JPH0225752A - 血清中の鉄を定量する方法および複合試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明な、体液中の鉄を定量する九め、結合し九鉄を遊
離させ、Ｆｅ”＋に還元し、鉄の検出に適当な色素系を
添加し、色素錯体全測定する方法、ならびに澄明化界面
活性剤混合物の添加なしでも脂肪血症血清の測定に適当
である複合試薬に関する。

〔従来の技術〕

鉄物質代謝障害、殊に鉄欠乏および鉄吸収障害は、なか
んず（女性住民に広（まん延している。従って、体液、
殊に血清中の鉄の検出は、医用分析における標準定量法
に７寓する。鉄は、食物で供給され、腸の粘膜により吸
収される。

次いで、鉄にトランスフェリンに５ｇｆｉの状態で結合
して骨髄に運搬され、ここで主としてヘモグロビン中へ
取込まれる。鉄の吸収が少なすぎると貧血現象が起きる
。

血清中の鉄の定量は、端末診断において頻繁に実施され
る微量元素分析に属する。このためには、種々の方法が
公知である。それで、′クリニカル・ケミストリイ（Ｃ
１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　）　’第２６巻、（１９８０年
）、第３２７頁〜第３３１頁には、トランスフェリンに
炭酸塩錯体の形で結合している３価の鉄を強酸性媒体中
で遊離させる方法が記載されている。この方法の欠点は
、−強酸性試薬が腐刻および腐蝕特性全音することであ
る。この欠点を除くために、九とえば１クリニカル・ケ
ミストリイ（Ｃ１１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　）　”、第２３巻、（１９７７年）、第シ ２３７頁〜第２４０頁および１ツアイト／ユリフトΦフ
ユア参クリニツシエφヒエミー（２゜Ｋ１１ｎ、、Ｃｈ
ｅｍ、　）　’　　第６巻（１９６５年〕、第９６頁〜
第９９頁から、鉄全遊離させるために製塩化グアニジニ
ウムのようなタンパク質変性剤マ几にアニオン界面活性
剤全使用することが公知である。

この方法の公知実施例では、混濁せる脂肪血症血清中の
鉄全定量する場合に誤測定が生じる。

塩化グアニジニウムもアニオン界面活性剤も、混濁の除
去全達成するのに十分な澄明力全音しない。

この問題全解決するためにヨーロッパ特許第１３０５３
７号には、非イオン界面活性剤とアニオン界面活性剤か
らなる混合物を弱酸性媒体中で鉄全遊離させる九めに使
用することが提案されて、いる。しかし、これらの界面
活性剤金側は 用する場合に脂肪血症血清の澄明化メ迅速かり完全に行
なわれるが、免疫グロブリンの高含量を有する血清（Ｇ
ａｍｍｏｐａｔｈｉｅ　−５ｅｒｅｎ　）に対しては、
測定結果を偽造しうる混濁が観察される。

さらに、強い溶血性血清の場合に扛鉄の発見が完全に満
足なものではない。

これに加えて、従来公知の方法では、変性剤としてであ
れ、混濁上さけるためまｔは色素と試料との間の相互作
用を阻止するためであれ、常に界面活性剤が添加されて
いなければならない。しかし、界面活性剤の存在な殊に
自動分析装置にこの定量法を適用する場合には不利であ
る。それというのも界面活性剤は発泡全惹起し、これに
より測定を著しく妨げうるからである。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、−面で攻撃性成公金使用する必要がなく、他面
で脂肪血症血清による障害上さけることができ、測定が
溶血性試料まｔは高い免疫グロブリン含ｉｒ有する血清
によって妨げられることのない、血清中の鉄全定盪する
方法および七の九めの試薬全提供すると−う課題が生じ
ｔｅ さらに、自動化および合理化の理由から、発泡性界面活
性剤なしに作業することができ、試料の先行除タンパク
が必要でないことも望ましい。

〔課題を解決する九めの手段〕

この課題は本発明によれば、血清中の鉄を定量する九め
結合した鉄をタンパク質変性剤の添加により遊離させ、
遊離し危鉄ｔ″Ｆｅ”＋に還元し、色素試薬溶液を添加
し、生成し九色累錯体ｖｉ−光度測定する方法であって
、血清に＃に度１〜８モル／ｌの変性剤の第−銭金添加
し、七の後色素試薬および同様に変性剤を１〜８モル／
ｌの濃度で含有する第二液全添加し、七の後に色索錯体
金測定することを特徴とする方法によって解決される。

本発明は、２工程法（第１工程：変性剤を用いる結合タ
ンパク質からの鉄の分離、第２工程患 ニア色反応）を適用すれば界面活性剤の不在でも作業す
ることができ、七の際色素試薬に同様に変性剤を添加す
れば、色素試薬の添加の際の混濁をさけることができる
という認識に基づく。

従って、脂肪血症血清の障害のない測定が可能である。

結合タンパク質、殊にフェリチンから鉄を分離するｔめ
に、檀々のタンパク質変性試薬を添加することは公知で
ある。このためにな、界面活性剤のほかに、九とえは塩
化グアニジニウム′！友は酢酸グアニジニウム、流酸マ
グネシウムＣＫ、　Ｌａｕｋ）ｅｒ　、　　１ｚ、　Ｋ
１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　　％　＠３０、（１９６５年）
、第９６頁〜第９９頁）、塩化マグネシウム（Ｇ、　Ｂ
ｒ１ｖｉｏ　、　”　Ｌａ　ＲｌｃｅｒｃａＣｌｉｎ、
　Ｌａｂ、　　　第１６巻、（１９８６年）、第５２３
頁〜第５３３頁）およびＮａＣｊ　（’３−ロツバ特許
出願公開（ｇｐＡ）　０２２８０６０号）のような多数
の塩の高濃度溶液が使用される。

前接され比変性工程と後接され九色素反応と全音する、
秩定量を２工程法で行なう公知実施例では、色素試薬の
添加によって変性試薬のイオン強度が低下する。ところ
で驚異的なことに、イオン強度のこの変化が鉄試験にお
ける脂肪血症血清の誤測定に責任があることが判明した
。

変性剤により第一に鉄がその輸送タンパク質ゝから遊離
され、第二に脂肪血症血清の場合明確な混濁レベルが生
じるものと思われる。従って、混濁はと（に色素試薬溶
液の添加前に測定し、試料９値として控除される。本発
明によれば色素試薬溶液は、変性溶液からほんの１菟か
１奇す）−度□１９．６ユえ、お１゜、□イア、。

で、混濁背景の色素錯体が生成する間形！＃全受けない
１１である。

本発明の範囲内でタンパク質変性の几めには、上述し比
例のほかに、一般に高濃度の、タンホルト（Ｃ，Ｔａｎ
ｆｏｒｄ　”’　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ、、　Ｃｈｅｍ、
　　　ｒｇ２３巻、第１２１頁以降、殊に第１５９頁、
第１７３ｃｊＬ、第１８２−第１８６Ｗ（１９８６ｍ）
）に記載されｔタンパク質変性剤が適当であり、この場
合カチオンとしてアルカリ−’１７？、はアルカリ土類
金４カチオン、置′！Ｉ！、または非置換のアンモニウ
ム化合物、（ま九ｈａとえはグアニジニウムのような他
の有機カチオンが挙げられ、アニオンとしてなハロゲン
化物、硫酸、過塩素置、チオシアン酸の各イオン、また
は他のｓｉ機まｅｈ有機アニオン、アシレー）（７ｔと
えは酢酸イオン）またにヘパリン酸イオンが挙げられる
。鉄結合タンパク質を変性するための１″！しい試薬は
、尿素またはカチオンＭｇ　ｇ＋の塩およびグアニジニ
ウム、とくに望ましいのはグアニジニウムカチオンの塩
、念とえは塩化物、酢酸塩、チオシアン酸塩または硫酸
塩である。

本発明による鉄試験の両溶液における変性剤の濃度に、
比較的高く、１〜８モル／ｌの間でなければならない。

４モル／ｌと６モル／ノの間の濃度が最良の結果金主じ
る。１モル／ｌよジ下の濃度では、トランスフェリンか
らの鉄の分離は徐々に増加する。と（に望ましい塩化グ
アニジニウムに対しては、望ましい濃度は１〜６モル／
ｌの間、とくに望まし論のに４〜５モル／ｌの間にある
。

双方の溶液中の変性剤の濃度ができるだけ十分に一致す
るのがとくに有利である。即ち、色素試薬における濃度
が予備１置試薬におけるよりも低い場合には、脂肪血症
血清試料に色素試薬全添加する際に再び混濁が生じ、こ
れが試料さらに澄明化が生じ、これによジ鉄信号が過度
に低くなる。従って、とくに予備１置試薬と色素試薬は
、変性試薬の濃度から２０係以下、とくに望ましくは５
幅以下相違すべきである。

本発明方法を実施する几めには、試料層″ｔｉ、を望ま
しくは弱酸性範囲内、とくに望ましくは…４〜６の範囲
内に緩衝する。緩衝剤としては、４〜６のｐＫ値を育し
かつ鉄を錯結合し々い化合物が適当である。九とえば酢
酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤および
トリス緩衝剤が適当である。

緩衝剤として望ましくに酢酸塩緩衝剤が使用される。。

緩衝剤は望ましくは２０〜５００　ミリモル／ｌ、とく
にｉｔしくは５０〜１５０ミリモル／ノの濃度で使用さ
れる。

鉄の定量の九めにな、自体公知の方法で試料溶液に、６
価の形で存在する遊離した鉄を２価の形に還元するため
に、たとえばアスコルビン酸ま九は亜ノチオン酸塩のよ
うな還元剤全添加する。還元剤はと（に第−液に添加さ
れる。さらに、鉄の検出に適当な色素系全添加する。こ
のような色素系は、九とえはヨーロッパ特許第２２８０
６０号、”　Ｃ１１ｎ、阻ｏｃｈｅｍ、　　　第１４巻
（１９８１年）、第３１１〜第６１５頁および”　Ｃ１
１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　　、第２３巻（１９７９年）、第
２５７〜第２４０頁に記載されてｂる。殊に、鉄と共に
、尤度測定により評価しうる色素を生じるフェロインタ
イブの錯生成剤が適白である。

適当な物質としては、パト７エナントロリンおよび６′
（７−ぎりジル）−５，６−ジフェニル−１，２，４−
）リアジンスルホン酸二ナトリウム塩が挙げられる。こ
の場合、色素生成な試料の鉄含量に比例して行なわれ、
自体公知の方法で尤度測定によフ評価することができる
。

本発明のもう１つの対象は、水溶液ま几はそれの製造に
適した乾燥混合物の形の、 緩衝剤（ｐＨ４〜６） ２０〜５００ミリモル／ｌ 変性剤　　　　　　　　１〜８　　モル／ｌＪ還元剤　
　　　　０．１〜１００ミリモル／ｌを含有する第一試
薬およびこれと別個に、攪衝剤（ｐＨ４〜６） ２０〜５００ミリモル／ｌ 変性剤　　　　　　　　１〜８　　モル／ｌ色　　素　
　　　　　　　０．５〜５０　　ミ　リモル／ｌを含有
する第二試’１１特徴とする、血清中の鉄を定量する念
めの複合試薬である。

と（に、試薬１は 還元剤　　　　　　５〜５０　ミリモル／ｌ変性剤　　
　　　　　　４〜６　　モル／ｌ緩衝剤　　　　　５０
〜１５０ミリモル／ｌを含有し、試薬２は 変性、剤　　　　　　　　４〜６　　モル／）緩衝剤　
　　　　５０〜１５０ミリモル／ｌ色　　素　　　　　
　　　　　１〜２０　　ば　リモル／ｌ全含有する〇 次側は本発明を詳述するものである。

〔実施例〕

例　　１ 血清中の鉄定量の几めに次の試薬全使用する：試薬１ グアニジニウム塩涜塩　　４．５　　　モル／ｌ酢酸塩
ｕｋ衝剤ｐＨ＝５．０　　０．１５　　モル／ノアスコ
ルヒンｒ！ｆ１０．０２３モル／ｌ試渠２ グアニジニウム塩酸塩　　４．５　　　モル／ｌ酢駿塩
緩責剤ｐ）ｌ−５，５０，０２モル／ｌフェロジン（Ｆ
ｅｒｒｏｚｉｎ■）１．７ミリモル／ｌ（３−（２−ぎ
リシル）−５，６−ジフェニル−１，２，４−１リアジ
ンスルホンヤニナトリウム塩） キュベツト中へ４０μｌの試料体積に、変性試薬１７０
０μ！ｊをピペットで加え、偏度２５°Ｃで５分間（ｌ
ｉ［Ｌ、５／ｌ）　ｎｍで吸光を測定する（　Ｈｚ試料
）。その後、色素試薬−１００μノを加える。さらに５
分後、色信号を測定する（　ＴＬｚ試料）。試薬の９値
を、色素試薬添加の前（ＩｈＢＬ）および後（”２ＲＬ
　）で測定し、この場合試料の代りに２回蒸留し九本４
０μ！を使用する。従って、鉄定量に対して生じる測定
信号は次式から得られる： 鉄定量金検量する几めに、既知の鉄含量を有する対照血
？′＃全使用する。

試料としては、１１６μ９　／　ｄｌの既知鉄含量を有
する対照血清および強混濁の脂肪エマルショｙ　（１ｎ
ｔｒａｌｉｐ□ｄ［Ｆ］；エヤラフデア在Ｐｆｒｉｍｍ
ｅｒ　＆　Ｃｏ、社製品）からなる混合物を製造した。

まず、イントラリビド（１ｎｔｒａｌｉｐｉｄ　）１部
十氷水１０ないしインドラリぎド１部十水０．５部の範
囲内の、このエマルションの予（ＩＩ　希釈系利金調製
し、その際混濁増加の生成およびＴＧ含量の上昇が測定
される（トリグリセリド試験、日立７０４で測定）、０
の予備希釈系列からそれぞれ１部を取出し、対照血清１
９部金加える。鉄発見の結果は、第１図にトリグリセリ
ド含量に対して記載されている。曲線ａは、上記の処方
を有する鉄発見の混濁独立性を示し、曲線すはＲ２から
塩化グアニジニウム全省略した場合の類似処方での結果
全表わす。

例　　２ 例１と類似の測定法において、試薬１中の変なかった。

第２図から、誤測定は変性試薬の濃度に依存せず、従っ
て例１におけるように試薬２での添加に依存することが
明白である。

例　　６ 例１と類似の測定法において、試薬２中の色素を省略し
、グアニジニウム塩酸塩４．５モル／ノの代りに、変性
試薬として公知の他の試薬を使用し次。例１における最
高トリグリセリド濃度に一致するインドラリぎド試料に
つき、５７０ｎｍにおける混濁度変化を、色素試薬不在
のため鉄信号による重畳なしに測定した。表１には、試
薬２を添加した際の相対混濁度が記載されている。

表　１ 試薬２における種々の添加物に対する５７０ｎｍ　Ｋお
ける相対混濁度 添加物：　　　　　　　　　　ΔＫｓ？ｏＣ係〕（混濁
）３２．１ 塩化グアニジニウム　４．５モル７／ｌ　　　　　　　
２．６塩化ナトリウム　　６．４モル／ｌ　　　　　　
２０．４尿　素　　　　　　５　モル／ｌ　　　　　　
１２．９試′＃＆２に種々の変性剤の添加により相対混
濁度音強く減少させうることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明方法の作用効果全説明するためのもの
で、 第１１図はトリグリセリド含量に対する鉄発見の結果を
示す曲線図であり、第２図は試薬１中の変性剤塩化グア
ニジニウムの種々の濃度における、第１図と同様の曲線
図である。 ａ・・・例１に記載の処方による場合 ｂ・・・試薬２から塩化グアニジニウム金省略し次回様
の処方による場合 ＦＩＧ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質変性剤を添加して結合した鉄を遊離させ
   、遊離した鉄をＦｅ＾２＾＋に還元し、色素試薬溶液を
   添加し、生成した色素錯体を光度測定する、血清中の鉄
   の定量方法において、血清に濃度１〜８モル／ｌの変性
   剤の第一液を加え、その後色素試薬および同様に変性剤
   を１〜８モル／ｌの濃度で含有する第二液を添加し、そ
   の後色素錯体を測定することを特徴とする血清中の鉄を
   定量する方法。 ２、第二液中の変性剤の濃度が第一液中の濃度から最高
   ２０％偏奇する、請求項１記載の方法。 ３、第一液の添加後に混濁度測定を行ない、測定値を、
   鉄量を確かめるため色素錯体溶液の測定値から控除する
   、請求項１または２記載の方法。 ４、緩衝剤、ｐＨ４〜６ ２０〜５００ミリモル／ｌ 変性剤１〜８モル／ｌおよび 還元剤０．１〜１００ミリモル／ｌ を含有する第１試薬およびこれと別個に、 緩衝剤、ｐＨ４〜６ ２０〜５００ミリモル／ｌ 変性剤１〜８モル／ｌ 色素０．５〜５０ミリモル／ｌ を含有する第２試薬からなる、水溶液またはそれの製造
   に適した乾燥混合物の形の、血清中の鉄を定量するため
   の複合試薬。