JPH02263161A - 堅牢なカップリング化合物の中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有用なりガント及び／又はマーカーを含むカッ
プリングした化合物を製造するために有用な中間体化合
物に関する。

カップリング試薬またはスペーザー化合物は、ある有機
物質を他にカップリングさせるために用いられる一般に
二官能性の化合物である。たとえばイムノアッセイなど
のアッセイにおいては、アッセイの成分の一方はリガン
ドからなるトレーサー；たとえば適切なマーカー（例え
ば蛍光色素のような色原体）にカップリングした抗原で
ある。

この種のトレーサーを製造する際には、多くの場合抗原
を二官能性のカップリング剤またはスペーサーの使用に
より蛍光色素にカップリングさせる。

同様に固体支持体を用いるイムノアッセイにおいては、
アッセイに用いられる物質（たとえば抗体）を固体支持
体（たとえばポリマー）にカップリングさせる必要があ
り、ある場合にはこれはカップリング剤の使用により達
成される。

当技術分野においては、ある物質をカップリング剤また
はスペーサー化合物を介して他にカップリングさせるた
めの改良された手段が求められている。

本発明の一観点によれば、ある物質を他にカップリング
させるための中間体が提供される。

より詳細には、本発明の一観点によればカンプリングし
た化合物の製造に有用な中間体であって、下記の構造式
： ０　　　　　　　　　　　　　（Ｉ） １１−Ｃ−Ｎｉｌ−Ｙ　　−八 （式中、ｙは２価の芳香炭化水素残基であり；Ｒは蛍光
色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗原
、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
あり、及びＡは−Ｎｏ２、−Ｎ１１□、Ｃ００ＩＩ、−
Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−３Ｈ，−叶、−Ｎ＝Ｃ＝０．Ｃ−（Ｊ！
、　　−Ｃ−０−’１″、　−３−Ｃ−１７”　　及び
０−Ｃ−Ｒ″（式中、ｐｌ＋はアルキル基である）より
なる群から選ばれる）を有する中間体が提供される。

本発明の中間体を用いると下記の 構造式■： （式中、Ｚは　　　０ Ｎｌｌ−Ｃ−Ｂ　。

Ｏ Ｎ＋１−Ｃ−０−Ｂ　　、　　　−ＮＨ−Ｃ−５−Ｂ　
　。

Ｎｉｌ−Ｃ−Ｎｌｌ−Ｂ　　、　　　−Ｃ−Ｎｌｌ−Ｂ
　　。

Ｓ　−Ｃ−Ｎｌｌ−Ｂ　　及び　−０−Ｃ−Ｎｌｌ−Ｂ
よりなる群から選ばれ；Ｙは２価の芳香族炭化水素残基
であり；及びＲ及びＢの一方は蛍光色素及び酵素から選
ばれる検出可能なマーカーであり、Ｒ及びＢの他方が抗
原、ハブテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
である）を有する化合物を製造することができる。

本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記の各構造
式においてＹは２価のヘンゼン残基である。ただしＹは
２価のナフタリン残基または２価のジフェニル残基であ
りうるとも解すべきである。

中間体（１）は構造式（■）： ０＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−Ｒ’　　　　　　　　　　　（］Ｉ［
）（式中Ｒ′は−ＮＯ２；　　Ｃ０ＯＲ″；　　Ｓ　　
ＣＲ”；またＩ は−０−Ｃ−Ｒ“であり、 ＲｒｒおよびＹは定義されたものである）により表わさ
れる化合物から製造できる。

Ｒ′は一般にパラ位またはメタ位にあり、好ましくはパ
ラ位にあり、Ｒ′は最も好ましくは−ＮＯ２である。

化合物■においてＲ′がＮｏ２である場合、化合物■を
まずイソシアネート基と反応性である活性水素置換基を
有するマーカーまたはリガンドとカップリングさせて、
八が−ＮＯ□である式■の化合物を製造する。次いでこ
の−ＮＯ２基を選択的に還元してアミノ基となしく硫化
された水素化ホウ素ナトリウムの使用）、他のマーカー
またはりガントにカップリングさせるための反応性基を
与えることができる。あるいはアミン基をイソシアネー
ト基（ホスゲンとの反応）またはイソチオシアネート基
（チオホスゲンとの反応）に変えることができる。これ
らのいずれも中間体１をマーカー又はリガンドにカップ
リングさせるための反応性を有または−０−Ｃ−Ｒ“で
ある場合、化合物■をイソシアネート置換基を介してマ
ーカーまたはりガントにカップリングさせたのち、置換
基Ｒ′を加水分解して置換基Ａ（それぞれ−ＣＯＯ１１
、−５ＨまたはＯＨであり、これらはそれぞれ中間体１
をマーカーまたはリガンドにカップリングさせるための
反応性を有する）にすることができる。

従って明らかなとおり、化合物■はこれがそのイソシナ
ネート基を介してカンプリングすべきマーカーまたはり
ガントの活性水素置換基と反応性でない置換基Ｒ′を含
むべく選ばれる。次いでＲ′を、中間体Ｉがそれとカッ
プリングしてカンプリングした化合物■を形成するマー
カーまたはりガントの活性水素置換基と反応性である置
換基へに変える。

構造式Ｉで表わされる化合物は、構造式■で表わされる
カップリングした化合物の製造に用いることができる。

構造式■で表わされる化合物を使用する際には、八で表
わされる置換基Ｇノ構造式■により表わされる化合物を
カップリングさせるべき化合物の活性水素置換基と反応
しうるものである。たとえば八がアミノ基である場合、
化合物Ｉを当技術分野で一般に知られている方法により
、カルボキシル置換基を有するマーカーまたはりガント
とカップリングさせることができる。同様に八がカルボ
キシル基である場合、化合物Ｉを当技術分野で知られて
いる方法により、アミノ置換基またはイソシアネート置
換基を有する有機化合物とカップリングさせることがで
きる。八がイソシアネート基些である場合、化合物Ｉを
・活性水素置換基（メルカプト（チオール）基、水酸基
、カルボキシル基またはアミノ基である）を有するマー
カーまたはりガントにカップリングさせることができる
。八がチオール基または水酸基である場合、化合物１を
活性水素置換基（イソシアネー１−）を有するマーカー
またはリガンドにカップリングさせることができる。八
がイソチオシアネート基である場合、化合物■をアミノ
置換基を有するマーカーまたばリガンドとカップリング
させることができる。この種のカップリングをこの種の
官能基を介して行う方法は、当技術分野で一般に知られ
ている。

カップリング剤■は多種多様な有機物質を互いにカップ
リングさせるために使用できる。たとえばトレーサーが
検出可能なマーカーｔたとえばリガンド（ここで用いら
れる“リガンド゛という語はハプテン、抗原または抗体
を意味する）にカップリングした放射性マーカー、色原
体、酵素などからなるアッセイに使用すべきトレーサー
の製造にカップリング化合物■を用いることができる。

この種の実施態様においてマーカーまたはりガントの一
方には、イソシアネート基と反応しうる置換基が含まれ
、カップリング剤■の置換基Ｒ′ばそのリガンドまたは
マーカーの置換基と非反応性である。カップリング剤■
をリガンドまたはマーカーとカップリングさせたのち、
置換基へが、最初にカップリングして中間体１を生成し
たリガンドまたはマーカー上にある活性水素置換基と非
反応性である中間化合物Ｉが製造される。次いで中間化
合物■をマーカーまたはリガンドの他方とカップリング
させる。中間体１の置換基へがリガンドまたはマーカー
の他方にある活性水素置換基と反応でない場合は、置換
基へを先に定義したようにリガンドまたはマーカーの他
方にある活性水素置換基と反応性である置換基に選択的
に変換する。

次いでこの中間体１をリガンドまたはマーカーの他方と
カップリングさせてカップリングした化合物■を製造す
る。

たとえばアッセイに使用するトレーサーを製造する際に
、カップリング化合物■においてＲおよびＢの一方がマ
ーカー、たとえば色原体、放射性置換基を含む有機化合
物または酵素であり、ＲおよびＢの他方がリガントであ
る。たとえば蛍光１・レーサーを製造する際にはＲおよ
びＢの一方がイソシアネート基または構造式Ｉ中の八に
より表わされる反応性官能基の一つにカップリングしう
る置換基を有する蛍光色素から誘導され、ＲおよびＢの
他方がイソシアネート基または構造式Ｉにおいて八で表
わされる反応性置換基の他方にカップリンタしうる置換
基を有するリガンドから誘導される。この種のトレーサ
ーを導入する際には、リガントまたは蛍光色素をまずカ
ップリング試薬■のイソシアネート官能基にカップリン
グさせる。

本発明者らは、弐■で表わされるカップリング剤を使用
することは、カップリング剤が堅牢であり、このため蛍
光マーカーがリガンド上に°°折り返ることがなく、従
ってリガンドにより蛍光化合物が消光される可能性が最
小限に抑えられる点で、蛍光トレーサーの製造に特に有
利であることを見出した。

適切な色原体の代表例として、以下のものが挙げられる
。アクリジン色素、アズレ（ａｚｕｒｅ）色素、キノン
色素、ナイルブルー、タレジルバイオレット、フルオレ
セイン類、ローダミン類、クマリン類、アミノナフタリ
ン誘導体（ダンシル化合物）、カルボシアニン類、イン
ドール類、ランタニドキレ−１・類など。

たとえばＴ４）レーサーは、まずｐ−ニトロフェニルイ
ソシアネートをＴ、のカルボキシ部分が適宜ブロックさ
れたチロキシン（Ｔ４）にカップリングさせることによ
り製造できる。ニトロ基を還元してアミノ基（化合物１
、ＰはブロックされたＴ４残基であり、■はベンゼン残
基、Ａはアミノ基である）となし、化合物１のアミノ部
分をたとえばイソチオシアネート基を含む蛍光色素（特
にフルオレセインイソチオシアネート）にカップリング
させることができる。

あるいは化合物１のアミノ基をチオホスゲンとの反応に
よりイソチオシナネート基に変え（化合物ＩにおいてＡ
がイソチオシアネート基）、次いで化合物Ｉをアミノ基
含有蛍光色素（特にフルオレセインアミン）と反応させ
ることができる。

同様にジゴキシントレーサーは、ジゴキシンをｐ−ニト
ロフェニルイソシアネートとカップリングさせたのちニ
トロ基を還元してアミノ基となし、そして蛍光色素、た
とえばフルオレセインイソチオシアネートと反応させる
ことにより製造できる。

本発明は前記のように蛍光トレーサーの製造に特に用い
られるが、本発明は他のトレーサー、たとえば放射性ト
レーサー、酵素トレーサーなどの製造にも用いられる。

放射性１−レーサーを製造するだめの適切な放射性マー
カーの代表例としては、以下のものが挙げられる：ヒド
ロキシフェニル置換されたアミンまたはアミノ酸。これ
らにおいてフェニル基には放射性置換基１個または２個
以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ素化さ
れたチロシンまたはチラミン；イミダゾール基が放射性
置換基１個または２個以上により置換されたイミダゾー
ル置換アミノ酸またはアミン等。

適切な酵素マーカーの代表例としては以下のものが挙げ
られる：バーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイ
ン酸デヒロトゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルクルオキシダーゼ、アシドホスファタ
ーゼなど。

当技術分野で知られるように、固体支持体はポリマーで
あってもよい。ただしそのようなポリマーにはイソシア
ネート官能基または中間体Ｉの八により表わされる反応
性置換基の１つと反応しうる置換基が含まれる必要があ
る。たとえばポリアクリルアミド、ポリ（アミノスチレ
ン）など。

本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上にリ
ガンドは、当技術分野で一般に知られている型の多種多
様な被分析体じ被分析体（ａｎａｊｙｔｅ）“′という
語はハプテン、抗原または抗体を表わす）のアッセイに
使用できる。たとえば本発明は治療薬およびいわゆる“
麻薬（ｄｒｕｇｓ　ｏｆ　ａｂｕｓｅ）”を含む薬剤；
ステロイド、ビタミン、糖、アミノ酸、ポリペプチド、
蛋白質、各種ホルモン、抗生物質、ウィルスなどのアッ
セイに使用できる。

本発明により製造されるトレーサーおよび支持体上のり
ガントはイムノアッセイ　（“°イムノア・ンセイ゛と
いう語は総称的に用いられ、抗原または抗体の代わりに
天然の結合剤を使用し、時に競合帯白質結合アッセイと
呼ばれるアッセイを含む）に使用でき、当技術分野で知
られるようにアッセイの成分の一つは結合剤である。被
分析体がハプテンまたは抗原である場合、結合剤は抗体
、または被分析体に特異的な結合部位１個または２個以
上をもつ天然物質であり、被分析体が抗体である場合、
結合剤は抗体に対する抗原または被分析体に呼応して誘
発された抗体であろう。適切な結合剤の選択は当業者が
なしうる範囲内にあると考えられ、本発明を十分に理解
するためにこの点に関してこれ以上詳述する必要はない
と思われる。

アッセイに際して、アッセイに用いられるトレーサーの
りガント部分は採用されるアッセイの型により定められ
る。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである被分
析体に関するものである場合、トレーナ−のりガント部
分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたはそれら
の適宜な同族体である（“適宜な同族体°゛という語は
アッセイに用いられる結合剤に結合した被分析体の同族
体を意味する）。あるいはｌ−レーサーのりガント部分
がアッセイすべきハプテンまたは抗原に対する結合剤で
あってもよく、この場合アッセイはトレーサーがそのト
レーサーに特異的な結合部位に結合するのを被分析体が
阻止するように工夫される。

被分析体が抗体である場合、トレー・す−のりガント部
分は抗体またはその適宜な同族体であり、この場合抗体
およびトレーザーの双方が被分析抗体およびトレーサー
の双方に対して特異的な限られた数の結合部位に関して
競合するであろう。あるいはトレーサーのりガント部分
は、被分析抗体に対する抗原または被分析抗体に呼応し
て誘発された抗体であってもよい。この場合、被分析抗
体はトレーサーがそのトレーザーに対し特異的な結合部
位に結合するのを阻止する。

被分析体をいわゆる“ザンドイッチ型°゛のアッセイに
より決定する場合には、１−レーザーのりガント部分が
被分析体に特異的あ結合部位をもち、被分析体は複数の
決定部位をもつ。

トレーサーのりガント部分として用いられる適切なリガ
ンドの選択は本明細書の教示から当業者がなしうる範囲
のものと考えられ、従って本発明を十分に理解するため
にこの点に関してこれ以上詳述する必要はないと思われ
る。

本発明のカップリング剤は治療薬を抗体（特にモノクロ
ーン抗体）にカップリングさせるためにも使用できる。

この場合、カップリングした化合物■においてＲは治療
薬から誘導され、Ｂは抗体から誘導される。

従って上記の記述から明らかなように、カップリングし
た化合物■は多種多様なマーカーまたはリガンドから製
造でき、化合物ＨにおいてＲにより表わされる有機残基
はあるマーカーまたはりガントから誘導され、カップリ
ングした化合物ＨにおいてＢにより表わされる有機残基
は他のマーカーまたはりガントから誘導される。ただし
各マーカーまたはりガントはガラプリング剤■中の適宜
な置換基（イソシアネート）または構造式Ｉにおいて八
により表わされる適宜な反応性置換基と反応するだめの
適宜な活性水素置換基を含む。たとえばカップリングし
た化合物■においてＲはイソシアネート基と反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよく、そのマーカーは放射置
換基された有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素、
酵素であって良くまたはりガントは特に非蛋白性抗原も
しくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、または治療薬（
特に医薬）であってもよい。同様にＢは中間体Ｉにおい
て八により表わされる反応性置換基の１つと反応しうる
活性水素置換基を含むマーカーまたはりガントから誘導
される有機残基であってもよい。たとえばＢは蛋白質、
抗体、ハプテン、抗原、色原体（色素、好ましくは蛍光
色素）、酵素、放射性置換基を有する有機化合物ポリマ
ーなどのマーカーまたはりガントから誘導される有機残
基であってもよい。

本発明を以下の実施例に関連してさらに記述するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるべきではない。

実施例　１ 塩化トリメチルシリル（ＴＭＳ−Ｃｆｆｉ）２．１ミリ
モルをＴ、１ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加した
。

反応は約２時間を要し、はぼ定量的であった。反応後、
ｐ−ニトロフェニルイソシアネート１．１モルを反応混
合物に注入添加し、混合物を磁気撹拌棒を用いて約４８
時間攪拌し、少量の試料を薬４時間毎にＴＬＣ（Ｆ４Ｉ
層クロマトグラフィー）による分析のため取出した。４
８時間後に生成物を未反応イソシアネートの除去のため
メタノールで十分に洗浄し、次いでＴＬＣもしくは高圧
液体クロマトグラフィー　（ＩＩＰＬｃ）によりまたは
カラムクロマトグラフィーにより生成物を分離した。得
られた生成物はＴ４のカルボキシル官能基がトリメチル
シラン（ＴＭＳ）でブロックされたパラ−ニトロフェニ
ルイソシアナイト−Ｔ４であった。

上記の反応は常温常圧（ＳＴＰ）で行われた。

硫化された水素化ホウ素ナトリウム０．５５ミリモル（
使用したＴ４の濃度に対して過剰量を生成物０．５ミリ
モルに室内の温度および圧力で添加することによりニト
ロ基を還元した。反応は約３〜４時間混合して完了し、
ＩＲによりニトロからアミンへの変換を監視することに
より行われた。得られた生成物はパラ−アミノフェニル
イソシアナトＴ４であった。

上記生成物に１モル当量のイソチオシアナ１〜フルオレ
セインを添加したのち約４８〜７２時間攪拌し、ＴＬＣ
またはＨＰＬＣにより監視した。フルオレセイン色素を
Ｔ４カップリングした中間体にカップリングさせたのち
ブロック剤ＴＭＳを水性条件下で除去した。

得られた生成物はフルオレセインイソチオシアネートが
堅牢なカップリング剤を介してＴ４にカップリングした
蛍光トレーサーであり、このトレーサーはＴ４のアッセ
イに使用できる。

実施例　２ ジゴキシン蛍光トレーサーの製造 １０ｈ＋Ｒ容の丸底フラスコにジゴキシン１ミリモルお
よび攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、ガス抜き針
を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で５分間パージした
。長い１８ゲージのステンレス網製の針を備えた５０雌
のガラス製注射器に新たに蒸留したピリジン３０ｍＲを
取り、ゴム膜を介して丸底フラスコに最初は徐々に注入
し、１５〜２０ｍ１が注入されたのち攪拌を加えた。残
りの１０〜１５雌は丸底フラスコの側面を洗い落として
ジゴキシンを溶解するのに使用した。再びガス抜き針を
用いて容器を窒素で約５分間パージした。ジゴキシンが
すべて熔解して完全な溶液になるまで攪拌混合を続りた
。

別個の容器（好ましくは閉じた丸底フラスコ）にパラ−
ニトロフェニルイソシアネート１．１　ミリモル（あら
かじめ乾燥したもの）をとり、ピリジン１５ｍ２を注入
により添加し、前記のように閉鎖容器を窒素で混和パー
ジし、すべての物質が溶液となった時点で注射により取
出し、攪拌を続けながら徐々にジゴキシンを入れた１０
０ｍｊ！容丸底フラスコに添加した。

注釈＝１）作業はすべて防護フード内で行うべきである
。

２）パラ−ニド−フェニルイソシアネートは使用前に常
にＩＲで検査すべきで ある。貯蔵期間および露光によりこ のイソシアネ−１・が著しく影響を受 ける可能性がある。ロフト毎にイソ シアネートの存在を調べるべきであ る。

ＴＬＣ用試料は注射器により取出すべきでありＴＩ、Ｃ
による監視はパラ−ニトロフェニルイソシアネートを添
加した２時間後に開始すべきである。

第１日日については２〜４時間毎にスポットを検査し、
−夜間いた場合は且Ｃをまず朝一番に行うべきである。

反応は終了するまで約７２時間かかった。（４８時間後
に主生成物は実質的に形成されていたが一７５％終了）
。これよりも長時間置くと目的生成物の増加は認められ
るが、これは付加的な副生物が匹敵するかまたはより大
きな割合で生じるという犠牲においてなされる。可能な
限り最良の結果が得られたことを確認するため、目的生
成物の精製（および単離）をここで行うべきである。

この生成物の精製は調製用ＴＬＣにより行われ、１日で
行うことができるが、プレートに過剰負荷しないように
注意しなければならない。さもなければバンドが重複す
るおそれがある。シリカゲルからメタノール：クロロホ
ルムを用いて抽出する際、溶液を０．２２μのフィルタ
ーを介して回転蒸発用の丸底フラスコ中へ濾過するとよ
い。濾過はジゴキシンに対するイソシアネート（結合）
形成を破壊する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去
するために重要である。（シリカゲル−メタノール：ク
ロロホルムを濾過の前に遠心分離することにより大部分
の粒子を除去することができ、濾過工程が促進される。

） この時点で生成物およびその相対濃度を確認する最も迅
速な試験はジゴキシンに対するＲＩＡによるものである
。濾過した生成物を回転蒸発させ（×４）、生成物を少
量のメタノールに取り入れることにより希釈液を調製し
、置換ジゴキシンの免疫反応性につき容易に試験された
。これが確認され、相対純度が求められると（ＴＬＣに
よる）、次の工程はニトロを硫化した水素化ボウ素すｌ
・リウムの使用によりアミンに還元することであった。

生成物はＹがベンゼン残基、ＡがＮＯ２、Ｒが１５′ジ
ゴキシン残基である化合物Ｉであった。

操作を続行する前に、カップリングしたジゴキシンを回
転蒸発により乾燥させ、反応器にバラニ１−ロフェニル
イソシアナ１ヘ−ジゴキシンを入れる前にテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）で１回洗浄すべきである。

ＮａＢ１１゜Ｓ３　との反応はジオキサンまたはＴＨＦ
中で行うことができるが、置換されたジゴキシンの溶解
性の点でＴＩＩＦが好ましい。窒素雰囲気を維持するこ
とは決定的ではないが、前記のようにＮａＢＩＩ□Ｓ３
を添加する前に容器をパージすべきである。

１００ｍｆｆ１容の丸底フラスコに上記ジゴキシン（置
換パラ−ニトロフェニルイソシアナト−ジゴキシン）お
よび撹拌棒を一定容積のＴＩ（Ｆに入れた（この場合も
Ｔ肝の容積を最小限にすべきである）。

ガス抜き針を用いてゴム膜を介して５分間窒素でパージ
した。

別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥させたＮａ
ＢＩＩｚＳ３を入れ、ＴＩＩＦ　２０ｍＲを添加し、完
全に溶解させ、ゴム膜を介して窒素でパージした。

５０ｍ１のガラス製注射器を用いて溶液を取出し、連続
的に攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加した。反応速
度はＩＲにより追跡することができ（Ｎｏ。

→Ｎ１１□への変換）、反応はジゴキシンの濃度に応じ
てわずか数時間後に終了すべきである。進行速度を増す
ために熱を用いることもできるが、わずか３７°Ｃまで
であり、きわめて綿密に監視すべきである。２５°Ｃ（
室温）では反応はこれよりも若干緩慢に進行するが、よ
り制御しやすい。

この生成物はシリカケル且Ｃ（ａｌｌ製用）またはシリ
カゲルカラムにより単離および精製し、メタノールで十
分に洗浄し、濾過し、保存のため乾燥させておくことが
できる。あるいは後続の反応にはニトロ基は全く関与し
ないと思われるので、これをそれ以上精製することなく
そのまま使用し、後続の最終精製をこれらの生成物の精
製に利用することもできる。

ジゴキシンの相対濃度が確認されると（この場合モＲＩ
Ａにより）、後続のパラ−アミノフェニルイソシアナト
−ジゴキシンとの反応は、たとえばフルオレセインイソ
チオシアネーＩ・の使用により直接行うことができる。

置換ジゴキシン１００μモルを清浄な乾燥した２５ｍｆ
ｌ容丸底フラスコに入れ、撹拌棒を入れた。注射器によ
りピリジン１０ｍｆｆを添加し、ゴム膜で閉じ前記のよ
うに窒素でパージし、生成物が完全に溶解するまで攪拌
した。

第２の丸底フラスコにフルオレナインイソチオシアネー
ト１００μモルを添加し、ピリジン１０〜１５ｍ１に溶
解した。ゴム膜で閉じ、Ｎ２でパージし、ガラス製注射
器で取出し、連続的に混合しながらジゴキシンに徐々に
添加した。（フルオレセインイソチオシアネートの性質
のためこれは丸底フラスコおよび注射器に付着するので
、必ずしもすべての物質が移されるわけではないであろ
う。しかし必要ならばのちに上記と同じ方法で追加する
ことができる。） この反応は終了するのに約７２時間かがるであろう。こ
れは分析用ＴＬＣを採用すると新たな蛍光種が出現する
ことにより監視テきる。

生成物の精製はその後の分析作業前に行わなければなら
ない。ＲＩＭ、および蛍光を検出するように考案された
他の試験法はいずれも最終生成物の免疫反応性を証明す
るであろう。

最終生成物が単離されると、これをメタノールで十分に
洗浄し、数回濾過しく０．２２μ）、乾燥剤により乾燥
させ、−３０’Ｃで乾燥剤下に保存した（冷凍）。

得られた生成物はＲが１５′−ジゴキシン残基、Ｚが−
Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｂ　、Ｂがフルオレセイン残基そしてＶが
２価のベンゼン残基である化合物■であった。

実施例　３ ２５ｍｆｌ容の丸底フラスコに１５’−ｐ−アミノフェ
ニルイソシアナト−ジゴキシン（ジゴキシン）（実施例
２で製造したもの）　１００ミリモルを添加し、新たに
蒸留したピリジン５〜７　ｍｌを添加し、完全に溶解す
るまで攪拌により溶解および混和した。

丸底フラスコにゴム膜で蓋をし、Ｎ２て５分間パージし
た。

十分に換気された防護フード内でガラス製注射器（洗浄
でかつ十分に乾燥したもの）によりこのホスゲン液１０
０μｌを取出し、注射器から空気をすべて除去し、この
チオホスゲンを連続的に攪拌されているジゴキシン溶液
に３〜４分間にわたって徐々に添加した。反応器は直射
光を遮断しなレノればならず（金属箔または箱）、少量
を注射器により取出すことによって監視すべきである。

ＩＲは２２５０ｃｍ−’にイソチオシアネートの生成を
示すはずである。生成は象、速に進行し、通常は数時間
内に終了するが、所望により一夜放置することもできる
。

メタノールの添加により反応を停止し、メタノールで数
回洗浄し、回転蒸発により乾燥させた。

単離および精製はＴＬＣによりメタノール；クロロホル
ム（５０：５０）を用いて行うことができ、抽出により
パラ−イソチオシアナト−フェニルイソシアナト−ジゴ
キシンを取出すことについては先に述べた（調製用シリ
カゲル、ＭｅＯＨ中への抽出、および０．２２μのフィ
ルターによる濾過、乾燥、洗浄（３×）および保存のた
めの乾燥）。

得られた生成物はＹが２価のベンゼン残基；Ｒが１５′
−ジゴキシン残基、そしてＡが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓである化合
物Ｉであった。

この化合物は単離および精製されるとさらに精製する必
要なしに数か月にわたって安定である。

保存条件を維持しなければならない（即ちこれらを乾燥
させ、−３０°Ｃで乾燥条件下に保存する）。

実施例　４ １５′−バラ−イソチオシアナト−フェニルイソシアナ
ト−ジゴキシンと酵素（アシドホスファターゼ）との反
応 反応容積を最小限に保ちながら、解放（または閉鎖）容
器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第１または第２アミ
ンを含まない塩基性の低分子緩衝液（たとえばｐｌ＋　
９．５．０．５Ｍのホウ酸塩緩衝液が適切である）を最
少容積添加した。４°Ｃで攪拌混和した。

希望する置換の程度（ジゴキシン：酵素）を計算し、こ
の量になるまで、酵素溶液の全容積の１０％以上ではな
いジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。溶解するまで混和し
た。

ピペットまたはこれに類する移しかえ用器具によりＤ肝
またはＤＭＳＯ中のジゴキシンを取出し、酵素を含むｐ
Ｈ９，５の溶液にきわめて徐々に添加した。

（１０分程度かけるべきであり、受器は４°Ｃに保存す
るかまたは氷上で保存して低温に保持して使用ずべきで
ある）。ジゴキシン−酵素（複合体）を形成する反応は
比較的速やかであり、通常は２４時間以内に終了する。

生成物はＲがジゴキシン残基、■が２価のベンゼン残基
、Ｚが Ｎ１１−Ｃ−Ｎ１１−Ｂ　、そしてＢが酵素アシドホス
ファターゼ残基である化合物■であった。

結合したジゴキシン−アシドホスファターゼの精製は多
数の分離法のうぢのいずれか（たとえばセファデックス
、バイオゲルなど）を用いることにより行われる。

上記の方法は一例であり、有機化合物が必要な活性水素
置換基をもつ限り多種多様な有機化合物を互いにカップ
リングさせるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはＴ４以外のリガンドをフルオレ
セイン色素および／または酵素以外の有機化合物にカッ
プリングさせるのに使用できる。

本発明は、化合物■の使用によりある有機化合物と他の
ものが堅牢にカップリングしたカップリング生成物■を
製造しうるという点で特に有利である。これは、蛍光ト
レーサーを製造するに際し、カップリングが堅牢である
ためリガンドによる蛍光化合物の消光が少なくなるとい
う点で有利である。たとえば蛍光物質を、消光させる可
能性のある重い原子（たとえばＴ３および／またはＴ４
のヨウ素基）が蛍光色素に与える影響が少なくなりおよ
び／または除かれる。従って本発明は特に甲状腺ホルモ
ン（Ｔ３又はＴ４）が蛍光化合物に結合した甲状腺ホル
モントレーサーの製造に用いられる。

以上の教示を考慮して本発明を種々に修正および変更す
ることができ、従って特許請求の範囲の記述の範囲内に
おいて本発明を以」−に詳述した以外の様式で実施する
ことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であり；Ｒは蛍
   光色素及び酵素から選ばれる検出可能なマーカー又は抗
   原、ハプテン及び抗体からなる群から選ばれるリガンド
   であり、及びＡは−ＮＯ＿２、−ＮＨ＿２、−ＣＯＯＨ
   、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、▲数
   式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等
   があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼及び ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ″はアル
   キル基である）よりなる群から選ばれる）を有する化合
   物。 ２、Ｙが２価のベンゼン残基である、特許請求の範囲第
   １項記載の化合物。 ３、Ａが−ＮＯ＿２である、特許請求の範囲第１項また
   は２項記載の化合物。 ４、Ａが−ＮＨ＿２である、特許請求の範囲第１項また
   は２項記載の化合物。 ５、Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｓである、特許請求の範囲第１項ま
   たは２項記載の化合物。 ６、Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｏである、特許請求の範囲第１項ま
   たは２項記載の化合物。 ７、Ｒがジゴキシン残基である、特許請求の範囲第１項
   ないし６項のいずれか１項に記載の化合物。 ８、ＲがＴ＿４である、特許請求の範囲第１項ないし６
   項のいずれか１項に記載の化合物。 ９、Ｒが検出可能なマーカーである、特許請求の範囲第
   １項ないし６項のいずれか１項に記載の化合物。