JPH0454904B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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Description
本発明は、マーカー及び／又はリガンドを含む
カツプリング生成物であるトレーサー及びその製
造方法、並びにこれのトレーサーを用いたアツセ
イ方法に関する。 カツプリング試薬またはスペーサー化合物は、
ある有機物質を他にカツプリングさせるために用
いられる一般に二官能性の化合物である。たとえ
ばイムノアツセイなどのアツセイにおいては、ア
ツセイの成分の一方はリガンドからなるトレーサ
ー；たとえば適切なマーカー（例えば蛍光色素の
ような色原体）にカツプリングした抗原である。
この種のトレーサーを製造する際には、多くの場
合抗原を二官能性のカツプリング剤またはスペー
サーの使用により蛍光色素にカツプリングさせ
る。 同様に固体支持体を用いイムノアツセイにおい
ては、アツセイに用いられる物質（たとえば抗
体）を固体支持体（たとえばポリマー）にカツプ
リングさせる必要があり、ある場合にはこれはカ
ツプリング剤の使用により達成される。 当技術分野においては、ある物質をカツプリン
グ剤またはスペーサー化合物を介して他にカツプ
リングさせるための改良された手段が求められて
いる。 本発明の一観点によれば、カツプリング生成物
であるトレーサーが提供される。 本発明の他の観点によれば、かかるトレーサー
の製造方法が提供される。 本発明の更に他の観点によれば、かかるトレー
サーを用いたアツセイ方法が提供される。 より詳細には、本発明の一観点によれば、下記
の構造式： （式中、Ｚは
カツプリング生成物であるトレーサー及びその製
造方法、並びにこれのトレーサーを用いたアツセ
イ方法に関する。 カツプリング試薬またはスペーサー化合物は、
ある有機物質を他にカツプリングさせるために用
いられる一般に二官能性の化合物である。たとえ
ばイムノアツセイなどのアツセイにおいては、ア
ツセイの成分の一方はリガンドからなるトレーサ
ー；たとえば適切なマーカー（例えば蛍光色素の
ような色原体）にカツプリングした抗原である。
この種のトレーサーを製造する際には、多くの場
合抗原を二官能性のカツプリング剤またはスペー
サーの使用により蛍光色素にカツプリングさせ
る。 同様に固体支持体を用いイムノアツセイにおい
ては、アツセイに用いられる物質（たとえば抗
体）を固体支持体（たとえばポリマー）にカツプ
リングさせる必要があり、ある場合にはこれはカ
ツプリング剤の使用により達成される。 当技術分野においては、ある物質をカツプリン
グ剤またはスペーサー化合物を介して他にカツプ
リングさせるための改良された手段が求められて
いる。 本発明の一観点によれば、カツプリング生成物
であるトレーサーが提供される。 本発明の他の観点によれば、かかるトレーサー
の製造方法が提供される。 本発明の更に他の観点によれば、かかるトレー
サーを用いたアツセイ方法が提供される。 より詳細には、本発明の一観点によれば、下記
の構造式： （式中、Ｚは
【式】
【式】
【式】
【式】及び
【式】
よりなる群から選ばれ；Ｙは２価の芳香族炭化水
素残基であり；及びＲ及びＢの一方は蛍光色素及
び酵素から選ばれる検出可能なマーカーであり、
Ｒ及びＢの他方が抗原、ハプテン及び抗体からな
る群から選ばれるリガンドである）を有するトレ
ーサーが提供される。 また本発明の他の観点によれば、構造式（）
のトレーサーを製造する方法であつて、 下記の構造式： （式中、Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であ
り；Ｒは蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカー又は抗原、ハプテン及び抗体からなる
群から選ばれるリガンドであり；及びＡは−
NO2、−NH2、−COOH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−SH、−
OH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、
素残基であり；及びＲ及びＢの一方は蛍光色素及
び酵素から選ばれる検出可能なマーカーであり、
Ｒ及びＢの他方が抗原、ハプテン及び抗体からな
る群から選ばれるリガンドである）を有するトレ
ーサーが提供される。 また本発明の他の観点によれば、構造式（）
のトレーサーを製造する方法であつて、 下記の構造式： （式中、Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であ
り；Ｒは蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカー又は抗原、ハプテン及び抗体からなる
群から選ばれるリガンドであり；及びＡは−
NO2、−NH2、−COOH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−SH、−
OH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、
【式】
【式】及び
【式】（式中、R″はアルキル基である）
よりなる群から選ばれる）を有する中間体化合物
（）を 次式： Ｂ−Y″ （式中、Y″は水酸基、カルボキシル基、メル
カプト基又はアミノ基であり、Ｂは上記の構造式
（）で与えられる意味を有する）の化合物と反
応させることを特徴とする方法が提供される。 本発明のさらに他の観点によれば、トレーサー
を使用する被分析体のアツセイにおいて、構造式
（）を有するトレーサーを使用することを特徴
とするアツセイ方法が提供される。 本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記
の各構造式においてＹは２価のベンゼン残基であ
る。ただしＹは２価のナフタリン残基または２価
のジフエニル残基でありうるとも解すべきであ
る。 中間体（）は構造式（）： Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−R′ （） （式中R′は−NO2；−COOR″；
（）を 次式： Ｂ−Y″ （式中、Y″は水酸基、カルボキシル基、メル
カプト基又はアミノ基であり、Ｂは上記の構造式
（）で与えられる意味を有する）の化合物と反
応させることを特徴とする方法が提供される。 本発明のさらに他の観点によれば、トレーサー
を使用する被分析体のアツセイにおいて、構造式
（）を有するトレーサーを使用することを特徴
とするアツセイ方法が提供される。 本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記
の各構造式においてＹは２価のベンゼン残基であ
る。ただしＹは２価のナフタリン残基または２価
のジフエニル残基でありうるとも解すべきであ
る。 中間体（）は構造式（）： Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−R′ （） （式中R′は−NO2；−COOR″；
【式】または
【式】であり、
R″およびＹは定義されたものである）
により表わされる化合物から製造できる。
R′は一般にパラ位またはメタ位にあり、好ま
しくはパラ位にあり、R′は最も好ましくは−
NO2である。 化合物においてR′がNO2である場合、化合
物2をまずイツシアネート基と反応基である活性
水素置換基を有するマーカーまたはリガンドとカ
ツプリングさせて、Ａ−NO2である式の化合
物を製造する。次いでこの−NO2基を選択的に
還元してアミノ基となし（硫化された水素化ホウ
素ナトリウムの使用）、他のマーカーまたはリガ
ンドにカツプリングさせるための反応性基を与え
ることができる。あるいはアミノ基をイソシアネ
ート基（ホスゲンとの反応）またはイソシアネー
ト基（チオホスゲンとの反応）に変えることがで
きる。これのいずれも中間体１をマーカーまたは
リガンドにカツプリングさせるための反応性を有
する。 化合物においてR′が−COOR″、
しくはパラ位にあり、R′は最も好ましくは−
NO2である。 化合物においてR′がNO2である場合、化合
物2をまずイツシアネート基と反応基である活性
水素置換基を有するマーカーまたはリガンドとカ
ツプリングさせて、Ａ−NO2である式の化合
物を製造する。次いでこの−NO2基を選択的に
還元してアミノ基となし（硫化された水素化ホウ
素ナトリウムの使用）、他のマーカーまたはリガ
ンドにカツプリングさせるための反応性基を与え
ることができる。あるいはアミノ基をイソシアネ
ート基（ホスゲンとの反応）またはイソシアネー
ト基（チオホスゲンとの反応）に変えることがで
きる。これのいずれも中間体１をマーカーまたは
リガンドにカツプリングさせるための反応性を有
する。 化合物においてR′が−COOR″、
【式】
または
【式】である場合、化合物をイ
ソシアネート置換基を介してマーカーまたはリガ
ンドにカツプリングさせたのち、置換基R′を加
水分解して置換基Ａ（それぞれ−COOH、−SHま
たは−OHであり、これらはそれぞれ中間体を
マーカーまたはリガンドにカツプリングさせるた
めの反応性を有する）にすることができる。 従つて明らかなとおり、化合物はこれがその
イソシアネート基を介してカツプリングすべきマ
ーカーまたはリガンドの活性水素置換基と反応性
でない置換基R′を含むべく選ばれる。次いで
R′を、中間体がそれとカツプリングして構造
式を有するトレーサーを形成するマーカーまた
はリガンドの活性水素置換基と反応性である置換
基Ａに変える。 構造式で表わされる化合物は、構造式で表
わされるトレーサーの製造に用いることができ
る。構造式で表わされる化合物を使用する際に
は、Ａで表わされる置換基は構造式により表わ
される化合物をカツプリングさせるべき化合物の
活性水素置換基と反応しうるものである。たとえ
ばＡがアミノ基である場合、化合物を当技術分
野で一般に知られている方法により、カルボキシ
ル置換基を有するマーカーまたはリガンドとカツ
プリングさせることができる。同様にＡがカルボ
キシル基である場合、化合物を当技術分野で知
られている方法により、アミノ置換基またはイソ
シアネート基置換基を有する有機化合物とカツプ
リングさせることができる。Ａがイソシアネート
基である場合、化合物を活性水素置換基（メル
カプト（チオール）基、水酸基、カルボキシル基
またはアミノ基である）を有するマーカーまたは
リガンドにカツプリングさせることができる。Ａ
がチオール基または水酸基である場合、化合物
を活性水素置換基（イソシアネート）を有するマ
ーカーまたはリガンドにカツプリングさせること
ができる。Ａがイソチオシアネート基である場
合、化合物を、アミノ置換基を有するマーカー
またはリガンドとカツプリングさせることができ
る。この種のカツプリングをこの種の官能基を介
して行う方法は、当技術分野で一般に知られてい
る。 カツプリング剤は多種多様な有機物質を互い
にカツプリングさせるために使用できる。たとえ
ばトレーサーが検出可能なマーカー；たとえばリ
ガンド（ここで用いられる“リガンド”という語
はハプテン、抗原または抗体を意味する）にカツ
プリングして放射性マーカー、色原体、酵素など
からなるアツセイに使用すべきトレーサーの製造
にカツプリング化合物を用いることができる。
この種の実施態様においてマーカーまたはリガン
ドの一方には、イソシアネート基と反応しうる置
換基が含まれ、カツプリング剤の置換基R′は
そのリガンドまたはマーカーの置換基と非反応性
である。カツプリング剤をリガンドまたはマー
カーとカツプリングさせたのち、置換基Ａが、最
初にカツプリングして中間体を生成したリガン
ドまたはマーカー上にある活性水素置換基と非反
応性である中間化合物が製造される。次いで中
間化合物をマーカーまたはリガンドの他方とカ
ツプリングさせる。中間体の置換基Ａがリガン
ドまたはマーカーの他方にある活性水素置換基と
反応性でない場合は、置換基Ａを先に定義したよ
うにリガンドまたはマーカーの他方にある活性水
素置換基と反応性である置換基に選択的に変換す
る。次いでこの中間体をリガンドまたはマーカ
ーの他方とカツプリングさせて構造式を有する
トレーサーを製造する。 構造式のトレーサーにおいては、ＲおよびＢ
の一方のマーカー、たとえば色原体、放射性置換
基を含む有機化合物または酵素であり、Ｒおよび
Ｂの他方がリガンドである。たとえば蛍光トレー
サーを製造する際にはＲおよびＢの一方がイソシ
アネート基または構造式中のＡにより表わされ
る反応性官能基の一つにカツプリングしうる置換
基を有する蛍光色素から誘導され、ＲおよびＢの
他方がイソシアネート基または構造式において
Ａで表わされる反応性置換基の他方にカツプリン
グしうる置換基を有するリガンドから誘導され
る。この種のトレーサーを導入する際には、リガ
ンドまたは蛍光色素をまずカツプリング試薬の
イソシアネート官能基にカツプリングさせる。 本発明者らは、式で表わされるカツプリング
剤を使用することは、カツプリング剤が堅牢であ
り、このため蛍光マーカーがリガンド上に“折
り”返ることがなく、従つてリガンドにより蛍光
化合物が消光される可能性が最小限に抑えられる
点で、蛍光トレーサーの製造に特に有利であるこ
とを見出した。 適切な色原体の代表例として、以下のものが挙
げられる。アクリジン色素、アズレ（azure）色
素、キノン色素、ナイルブルー色素、クレジルバ
イオレツト、フルオレセイン類、ローダミン類、
クマリン類、アミノナフタリン誘導体（ダンシル
化合物）、カルボシアニン類、インドール類、ラ
ンタニドキレート類など。 たとえばT4トレーサーは、まずｐ−ニトロフ
エニルイソシアネートをT4のカルボキシ部分が
適宜ブロツクされたチロキシン（T4）にカツプ
リングさせることによ製造できる。ニトロ基を還
元してアミノ基（化合物、Ｒはブロツクされた
T4残基であり、Ｙはベンゼン残基、Ａはアミノ
基である）となし、化合物のアミノ部分をたと
えばイソシアネート基を含む蛍光色素（特にフル
オレセインイソチオシアネート）にカツプリング
させることができる。 あるいは化合物のアミノ基をチオホスゲンと
の反応によイソシアネート基に変え（化合物に
おいてＡがイソシアネート基）、次いで化合物
をアミノ基含有蛍光色素（特にフルオレセインア
ミン）と反応させることができる。 同様にジゴキシントレーサーは、ジゴキシンを
ｐ−ニトロフエニルイソシアネートとカツプリン
グさせたのちニトロ基を還元してアミノ基とな
し、そして蛍光色素、たとえばフルオレセインイ
ソチオシアネートと反応させることにより製造で
きる。 本発明は前記のように蛍光トレーサーの製造に
特に用いられるが、本発明は他のトレーサー、た
とえば放射性トレーサー、酵素トレーサーなどの
製造にも用いられる。放射性トレーサーを製造す
るための適切な放射性マーカーの代表例として
は、以下のものが挙げられる：ヒドロキシフエニ
ル置換されたアミンまたはアミノ酸。これらにお
いてフエニル基には放射性置換基１個または２個
以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ
素化されたチロシンまたはチラミン；イミダゾー
ル基が放射性置換基１個または２個以上により置
換されたイミダゾール置換アミノ酸またはアミン
等。 適切な酵素マーカーの代表例としては以下のも
のが挙げられる：パーオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グル
コアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ルオキシダーゼ、アシドホスフアターゼなど。 当技術分野で知られるように、固体支持体はポ
リマーであつてもよい。ただしそのようなポリマ
ーにはイソシアネート官能基または中間体のＡ
により表わされ反応性置換基の１つと反応しうる
置換基が含まれる必要がある。たとえばポリアク
リルアミド、ポリ（アミノスチレン）など。 本発明により製造されるトレーサーおよび支持
体上のリガンドは、当技術分野で一般に知られて
いる型の多種多様な被分析体（“被分析体
（analyte）”という語はハプテン、抗原または抗
体を表わす）のアツセイに使用できる。たとえば
本発明は治療薬およびいわゆる“麻薬（drugs of
abuse）”を含む薬剤；ステロイド、ビタミン、
糖、アミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、各種ホル
モン、抗生物質、ウイルスなどのアツセイに使用
できる。 本発明により製造されるトレーサーおよび支持
体上のリガンドはイムノアツセイ（“イムノアツ
セイ”という語は総称的に用いられ、抗原または
抗体の代わりに天然の結合剤を使用し、時に競合
蛋白質結合アツセイと呼ばれるアツセイを含む）
に使用でき、当技術分野で知られるようにアツセ
イの成分の一つは結合剤である。被分析体がハプ
テンまたは抗原である場合、結合剤は抗体、また
は被分析体に特異的な結合部位１個または２個以
上をもつ天然物質であり、被分析体が抗体である
場合、結合剤は抗体に対する抗原または被分析体
に呼応して誘発された抗体であろう。適切な結合
剤の選択は当業者がなしうる範囲内にあると考え
られ、本発明を十分に理解するためにこの点に関
してこれ以上詳述する必要はないと思われる。 アツセイに際して、アツセイに用いられるトレ
ーサーのリガンド部分は採用されるアツセイの型
により定められる。たとえばアツセイが抗原また
はハプテンである被分析体に関するものである場
合、トレーサーのリガンド部分はアツセイすべき
抗原もしくはハプテンまたはそれらの適宜な同族
体である（“適宜な同族体”という語はアツセイ
に用いられる結合剤に結合した被分析体の同族体
を意味する）。あるいはトレーサーのリガンド部
分がアツセイすべきハプテンまたは抗原に対する
結合剤であつてもよく、この場合アツセイはトレ
ーサーがそのトレーサーに特異的な結合部位に結
合するのを被分析体が阻止するように工夫され
る。 被分析体が抗体である場合、トレーサーのリガ
ンド部分は抗体またはその適宜な同族体であり、
この場合抗体およびトレーサーの双方の被分析抗
体およびトレーサーの双方に対して特異的な限ら
れた数の結合部位に関して競合するであろう。あ
るいはトレーサーのリガンド部分は、被分析抗体
に対する抗原または被分析抗体に呼応して誘発さ
れた抗体であつてもよい。この場合、被分析抗体
はトレーサーがそのトレーサーに対し特異的な結
合部位に結合するのを阻止する。 被分析体をいわゆる“サンドイツチ型”のアツ
セイにより決定する場合には、トレーサーのリガ
ンド部分が被分析体に特異的な結合部位をもち、
被分析体は複数の決定部位をもつ。 トレーサーのリガンド部分として用いられる適
切なリガンドの選択は本明細書の教示から当業者
がなしうる範囲のものと考えられ、従つて本発明
を十分に理解するためにこの点に関してこれ以上
詳述する必要はないと思われる。 従つて上記の記述から明らかなように、構造式
を有するトレーサーは多種多様なマーカーまた
はリガンドから製造でき、構造式においてＲに
より表わされる有機残基はあるマーカーまたはリ
ガンドから誘導され、構造式を有するトレーサ
ーにおいてＢにより表わされる有機残基は他のマ
ーカーまたはリガンドから誘導される。ただし各
マーカーまたはリガンドはカツプリング剤中の
適宜な置換基（イソシアネート）または構造式
においてＡにより表わされる適宜な反応性置換基
と反応するための適宜な活性水素置換基を含む。
たとえば構造式を有するトレーサーにおいてＲ
はイソシアネート基と反応しうる活性水素置換基
を含むマーカーまたはリガンドから誘導される有
機残基であつてもよく、マーカーは放射性置換さ
れた有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素ま
たは酵素であつてもよく、リガンドは特に非蛋白
性抗原もしくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、
または治療薬（特に医薬）にあつてもよい。同様
にＢは中間体においてＡにより表わされる反応
性置換基の１つと反応しうる活性水素置換基を含
むマーカーまたはリガンドから誘導される有機残
基であつてもよい。たとえばＢは蛋白質、抗体、
ハプテン、抗原、色原体（色素、好ましくは蛍光
色素）、酵素、放射性置換基を有する有機化合物、
ポリマーなどのマーカーまたはリガンドから誘導
される有機残基であつてもよい。 本発明を以下の実施例に関連してさらに記述す
るが、これにより本発明の範囲が限定されるべき
ではない。 実施例 １ 塩化トリメチルシリル（TMS−Cl）2.1ミリモ
ルをT41ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加し
た。反応は約２時間を要し、ほぼ定量的であつ
た。反応後、ｐ−ニトロフエニルイソシアネート
1.1モルを反応混合物に注入添加し、混合物を磁
気攪拌棒を用いて約48時間攪伴し、少量の試料を
約４時間毎にTLC（薄層クロマトグラフイー）に
よる分析のため取出した。48時間後に生成物を未
反応イソシアネートの除去のためメタノールで十
分に洗浄し、次いでTLCもしくは高圧液体クロ
マトグラフイー（HPLC）によりまたはカラムク
ロマトグルフイーにより生成物を分離した。得ら
れた生成物はT4のカルボキシル官能基がトリメ
チルシラン（TMS）でブロツクされたパラーニ
トロフエニルイソシアナト−T4であつた。 上記の反応は常温常圧（STP）で行われた。 硫化された水素化ホウ素ナトリウム0.55ミリモ
ル（使用したT4の濃度に対して過剰量を生成物
0.5ミリモルに室内の温度および圧力で添加する
ことによりニトロ基を還元した。反応は約３〜４
時間混合して完了し、IRによりニトロからアミ
ンへの変換を監視することにより行われた。得ら
れた生成物はパラ−アミノフエニルイソシアナト
−T4であつた。 上記生成物に１モル当量のイソチオシアナト−
フルオレセインを添加したのち約48〜72時間攪拌
し、TLCまたはHPLCにより監視した。フルオ
レセイン色素をT4カツプリングした中間体にカ
ツプリングさせたのちブロツク剤TMSを水性条
件下で除去した。 得られた生成物はフルオレセインイソチオシア
ネートが堅牢なカツプリング剤を介してT4にカ
ツプリングした蛍光トレーサーであり、このトレ
ーサーはT4はアツセイに使用できる。 実施例 ２ ジゴキシン蛍光トレーサーの製造 100ml容の丸底フラスコにジゴキシン１ミリモ
ルおよび攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、
ガス抜き針を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で
５分間ページした。長い18ゲージのステンレス鋼
製の針を備えた50mlのガラス製注射器に新たに蒸
留したピリジン30mlを取り、ゴム膜を介して丸底
フラスコに最初は徐々に注入し、15〜20mlが注入
されたのち攪拌を加えた。残りの10〜15mlは丸底
フラスコの側面を洗い落としてジゴキシンを溶解
するのに使用した。再びガス抜き針を用いて容器
を窒素で約５分間パージした。ジゴキシンがすべ
て溶解して完全な溶液になるまで攪拌混合を続け
た。 別個の容器（好ましくは閉じた丸底フラスコ）
にパラーニトロフエニルイソシアネート1.1ミリ
モル（あらかじめ乾燥したもの）をとり、ピリジ
ン15mlを注入により添加し、前記のように閉鎖容
器を窒素で混和パージし、すべての物質が溶液と
なつた時点で注射により取出し、攪拌を続けなが
ら徐々にジゴキシンを入れた100ml容丸底フラス
コに添加した。 注釈：１） 作業はすべて防護フードで行うベき
である。 ２） パラ−ニトロフエニルイソシアネートは使
用前に常にIRで検査すべきである。貯蔵期間
および露光によりこのイソシアネートが著しく
影響を受ける可能性がある。ロツト毎にイソシ
アネートの存在を調べるべきである。 TLC用試料は注射器により取出すべきであり
TLCによる監視はパラ−ニトロフエニルイソシ
アネートを添加した２時間後に開始すべきであ
る。第１日目については２〜４時間毎にスポツト
を検査し、一夜置いた場合はTLCをまず朝一番
に行うべきである。 反応は終了するまで約72時間かかつた。（48時
間後に主生成物は実質的に形成されていたが−75
％終了）。これよりも長時間置くと目的生成物の
増加は認められるが、これは付加的な副生物が匹
敵するかまたはより大きな割合で生じるという犠
牲においてなされる。能な限り最良の結果が得ら
れたことを確認するため、目的生成物の精製（お
よび単離）をここで行うべきである。 この生成物の精製は調製用TLCにより行われ、
１日で行うことができるが、プレートに過剰負荷
しないようにしなければならない。さもなければ
バンドが重複するおそれがある。シリカゲルから
メタノール：クロムホルムを用いて抽出する際、
溶液を0.22μのフイルターを介して回転蒸発用の
丸底フラスコ中へ過するとよい。過はジゴキ
シンに対するイソシアネート（結合）形成を破壊
する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去する
ために重要である。（シリカゲル−メタノール：
クロロホルムを過の前に遠心分離することによ
り大部分の粒子を除去することができ、過工程
が促進される。） この時点で生成物およびその相対濃度を確認す
る最も迅速な試験はジゴキシンに対するRIAによ
るものである。過した生成物を回転蒸発させ
（×４）、生成物を少量のメタノールに取り入れる
ことにより希釈剤を調製し、置換ジゴキシンの免
疫反応性につき容易に試験された。これが確認さ
れ、相対純度が求められると（TLCによる）、次
の工程はニトロを硫化した水素化ホウ素ナトリウ
ムの使用によりアミンに還元することであつた。 生成物はＹがベンゼン残基、ＡががNO2、Ｒ
が15′−ジゴキシン残基である化合物であつた。 操作を続行する前に、カツプリングしたジゴキ
シンを回転蒸発により乾燥させ、反応器にパラ−
ニトロフエニルイソシアナト−ジゴキシンを入れ
る前にテトラヒドロフラン（THF）で１回洗浄
すべきである。 NaBH2S3との反応はジオキサンまたはTHF中
で行うことができるが、置換されたジゴキシンの
溶解性の点でTHFが好ましい。窒素雰囲気を維
持することは決定的ではないが、前記のように
NaBH2S3を添加する前に容器をパージすべきで
ある。 100ml容の丸底フラスコに上記ジゴキシン（置
換パラ−ニトロフエニルイソシアナト−ジゴキシ
ン）および攪拌棒を一定容積のTHFに入れた
（この場合もTHFの容積を最小限にすべきであ
る）。ガス抜き針を用いてゴム膜を介して５分間
窒素でパージした。 別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥さ
せたNaBH2S3を入れ、THF20mlを添加し、完全
に溶解させ、ゴム膜を介して窒素でパージした。 50mlのガラス製注射器を用いて溶液を取出し、
連続的に攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加し
た。反応速度はIRにより追跡することができ
（NO2→NH2への変換）、反応はジゴキシンの濃
度に応じてわずか数時間後に終了すべきである。
進行速度を増すために熱を用いることもできる
が、わずか37℃までであり、きわめて綿密に監視
すべきである。25℃（室温）では反応はこれより
も若干緩慢に進行するが、より制御しやすい。 この生成物はシリカゲルTLC（調製用）または
シリカゲルカラムにより単離および精製し、メタ
ノールで十分に洗浄し、過し、保存のため乾燥
させておくことができる。あるいは後続の反応に
はニトロ基は全く関与しないと思われるので、こ
れをそれ以上精製することなくそのまま使用し、
後続の最終精製をこれらの生成物の精製に利用す
ることもできる。 ジゴキシンの相対濃度が確認されること（この
場合もRIAにより）、後続のパラ−アミノフエニ
ルイソシアナト−ジゴキシンとの反応は、たとえ
ばフルオレセインイソチオシアネートの使用によ
り直接行うことができる。 置換ジゴキシン100μモルを清浄な乾燥した25
ml容丸底フラスコに入れ、攪拌棒を入れた。注射
器によりピリジン10mlを添加し、ゴム膜で閉じ前
記のように窒素でパージし、生成物が完全に溶解
するまで攪拌した。 第２の丸底フラスコにフルオレセインイソチオ
シアネート100μモルを添加し、ピリジン10〜15
mlに溶解した。ゴム膜で閉じ、N2でパージし、
ガラス製注射器で取出し、連続的に混合しながら
ジゴキシンに徐々に添加した。（フルオレセイン
イソチオシアネートの性質のためこれは丸底フラ
スコおよび注射器に付着するので、必ずしもすべ
ての物質が移されるわけではないであろう。しか
し必要ならばのちに上記と同じ方法で追加するこ
とができる。） この反応は終了するのに約72時間かかるであろ
う。これは分析用TLCを採用すると新たな蛍光
種が出現することにより監視できる。 生成物の精製はその後の分析作業前に行わなけ
ればならない。RIA、および蛍光を検出するよう
に提案された他の試験法はいずれも最終生成物の
免疫反応性を証明するであろう。 最終生成物が単離されると、これをメタノール
で十分に洗浄し、数回過し（0.22μ）、乾燥剤に
より乾燥させ、−30℃で乾燥剤下に保存した（冷
凍）。 得られた生成物はＲが15′−ジゴキシン残基、
Ｚが
ンドにカツプリングさせたのち、置換基R′を加
水分解して置換基Ａ（それぞれ−COOH、−SHま
たは−OHであり、これらはそれぞれ中間体を
マーカーまたはリガンドにカツプリングさせるた
めの反応性を有する）にすることができる。 従つて明らかなとおり、化合物はこれがその
イソシアネート基を介してカツプリングすべきマ
ーカーまたはリガンドの活性水素置換基と反応性
でない置換基R′を含むべく選ばれる。次いで
R′を、中間体がそれとカツプリングして構造
式を有するトレーサーを形成するマーカーまた
はリガンドの活性水素置換基と反応性である置換
基Ａに変える。 構造式で表わされる化合物は、構造式で表
わされるトレーサーの製造に用いることができ
る。構造式で表わされる化合物を使用する際に
は、Ａで表わされる置換基は構造式により表わ
される化合物をカツプリングさせるべき化合物の
活性水素置換基と反応しうるものである。たとえ
ばＡがアミノ基である場合、化合物を当技術分
野で一般に知られている方法により、カルボキシ
ル置換基を有するマーカーまたはリガンドとカツ
プリングさせることができる。同様にＡがカルボ
キシル基である場合、化合物を当技術分野で知
られている方法により、アミノ置換基またはイソ
シアネート基置換基を有する有機化合物とカツプ
リングさせることができる。Ａがイソシアネート
基である場合、化合物を活性水素置換基（メル
カプト（チオール）基、水酸基、カルボキシル基
またはアミノ基である）を有するマーカーまたは
リガンドにカツプリングさせることができる。Ａ
がチオール基または水酸基である場合、化合物
を活性水素置換基（イソシアネート）を有するマ
ーカーまたはリガンドにカツプリングさせること
ができる。Ａがイソチオシアネート基である場
合、化合物を、アミノ置換基を有するマーカー
またはリガンドとカツプリングさせることができ
る。この種のカツプリングをこの種の官能基を介
して行う方法は、当技術分野で一般に知られてい
る。 カツプリング剤は多種多様な有機物質を互い
にカツプリングさせるために使用できる。たとえ
ばトレーサーが検出可能なマーカー；たとえばリ
ガンド（ここで用いられる“リガンド”という語
はハプテン、抗原または抗体を意味する）にカツ
プリングして放射性マーカー、色原体、酵素など
からなるアツセイに使用すべきトレーサーの製造
にカツプリング化合物を用いることができる。
この種の実施態様においてマーカーまたはリガン
ドの一方には、イソシアネート基と反応しうる置
換基が含まれ、カツプリング剤の置換基R′は
そのリガンドまたはマーカーの置換基と非反応性
である。カツプリング剤をリガンドまたはマー
カーとカツプリングさせたのち、置換基Ａが、最
初にカツプリングして中間体を生成したリガン
ドまたはマーカー上にある活性水素置換基と非反
応性である中間化合物が製造される。次いで中
間化合物をマーカーまたはリガンドの他方とカ
ツプリングさせる。中間体の置換基Ａがリガン
ドまたはマーカーの他方にある活性水素置換基と
反応性でない場合は、置換基Ａを先に定義したよ
うにリガンドまたはマーカーの他方にある活性水
素置換基と反応性である置換基に選択的に変換す
る。次いでこの中間体をリガンドまたはマーカ
ーの他方とカツプリングさせて構造式を有する
トレーサーを製造する。 構造式のトレーサーにおいては、ＲおよびＢ
の一方のマーカー、たとえば色原体、放射性置換
基を含む有機化合物または酵素であり、Ｒおよび
Ｂの他方がリガンドである。たとえば蛍光トレー
サーを製造する際にはＲおよびＢの一方がイソシ
アネート基または構造式中のＡにより表わされ
る反応性官能基の一つにカツプリングしうる置換
基を有する蛍光色素から誘導され、ＲおよびＢの
他方がイソシアネート基または構造式において
Ａで表わされる反応性置換基の他方にカツプリン
グしうる置換基を有するリガンドから誘導され
る。この種のトレーサーを導入する際には、リガ
ンドまたは蛍光色素をまずカツプリング試薬の
イソシアネート官能基にカツプリングさせる。 本発明者らは、式で表わされるカツプリング
剤を使用することは、カツプリング剤が堅牢であ
り、このため蛍光マーカーがリガンド上に“折
り”返ることがなく、従つてリガンドにより蛍光
化合物が消光される可能性が最小限に抑えられる
点で、蛍光トレーサーの製造に特に有利であるこ
とを見出した。 適切な色原体の代表例として、以下のものが挙
げられる。アクリジン色素、アズレ（azure）色
素、キノン色素、ナイルブルー色素、クレジルバ
イオレツト、フルオレセイン類、ローダミン類、
クマリン類、アミノナフタリン誘導体（ダンシル
化合物）、カルボシアニン類、インドール類、ラ
ンタニドキレート類など。 たとえばT4トレーサーは、まずｐ−ニトロフ
エニルイソシアネートをT4のカルボキシ部分が
適宜ブロツクされたチロキシン（T4）にカツプ
リングさせることによ製造できる。ニトロ基を還
元してアミノ基（化合物、Ｒはブロツクされた
T4残基であり、Ｙはベンゼン残基、Ａはアミノ
基である）となし、化合物のアミノ部分をたと
えばイソシアネート基を含む蛍光色素（特にフル
オレセインイソチオシアネート）にカツプリング
させることができる。 あるいは化合物のアミノ基をチオホスゲンと
の反応によイソシアネート基に変え（化合物に
おいてＡがイソシアネート基）、次いで化合物
をアミノ基含有蛍光色素（特にフルオレセインア
ミン）と反応させることができる。 同様にジゴキシントレーサーは、ジゴキシンを
ｐ−ニトロフエニルイソシアネートとカツプリン
グさせたのちニトロ基を還元してアミノ基とな
し、そして蛍光色素、たとえばフルオレセインイ
ソチオシアネートと反応させることにより製造で
きる。 本発明は前記のように蛍光トレーサーの製造に
特に用いられるが、本発明は他のトレーサー、た
とえば放射性トレーサー、酵素トレーサーなどの
製造にも用いられる。放射性トレーサーを製造す
るための適切な放射性マーカーの代表例として
は、以下のものが挙げられる：ヒドロキシフエニ
ル置換されたアミンまたはアミノ酸。これらにお
いてフエニル基には放射性置換基１個または２個
以上が含まれていてもよい。たとえば放射性ヨウ
素化されたチロシンまたはチラミン；イミダゾー
ル基が放射性置換基１個または２個以上により置
換されたイミダゾール置換アミノ酸またはアミン
等。 適切な酵素マーカーの代表例としては以下のも
のが挙げられる：パーオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グル
コアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ルオキシダーゼ、アシドホスフアターゼなど。 当技術分野で知られるように、固体支持体はポ
リマーであつてもよい。ただしそのようなポリマ
ーにはイソシアネート官能基または中間体のＡ
により表わされ反応性置換基の１つと反応しうる
置換基が含まれる必要がある。たとえばポリアク
リルアミド、ポリ（アミノスチレン）など。 本発明により製造されるトレーサーおよび支持
体上のリガンドは、当技術分野で一般に知られて
いる型の多種多様な被分析体（“被分析体
（analyte）”という語はハプテン、抗原または抗
体を表わす）のアツセイに使用できる。たとえば
本発明は治療薬およびいわゆる“麻薬（drugs of
abuse）”を含む薬剤；ステロイド、ビタミン、
糖、アミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、各種ホル
モン、抗生物質、ウイルスなどのアツセイに使用
できる。 本発明により製造されるトレーサーおよび支持
体上のリガンドはイムノアツセイ（“イムノアツ
セイ”という語は総称的に用いられ、抗原または
抗体の代わりに天然の結合剤を使用し、時に競合
蛋白質結合アツセイと呼ばれるアツセイを含む）
に使用でき、当技術分野で知られるようにアツセ
イの成分の一つは結合剤である。被分析体がハプ
テンまたは抗原である場合、結合剤は抗体、また
は被分析体に特異的な結合部位１個または２個以
上をもつ天然物質であり、被分析体が抗体である
場合、結合剤は抗体に対する抗原または被分析体
に呼応して誘発された抗体であろう。適切な結合
剤の選択は当業者がなしうる範囲内にあると考え
られ、本発明を十分に理解するためにこの点に関
してこれ以上詳述する必要はないと思われる。 アツセイに際して、アツセイに用いられるトレ
ーサーのリガンド部分は採用されるアツセイの型
により定められる。たとえばアツセイが抗原また
はハプテンである被分析体に関するものである場
合、トレーサーのリガンド部分はアツセイすべき
抗原もしくはハプテンまたはそれらの適宜な同族
体である（“適宜な同族体”という語はアツセイ
に用いられる結合剤に結合した被分析体の同族体
を意味する）。あるいはトレーサーのリガンド部
分がアツセイすべきハプテンまたは抗原に対する
結合剤であつてもよく、この場合アツセイはトレ
ーサーがそのトレーサーに特異的な結合部位に結
合するのを被分析体が阻止するように工夫され
る。 被分析体が抗体である場合、トレーサーのリガ
ンド部分は抗体またはその適宜な同族体であり、
この場合抗体およびトレーサーの双方の被分析抗
体およびトレーサーの双方に対して特異的な限ら
れた数の結合部位に関して競合するであろう。あ
るいはトレーサーのリガンド部分は、被分析抗体
に対する抗原または被分析抗体に呼応して誘発さ
れた抗体であつてもよい。この場合、被分析抗体
はトレーサーがそのトレーサーに対し特異的な結
合部位に結合するのを阻止する。 被分析体をいわゆる“サンドイツチ型”のアツ
セイにより決定する場合には、トレーサーのリガ
ンド部分が被分析体に特異的な結合部位をもち、
被分析体は複数の決定部位をもつ。 トレーサーのリガンド部分として用いられる適
切なリガンドの選択は本明細書の教示から当業者
がなしうる範囲のものと考えられ、従つて本発明
を十分に理解するためにこの点に関してこれ以上
詳述する必要はないと思われる。 従つて上記の記述から明らかなように、構造式
を有するトレーサーは多種多様なマーカーまた
はリガンドから製造でき、構造式においてＲに
より表わされる有機残基はあるマーカーまたはリ
ガンドから誘導され、構造式を有するトレーサ
ーにおいてＢにより表わされる有機残基は他のマ
ーカーまたはリガンドから誘導される。ただし各
マーカーまたはリガンドはカツプリング剤中の
適宜な置換基（イソシアネート）または構造式
においてＡにより表わされる適宜な反応性置換基
と反応するための適宜な活性水素置換基を含む。
たとえば構造式を有するトレーサーにおいてＲ
はイソシアネート基と反応しうる活性水素置換基
を含むマーカーまたはリガンドから誘導される有
機残基であつてもよく、マーカーは放射性置換さ
れた有機化合物、色原体、好ましくは蛍光色素ま
たは酵素であつてもよく、リガンドは特に非蛋白
性抗原もしくは非蛋白性ハプテン、固体支持体、
または治療薬（特に医薬）にあつてもよい。同様
にＢは中間体においてＡにより表わされる反応
性置換基の１つと反応しうる活性水素置換基を含
むマーカーまたはリガンドから誘導される有機残
基であつてもよい。たとえばＢは蛋白質、抗体、
ハプテン、抗原、色原体（色素、好ましくは蛍光
色素）、酵素、放射性置換基を有する有機化合物、
ポリマーなどのマーカーまたはリガンドから誘導
される有機残基であつてもよい。 本発明を以下の実施例に関連してさらに記述す
るが、これにより本発明の範囲が限定されるべき
ではない。 実施例 １ 塩化トリメチルシリル（TMS−Cl）2.1ミリモ
ルをT41ミリモルおよび再蒸留ピリジンに添加し
た。反応は約２時間を要し、ほぼ定量的であつ
た。反応後、ｐ−ニトロフエニルイソシアネート
1.1モルを反応混合物に注入添加し、混合物を磁
気攪拌棒を用いて約48時間攪伴し、少量の試料を
約４時間毎にTLC（薄層クロマトグラフイー）に
よる分析のため取出した。48時間後に生成物を未
反応イソシアネートの除去のためメタノールで十
分に洗浄し、次いでTLCもしくは高圧液体クロ
マトグラフイー（HPLC）によりまたはカラムク
ロマトグルフイーにより生成物を分離した。得ら
れた生成物はT4のカルボキシル官能基がトリメ
チルシラン（TMS）でブロツクされたパラーニ
トロフエニルイソシアナト−T4であつた。 上記の反応は常温常圧（STP）で行われた。 硫化された水素化ホウ素ナトリウム0.55ミリモ
ル（使用したT4の濃度に対して過剰量を生成物
0.5ミリモルに室内の温度および圧力で添加する
ことによりニトロ基を還元した。反応は約３〜４
時間混合して完了し、IRによりニトロからアミ
ンへの変換を監視することにより行われた。得ら
れた生成物はパラ−アミノフエニルイソシアナト
−T4であつた。 上記生成物に１モル当量のイソチオシアナト−
フルオレセインを添加したのち約48〜72時間攪拌
し、TLCまたはHPLCにより監視した。フルオ
レセイン色素をT4カツプリングした中間体にカ
ツプリングさせたのちブロツク剤TMSを水性条
件下で除去した。 得られた生成物はフルオレセインイソチオシア
ネートが堅牢なカツプリング剤を介してT4にカ
ツプリングした蛍光トレーサーであり、このトレ
ーサーはT4はアツセイに使用できる。 実施例 ２ ジゴキシン蛍光トレーサーの製造 100ml容の丸底フラスコにジゴキシン１ミリモ
ルおよび攪拌棒を入れた。開口にゴム膜をはり、
ガス抜き針を用いて徐々に丸底フラスコを窒素で
５分間ページした。長い18ゲージのステンレス鋼
製の針を備えた50mlのガラス製注射器に新たに蒸
留したピリジン30mlを取り、ゴム膜を介して丸底
フラスコに最初は徐々に注入し、15〜20mlが注入
されたのち攪拌を加えた。残りの10〜15mlは丸底
フラスコの側面を洗い落としてジゴキシンを溶解
するのに使用した。再びガス抜き針を用いて容器
を窒素で約５分間パージした。ジゴキシンがすべ
て溶解して完全な溶液になるまで攪拌混合を続け
た。 別個の容器（好ましくは閉じた丸底フラスコ）
にパラーニトロフエニルイソシアネート1.1ミリ
モル（あらかじめ乾燥したもの）をとり、ピリジ
ン15mlを注入により添加し、前記のように閉鎖容
器を窒素で混和パージし、すべての物質が溶液と
なつた時点で注射により取出し、攪拌を続けなが
ら徐々にジゴキシンを入れた100ml容丸底フラス
コに添加した。 注釈：１） 作業はすべて防護フードで行うベき
である。 ２） パラ−ニトロフエニルイソシアネートは使
用前に常にIRで検査すべきである。貯蔵期間
および露光によりこのイソシアネートが著しく
影響を受ける可能性がある。ロツト毎にイソシ
アネートの存在を調べるべきである。 TLC用試料は注射器により取出すべきであり
TLCによる監視はパラ−ニトロフエニルイソシ
アネートを添加した２時間後に開始すべきであ
る。第１日目については２〜４時間毎にスポツト
を検査し、一夜置いた場合はTLCをまず朝一番
に行うべきである。 反応は終了するまで約72時間かかつた。（48時
間後に主生成物は実質的に形成されていたが−75
％終了）。これよりも長時間置くと目的生成物の
増加は認められるが、これは付加的な副生物が匹
敵するかまたはより大きな割合で生じるという犠
牲においてなされる。能な限り最良の結果が得ら
れたことを確認するため、目的生成物の精製（お
よび単離）をここで行うべきである。 この生成物の精製は調製用TLCにより行われ、
１日で行うことができるが、プレートに過剰負荷
しないようにしなければならない。さもなければ
バンドが重複するおそれがある。シリカゲルから
メタノール：クロムホルムを用いて抽出する際、
溶液を0.22μのフイルターを介して回転蒸発用の
丸底フラスコ中へ過するとよい。過はジゴキ
シンに対するイソシアネート（結合）形成を破壊
する可能性がある痕跡量のシリカゲルを除去する
ために重要である。（シリカゲル−メタノール：
クロロホルムを過の前に遠心分離することによ
り大部分の粒子を除去することができ、過工程
が促進される。） この時点で生成物およびその相対濃度を確認す
る最も迅速な試験はジゴキシンに対するRIAによ
るものである。過した生成物を回転蒸発させ
（×４）、生成物を少量のメタノールに取り入れる
ことにより希釈剤を調製し、置換ジゴキシンの免
疫反応性につき容易に試験された。これが確認さ
れ、相対純度が求められると（TLCによる）、次
の工程はニトロを硫化した水素化ホウ素ナトリウ
ムの使用によりアミンに還元することであつた。 生成物はＹがベンゼン残基、ＡががNO2、Ｒ
が15′−ジゴキシン残基である化合物であつた。 操作を続行する前に、カツプリングしたジゴキ
シンを回転蒸発により乾燥させ、反応器にパラ−
ニトロフエニルイソシアナト−ジゴキシンを入れ
る前にテトラヒドロフラン（THF）で１回洗浄
すべきである。 NaBH2S3との反応はジオキサンまたはTHF中
で行うことができるが、置換されたジゴキシンの
溶解性の点でTHFが好ましい。窒素雰囲気を維
持することは決定的ではないが、前記のように
NaBH2S3を添加する前に容器をパージすべきで
ある。 100ml容の丸底フラスコに上記ジゴキシン（置
換パラ−ニトロフエニルイソシアナト−ジゴキシ
ン）および攪拌棒を一定容積のTHFに入れた
（この場合もTHFの容積を最小限にすべきであ
る）。ガス抜き針を用いてゴム膜を介して５分間
窒素でパージした。 別個の容器にて乾燥後、さらに乾燥剤で乾燥さ
せたNaBH2S3を入れ、THF20mlを添加し、完全
に溶解させ、ゴム膜を介して窒素でパージした。 50mlのガラス製注射器を用いて溶液を取出し、
連続的に攪拌しながらジゴキシンに徐々に添加し
た。反応速度はIRにより追跡することができ
（NO2→NH2への変換）、反応はジゴキシンの濃
度に応じてわずか数時間後に終了すべきである。
進行速度を増すために熱を用いることもできる
が、わずか37℃までであり、きわめて綿密に監視
すべきである。25℃（室温）では反応はこれより
も若干緩慢に進行するが、より制御しやすい。 この生成物はシリカゲルTLC（調製用）または
シリカゲルカラムにより単離および精製し、メタ
ノールで十分に洗浄し、過し、保存のため乾燥
させておくことができる。あるいは後続の反応に
はニトロ基は全く関与しないと思われるので、こ
れをそれ以上精製することなくそのまま使用し、
後続の最終精製をこれらの生成物の精製に利用す
ることもできる。 ジゴキシンの相対濃度が確認されること（この
場合もRIAにより）、後続のパラ−アミノフエニ
ルイソシアナト−ジゴキシンとの反応は、たとえ
ばフルオレセインイソチオシアネートの使用によ
り直接行うことができる。 置換ジゴキシン100μモルを清浄な乾燥した25
ml容丸底フラスコに入れ、攪拌棒を入れた。注射
器によりピリジン10mlを添加し、ゴム膜で閉じ前
記のように窒素でパージし、生成物が完全に溶解
するまで攪拌した。 第２の丸底フラスコにフルオレセインイソチオ
シアネート100μモルを添加し、ピリジン10〜15
mlに溶解した。ゴム膜で閉じ、N2でパージし、
ガラス製注射器で取出し、連続的に混合しながら
ジゴキシンに徐々に添加した。（フルオレセイン
イソチオシアネートの性質のためこれは丸底フラ
スコおよび注射器に付着するので、必ずしもすべ
ての物質が移されるわけではないであろう。しか
し必要ならばのちに上記と同じ方法で追加するこ
とができる。） この反応は終了するのに約72時間かかるであろ
う。これは分析用TLCを採用すると新たな蛍光
種が出現することにより監視できる。 生成物の精製はその後の分析作業前に行わなけ
ればならない。RIA、および蛍光を検出するよう
に提案された他の試験法はいずれも最終生成物の
免疫反応性を証明するであろう。 最終生成物が単離されると、これをメタノール
で十分に洗浄し、数回過し（0.22μ）、乾燥剤に
より乾燥させ、−30℃で乾燥剤下に保存した（冷
凍）。 得られた生成物はＲが15′−ジゴキシン残基、
Ｚが
【式】Ｂがフルオレセイン残基
そしてＹが２価のベンゼン残基である化合物で
あつた。 参考例 １ 25ml容の丸底フラスコに15′−ｐ−アミノフエ
ニルイソシアナト−ジゴキシン（ジゴキシン）
（実施例２で製造したもの）100ミリモルを添加
し、新たに蒸留したピリジン５〜７mlを添加し、
完全に溶解するまで攪拌により溶解および混和し
た。丸底フラスコにゴム膜で蓋をし、N2で５分
間パージした。 十分に換気された防護フード内でガラス製注射
器（清浄でかつ十分に乾燥したもの）によりこの
ホスゲン液100μを取出し、注射器から空気を
すべて除去し、このチオホスゲンを連続的に攪拌
されているジゴキシン溶液に３〜４分間にわたつ
て徐々に添加した。反応器は直射光を遮断しなけ
ればならず（金属箔または箱）、少量を注射器に
より取出すことによつて監視すべきである。IR
は2250cm-1にイソシアネートの生成を示すはずで
ある。生成は急速に進行し、通常は数時間内に終
了するが、所望により一夜放置することもでき
る。 メタノールの添加により反応を停止し、メタノ
ールで数回洗浄し、回転蒸発によりり乾燥させ
た。 単離および精製はTLCによりりメタノール：
クロロホルム（50：50）を用いて行うことがで
き、抽出によりパラ−イソチオシアナト−フエニ
ルイソシアナト−ジゴキシンを取出すことについ
ては先きに述べた（調製用シリカゲル、MeOH
中への抽出、および0.22μのフイルターによる
過、乾燥、洗浄（３×）および保存のための乾
燥）。 得られた生成物はＹが２価のベンゼン残基；Ｒ
が15′−ジゴキシン残基、そしてＡが−Ｎ＝Ｃ＝
Ｓである化合物であつた。 この化合物は単離および精製されるとさらに精
製する必要なしに数か月にわたつて安定である。
保存条件を維持しなければならない（即ちこれら
を乾燥させ、−30℃で乾燥条件下に保存する）。 実施例 ３ 15′−パラ−イソチオシアナト−フエニルイソ
シアナト−ジゴキシンと酵素（アシドホスフア
ターゼ）との反応 反応容積を最小限に保ちながら、開放（または
閉鎖）容器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第１
または第２アミンを含まない塩基性の低分子緩衝
液（たとえばPH9.5、0.5Mのホウ酸塩緩衝液が適
切である）を最少容積添加した。４℃で攪拌混和
した。 希望する置換の程度（ジゴキシン：酵素）を計
算し、この量になるまで、酵素溶液の全容積の10
％以上ではないジメチルホルムアミド（DMF）
またはジメチルスルホキシド（DMSO）を添加
した。溶解するまで混和した。 ピペツトまたはこれに類する移しかえ用器具に
よりDMFまたはDMSO中のジゴキシンを取出
し、酵素を含むPH9.5の溶液にきわめて徐々に添
加した。（10分程度かけるべきであり、受器は４
℃に保存するかまたは氷上で保存して低温に保持
して使用すべきである）。ジゴキシン−酵素（複
合体）を形成する反応は比較的速やかであり、通
常は24時間以内に終了する。生成物はＲがジゴキ
シン残基、Ｙが２価のベンゼン残基、Ｚが
あつた。 参考例 １ 25ml容の丸底フラスコに15′−ｐ−アミノフエ
ニルイソシアナト−ジゴキシン（ジゴキシン）
（実施例２で製造したもの）100ミリモルを添加
し、新たに蒸留したピリジン５〜７mlを添加し、
完全に溶解するまで攪拌により溶解および混和し
た。丸底フラスコにゴム膜で蓋をし、N2で５分
間パージした。 十分に換気された防護フード内でガラス製注射
器（清浄でかつ十分に乾燥したもの）によりこの
ホスゲン液100μを取出し、注射器から空気を
すべて除去し、このチオホスゲンを連続的に攪拌
されているジゴキシン溶液に３〜４分間にわたつ
て徐々に添加した。反応器は直射光を遮断しなけ
ればならず（金属箔または箱）、少量を注射器に
より取出すことによつて監視すべきである。IR
は2250cm-1にイソシアネートの生成を示すはずで
ある。生成は急速に進行し、通常は数時間内に終
了するが、所望により一夜放置することもでき
る。 メタノールの添加により反応を停止し、メタノ
ールで数回洗浄し、回転蒸発によりり乾燥させ
た。 単離および精製はTLCによりりメタノール：
クロロホルム（50：50）を用いて行うことがで
き、抽出によりパラ−イソチオシアナト−フエニ
ルイソシアナト−ジゴキシンを取出すことについ
ては先きに述べた（調製用シリカゲル、MeOH
中への抽出、および0.22μのフイルターによる
過、乾燥、洗浄（３×）および保存のための乾
燥）。 得られた生成物はＹが２価のベンゼン残基；Ｒ
が15′−ジゴキシン残基、そしてＡが−Ｎ＝Ｃ＝
Ｓである化合物であつた。 この化合物は単離および精製されるとさらに精
製する必要なしに数か月にわたつて安定である。
保存条件を維持しなければならない（即ちこれら
を乾燥させ、−30℃で乾燥条件下に保存する）。 実施例 ３ 15′−パラ−イソチオシアナト−フエニルイソ
シアナト−ジゴキシンと酵素（アシドホスフア
ターゼ）との反応 反応容積を最小限に保ちながら、開放（または
閉鎖）容器に適量の酵素を入れ、乾燥させ、第１
または第２アミンを含まない塩基性の低分子緩衝
液（たとえばPH9.5、0.5Mのホウ酸塩緩衝液が適
切である）を最少容積添加した。４℃で攪拌混和
した。 希望する置換の程度（ジゴキシン：酵素）を計
算し、この量になるまで、酵素溶液の全容積の10
％以上ではないジメチルホルムアミド（DMF）
またはジメチルスルホキシド（DMSO）を添加
した。溶解するまで混和した。 ピペツトまたはこれに類する移しかえ用器具に
よりDMFまたはDMSO中のジゴキシンを取出
し、酵素を含むPH9.5の溶液にきわめて徐々に添
加した。（10分程度かけるべきであり、受器は４
℃に保存するかまたは氷上で保存して低温に保持
して使用すべきである）。ジゴキシン−酵素（複
合体）を形成する反応は比較的速やかであり、通
常は24時間以内に終了する。生成物はＲがジゴキ
シン残基、Ｙが２価のベンゼン残基、Ｚが
【式】そしてＢが酵素アシドホス
フアターゼ残基である化合物であつた。
結合したジゴキシン−アシドホスフアターゼの
精製は多数の分離法のうちのいずれか（たとえば
セフアデツクス、バイオゲルなど）を用いること
により行われる。 上記の方法は一例であり、マーカーまたはリガ
ンドが必要な活性水素置換基をもつ限り多種多様
なマーカーまたはリガンドを互いにカツプリング
させるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはT4以外のリガンドをフ
ルオレセイン色素および／または酵素以外のマー
カーまたはリガンドにカツプリングさせるのに使
用できる。 本発明は、化合物の使用によりあるマーカー
またはリガンドと他のものが堅牢にカツプリング
したカツプリング生成物であるトレーサーを製
造しうるという点で特に有利である。これは、蛍
光トレーサーを製造するに際し、カツプリングが
堅牢であためリガンドによる蛍光化合物の消光が
少なくなるという点で有利である。たとえば蛍光
物質を、消光させる可能性のある重い原子（たと
えばT3および／またはT4のヨウ素基）が蛍光色
素に与える影響が少なくなりおよび／または除か
れる。従つて本発明は特に甲状腺ホルモン（T3
又はT4）が蛍光化合物に結合した甲状腺ホルモ
ントレーサーの製造に用いられる。 以上の教示を考慮して本発明を種々に修正およ
び変更することができ、従つて特許請求の範囲の
記述の範囲内において本発明を以上に詳述した以
外の様式で実施することができる。
精製は多数の分離法のうちのいずれか（たとえば
セフアデツクス、バイオゲルなど）を用いること
により行われる。 上記の方法は一例であり、マーカーまたはリガ
ンドが必要な活性水素置換基をもつ限り多種多様
なマーカーまたはリガンドを互いにカツプリング
させるために同様に使用できる。たとえば上記の
方法はジゴキシンまたはT4以外のリガンドをフ
ルオレセイン色素および／または酵素以外のマー
カーまたはリガンドにカツプリングさせるのに使
用できる。 本発明は、化合物の使用によりあるマーカー
またはリガンドと他のものが堅牢にカツプリング
したカツプリング生成物であるトレーサーを製
造しうるという点で特に有利である。これは、蛍
光トレーサーを製造するに際し、カツプリングが
堅牢であためリガンドによる蛍光化合物の消光が
少なくなるという点で有利である。たとえば蛍光
物質を、消光させる可能性のある重い原子（たと
えばT3および／またはT4のヨウ素基）が蛍光色
素に与える影響が少なくなりおよび／または除か
れる。従つて本発明は特に甲状腺ホルモン（T3
又はT4）が蛍光化合物に結合した甲状腺ホルモ
ントレーサーの製造に用いられる。 以上の教示を考慮して本発明を種々に修正およ
び変更することができ、従つて特許請求の範囲の
記述の範囲内において本発明を以上に詳述した以
外の様式で実施することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 構造式： （式中、Ｚは、 【式】【式】 【式】【式】 【式】【式】及び 【式】よりなる群から選ばれ；Ｙは ２価の芳香族炭化水素残基であり；及びＲ及びＢ
の一方は蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカーであり、Ｒ及びＢの他方が抗原、ハプ
テン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
ある） を有するトレーサー。 ２ Ｂが検出可能なマーカーである特許請求の範
囲第１項記載のトレーサー。 ３ マーカーが蛍光色素である特許請求の範囲第
１項記載のトレーサー。 ４ マーカーがフルオレセイン色素である特許請
求の範囲第１項記載のトレーサー。 ５ Ｒがジゴキシンである特許請求の範囲第１項
記載のトレーサー。 ６ ＲがT4である特許請求の範囲第１項記載の
トレーサー。 ７ 構造式： （式中、Ｙは２価の芳香族炭化水素残基であ
り；Ｒは蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカー又は抗原、ハプテン及び抗体からなる
群から選ばれるリガンドであり；及びＡは−
NO2、−NH2、−COOH、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−SH、−
OH，−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、 【式】【式】【式】 及び【式】（式中、R″はアルキル基であ る）よりなる群から選ばれる） を有する化合物を、次式： Ｂ−Y″ （式中、Y″は水酸基、カルボキシル基、メル
カプト基又はアミノ基であり、Ｂは下記の構造式
（）で与えられる意味を有する） の化合物と反応させて構造式： （式中、Ｚは、 【式】【式】 【式】【式】 【式】【式】及び 【式】よりなる群から選ばれ；Ｙは ２価の芳香族炭化水素残基であり；及びＲ及びＢ
の一方は蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカーであり、Ｒ及びＢの他方が抗原、ハプ
テン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
ある） を有するトレーサーを製造する方法。 ８ トレーサーを使用する被分析体のアツセイに
おいて構造式： （式中、Ｚは、 【式】【式】 【式】【式】 【式】【式】及び 【式】よりなる群から選ばれ；Ｙは ２価の芳香族炭化水素残基であり；及びＲ及びＢ
の一方は蛍光色素及び酵素から選ばれる検出可能
なマーカーであり、Ｒ及びＢの他方が抗原、ハプ
テン及び抗体からなる群から選ばれるリガンドで
ある） を有するトレーサーを使用することを特徴とする
アツセイ方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US568482 | 1984-01-06 | ||
| US06/568,482 US4670406A (en) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | Tracers for use in assays |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2035044A Division JPH0758290B2 (ja) | 1984-01-06 | 1990-02-15 | 堅牢なカップリング化合物の中間体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60152497A JPS60152497A (ja) | 1985-08-10 |
| JPH0454904B2 true JPH0454904B2 (ja) | 1992-09-01 |
Family
ID=24271489
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59253952A Granted JPS60152497A (ja) | 1984-01-06 | 1984-11-30 | トレーサー |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2035044A Expired - Lifetime JPH0758290B2 (ja) | 1984-01-06 | 1990-02-15 | 堅牢なカップリング化合物の中間体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670406A (ja) |
| EP (1) | EP0153533B1 (ja) |
| JP (2) | JPS60152497A (ja) |
| AU (1) | AU569117B2 (ja) |
| CA (1) | CA1249811A (ja) |
| DE (1) | DE3469893D1 (ja) |
| DK (1) | DK161045C (ja) |
| MY (1) | MY102211A (ja) |
| NZ (1) | NZ209819A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5622871A (en) | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
| US4698315A (en) * | 1985-04-22 | 1987-10-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method and kit for determining total digoxin levels involving agent to dissociate digoxin-protein complex |
| US4680338A (en) * | 1985-10-17 | 1987-07-14 | Immunomedics, Inc. | Bifunctional linker |
| WO1988008534A1 (en) | 1987-04-27 | 1988-11-03 | Unilever Plc | Immunoassays and devices therefor |
| JPH0776237B2 (ja) * | 1988-09-13 | 1995-08-16 | 富士写真フイルム株式会社 | 蛋白質修飾物 |
| JPH0776236B2 (ja) * | 1988-04-13 | 1995-08-16 | 富士写真フイルム株式会社 | 蛋白質修飾物 |
| US6352862B1 (en) | 1989-02-17 | 2002-03-05 | Unilever Patent Holdings B.V. | Analytical test device for imuno assays and methods of using same |
| US5661040A (en) * | 1993-07-13 | 1997-08-26 | Abbott Laboratories | Fluorescent polymer labeled conjugates and intermediates |
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| BE756287A (fr) * | 1969-09-17 | 1971-03-17 | Hoechst Ag | Produits de polyaddition d'ethylene-imines utilisables pour l'appretagede textiles |
| GB1315871A (en) * | 1971-05-19 | 1973-05-02 | Mon Anto Co | Carbanilates thio-carbanilates and compositions containing them |
| GB1417618A (en) * | 1973-04-03 | 1975-12-10 | Ici Ltd | Surface active urethanes |
| US3925355A (en) * | 1974-03-01 | 1975-12-09 | Corning Glass Works | Labelled digoxin derivatives for radioimmunoassay |
| GB1471755A (en) * | 1974-06-20 | 1977-04-27 | Radiochemical Centre Ltd | Derivatives of digoxin and digotoxin |
| US4007089A (en) * | 1975-04-30 | 1977-02-08 | Nelson Research & Development Company | Method for binding biologically active compounds |
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| DE2609614A1 (de) * | 1976-03-09 | 1977-09-15 | Hermann Guenther | Neues immunadsorbens, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung |
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-
1984
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- 1984-10-03 CA CA000464595A patent/CA1249811A/en not_active Expired
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- 1984-12-14 EP EP84308722A patent/EP0153533B1/en not_active Expired
-
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- 1987-09-29 MY MYPI87002145A patent/MY102211A/en unknown
-
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- 1990-02-15 JP JP2035044A patent/JPH0758290B2/ja not_active Expired - Lifetime
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