥＭ。

ＲＰＭ１１６４０培地、ＡＳＦ培地１０３等の培地を挙
げることができる。分離精製は、硫安分画ａ＜硫酸アン
モニウム塩析）、ＤＥＡＥセルロース等を用いたイオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の常法により行うことができる。

この様にして得られた本発明抗体は、アポＣ−ＩＩの免
疫学的測定法、例えば、常法の酵素免疫測定法（ＥＩＡ
法）や免疫比濁法（ＴＩＡ法）等に利用することができ
る。

本発明抗体の酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）への応用は次
の様にして行うことができる。即ち、不溶化した本発明
抗体（以下、「不溶化抗体」という）とアポＣ−ＩＩを
反応させた後、不溶化抗体に結合したアポＣ−■に標識
物質で標識した本発明抗体（以下、「標識抗体」という
）を反応させる。次いで、不溶化抗体／アポＣ−■結合
体に結合した標識抗体と未結合標識抗体とを分離した後
、結合標識抗体または未結合標識抗体のいずれか一方の
標識活性を測定すれば試料中のアポＣ−■を定量するこ
とができる。

一般に本発明抗体を用いて酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）
によりアポＣ−ＩＩを測定する場合、異なる抗原決定基
に反応する２種類の本発明抗体を用い、一方を不溶化抗
体とし、他方を標識抗体として、いわゆるサンドイツチ
法によって行うのが好都合である。不溶化抗体は、常法
により本発明抗体を不溶化担体（ポリスチレンビーズ、
ガラスピーズ、９６ウエルマイクロプレート等）に化学
的または物理的に結合させることにより製造することが
できる。例えば不溶化担体として９６ウエルマイクロプ
レート（ポリスチレン製）を用い本発明抗体を物理的に
結合させる場合には、抗体濃度が５〜５００μｇ／ｓ２
、好ましくはｌＯ〜１００μｇ／ｌａＱとなる様に炭酸
緩衝液等の適当な緩衝液で調製した後〔抗体濃度はマウ
スＩｇＧまたはｒｇＭＲＩＤプレート（セロチック社製
）で測定した数値より計算する〕、各ウェルに５０〜１
００μＱずつ分注し、３７℃で数時間保温すればよい。

抗体の標識物質としては、β−ガラクトシダーゼ、パー
オキシダーゼ等の各種の酵素が挙げられ、標識は常法に
従って行えばよい。標識抗体は、測定感度や測定範囲、
あるいは、不溶化抗体との適合性等の点を考慮し、至適
な濃度となる様に適当な緩衝液で希釈し用いればよい。

免疫反応は、４〜３７℃で数時間〜２４時間程度で行う
。

免疫比濁法（ＴＩＡ法）に本発明抗体を応用する場合に
は、本発明抗体とアポＣ−ＩＩを適当な緩衝液中で反応
させて免疫複合体を形成させ、その際生じる濁度を測定
して行う。一般に、１つの抗原中に複数の同じ抗原決定
基を有する被験物質の場合には、抗原抗体反応による濁
度を生じ易いので１種類のモノクローナル抗体でも充分
濁度を生じさせることができるが、アポＣ−ＩＩの場合
のように、測定すべき抗原中にある特定の抗原決定基が
１つしか含まれていない場合には、その特定の抗原決定
基に対するモノクローナル抗体のみでは　゛抗原抗体反
応によ７る濁度を生じにくい。従って、この場合に適当
な濁度を得るためには、別種の抗原決定基をそれぞれ認
識する複数のモノクローナル抗体を２種以上組み合わせ
て用いる必要があるが、本発明の抗体は、１種の抗体の
みで濁度を生じさせるものや、１種の抗体では濁度を生
じさせないが異なる抗原決定基に反応する２種以上の抗
体を組み合わせた場合に濁度を生じさせるものなどがあ
り、それぞれ免疫比濁法に適したものを適宜選択すれば
よい。

免疫比濁法に用いる本発明抗体の濃度は、１種の抗体を
用いる場合は、ｌＯ〜５００μｇ／ｍ１２、好ましくは
５０〜２００μｇ／ＩＩＩＱ、２種以上の抗体を組み合
わせる場合は、１００〜５．　ＯＯＯμ９／ＩＩＱ、好
ましくは５００〜３，０００μ９／ｘ（ｌとすればよく
〔抗体濃度はマウスＩｇＧまたはＩｇＭＲＩＤプレート
（セロチック社製）で測定した数値より計算する〕、緩
衝液としては、反応促進剤を含み中性付近に緩衝能を有
する様に調製した、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣａ緩衝
液、グツド緩衝液等を用いることができる。反応促進剤
の具体例としては、ポリエチレングリコール６０００等
を挙げることができる。反応は、３７℃付近の温度で数
分〜３０分間程度行う。

これらの免疫学的測定法に用いる試料としては、ヒト血
清または血漿を挙げることができる。

上記のように、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）や免疫比濁
法（Ｔ　Ｉ　Ａ法）等に本発明抗体を用いることにより
、試料中のアポＣ−ＩＩを簡便かつ精度よ（測定するこ
とが可能になる。

つぎに実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（本発明抗体産生ハイブリドーマの作製） ■抗原の作製 ヒトカイロミクロン・ＶＬＤＬ画分の調製正常ヒト血漿
を遠心管（ベックマン社製、ウルトラクリアー、１６８
７６ｍ＋＊）に入れ、生理食塩水を重層した。これを日
立５５Ｐ−２超遠心機（日立ＲＰ４０ローター）を用い
、４０．ＯＯＯｒｐｍ。

１５℃で２４時間遠心した。上履のカイロミクロン・Ｖ
ＬＤＬ画分を回収した。

アポＣ−■溶液の調製 カイロミクロン・ＶＬＤＬ画分に１０倍量のエタノール
：エーテル（３：１）を加え、３回脱脂した。

沈殿物をｌＯ％ＳＤＳ溶液（２−メルカプトエタノール
を１％含む）（７，５ｍｅ）で溶解した。得られた溶液
を、０．２％ＳＤＳ、１ｓＭ　　ＥＤＴＡ。

０．９％塩化ナトリウムを含む１０ｓＭ）リスーＨＣｇ
緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化し５０℃に保温したセフ
ァクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラムにかけ
、同緩衝液で溶出した。３つのピーク（Ｆ１％Ｆ２およ
びＦ３）が得られ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動で調べたところ、ピークＦ３にアポＣ−■が認めら
れた。この両分を回収し、精製水（５，０００＋ａのに
対して２回透析した。この透析液を、７Ｍ５メンブラン
（アミコン社製）を用いた限外濾過法により濃縮した。

回収した総液量は４．８−であった。総蛋白濃度をロー
リ−法にて測定したところ、２．４５ｘ９７ｃｍ（１で
あった。得られたアポＣ−■溶液は小分けして、＝７５
℃で保存した。

■動物の免疫 上記工程■で得たアポＣ−■溶液を蛋白濃度が２００μ
ｇ／ｓＮとなる様に生理食塩水で希釈した。

この希釈アポＣ−■溶液とフロイント完全アジニバント
とを１：１（容量比）に混合し、抗原乳剤を作製した。

この抗原乳剤（１ｍＱ）をＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、６
週齢）の背部皮下に投与したく初回免疫）。初回免疫の
１ケ月後、上記の希釈アポＣ−■溶液（０，２５ｓＮ）
をさらに腹腔内に投与した（追加免疫）。

■細胞融合 肺細胞浮遊液の調製 追加免疫３日後のマウスより肺臓を摘出し、ＤＭＥＭ（
ギブコ社製；グルコース４　、５００３１９／１２含有
、ペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ１０
０単位／ｓｅ、１００μｇ／−となる様に添加、ウシ胎
児血清未添加：以下、「基礎培地」という）中で肺臓か
ら肺細胞を取り出した。取り出した肺細胞は基礎培地中
に浮遊させ、細胞融合に用いる時まで４℃にて保存した
。２．３６Ｘ１０＠個の肺細胞が得られた。

ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞はＦＯを用いた。１０％ウシ胎児血清、
ｌａＭピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地（以下、「
基本培地」という）で培養したＦＯを基礎培地で２回洗
浄した後、基礎培地中に浮遊させた。細胞密度は８ＸＩ
Ｏ”個／ｒｓ（ｌとした。

細胞融合 上記肺細胞浮遊液に上記ミエローマ細胞浮遊液（約７．
５ｍのを混合し、１，０００ｒｐｎ＋で５分間遠心した
後、上清を除去した。これに、３７°Ｃに保温した滅菌
５０％ポリエチレングリコール４０００溶液（ｌｎ＋の
を攪拌しながら１分間かけて滴下した。１分間混合物を
攪拌した後、基礎培地（２ｄ）を攪拌しながら２分間か
けて滴下した。さらに、基礎培地８ｍＱを攪拌しながら
２分間で滴下した。１．０００ｒｐＩｌで５分間遠心し
て上清を除去した後、１．０Ｘ１０−’Ｍヒボキサンチ
ン、４．０×１０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０
−５Ｍチミジンを含む基本培地（以下、ｒＨＡＴ培地」
という）（５０ｎ＋１２）を加え、ハイブリドーマ浮遊
液を作製した。

■ハイブリドーマの培養および本発明抗体産生ハイブリ
ドーマのスクリーニング 上記ハイブリドーマ浮遊液を、あらかじめＨＡＴ培地を
２００μσずつ分注しである５枚の培養用９６ウエルマ
イクロプレート（コースタ−社製）に１００μＱずつ加
え、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーター内で培
養した。ヒトカイロミクロン・ＶＬＤＬ感作マイクロプ
レートを用い、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）によって本
発明抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った
。

ヒトカイロミクロン・ＶＬＤＬ感作マイクロプレートの
作製 アポＣ−ＩＩの精製過程で得られたヒトカイロミクロン
・ＶＬＤＬ画分を５０μＭ炭酸緩衝液（ｐｉ−１９，６
）で適宜希釈しく５０〜２００倍）、ＥＩＡ用９６ウエ
ルマイクロプレート（コースタ−社製）にｌウェル当り
１００μＱずつ分注した後、３７°Ｃで１時間加温した
。次いで、２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，３
、ツイーン２０を領１％含む；以下、「ＰＢＳ」という
）で洗浄した後、３％ウシ血清アルブミン溶液（ＰＢＳ
で調製）（２００μＩ２）を分注し、３７℃で１時間加
温した。この様にして得たヒトカイロミクロン・ＶＬＤ
Ｌ感作マイクロプレートを使用時まで４℃で保存した。

ＥＩＡ法 ハイブリドーマが増殖しているウェルの培養上清（１０
０μＣ）をヒトカイロミクロン・ＶＬＤＬ感作マイクロ
プレートに分注し、３７℃で１時間加温した。ＰＢＳで
洗浄した後、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体のホー
スラデイツシュパーオキシｆ−ゼ標識物（バイオラッド
社製、３％ウシ血清アルブミン溶液で５００倍希釈’）
（１００μｍ２）を分注し、３７℃で１時間加温した。

ＰＢＳで洗浄し、発色溶液（０−フェニレンジアミンニ
塩酸塩２０ｏ、３０％過酸化水素水ｌＯμｇ、クエン酸
５２５ｍｇ、リン酸二ナトリウム・１２水和物１゜７９
ｇ、精製水５０ｅｉ２）（１００μのを加え、室温で約
２０分間酵素反応させた後、２Ｎ硫酸（５０μのを加え
て反応を停止させた。

■限界希釈法によるクローニング 抗体陽性ウェルのハイブリドーマを２４ウエルマイクロ
プレート（コースタ−社製）に移し、ＨＡＴ培地で３〜
５日間培養した。この培養液を攪拌して細胞浮遊液とし
、その一部をトリパンブルー染色液（ギブコ社製）で染
色し、細胞数を計測した。

次いで、細胞密度がｌＯ〜２５個／ｍ（ｌとなる様に細
胞浮遊液をＨＡＴ培地で希釈した。この細胞希釈液を、
あらかじめフィーダー細胞（マウス胸腺細胞）を１００
μＱ分注した９６ウエルマイクロプレートに２００μｇ
ずつ加え、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベーター
内で培養した。このクローニングを２回行った。

このクローニングの結果、本発明抗体を産生ずるハイブ
リドーマが４種類得られた。この４種類の本発明抗体産
生ハイブリドーマをＮＨＣ−ｎｌ、Ｎ　ＨＣ−ｎ　−４
、ＮＨＣ−１１−８およびＮＨｃ−ｎ−ｉｏと命名し、
これらのハイブリドーマが産生ずる抗体をそれぞれＭＮ
ＨＣ−１１−１，、ＭＮＨＣ−■−４、ＭＮＨＣ−１１
−８およびＭＮＨｃ−ｎ−ｔｏと命名した。

上記４種の本発明抗体産生ハイブリドーマ、ＮＨＣ−１
１−１，ＮＨＣ−ＩＩ−４、ＮＨＣ−ＩＩ−８およびＮ
ＨＣ−ｎ−１０は、それぞれ、微工研菌寄第１０６２５
号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０６２５）、第１０６２６号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０６２６）、第１０６２７号（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１０６２７）および第１０６２８号（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１０６２８）として寄託しである。

■本発明抗体産生ハイブリドーマの凍結保存クローニン
グを２回行った後の本発明抗体産生ハイブリドーマを２
４ウエルマイクロプレートに移し、１．０Ｘｌｏ−’Ｍ
ヒボキサンチン、１．６×１０−’Ｍチミジンを含む基
本培地（以下、白（Ｔ培地」という）で培養した。次い
で、約１週間かけて培地を徐々にＨＴ培地から基本培地
に変換した。

細胞を基本培地で培養した後、細胞を回収し、細胞密度
が１０’〜１０８個／ｍ（！となる様に１０％ジメチル
スルホオキサイド（ＤＭＳＯ）を含むウシ胎児血清に浮
遊さぜ、２ＩＩＩｃ容のセラムチューブ（コーニング社
製）にＩ＋１２ずつ分注した。このセラムチューブを脱
脂綿で包み、−７５℃の冷凍庫内に一夜放置して内容物
を凍結させた後、液体窒素保存容器に移して保存した。

実施例２（本発明抗体の特異性） 実施例１で得た４種の本発明抗体産生ハイブリドーマの
培養上清を用い、本発明抗体の特異性をヒトカイロミク
ロン・ＶＬＤＬ画分を抗原としたウェスタンプロット法
で確かめたところ、いずれもアポＣ−Ｈにのみ反応する
ことが確認された。

また、本発明モノクローナル抗体のクラスをマウスモノ
クローナル抗体タイピングキ・ノド（ＩＣＮ社製）で調
べたところ、ＭＮＨＣ−ｎ−１とＭＮＨＣ−ｎ−４はＩ
ｇＧ＋サブクラスに、ＭＮＨＣ−Ｉ［−８は１ｇＭクラ
スに、ＮＨＣ−Ｉｒ−１０はＩｇＧｏサブクラスに属す
ることがわかった。

実施例３（本発明抗体の精製） ■ＭＮＨＣ−ＩＩ−１、ＭＮＨＣ−１１−４およびＭＮ
ＨＣ−Ｉｒ−１０の精製 凍結保存しであるＮＨＣ−ｎ−１，ＮＨＣ−ｎ−４およ
びＮＨＣ−ＩＩ−１０を基本培地で前培養した後、ＡＳ
Ｆ培地１０３（動物細胞培養用無血清培地、味の素社製
）（１，０００ｍので約１０日間培養した。５０％飽和
となる様に培養上清に硫酸アンモニウムを加え、４℃で
一夜塩析した。７゜０００　ｒｐｍで３０分間遠心し、
その沈殿物を１５０ＩＩＭ塩化ナトリウムを含む２０Ｉ
ＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２；以下、「基本緩衝液
」という）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。この
様にして得られた粗精製抗体液と３Ｍ塩化ナトリウムを
含む１゜５Ｍグリシ７−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，ｏ；
以下、「結合用緩衝液」という）を等量混合し、結合用
緩衝液で平衡化した固定化ｒプロティンＡ（レブリゲン
（Ｒｅｐ　ｌ　１Ｇｅｎ）　Ｉｒ製）カラムにかけた。

ベツドボリュームの１５倍容量の結合用緩衝液でカラム
を洗浄した後、Ｏ，１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３゜０）
で溶出した。この溶出液を１Ｍトリス−ＨＣ１２緩衝液
（ｐＨ９，０）で直ちに中和した。基本緩衝液に対して
透析した後、ウルトラフィルターＰＯ２００（アトバン
チツク東洋社製）を用いた限外濾過法で濃縮した。

■ＭＮＨＣ−１１−８の精製 凍結保存しであるＮＨＣ−Ｕ−８を基本培地で前培養し
た後、ＡＳＦ培地１０３　（１，ＯＯＯ＋＋＋１２）で
約１０日間培養した。５０％飽和となる様に培養上清に
硫酸アンモニウムを加え、４°Ｃで一夜塩析した。７．
ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心し、その沈殿物を基本緩衝
液に溶解し、同緩衝液に対して透析した。この様にして
得られた粗精製抗体液を、基本緩衝液で平衡化したセフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア社製）カラムにかけ、同緩
衝液で溶出した。溶出液をウルトラフィルターＰＯ２０
０（アトバンチツク東洋社製）を用いた限外濾過法で濃
縮した。この濃縮液を再度、基本緩衝液で平衡化したセ
ファロース６Ｂ（ファルマシア社製）カラムにかけ、同
緩衝液で溶出した。溶出液をウルトラフィルターＰＯ２
００（アトバンチツク東洋社製）を用いた限外濾過法で
濃縮した。

■モノクローナル抗体の回収量 上記工程■および■で精製した各モノクローナル抗体の
抗体濃度を、ＭＮＨＣ−Ｉ［−１，ＭＮＨＣ−１１−４
およびＭＮＨＣ−■−１０についてはマウスＩｇＧ　　
ＲＩＤプレート（セロチック社製）で、ＭＮＨＣ−１１
−３についてはマウスＩｇＭＲＩＤプレート（七ロチツ
ク社製）で測定した。各モノクローナル抗体の回収量を
第１表に示す。

箸↓考モノクローナル抗体の回収量 実施例４（免疫比濁法（Ｔ　Ｉ　Ａ法））■試験抗体溶
液の調製 実施例３で得た各モノクローナル抗体の原液、基本緩衝
液および１０％ＰＥＧ緩衝液（ポリエチレングリコール
６０００を１０％含む基本緩衝液）を用い、抗体濃度を
ＭＮＨＣ−１１−１、ＭＮＨＣｎ−４およびＭＮＨＣ−
ＩＩ−１０の場合は１１００ａ／ｍＱ、ＭＮＨＣ−１１
−８の場合は８５μｇ／ｍＱとなる様に、そしてポリエ
チレングリコール６０００の濃度が５％となる様に試験
抗体溶液をそれぞれ調製した。また、ＭＮＨＣ−ｎ−４
とＭＮＨＣ−ｎ−１０を各１　、０００ｕ９／ｘ（ｌと
なる様に混合し、同様に調製した。

■混濁反応のタイムコース 上記工程■で７Ａ製した試験抗体溶液をキュベツトに１
．５ｍ１Ｊずつ分注し、３７℃恒温装置付きの分光光度
計（島津ＵＶ−１６０）にセットし、約１０分間ブレイ
ンキュベーションした。次いで、ヒト血清（５０μａ）
を加えて転倒混和し、波長３４０ｎｍの吸光度を３７°
Ｃで２分ごとに、３０分まで測定した。なお、ブランク
は５％ＰＥＧ緩衝液（ポリエチレングリコール６０００
を５％含む基本緩衝液）を用いて測定した。結果を第１
図に示す。

■アポＣ−■量と吸光度との関係 上記工程■で調製したＭＮＨＣ−Ｉ［−８の試験抗体溶
液を用い、アポｃ−ｎｍと吸光度との関係を調べた。ヒ
ト血清〔−元免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）を原理とするア
ポＣ−■プレート「第一」（第一化学薬品社製）で測定
したアポＣ−■濃度が２．８ｙｔ９／ｄ（１）もの〕を
試験管ｉ：１２．５．２５．５ｏ、１００および１５０
μａずつサンプリングし、これに試験抗体溶液を１．５
ｄずつ加え、３７℃で２５分間反応させた後、波長３４
０ｒ＋ｍにおける吸光度を測定した。なお、ブランクは
５％ＰＥＧ１１衝液を用いて測定した。結果を第２図に
示す。第２図に示された結果から明らかなように、吸光
度は血清量、従ってアポｃ−■ｍに正比例する。

■ヒト血清中のアポＣ−Ｈの測定 上記工程■で調製したＭＮＨＣ−１１−８の試験抗体溶
液を用い、ヒト血清中のアポＣ−ＩＩを測定した。ヒト
血清および標準液（ＳＲＩＤ法でアポＣ−ＩＮ農度が３
．６５肩９／ｄｄのヒトプール血清）をそれぞれ試験管
に５０μＱずつサンプリングし、これに試験抗体溶液を
１．５−ずつ加え、３７°Ｃで２５分間反応させ、波長
３４０ｎｒＱにおける吸光度を測定した。ブランクは５
％ＰＥＧ緩衝液を用いて測定した。本法の測定結果を５
ＲＩＤ法の結果とあわせて第２表に示す。第２表の結果
から、両方法による測定値はほぼ同等であることがわか
る。

なお、５ＲＩＤ法による測定には４８時間を要したのに
対し、本法では測定に要した時間はわずかに２５分であ
った。

晟ス嚢　アポｃ−ｎ測定値 実施例５（酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））■酵素標識抗
体の作製 実施例３の工程■で得たＭＮＨＣ−１１−１およびβ−
ガラクトシダーゼ（ＥＩＡ用、ベーリンガー・マンハイ
ム社製）を用い、酵素標識抗体を作製した。実施例３の
工程■で得たＭＮＨＣ−ＩＩ−１の原液（１，３２ｍの
、基本緩衝液（１，１８ｍの、Ｎ−（ε−マレイミドカ
プロイルオキシ）サクシンイミド溶液（２，２４ｘ９／
ｍ（ｌとなる様にＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解
したもの）（１２５μのを混合し、３０℃で３０分間加
温した。これを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア
社製）カラムにかけ、同緩衝液で溶出した。回収した抗
体画分に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で５
叩／ｌｌＩ２となる様に作製したβ−ガラクトシダーゼ
溶液（２ｍの、１．３７％のＮ−エチルマレイミド処理
ウシ血清アルブミン溶液（４２μのおよび１００ｍＭ塩
化マグネシウム（８４μＱ）を加え、３０°Ｃで２時間
加温した。次いで、この反応液に１００＋ｎＭ　　２−
メルカプトエチルアミン塩酸塩（６４０μのを加え、３
０°Ｃで２０分間加温した。これを、０，１％ウシ血清
アルブミン、０．０２％塩化マグネシウム・６水和物、
ｌ１００ＩＩＩ塩化ナトリウムを含む１０ｎ＋Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６゜６）で平衡化したセファロース６Ｂ（
ファルマシア社製）カラムにかけ、同緩衝液で溶出した
。酵素標識抗体画分を回収した。

■抗体感作マイクロプレートの作製 実施例３の工程■で得たＭＮＨＣ−ｎ−４と実施例３の
工程■で得たＭＮＨＣ−１１−８を、５０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐ１４９　、６　）で抗体濃度が２５μｇ／１ｒｒ
（ｌとなる様にそれぞれ希釈し、これをＥＩＡ用９６ウ
エルマイクロプレート（コースタ−社製）に１ウエルあ
たり１００μａずつ分注し、３７°Ｃで２時間加温した
。次いで、ＰＢＳで洗浄した後、３％ウシ血清アルブミ
ン溶液（５０ｆｆｉＭ炭酸緩衝液で調製）（２００μｇ
）を分注し、３７℃で１時間加温した。この様にして得
た抗体感作マイクロプレートを使用時まで４℃で保存し
た。

■酵素免疫測定法（ＥＩＡ法） 上記工程■で得た抗体感作マイクロプレートに、ヒト血
清（ＳＲＩＤ法でアポＣ−■濃度が２．９５ｍ９／ｄ（
ｌのもの）を１％ウシ血清アルブミン溶液（基本緩衝液
で調製）で１００．２００および４００倍に希釈したも
のを５０μａずつ分注しくブランクは１％ウシ血清アル
ブミン溶液を用いた）、３７℃で１時間加温した。次い
で、これをＰＢＳで洗浄した後、上記工程■で得た酵素
標識抗体を１％ウシ血清アルブミン溶液で１００倍希釈
したちのを各ウェルに５０μｇずつ分注し、３７℃で１
時間加温した。次いで、これをＰＢＳで洗浄した後、基
質溶液（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド３．０１ｇ、　リン酸−ナトリウム・２水相物４．
６ｇ、リン酸二ナトリウム・１２水和物７゜３６ｇ、塩
化ナトリウム４．３８ｇ、塩化マグネシウム・６水和物
０．４ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇ、ウシ血清アルブ
ミン０．５ｇ、エチレングリコール６０ｇ、全量を精製
水で１．０００１とする）を５０μｅずつ加え、３７℃
で２５分間加温した。次いで、１％炭酸ナトリウム溶液
を１００μｇずつ加え、酵素反応を停止させた後、波長
４１４ｒｕ＋＋における吸光度を測定した。結果を第３
図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明抗体を用いて血清アポＣ−■と免疫混濁
反応させた時のタイムコースを示すグラフ、第２図はＭ
ＮＨＣ−Ｕ−８を用いた免疫比濁法でのアポＣ−１１ｆ
ｆｉと吸光度の関係を示すグラフ、第３図は酵素免疫測
定法でのアポＣ−ＩＩ　ｆｆｉと吸光度の関係を示すグ
ラフである。 １２．５　２５ 第２図 ５０噛００１５０

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトアポリポ蛋白Ｃ−IIを特異的に認識するモノ
   クローナル抗体。
2. （２）試料中のヒトアポリポ蛋白Ｃ−IIを測定する方法
   において、請求項１記載のモノクローナル抗体の１種ま
   たは２種以上を用いることを特徴とするヒトアポリポ蛋
   白Ｃ−IIの測定法。