JPH0264458A - 血清アポbの定量法 - Google Patents
血清アポbの定量法Info
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、血清アポBの定量法、さらに詳しくは、認識
する抗原決定基が異なる血清アポBに対するモノクロー
ナル抗体を2種類以上用いてヒト血清と抗原抗体反応さ
せ、そして生じる濁度を分光学的に測定することを特徴
とする血清アポBの定量法に関する。
する抗原決定基が異なる血清アポBに対するモノクロー
ナル抗体を2種類以上用いてヒト血清と抗原抗体反応さ
せ、そして生じる濁度を分光学的に測定することを特徴
とする血清アポBの定量法に関する。
従来技術
血中のアポBは、脂質の代謝・運搬に重要な役割を持つ
リポタンパクであるカイロミクロン、超低比重リポタン
パク(VLDL)、低比重リポタンパク(L D L)
を構成する主要タンパクであり、近年、高脂血症との関
係、特に動脈硬化症の促進因子として注目されているア
ポリポタンパクである。
リポタンパクであるカイロミクロン、超低比重リポタン
パク(VLDL)、低比重リポタンパク(L D L)
を構成する主要タンパクであり、近年、高脂血症との関
係、特に動脈硬化症の促進因子として注目されているア
ポリポタンパクである。
従って、血中アポBの測定は高脂血症の診断や治療の指
標として重要なものとなっている。
標として重要なものとなっている。
血中のアポBを測定する方法としては、ウサギや山羊な
どの動物の抗アポBポリクローナル抗体を用いたラジオ
イムノアッセイ(RI A)、エンザイムイムノアノセ
イ(EIA)、−元免疫拡散法(SRID)、エレクト
ロイムノアッセイ、免疫比濁法(T lΔ)などが知ら
れており、5RIDのプレート試薬や自動分析装置で測
定できるTIA試薬が既に市販されている。しかし、こ
れらの試薬は動物で免疫して得たポリクローナル抗体を
用いているため、免疫動物の個体差から生じる力価や特
異性等の差により、一定した測定値を得ることが困難で
ある。
どの動物の抗アポBポリクローナル抗体を用いたラジオ
イムノアッセイ(RI A)、エンザイムイムノアノセ
イ(EIA)、−元免疫拡散法(SRID)、エレクト
ロイムノアッセイ、免疫比濁法(T lΔ)などが知ら
れており、5RIDのプレート試薬や自動分析装置で測
定できるTIA試薬が既に市販されている。しかし、こ
れらの試薬は動物で免疫して得たポリクローナル抗体を
用いているため、免疫動物の個体差から生じる力価や特
異性等の差により、一定した測定値を得ることが困難で
ある。
また、その測定においては、血清のアポB含量が高いた
め、適度な感度で測定するためには血清の希釈を必要と
し、5RIDやTIAでは数倍から50倍、EIAやR
[Aでは100倍から10゜000倍に希釈した試料を
用いなければならず、それが操作の煩雑さやバラツキの
原因ともなっている。
め、適度な感度で測定するためには血清の希釈を必要と
し、5RIDやTIAでは数倍から50倍、EIAやR
[Aでは100倍から10゜000倍に希釈した試料を
用いなければならず、それが操作の煩雑さやバラツキの
原因ともなっている。
近年、ポリクローナル抗体のもつ欠点を改良すべく、特
異性が高く、かつ一定した測定値が得られるモノクロー
ナル抗体の開発が進められており、血清のrgG、Ig
A、rgM [特開昭60−237363;JapJ、
Cl1n、Chem、、 vol、14. 185
−191(1985)コやC反応性タンパク(CRP)
(特開昭82−192661)の測定においては、モノ
クローナル抗体を用いたTIA法が応用されている。こ
れらの被験物質の場合は、1つの抗原中に複数の同じ抗
原決定基を持つことから抗原抗体反応による濁度が生じ
易く、1種類のモノクローナル抗体でも濁度を生じ、モ
ノクローナル抗体の種類を調節することで適度な感度を
得ることができる。しかし、一般には、測定すべき抗原
には、ある特定の抗原決定基についてはそれが1つしか
存在していない場合が多く、その特定の抗原決定基に対
するモノクローナル抗体のみでは抗原抗体反応による濁
度は生じにくい。
異性が高く、かつ一定した測定値が得られるモノクロー
ナル抗体の開発が進められており、血清のrgG、Ig
A、rgM [特開昭60−237363;JapJ、
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−191(1985)コやC反応性タンパク(CRP)
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クローナル抗体を用いたTIA法が応用されている。こ
れらの被験物質の場合は、1つの抗原中に複数の同じ抗
原決定基を持つことから抗原抗体反応による濁度が生じ
易く、1種類のモノクローナル抗体でも濁度を生じ、モ
ノクローナル抗体の種類を調節することで適度な感度を
得ることができる。しかし、一般には、測定すべき抗原
には、ある特定の抗原決定基についてはそれが1つしか
存在していない場合が多く、その特定の抗原決定基に対
するモノクローナル抗体のみでは抗原抗体反応による濁
度は生じにくい。
従って、適度な濁度を得るためには、別種の抗原決定基
をそれぞれ認識する複数のモノクローナル抗体を組合わ
せて用いる必要があるが、TlA法に適したモノクロー
ナル抗体を作製選択するのは困難であった。
をそれぞれ認識する複数のモノクローナル抗体を組合わ
せて用いる必要があるが、TlA法に適したモノクロー
ナル抗体を作製選択するのは困難であった。
アポBにおいても、モノクローナル抗体の開発が行われ
、いくつか報告されている[特開昭60193928、
特開昭60−193927、C11nical Che
mistryVOl、321484−1490(198
6)]。しかし、その測定法は、煩雑な血清希釈を必要
とするEIAあるいはRIA、または通常測定に48時
間を要する5RIDによるものであり、日常検査法とし
ては問題があった。
、いくつか報告されている[特開昭60193928、
特開昭60−193927、C11nical Che
mistryVOl、321484−1490(198
6)]。しかし、その測定法は、煩雑な血清希釈を必要
とするEIAあるいはRIA、または通常測定に48時
間を要する5RIDによるものであり、日常検査法とし
ては問題があった。
発明の目的
このような状況下、本発明者等は、血清の希釈か不要で
、かつ短時間に精度良(、しかも常に一定した測定値が
得られる血清アポBの測定法の開発を試み、本発明を完
成するに至った。
、かつ短時間に精度良(、しかも常に一定した測定値が
得られる血清アポBの測定法の開発を試み、本発明を完
成するに至った。
即ち、本発明は、血清の希釈を必要としない免疫比濁法
による血清アポBの定量法であって、認識する抗原決定
基が異なる2種類以上の抗ヒトアポBモノクローナル抗
体を用いて血清と抗原抗体反応をさせ、生ずる抗原抗体
複合物による濁度を分光学的に測定することを特徴とす
る血清アポBの定量法を提供するものである。
による血清アポBの定量法であって、認識する抗原決定
基が異なる2種類以上の抗ヒトアポBモノクローナル抗
体を用いて血清と抗原抗体反応をさせ、生ずる抗原抗体
複合物による濁度を分光学的に測定することを特徴とす
る血清アポBの定量法を提供するものである。
発明の構成および効果
本発明方法においては、認識する抗原決定基が異なる2
種類以上の抗ヒトアポBモノクローナル抗体を用いる。
種類以上の抗ヒトアポBモノクローナル抗体を用いる。
このモノクローナル抗体は、以下のようにして製造する
ことができるi i)ヒト血清または血漿から分離したLDLを抗原とし
て動物を免疫し、 ii)該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞と
を融合させ、アポBに特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、 山)該ハイブリドーマを適当な条件下で培養し、該モノ
クローナル抗体を回収する。
ことができるi i)ヒト血清または血漿から分離したLDLを抗原とし
て動物を免疫し、 ii)該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞と
を融合させ、アポBに特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、 山)該ハイブリドーマを適当な条件下で培養し、該モノ
クローナル抗体を回収する。
工程i)の動物の免疫は、ヒト血清または血漿から超遠
心でLDLを分画し、生理食塩水に対して透析した後、
得られたLDL溶液を抗原として動物に没与し、一定期
間経過後さらに同一の抗原で動物を処理することによっ
て行うことができる。
心でLDLを分画し、生理食塩水に対して透析した後、
得られたLDL溶液を抗原として動物に没与し、一定期
間経過後さらに同一の抗原で動物を処理することによっ
て行うことができる。
通常、このLDL溶液はフロイントコンプリートアジュ
バントと混合して動物に投与する。
バントと混合して動物に投与する。
免疫する動物種としては、マウス、ラット等の動物が用
いられ得るが、中でもB A L B / cマウスか
特に好ましい。
いられ得るが、中でもB A L B / cマウスか
特に好ましい。
工程II)の細胞融合は、工程l)で免疫された動物の
抗体産生細胞と動物のミニローマ細胞とを用い、常法に
よって行うことができる。
抗体産生細胞と動物のミニローマ細胞とを用い、常法に
よって行うことができる。
抗体産生細胞としては、上記B A L B / cマ
ウスの肺細胞が最も好ましいが、これ以外に、例えば、
マウスのリンパ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ
球も使用することができる。
ウスの肺細胞が最も好ましいが、これ以外に、例えば、
マウスのリンパ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ
球も使用することができる。
ミエローマ細胞としては、マウスのミエローマ細胞FO
が好ましいが、その他の細胞も用いることができる。
が好ましいが、その他の細胞も用いることができる。
細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、HV
J法、電気融合法などを挙げることがてきる。
J法、電気融合法などを挙げることがてきる。
また、得られたハイブリドーマの選択は、例えば、以下
のようにして行うことができる。即ち、ハイブリドーマ
を適当な培地で培養し、・その培養液を、あらかじめ調
製しておいたヒトLDL感作マイクロプレートに加えて
反応させ、次いで抗マウスIgGヤギ抗体ホースラデイ
ツシュパーオキシダーゼ標識物と反応させ、そして発色
液を加えることによって目的の抗体を産生じているハイ
ブリドーマを選択すればよい。次いで、選択したハイブ
リドーマを限界希釈法によってクローニングする。
のようにして行うことができる。即ち、ハイブリドーマ
を適当な培地で培養し、・その培養液を、あらかじめ調
製しておいたヒトLDL感作マイクロプレートに加えて
反応させ、次いで抗マウスIgGヤギ抗体ホースラデイ
ツシュパーオキシダーゼ標識物と反応させ、そして発色
液を加えることによって目的の抗体を産生じているハイ
ブリドーマを選択すればよい。次いで、選択したハイブ
リドーマを限界希釈法によってクローニングする。
工程出)のモノクローナル抗体の回収は、例えば、工程
ii)で得られたハイブリドーマクローンを適当な動物
細胞培養用培地で培養し、その培養液から常法通り回収
することができる。また、回収した抗体を、硫酸アンモ
ニウム塩析、イオン交換クロマトグラフィー アフィニ
ティクロマトグラフィー等で精製してもよい。
ii)で得られたハイブリドーマクローンを適当な動物
細胞培養用培地で培養し、その培養液から常法通り回収
することができる。また、回収した抗体を、硫酸アンモ
ニウム塩析、イオン交換クロマトグラフィー アフィニ
ティクロマトグラフィー等で精製してもよい。
上記のように操作することによって、後記製造例におい
ては、8種類の抗アポBモノクローナル抗体、MNHB
−4,7,8,11,13,15,17および20か得
られた。この内、MNHBllとMN)IB−13の2
種抗体の組合せを除く他のすべての2種抗体の組合せ、
および3種以上の抗体の組合せで試験抗体液を調製する
と、ヒト血清アポBとの反応で混濁を生じた。従って、
このMNHB−11とMNHB−13は同じ抗原決定基
を認識するものと考えられるが、この2種抗体とその他
の抗体、およびその他の抗体どうしは互いに異なった抗
原決定基を認識しうるものと考えられる。本発明方法で
は、MNHB−11とMNHB−13の2種抗体の組合
せを除くその他の2種抗体の組合せ、および3種以上の
抗体の組合せを用いる。MNHB−7またはMNHB−
15と池の抗体を組合わせて用いるのが好ましい。さら
に好ましくは、MNHB〜7、MNHB−8、MNHB
−11およびMNHB−15の4種抗体を組合せて用い
る。
ては、8種類の抗アポBモノクローナル抗体、MNHB
−4,7,8,11,13,15,17および20か得
られた。この内、MNHBllとMN)IB−13の2
種抗体の組合せを除く他のすべての2種抗体の組合せ、
および3種以上の抗体の組合せで試験抗体液を調製する
と、ヒト血清アポBとの反応で混濁を生じた。従って、
このMNHB−11とMNHB−13は同じ抗原決定基
を認識するものと考えられるが、この2種抗体とその他
の抗体、およびその他の抗体どうしは互いに異なった抗
原決定基を認識しうるものと考えられる。本発明方法で
は、MNHB−11とMNHB−13の2種抗体の組合
せを除くその他の2種抗体の組合せ、および3種以上の
抗体の組合せを用いる。MNHB−7またはMNHB−
15と池の抗体を組合わせて用いるのが好ましい。さら
に好ましくは、MNHB〜7、MNHB−8、MNHB
−11およびMNHB−15の4種抗体を組合せて用い
る。
本発明方法は、通常の免疫比濁法に従って実施すればよ
く、例えば、次のようにして実施することができる。抗
アポBモノクローナル抗体2〜4種を適当な緩衝液で希
釈して試験抗体液を調製しく総抗体量は血清1μQに対
して0.4〜160μ9、好ましくは1.6〜40μ9
を用い、また各抗体の比は、2種抗体を用いるときは1
〜3:1〜3.3種抗体を用いるときは1〜6:1〜6
;1〜6.4種抗体を用いるときは1〜9:l〜9.1
〜9:1〜9、好ましくは各抗体を等量ずつ用いる)、
この試験抗体液とヒト血清とを反応させることによって
生じる濁度を分光光度計で測定し、あらかじめ作成して
おいた検量線から血清アポB濃度を得ることができる。
く、例えば、次のようにして実施することができる。抗
アポBモノクローナル抗体2〜4種を適当な緩衝液で希
釈して試験抗体液を調製しく総抗体量は血清1μQに対
して0.4〜160μ9、好ましくは1.6〜40μ9
を用い、また各抗体の比は、2種抗体を用いるときは1
〜3:1〜3.3種抗体を用いるときは1〜6:1〜6
;1〜6.4種抗体を用いるときは1〜9:l〜9.1
〜9:1〜9、好ましくは各抗体を等量ずつ用いる)、
この試験抗体液とヒト血清とを反応させることによって
生じる濁度を分光光度計で測定し、あらかじめ作成して
おいた検量線から血清アポB濃度を得ることができる。
本発明方法は、後記実施例に示すように、血清の希釈が
不要であり、そして極めて短時間に測定することが可能
なアポBの定量法である。例えば、4種のモノクローナ
ル抗体を組合せて用いたときには、抗原抗体反応は約9
分でプラトーに達する。
不要であり、そして極めて短時間に測定することが可能
なアポBの定量法である。例えば、4種のモノクローナ
ル抗体を組合せて用いたときには、抗原抗体反応は約9
分でプラトーに達する。
さらに、本方法によれば、少なくとも約230xy/d
(までの血清アポBを精度よ(測定することができる。
(までの血清アポBを精度よ(測定することができる。
以下に製造例および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、これらは本発明を限定するものではない
。
く説明するが、これらは本発明を限定するものではない
。
’A iM Fl抗ヒトアポBモノクローナル抗体の調
製 ■動物の免疫 ヒトLDLの調製 健常人の血漿に臭化カリウムを加えてその比重を1.0
06とし、これを遠心管(ベックマン社製、ウルトラク
リアー、16x76ax)に入れ、比重1.006の臭
化カリウム溶液を重層した。これを、日立55P−2超
遠心機(日立RP4Qローター)を用い、40.OOO
rpm、15°Cで24時間遠心した。上層のカイロミ
クロン、VLDLLDL画分除いた後、下層部分を集め
、臭化カリウムを加えて比重を1.063とした。これ
に比重1゜063の臭化カリウム溶液を重層した後、4
0゜000rpm、15°Cで24時間遠心し、上層の
LDL画分を回収した。このLDL画分を3.00Ox
Qの生理食塩水に対して3回透析してLDL溶液を得た
。
製 ■動物の免疫 ヒトLDLの調製 健常人の血漿に臭化カリウムを加えてその比重を1.0
06とし、これを遠心管(ベックマン社製、ウルトラク
リアー、16x76ax)に入れ、比重1.006の臭
化カリウム溶液を重層した。これを、日立55P−2超
遠心機(日立RP4Qローター)を用い、40.OOO
rpm、15°Cで24時間遠心した。上層のカイロミ
クロン、VLDLLDL画分除いた後、下層部分を集め
、臭化カリウムを加えて比重を1.063とした。これ
に比重1゜063の臭化カリウム溶液を重層した後、4
0゜000rpm、15°Cで24時間遠心し、上層の
LDL画分を回収した。このLDL画分を3.00Ox
Qの生理食塩水に対して3回透析してLDL溶液を得た
。
免疫
アポB100μ9に相当するLDL溶液とフロイントフ
ンプリートアジコバントとをに1(液量比)に混合し、
抗原乳剤を調製した。この抗原乳剤IxQをB A L
B / cマウス(雄、6週齢)の背部皮下に投与し
た(初回免疫)。初回免疫の1ケ月後に上記のLDL溶
液0.2511Qをさらに腹腔内投与した(追加免疫)
。
ンプリートアジコバントとをに1(液量比)に混合し、
抗原乳剤を調製した。この抗原乳剤IxQをB A L
B / cマウス(雄、6週齢)の背部皮下に投与し
た(初回免疫)。初回免疫の1ケ月後に上記のLDL溶
液0.2511Qをさらに腹腔内投与した(追加免疫)
。
■細胞融合
肺細胞浮遊液の調製
追加免疫の3日後に肺臓を摘出し、ダルベツコ改変イー
グル培地(ギブコ社製;グルコース4,500mv/ρ
、ベニシリア100単位/la、ストレプトマイシン1
00μg/ x(l含有、ウシ胎児血清未添加;以下、
「基礎培地」という)中で肺臓から牌細胞を取り出した
。取り出した牌細胞は基礎培地に浮遊させ、細胞融合に
用いる時まで4℃で保存した。2.11xlO’個の牌
細胞が得られた。
グル培地(ギブコ社製;グルコース4,500mv/ρ
、ベニシリア100単位/la、ストレプトマイシン1
00μg/ x(l含有、ウシ胎児血清未添加;以下、
「基礎培地」という)中で肺臓から牌細胞を取り出した
。取り出した牌細胞は基礎培地に浮遊させ、細胞融合に
用いる時まで4℃で保存した。2.11xlO’個の牌
細胞が得られた。
ミエローマ細胞浮遊液の調製
ミエローマ細胞はFOを用いた。10%0%ラン血清、
1mMピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地(以下、「
基本培地」という)で培養したFOを基礎培地で2回洗
浄した後、基礎培地に浮遊させた。細胞密度は8xlO
8個/Maとした。
1mMピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地(以下、「
基本培地」という)で培養したFOを基礎培地で2回洗
浄した後、基礎培地に浮遊させた。細胞密度は8xlO
8個/Maとした。
顛
上記肺細胞浮遊液に6.6mQの上記ミエローマ細胞浮
遊液を混合し、1.OOOrpmで5分間遠心した後、
上清を除去した。これに、37°Cに保温した滅菌50
%ポリエチレングリコール4000溶i(N l xQ
を撹拌しなから1分間で滴下した。1分間撹拌した後、
基礎培地2屑ρを撹拌しながら2分間で滴下した。さら
に、基礎培地8ttt(lを撹拌しながら2分間で滴下
した。次に、1.OOOrpmで5分間遠心して上清を
除去した後、1.0xlO−’Mヒボキサンチン、4.
0xlO−’Mアミ/プテリン、1.6xlO−’Mチ
ミンンを含む基本培地(以下、rHAT培地」という)
50.vcを加え、融合細胞浮遊液を調製した。
遊液を混合し、1.OOOrpmで5分間遠心した後、
上清を除去した。これに、37°Cに保温した滅菌50
%ポリエチレングリコール4000溶i(N l xQ
を撹拌しなから1分間で滴下した。1分間撹拌した後、
基礎培地2屑ρを撹拌しながら2分間で滴下した。さら
に、基礎培地8ttt(lを撹拌しながら2分間で滴下
した。次に、1.OOOrpmで5分間遠心して上清を
除去した後、1.0xlO−’Mヒボキサンチン、4.
0xlO−’Mアミ/プテリン、1.6xlO−’Mチ
ミンンを含む基本培地(以下、rHAT培地」という)
50.vcを加え、融合細胞浮遊液を調製した。
■融合細胞の培養および抗体産生細胞のスクリニング
上記融合細胞浮遊液を5枚の培養用96ウエルマイクロ
プレート(コースタ−社製)に蒔キ、370015%二
酸化炭素のインキュベーター内で培養した。
プレート(コースタ−社製)に蒔キ、370015%二
酸化炭素のインキュベーター内で培養した。
ヒトLDL感作マイクロプレートを用い、EIA法によ
って抗体産生細胞のスクリーニングを行った。
って抗体産生細胞のスクリーニングを行った。
ヒトLDL感作マイクロプレートの作製ヒトLDLを5
0mM炭酸緩衝液(pH9,6)で適宜希釈しく50〜
200倍)、EIA用96ウエルマイクロプレート(コ
ースタ−社製)に1ウエルあたり100uQずつ分注し
、1時間、37°Cで加温した。次いで、25mM!J
ン酸緩衝生理食塩水液(pH7,3;ツイーン20を0
1%含む;以下、「リン酸緩衝液」という)で洗浄した
後、3%ウシ血清アルブミン溶液(リン酸緩衝液で調製
)200μQを分注し、1時間、37°Cで加温した。
0mM炭酸緩衝液(pH9,6)で適宜希釈しく50〜
200倍)、EIA用96ウエルマイクロプレート(コ
ースタ−社製)に1ウエルあたり100uQずつ分注し
、1時間、37°Cで加温した。次いで、25mM!J
ン酸緩衝生理食塩水液(pH7,3;ツイーン20を0
1%含む;以下、「リン酸緩衝液」という)で洗浄した
後、3%ウシ血清アルブミン溶液(リン酸緩衝液で調製
)200μQを分注し、1時間、37°Cで加温した。
このようにして得たヒトLDL感作マイクロプレートを
使用時まで4°Cで保存した。
使用時まで4°Cで保存した。
EIA法
細胞が増殖しているウェルの培養上清100μぐをヒト
LDL感作マイクロプレートに分注し、1時間、37°
Cで加温した。リン酸緩衝液で洗浄した後、抗マウスr
gG(H+L)ヤギ抗体ホースラディノンユバーオ亭シ
ダーゼ漂識物(バイオラッド社製;3%ウシ血清アルブ
ミン溶液で500倍希釈)100μQを分注し、1時間
、37°Cで加温した。リン酸緩衝液で洗浄し、発色液
(0−フェニレンジアミン20巧、過酸化水素10μQ
、クエン酸525η、リン酸二ナトリウム・12水和物
1.79g、精製水50d) 100μ(lを加え、室
温で約20分間酵素反応させた後、2N硫酸50μ夕を
加えて反応を停止させた。
LDL感作マイクロプレートに分注し、1時間、37°
Cで加温した。リン酸緩衝液で洗浄した後、抗マウスr
gG(H+L)ヤギ抗体ホースラディノンユバーオ亭シ
ダーゼ漂識物(バイオラッド社製;3%ウシ血清アルブ
ミン溶液で500倍希釈)100μQを分注し、1時間
、37°Cで加温した。リン酸緩衝液で洗浄し、発色液
(0−フェニレンジアミン20巧、過酸化水素10μQ
、クエン酸525η、リン酸二ナトリウム・12水和物
1.79g、精製水50d) 100μ(lを加え、室
温で約20分間酵素反応させた後、2N硫酸50μ夕を
加えて反応を停止させた。
■抗体産生細胞のクローニングおよび抗体の特異性
限界希釈法によるクローニング
抗体陽性ウェルの細胞(ハイブリドーマ)を24ウエル
マイクロプレート(コースタ−社製)に移シ、HAT培
地で3〜5日間培養した。この培養液を撹拌して細胞浮
遊液とし、その一部をトリパンフルー染色液(ギブコ社
製)で染色し、細胞数を計測した。次いで、細胞密度が
10〜25個/酎となる耐うに細胞浮遊液をHAT培地
で希釈した。この細胞希釈液を、あらかじめフィーダー
細胞(マウス胸腺細胞)100μQを分注した96ウエ
ルマイクロプレートに200μρずつ蒔き、37°C1
5%二酸化炭素のインキュベーター内で培養した。
マイクロプレート(コースタ−社製)に移シ、HAT培
地で3〜5日間培養した。この培養液を撹拌して細胞浮
遊液とし、その一部をトリパンフルー染色液(ギブコ社
製)で染色し、細胞数を計測した。次いで、細胞密度が
10〜25個/酎となる耐うに細胞浮遊液をHAT培地
で希釈した。この細胞希釈液を、あらかじめフィーダー
細胞(マウス胸腺細胞)100μQを分注した96ウエ
ルマイクロプレートに200μρずつ蒔き、37°C1
5%二酸化炭素のインキュベーター内で培養した。
このクローニングを2回行った。
このクローニングの結果、抗ヒトアポBモノクローナル
抗体を産生ずるハイプリドーマ株が8種類得られた。こ
の8種類の抗体産生ハイプリドーマ株を、NHB−4、
NHB−7、NHB−8、NHB−11、NHB−13
、NHB−15、NHB17およびNHB−20と命名
し、これらの株が産生ずる抗体をそれぞれ、MNHB−
4、M N HB−7、MNHB−8、MHI(B−1
1、MNI(B13、MNHB−15、MNHB−17
およびMNHB−20と命名した。
抗体を産生ずるハイプリドーマ株が8種類得られた。こ
の8種類の抗体産生ハイプリドーマ株を、NHB−4、
NHB−7、NHB−8、NHB−11、NHB−13
、NHB−15、NHB17およびNHB−20と命名
し、これらの株が産生ずる抗体をそれぞれ、MNHB−
4、M N HB−7、MNHB−8、MHI(B−1
1、MNI(B13、MNHB−15、MNHB−17
およびMNHB−20と命名した。
上記8種の抗体産生ハイプリドーマ株の内の4種、NH
B−7、NHB−8、NHB−11およびN [(B
−15は、それぞれ微工研菌寄第10242号(FER
M P−10242)、第10243号(FERM P
−10243)、第10244号(FERM P−10
244)および第10245号(FERM P−102
45)として寄託されている。
B−7、NHB−8、NHB−11およびN [(B
−15は、それぞれ微工研菌寄第10242号(FER
M P−10242)、第10243号(FERM P
−10243)、第10244号(FERM P−10
244)および第10245号(FERM P−102
45)として寄託されている。
抗体の特異性
抗体の特異性をウェスタンブロッティングで確かめたと
ころアポBにのみ反応した。8種のハイプリドーマ株が
産生ずる抗体のクラスをマウスモノクローナル抗体タイ
ピングキット(+CN社ラフ)で調べたところ、MNH
B−8はl gG tb、池の7種抗体はいずれも1g
G、クラスに属することがわかった。
ころアポBにのみ反応した。8種のハイプリドーマ株が
産生ずる抗体のクラスをマウスモノクローナル抗体タイ
ピングキット(+CN社ラフ)で調べたところ、MNH
B−8はl gG tb、池の7種抗体はいずれも1g
G、クラスに属することがわかった。
抗体産生細胞の凍結保存
クローニングを2回行った後の抗体陽性ウェルの細胞を
24ウエルマイクロフツートに移し、1.0xlO−’
Mヒポキサンチア、1.6X10−5Mチミジンを含む
基本培地(以下、rHT培地」という)で培養した。次
いで、約1週間かけて培地を除々に)(T培地から基本
培地に変換した。細胞を基本培地で培養した後、細胞を
回収し、細胞密度か105〜106個/U&となるよう
に10%ジメチルスルホキシドを含むラン胎児血清に浮
遊させ、2ffCのセラムチューブ(コーニング社製)
に1mQずつ分注した。このセラムチューブを脱脂綿で
包み、−75°Cの冷凍庫内に一夜放置して内容物を凍
結させた後、液体窒素保管容器に移して保存した。
24ウエルマイクロフツートに移し、1.0xlO−’
Mヒポキサンチア、1.6X10−5Mチミジンを含む
基本培地(以下、rHT培地」という)で培養した。次
いで、約1週間かけて培地を除々に)(T培地から基本
培地に変換した。細胞を基本培地で培養した後、細胞を
回収し、細胞密度か105〜106個/U&となるよう
に10%ジメチルスルホキシドを含むラン胎児血清に浮
遊させ、2ffCのセラムチューブ(コーニング社製)
に1mQずつ分注した。このセラムチューブを脱脂綿で
包み、−75°Cの冷凍庫内に一夜放置して内容物を凍
結させた後、液体窒素保管容器に移して保存した。
■抗アポBモノクローナル抗体の精製
凍結保存の抗体産生細胞株を基本培地で前培養した後、
ASF培地103(動物細胞培養用無血清培地;味の素
社製)150+Cで約1週間培養した。50%飽和とな
るように培養上清に硫酸アンモニウムを加え、4°Cで
一夜塩折した。7,00Q rpmで30分間遠心し、
その沈澱物を20 mM ’)ン酸緩衝生理食塩水液(
pH7、’2 )に溶解し、同緩衝液に対して透析した
。このようにして得られた粗精製抗体液と、3MNaC
Qを含む1.5Mグリ/7−N ao l(暖?Ji液
(pH9、O;以下、「結合用緩衝液」という)を等量
混合し、結合用緩衝液で平衡化した固定化「プロティン
A (RepliGerlf製)カラムにかけた。ヘッ
ドボリュームの15倍容量の結合用緩衝液てカラムを洗
浄した後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH3,0)で溶
出した。この溶出液をl M トリス州c(!緩衝液(
pH9,0)で直ちに中和した。限外濾過で濃縮した後
、20mMリン酸緩i+1生理食塩水液(pt47.2
)に対して透析した。Ig(JJ度をマウスIgGRI
Dフッート(セロチック社製)で測定した。各モノクロ
ーナル抗体の回収量を第1表に示す。
ASF培地103(動物細胞培養用無血清培地;味の素
社製)150+Cで約1週間培養した。50%飽和とな
るように培養上清に硫酸アンモニウムを加え、4°Cで
一夜塩折した。7,00Q rpmで30分間遠心し、
その沈澱物を20 mM ’)ン酸緩衝生理食塩水液(
pH7、’2 )に溶解し、同緩衝液に対して透析した
。このようにして得られた粗精製抗体液と、3MNaC
Qを含む1.5Mグリ/7−N ao l(暖?Ji液
(pH9、O;以下、「結合用緩衝液」という)を等量
混合し、結合用緩衝液で平衡化した固定化「プロティン
A (RepliGerlf製)カラムにかけた。ヘッ
ドボリュームの15倍容量の結合用緩衝液てカラムを洗
浄した後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH3,0)で溶
出した。この溶出液をl M トリス州c(!緩衝液(
pH9,0)で直ちに中和した。限外濾過で濃縮した後
、20mMリン酸緩i+1生理食塩水液(pt47.2
)に対して透析した。Ig(JJ度をマウスIgGRI
Dフッート(セロチック社製)で測定した。各モノクロ
ーナル抗体の回収量を第1表に示す。
第1表モノクローナル抗体回収量
尤旌男抗アポBモノクローナル抗体を用いる免疫比濁法
■混濁反応のタイムコース
上記8種のモノクローナル抗体を単独で、または2〜4
種組合わせて用い、ヒト血清と反応させて、反応液か混
濁するか否か、および混濁反応のタイムコースを調へた
。2種の抗体を用いるときはすべての組合わせについて
、3種または4種の抗体を用いるときはMNHB−7、
MNHB−8、MNHB−11およびMNHB−15を
中心に試験した。
種組合わせて用い、ヒト血清と反応させて、反応液か混
濁するか否か、および混濁反応のタイムコースを調へた
。2種の抗体を用いるときはすべての組合わせについて
、3種または4種の抗体を用いるときはMNHB−7、
MNHB−8、MNHB−11およびMNHB−15を
中心に試験した。
PEG緩衝i&(15%ポリエチレングリコール600
0.150mM塩化ナトリウム、50mM’ノン酸緩衝
液、pH7,2)をキュベツトに0.51Yr2ずつ分
注し、これに製造例の■で得た精製抗体40μ7(抗体
を2種類用いるときは各20μ9.3種類用いるときは
各13.3μ9.4種類用いるときは各10μ9)およ
び150mM塩化ナトリウム溶液を加えて液量をl 、
511(lとした。このキュヘットを37°C恒昌装
置付きの分光光度計(島津UV−16O)にセントし、
約10分間プレインキユベーンヨンした。次いて、ヒト
血清(S RI Dfiで測定したときのアポB濃度は
222 m9/d0’)を5μσずつ加えて転倒混和し
、波長340nmの吸光度を37°Cで2分ごとに30
分まで、または1分ごとに19分まで測定した。尚、検
体ブランクはPEG緩?ji 液と150mM塩化ナト
リウム溶液をl:2の割合てl見合して用いた。
0.150mM塩化ナトリウム、50mM’ノン酸緩衝
液、pH7,2)をキュベツトに0.51Yr2ずつ分
注し、これに製造例の■で得た精製抗体40μ7(抗体
を2種類用いるときは各20μ9.3種類用いるときは
各13.3μ9.4種類用いるときは各10μ9)およ
び150mM塩化ナトリウム溶液を加えて液量をl 、
511(lとした。このキュヘットを37°C恒昌装
置付きの分光光度計(島津UV−16O)にセントし、
約10分間プレインキユベーンヨンした。次いて、ヒト
血清(S RI Dfiで測定したときのアポB濃度は
222 m9/d0’)を5μσずつ加えて転倒混和し
、波長340nmの吸光度を37°Cで2分ごとに30
分まで、または1分ごとに19分まで測定した。尚、検
体ブランクはPEG緩?ji 液と150mM塩化ナト
リウム溶液をl:2の割合てl見合して用いた。
結果を第1図、第2図および第3図に示すか、[腫類の
抗体だけを使用した場合はほとんど混濁反応を起こさな
かった。しかし、抗体を2種類組合せて使用するとMN
HB−11とMNHB−13との組合せを除(すべての
組合せで混濁反応が起こり、特にMNHB−7と他の抗
体を組合せたとき、およびMNHBi5と池の抗体を組
合せたときに大きな濁度を生じた。抗体を2種類組合せ
て使用した場合、f11蜀反応かプラトーに達するのに
は30分以上の時間を要したが、3種類あるいは4種類
組合せて使用した場合には、プラトーに達する時間が1
9分あるいは9〜13分と速くなる組合せかあった。4
種のモノクローナル抗体、MN)(B−7、MNT(B
−8、MNHB−11およびMNHB−15を組合せて
使用したときが最も速く、約9分て反応はプラトーに達
した。
抗体だけを使用した場合はほとんど混濁反応を起こさな
かった。しかし、抗体を2種類組合せて使用するとMN
HB−11とMNHB−13との組合せを除(すべての
組合せで混濁反応が起こり、特にMNHB−7と他の抗
体を組合せたとき、およびMNHBi5と池の抗体を組
合せたときに大きな濁度を生じた。抗体を2種類組合せ
て使用した場合、f11蜀反応かプラトーに達するのに
は30分以上の時間を要したが、3種類あるいは4種類
組合せて使用した場合には、プラトーに達する時間が1
9分あるいは9〜13分と速くなる組合せかあった。4
種のモノクローナル抗体、MN)(B−7、MNT(B
−8、MNHB−11およびMNHB−15を組合せて
使用したときが最も速く、約9分て反応はプラトーに達
した。
■アポBfitと吸光度との関係
2〜4種のモノクローナル抗体を組合わせて用い、アポ
B量と吸光度との関係を調べた。
B量と吸光度との関係を調べた。
製造例の■で得た精製抗体、150mM塩化ナトリウム
/8液およびPEG緩衝液を混合し、総抗体濃度か26
.7AI9/mρとなるように、モしてボjエチレング
リコール6000濃度か5%となるように試験抗体液を
調製した。精製モノクローナル抗体を2種類用いるとき
はMNHB−7およびMNHB−3を、3種類用いると
きはM、NHB−7、M N HB −3およびMNH
B−15を、4種類用いるときはMNHB−7、MNI
(B−8、MNHBllおよびMNHB−15を使用し
た。各抗体はそれぞれ等量ずつ用いた。
/8液およびPEG緩衝液を混合し、総抗体濃度か26
.7AI9/mρとなるように、モしてボjエチレング
リコール6000濃度か5%となるように試験抗体液を
調製した。精製モノクローナル抗体を2種類用いるとき
はMNHB−7およびMNHB−3を、3種類用いると
きはM、NHB−7、M N HB −3およびMNH
B−15を、4種類用いるときはMNHB−7、MNI
(B−8、MNHBllおよびMNHB−15を使用し
た。各抗体はそれぞれ等量ずつ用いた。
ヒトプール血清(SRID法で測定したアポB濃度は7
5mg/dのを試験管に2.5.5.10および15μ
ρサンブリン−グし、これに試験抗体液を1.51ずつ
加え、37°Cで30分間反応させた後、波長340n
mの吸光度を測定した。尚、検体フランクはPEG緩衝
液と150mM塩化ナトリウム溶液を1:2の割合に混
合した溶液を用いて測定した。
5mg/dのを試験管に2.5.5.10および15μ
ρサンブリン−グし、これに試験抗体液を1.51ずつ
加え、37°Cで30分間反応させた後、波長340n
mの吸光度を測定した。尚、検体フランクはPEG緩衝
液と150mM塩化ナトリウム溶液を1:2の割合に混
合した溶液を用いて測定した。
結果を第4図に示すか、検体量を5μρとし、試験抗体
液を1.51NQ、とじた測定系では少なくともアポB
t農度約230 肩?/d12までは測定可能であった
。
液を1.51NQ、とじた測定系では少なくともアポB
t農度約230 肩?/d12までは測定可能であった
。
また、10分間測定法についても試験した。製造例の■
で得た精製抗体M N HB −7、M N HB8、
MNHB−11およびMNHB−15を等全混合し、さ
らにそれに150mM塩化ナトリウムおよびPEG緩衝
液を混合し、総抗体濃度が240μ9/村となるように
、そしてポリエチレングリコール6000濃度か5%と
なるように抗体液を調製した。ヒト血清(4段階希釈)
9μQ1およびPEG緩衝液と150mM塩化ナトリウ
ムを1:2で混合した溶液900μQをキュベツトに入
れ、転倒混和した後、前記37°C恒温装置付き分光光
度計にセ、トシ、5分間加温した後、検体ブランクとな
る波長340nmの吸光度(A)を測定した。次いで、
直ちに上記抗体液150AIQをこのキュベツトに加え
、転倒混和し、37°Cでさらに5分間加温した後、波
長340nmの吸光度(B)を測定した。
で得た精製抗体M N HB −7、M N HB8、
MNHB−11およびMNHB−15を等全混合し、さ
らにそれに150mM塩化ナトリウムおよびPEG緩衝
液を混合し、総抗体濃度が240μ9/村となるように
、そしてポリエチレングリコール6000濃度か5%と
なるように抗体液を調製した。ヒト血清(4段階希釈)
9μQ1およびPEG緩衝液と150mM塩化ナトリウ
ムを1:2で混合した溶液900μQをキュベツトに入
れ、転倒混和した後、前記37°C恒温装置付き分光光
度計にセ、トシ、5分間加温した後、検体ブランクとな
る波長340nmの吸光度(A)を測定した。次いで、
直ちに上記抗体液150AIQをこのキュベツトに加え
、転倒混和し、37°Cでさらに5分間加温した後、波
長340nmの吸光度(B)を測定した。
抗原抗体反応により生じた濁度は、吸光度(B)吸光度
(A)x909/1059で求めた。その結果、生じた
濁度は検体量に比例し、原点を通る直線が得られた。
(A)x909/1059で求めた。その結果、生じた
濁度は検体量に比例し、原点を通る直線が得られた。
■5RID法との比較
本方法および5RID法(アポBプレート「第一」、第
一化学薬品社製)を用いて、ヒト血清5検体のアポB濃
度を測定し、両方法による3則定値を比較した。
一化学薬品社製)を用いて、ヒト血清5検体のアポB濃
度を測定し、両方法による3則定値を比較した。
本方法による測定は次のようにして行った。ヒト血清を
試験管に5μρずつサンプリングし、これに上記■で調
製した4種抗体(MNHB−7,8,11および15)
を用いる試験抗体液を1.Fliずつ加え、37°Cで
30分間反応させた後、波長340nmの吸光度を測定
した。尚、検体ブランクはPEG緩衝液と150mM塩
化ナトリウム溶液を12の割合に混合した溶液を用いて
測定した。
試験管に5μρずつサンプリングし、これに上記■で調
製した4種抗体(MNHB−7,8,11および15)
を用いる試験抗体液を1.Fliずつ加え、37°Cで
30分間反応させた後、波長340nmの吸光度を測定
した。尚、検体ブランクはPEG緩衝液と150mM塩
化ナトリウム溶液を12の割合に混合した溶液を用いて
測定した。
標準血清としては上記ヒトブール血清(75m9/dの
を用い、検体と同様の操作を行って1測定した。
を用い、検体と同様の操作を行って1測定した。
血清アポB値(my/dのは、75X(検体吸光度検体
ブランク吸光度)/(標準血清吸光度−標準血清ブラン
ク吸光度)で求めた。
ブランク吸光度)/(標準血清吸光度−標準血清ブラン
ク吸光度)で求めた。
結果を第2表に示すが、両方法による測定値はほぼ同等
であった。
であった。
第1図は1種または2種のモノクローナル抗体を用いて
、第2図は3種のモノクローナル抗体を用いて、第3図
は4種のモノクローナル抗体を用いて、血清アポBを測
定したときのタイムコースをそれぞれ示すグラフであり
、第4図は本方法によって血清アポBを測定したときの
アポB量と吸光度の関係を示すグラフである。
、第2図は3種のモノクローナル抗体を用いて、第3図
は4種のモノクローナル抗体を用いて、血清アポBを測
定したときのタイムコースをそれぞれ示すグラフであり
、第4図は本方法によって血清アポBを測定したときの
アポB量と吸光度の関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 1、認識する抗原決定基が異なる2種類以上の抗アポB
モノクローナル抗体を用いることを特徴とする免疫比濁
法による血清アポBの定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63217094A JPH0264458A (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 血清アポbの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63217094A JPH0264458A (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 血清アポbの定量法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0264458A true JPH0264458A (ja) | 1990-03-05 |
Family
ID=16698747
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63217094A Pending JPH0264458A (ja) | 1988-08-31 | 1988-08-31 | 血清アポbの定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0264458A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006214765A (ja) * | 2005-02-01 | 2006-08-17 | Bml Inc | ヒトApoA−V蛋白質に対する抗体、及び、当該抗体を用いたヒトApoA−V蛋白質定量測定系 |
CN108008135A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-05-08 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 一种载脂蛋白b测定试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60193926A (ja) * | 1984-03-15 | 1985-10-02 | Tokyo Daigaku | 単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質b100抗体 |
JPS60237363A (ja) * | 1984-05-11 | 1985-11-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫グロブリンの定量方法 |
JPS62192661A (ja) * | 1986-02-20 | 1987-08-24 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法によるcrpの測定法 |
-
1988
- 1988-08-31 JP JP63217094A patent/JPH0264458A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60193926A (ja) * | 1984-03-15 | 1985-10-02 | Tokyo Daigaku | 単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質b100抗体 |
JPS60237363A (ja) * | 1984-05-11 | 1985-11-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫グロブリンの定量方法 |
JPS62192661A (ja) * | 1986-02-20 | 1987-08-24 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法によるcrpの測定法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006214765A (ja) * | 2005-02-01 | 2006-08-17 | Bml Inc | ヒトApoA−V蛋白質に対する抗体、及び、当該抗体を用いたヒトApoA−V蛋白質定量測定系 |
CN108008135A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-05-08 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 一种载脂蛋白b测定试剂盒 |
CN108008135B (zh) * | 2017-11-23 | 2020-09-25 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 一种载脂蛋白b测定试剂盒 |
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