CN110981875B - 一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原、抗体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原和抗体，以及一种使用方便，快速简便，灵敏度和准确度高，可现场测定阿托品的免疫检测装置。一种阿托品半抗原，其具有式(I)所示的结构：

Description

一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原、抗体和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及了阿托品半抗原及其合成方法、抗原、抗体和应用。
背景技术
阿托品是抗胆碱药，为M-受体阻断剂，可用于镇静、止痛，同时也具有一定的毒性，可能引起中枢神经中毒。随着经济的高速发展，人们越来越注重生活质量，使保健品具有广阔的市场前景。在利益的驱使下，有一些不法商家可能违规添加阿托品用于缓解胃溃疡。若添加过量，将会影响消费者健康。
目前国内外阿托品的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等，上述方法中所用仪器设备操作复杂、成本高、对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果，不适用于基层管理等部门对怀疑对象进行快速的在线检测和监控。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。
建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测阿托品残留量，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的阿托品半抗原。但是，目前国内还没有针对阿托品半抗原以及相关快检产品的报道。
发明内容
为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原和抗体，以及一种使用方便，快速简便，灵敏度和准确度高，可现场测定阿托品的免疫检测装置。
为了解决上述技术问题，本发明采取了以下技术方案：
一种阿托品半抗原，其具有式(I)所示的结构：
Figure BDA0002311481000000011
一种上述阿托品半抗原的合成方法，其包括以下步骤：
Figure BDA0002311481000000012
Figure BDA0002311481000000021
(1)：去甲托品醇用DMF溶解后加入碱，然后加入6-溴-1-己烯，60-90℃反应数小时后，经过后处理得到褐色黏稠油状物，即中间体1，其中去甲托品醇、6-溴-1-己烯、碱的物质的量之比为1：(1-1.5)：(1-5)；
(2)：在惰性气体氛围下，苯乙酸甲酯与甲酸乙酯在四氯化钛的作用下生成中间体2，其中，苯乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氯化钛的物质的量之比为1：(3-5)：(3-5)；(3)：将中间体1与中间体2用甲苯进行溶解后，在甲醇钠的作用下发生酯交换反应生成中间体3，其中中间体1和中间体2的物质的量之比为1:1；
(4)：将中间体3经硼氢化钠还原后，萃取，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状液体，即中间体4；中间体3和硼氢化钠的物质的量之比为1:(1.1-3)；
(5)：将中间体4在高碘酸钠和三氯化钌下进行回流反应，蒸干得到固态，再分散溶解，过滤后滤液蒸干后过柱纯化得到黑色油状液体，即阿托品半抗原，其中中间体4、高碘酸钠、三氯化钌的物质的量之比为1:(1.1-3)：(0.3-0.5)。
一种阿托品抗原，所述阿托品抗原包含：如上述的阿托品半抗原，以及与所述阿托品半抗原偶联的载体蛋白。其中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
一种阿托品抗体，所述阿托品抗体为特异性针对上述的阿托品抗原的抗体。其中，所述阿托品抗体为阿托品单克隆抗体或阿托品多克隆抗体。
上述的阿托品半抗原和/或上述的阿托品抗原和/或上述的阿托品抗体在免疫学检测中的应用。
一种阿托品的免疫检测装置，所述检测装置含有上述的阿托品抗原和/或上述的阿托品抗体。
优选但不限定地，所述检测装置以胶体金检测装置，具体地，其包括试纸条和工作液(即反应杯)，其中试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接在所述底板上。所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述试纸条中的检测线包被有上述的阿托品抗原。反应杯内含有胶体金标记的上述的阿托品抗体。
所述的阿托品胶体金检测装置的制备方法，包括以下步骤：
(a)制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；
所述检测线为能与阿托品单克隆抗体结合的阿托品偶联抗原在所述硝酸纤维素膜上进行包被划线制得；所述质控线为能与阿托品单克隆抗体结合的羊抗鼠抗体进行包被划线制得。优选地，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，阿托品偶联抗原包被浓度为2mg/ml，单位划线量为1μL/cm；羊抗鼠抗体包被浓度为1.5mg/ml，单位划线量为1μL/cm。
上述阿托品偶联抗原是通过以下方法获得：取阿托品半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC和0.1mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜A液，称取人血清蛋白(HSA)140mg溶于10mL浓度0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF 1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以10mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用。
(b)组装试纸条，将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接在底板上，样品垫和吸水垫分别压在硝酸纤维素膜上方1-2mm。
(c)制备反应杯，所述反应杯中包含胶体金标记的阿托品单克隆抗体；
所述胶体金标记阿托品单克隆抗体使用胶体金及阿托品单克隆抗体偶联制得。
本发明的阿托品胶体金装置检测原理是采用竞争法免疫层析技术，使待测样品中的阿托品以及检测线上包被的阿托品抗原与胶体金标记的阿托品单抗发生竞争形式的结合。若待测样品中含有阿托品，待测样品中的阿托品与胶体金标记的阿托品单克隆抗体结合，从而抑制了金标阿托品单抗与检测线上包被的阿托品抗原的结合。通过检测线和质控线颜色深浅的比对得到检测结果。
本发明的有益效果：
本发明提供的阿托品半抗原是以去甲托品醇为原料，制备出合适的阿托品半抗原，能更充分的暴露给动物的免疫***；将本发明阿托品半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，将阿托品人工抗原免疫动物，并采用细胞融合技术制得对阿托品高特异性的单克隆抗体。
使用本发明得到的阿托品抗原/抗体的免疫检测装置，如胶体金免疫层析检测装置，利用试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中的阿托品残留量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有阿托品，能够满足监管部门、检测机构对阿托品的现场快速检测需求，具有很重要的现实意义。本发明与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
附图说明
图1是本发明阿托品胶体金检测装置的结构示意图，左边为试纸条、右边为反应杯；图中，1、吸水垫，2、质控线，3、硝酸纤维素膜，4、检测线，5、样品垫，6、反应杯。
图2是阿托品半抗原质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1阿托品半抗原的制备
实施例1-1一种阿托品半抗原的合成方法，其包括以下步骤：
Figure BDA0002311481000000041
(1)：将原料去甲托品醇2.5g，无水碳酸钾2.8g以及DMF(N,N-二甲基甲酰胺)27mL加入到100mL单口烧瓶中搅拌均匀，再加入6-溴-1-己烯3.3g，在80℃下搅拌反应6h(点TLC板检测，高锰酸钾显色)。反应结束后，冷却至室温，油泵减压旋蒸，蒸出溶剂DMF，加入甲醇溶解过滤掉不溶物。蒸干甲醇后，过柱纯化，得到褐色黏稠油状物，即中间体1；此步骤涉及的具体化学反应式如上所示。
Figure BDA0002311481000000042
(2)：在N2氛围下，将苯乙酸甲酯3.0g，甲酸乙酯2.2g，二氯甲烷60mL加入到100mL单口烧瓶中搅拌均匀，降温至0℃。搅拌中滴加四氯化钛5.67g，四氯化钛滴加完成后滴加三乙胺4.5g。期间体系变成血红色。滴加完成，保持在0℃1h，然后升温至室温反应1h(产物与原料极性接近但可用高锰酸钾溶液显色)。反应完成后，降温至0℃，用冰冷的水萃灭反应，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后得到橙色液体，即中间体2；此步骤涉及的具体化学反应式如上所示。
Figure BDA0002311481000000051
(3)：将上两步得到的2.0g中间体1与1.8g中间体2以及85mL甲苯混合在250mL单口烧瓶中搅拌均匀。加入0.14g甲醇钠后外温130℃回流反应4h。用装有水的分水器除去蒸出的甲醇。反应完成后，蒸干溶剂，加水及10％氢氧化钠调节溶液pH>10，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到白色固体(不纯则为棕黄色)，即中间体3；此步骤涉及的具体化学反应式如上所示。
Figure BDA0002311481000000052
(4)：将上步得到的3.55g阿托品中间体3投入250mL单口烧瓶中加入80mL甲醇搅拌均匀。将体系降温至0℃后分批缓慢加入硼氢化钠0.4g，期间有大量气体产生，注意不能冲料。硼氢化钠加完后体系升温至室温，搅拌反应8h。反应完成后旋蒸除去甲醇，然后加入稀碳酸钠溶液用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状液体，即中间体4；此步骤涉及的具体化学反应式如上所示。
Figure BDA0002311481000000053
(5)：将上步得到的3.2g阿托品中间体4投入250mL单口烧瓶中，加入乙腈25mL、水38mL，然后加入高碘酸钠2.0g，再加入三氯化钌0.46g，最后加入四氯化碳25mL。将混合体系加热60℃回流2h。反应完成后旋蒸除去所有溶剂，然后将所得固体刮散加入100mL甲醇搅拌，使可溶物尽量溶解。过滤除去滤渣，滤液蒸干后过柱纯化得到黑色油状液体，即阿托品半抗原，此步骤涉及的具体化学反应式如上所示，该阿托品半抗原的质谱鉴定EI-MS(positive)m/z：376.5[M+H]+，如图2所示。
实施例1-2一种阿托品半抗原的合成方法，其包括以下步骤：
(1)：将原料去甲托品醇5.0g，无水碳酸钾11.2g以及DMF(N,N-二甲基甲酰胺)100mL加入到250mL单口烧瓶中搅拌均匀，再加入6-溴-1-己烯8.0g，在80℃下搅拌反应6h(点TLC板检测，高锰酸钾显色)。反应结束后，冷却至室温，油泵减压旋蒸，蒸出溶剂DMF，加入甲醇溶解过滤掉不溶物。蒸干甲醇后，过柱纯化，得到褐色黏稠油状物，即中间体1。
(2)：在N2氛围下，将苯乙酸甲酯6.0g，甲酸乙酯8.8g，二氯甲烷100mL加入到250mL单口烧瓶中搅拌均匀，降温至0℃。搅拌中滴加四氯化钛12.0g，四氯化钛滴加完成后滴加三乙胺10.0g。期间体系变成血红色。滴加完成，保持在0℃1h，然后升温至室温反应1h(产物与原料极性接近但可用高锰酸钾溶液显色)。反应完成后，降温至0℃，用冰冷的水萃灭反应，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后得到橙色液体，即中间体2。
(3)：将上两步得到的4.0g中间体1与3.6g中间体2以及100mL甲苯混合在250mL单口烧瓶中搅拌均匀。加入0.3g甲醇钠后外温130℃回流反应4h。用装有水的分水器除去蒸出的甲醇。反应完成后，蒸干溶剂，加水及10％氢氧化钠调节溶液pH>10，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到白色固体(不纯则为棕黄色)，即中间体3。
(4)：将上步得到的7.0g阿托品中间体3投入250mL单口烧瓶中加入100mL甲醇搅拌均匀。将体系降温至0℃后分批缓慢加入硼氢化钠1.6g，期间有大量气体产生，注意不能冲料。硼氢化钠加完后体系升温至室温，搅拌反应8h。反应完成后旋蒸除去甲醇，然后加入稀碳酸钠溶液用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状液体，即中间体4。
(5)：将上步得到的3.2g阿托品中间体4投入250mL单口烧瓶中，加入乙腈25mL、水38mL，然后加入高碘酸钠4.0g，再加入三氯化钌0.69g，最后加入四氯化碳25mL。将混合体系加热60℃回流2h。反应完成后旋蒸除去所有溶剂，然后将所得固体刮散加入100mL甲醇与水等比例混合溶液搅拌，使可溶物尽量溶解。过滤除去滤渣，滤液蒸干后过柱纯化得到黑色油状液体，即阿托品半抗原。
实施例1-3一种阿托品半抗原的合成方法，其包括以下步骤：
(1)：将原料去甲托品醇10.0g，无水碳酸钾54g以及DMF(N,N-二甲基甲酰胺)150mL加入到500mL单口烧瓶中搅拌均匀，再加入6-溴-1-己烯19.3g，在80℃下搅拌反应6h(点TLC板检测，高锰酸钾显色)。反应结束后，冷却至室温，油泵减压旋蒸，蒸出溶剂DMF，加入甲醇溶解过滤掉不溶物。蒸干甲醇后，过柱纯化，得到褐色黏稠油状物，即中间体1。
(2)：在N2氛围下，将苯乙酸甲酯15.0g，甲酸乙酯37g，二氯甲烷200mL加入到1000mL单口烧瓶中搅拌均匀，降温至0℃。搅拌中滴加四氯化钛94.5g，四氯化钛滴加完成后滴加三乙胺50.0g。期间体系变成血红色。滴加完成，保持在0℃1h，然后升温至室温反应1h(产物与原料极性接近但可用高锰酸钾溶液显色)。反应完成后，降温至0℃，用冰冷的水萃灭反应，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后得到橙色液体，即中间体2。
(3)：将上两步得到的20.0g中间体1与18g中间体2以及200mL甲苯混合在500mL单口烧瓶中搅拌均匀。加入3.1g甲醇钠后外温130℃回流反应4h。用装有水的分水器除去蒸出的甲醇。反应完成后，蒸干溶剂，加水及10％氢氧化钠调节溶液pH>10，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到白色固体(不纯则为棕黄色)，即中间体3。
(4)：将上步得到的7.0g阿托品中间体3投入250mL单口烧瓶中加入100mL甲醇搅拌均匀。将体系降温至0℃后分批缓慢加入硼氢化钠2.24g，期间有大量气体产生，注意不能冲料。硼氢化钠加完后体系升温至室温，搅拌反应8h。反应完成后旋蒸除去甲醇，然后加入稀碳酸钠溶液用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状液体，即中间体4。
(5)：将上步得到的6.4g阿托品中间体4投入250mL单口烧瓶中，加入乙腈50mL、水72mL，然后加入高碘酸钠11.5.g，再加入三氯化钌1.54g，最后加入四氯化碳50mL。将混合体系加热60℃回流2h。反应完成后旋蒸除去所有溶剂，然后将所得固体刮散加入100mL甲醇搅拌，使可溶物尽量溶解。过滤除去滤渣，滤液蒸干后过柱纯化得到黑色油状液体，即阿托品半抗原。
实施例2阿托品免疫抗原的制备
利用实施例1-1制备的阿托品半抗原制备免疫抗原。具体地，取阿托品半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC(二环己基碳二亚胺)和0.15mmol NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，于4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液，称取血蓝蛋白(KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。
实施例3阿托品免疫抗原制备单克隆抗体的制备
利用实施例2制备的阿托品免疫抗原制备单克隆抗体。具体地，使用阿托品免疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL50％PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗阿托品单克隆抗体。选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射上述杂交瘤细胞3～5×106/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗阿托品单克隆抗体的含量。
实施例4阿托品胶体金检测装置的制备
4.1胶体金的制备
取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
4.2胶体金标记单克隆抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入阿托品单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的PEG，充分反应30min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。
4.3胶体金检测装置的制备
如图1所示，在底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有阿托品-BSA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接粘连；反应杯内加入胶体金标记单克隆抗体，冻干。
实施例5一种阿托品的胶体金快速检测的检测方法
5.1样品的预处理：取0.1g或0.1mL保健食品(硬胶囊、软胶囊、片剂、丸剂、散剂、水剂等剂型)待测物至含有0.1％醋酸溶液的提取瓶，拧紧瓶盖大力摇匀约30秒，混匀后即为待测液。
5.2检测：拧开试剂瓶上盖，垂直滴加9-10滴(约200μL)待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀。20-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条***到反应杯中，20-
40℃下开始第二步反应，并计时3分钟；从微孔中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读。
5.3结果判读
Figure BDA0002311481000000081
(1)与验证方法结果对比
Figure BDA0002311481000000082
实施例6阿托品胶体金检测装置的灵敏度
通过实验，本发明中阿托品胶体金检测装置的灵敏度为：阿托品50μg/kg。
实施例7阿托品胶体金检测装置的特异性实验
在阴性样品中，分别加入阿托品50μg/kg、佐匹克隆10mg/kg、磺胺二甲嘧啶10mg/kg、克伦特罗10mg/kg。实验结果发现，只有加入阿托品的样品能够检出，而加入佐匹克隆、磺胺二甲嘧啶、克伦特罗的样品无法检出，说明本检测装置对阿托品的特异性较好。
实施例8阿托品胶体金检测装置的保质期实验
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性和50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg加标实验，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阿托品半抗原，其特征在于，其具有式（
Figure 446850DEST_PATH_IMAGE001
）所示的结构：
Figure 912467DEST_PATH_IMAGE002
式
Figure 312355DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种如权利要求1所述的阿托品半抗原的合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：
Figure 240253DEST_PATH_IMAGE003
Figure 774003DEST_PATH_IMAGE004
Figure 969492DEST_PATH_IMAGE005
Figure 71440DEST_PATH_IMAGE006
Figure 250749DEST_PATH_IMAGE007
（1）：去甲托品醇与6-溴-1-己烯在碱的作用下反应得到褐色黏稠油状物，即中间体1；
（2）：在惰性气体氛围下，苯乙酸甲酯与甲酸乙酯在四氯化钛的作用下生成中间体2；
（3）：将中间体1与中间体2用甲苯进行溶解后，在甲醇钠的作用下发生酯交换反应生成中间体3；
（4）：将中间体3与硼氢化钠反应，萃取，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状液体，即中间体4；
（5）：将中间体4在高碘酸钠和三氯化钌下进行回流反应，蒸干得到固态，再分散溶解，过滤后滤液蒸干后过柱纯化得到黑色油状液体，即阿托品半抗原。
3.根据权利要求2所述的阿托品半抗原的合成方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述去甲托品醇、6-溴-1-己烯、碱的物质的量之比为1：（1-1.5）：（1-5）。
4.根据权利要求2或3所述的阿托品半抗原的合成方法，其特征在于，在步骤（2）中，苯乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氯化钛的物质的量之比为1：（3-5）：（3-5）。
5.根据权利要求2所述的阿托品半抗原的合成方法，其特征在于，在步骤（5）中，中间体4、高碘酸钠、三氯化钌的物质的量之比为1:（1.1-3）：（0.3-0.5）。
6.一种阿托品抗原，其特征在于，所述阿托品抗原包含：如权利要求1所述的阿托品半抗原，以及与所述阿托品半抗原偶联的载体蛋白。
7.一种阿托品抗体，其特征在于，所述阿托品抗体为特异性针对权利要求6所述的阿托品抗原的抗体。
8.权利要求1所述的阿托品半抗原或权利要求6所述的阿托品抗原或权利要求7所述的阿托品抗体在免疫学检测中的非治疗目的的应用。
9.一种阿托品的免疫检测装置，其特征在于，所述检测装置含有权利要求6所述的阿托品抗原或权利要求7所述的阿托品抗体。
10.根据权利要求9所述的免疫检测装置，其特征在于，所述检测装置包括试纸条和工作液，其中所述试纸条中的检测线包被有如权利要求6所述的阿托品抗原；所述工作液中包含有胶体金标记的权利要求7所述的阿托品抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113968853B (zh) * 2020-07-22 2022-09-16 中国农业大学 阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN114790203B (zh) * 2022-04-25 2024-04-02 杭州同舟生物技术有限公司 一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1079247A1 (ru) * 1982-02-08 1984-03-15 Институт токсикологии Способ получени эритроцитарного диагностикума дл вы влени специфических антител (его варианты)
US4591573A (en) * 1983-09-23 1986-05-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sensitive radioimmunoassay using antibody to L-hyoscyamine
WO2014102829A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Mylan Laboratories Ltd. Crystalline atropine sulfate
CN107033140A (zh) * 2017-02-20 2017-08-11 杭州百诚医药科技股份有限公司 一种制备异丙托溴铵的新方法
CN109970674A (zh) * 2019-03-26 2019-07-05 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 一种乙螨唑半抗原及其合成方法和应用
CN110441512A (zh) * 2019-07-23 2019-11-12 重庆市食品药品检验检测研究院 一种乙基麦芽酚半抗原以及乙基麦芽酚的胶体金免疫层析检测装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1079247A1 (ru) * 1982-02-08 1984-03-15 Институт токсикологии Способ получени эритроцитарного диагностикума дл вы влени специфических антител (его варианты)
US4591573A (en) * 1983-09-23 1986-05-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sensitive radioimmunoassay using antibody to L-hyoscyamine
WO2014102829A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Mylan Laboratories Ltd. Crystalline atropine sulfate
CN107033140A (zh) * 2017-02-20 2017-08-11 杭州百诚医药科技股份有限公司 一种制备异丙托溴铵的新方法
CN109970674A (zh) * 2019-03-26 2019-07-05 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 一种乙螨唑半抗原及其合成方法和应用
CN110441512A (zh) * 2019-07-23 2019-11-12 重庆市食品药品检验检测研究院 一种乙基麦芽酚半抗原以及乙基麦芽酚的胶体金免疫层析检测装置

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