JPH0223825B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液凝固の光学的測定方法に関する
ものである。血液凝固検査は、出血傾向が認めら
れる患者の治療、あるいは、抗凝固剤治療を行な
う患者の追跡管理に極めて重要な検査であり、
又、手術に先立つ検査として必須のものである。
かかる凝固検査としてプロトロンビン時間（以下
PTと略す）及び活性化部分トロンボプラスチン
時間（以下APTTと略す）を測定する検査がよ
く知られており、各々、外因系凝血機序及び内因
系凝血機序の総合的な検査として実施されてい
る。又、その他多くの検査によつて、どの凝固因
子がどの程度不足しているかを測定する因子定性
検査、因子定量検査も血友病等の診断・治療に利
用されている。

これらの検査は、それぞれ専用の試薬を用いて
実施されるが、いずれの場合も、被検試料（通常
は、血球を分離した血漿が使用される）中の多種
類の凝固因子がそれぞれの試薬の作用によつて活
性化し、相互に作用しあいながら最終的にフィブ
リノーゲンが不溶性のフイブリンに転換し、血液
の流動性が失なわれる現象に基いて測定を行な
う。

例えばPTの測定では、組織トロンボプラスチ
ンを主成分とする試薬を使用し、被検試料である
血漿と該試薬を混合した時点から、被検血漿が凝
固をはじめる迄の時間を測定する。被検血漿につ
いて得られた測定時間が、正常な血漿についての
同様な測定時間（使用する試薬、測定技法により
異るが、大略12秒前後）に比べ遅延しておれば、
血漿中の第因子、第因子、第因子、第因
子の異常が疑われる。さらに適当な補正試薬や特
殊な操作を追加して同様に凝固時間を測定すれ
ば、どの因子がどの程度欠乏しているか知ること
ができる。いずれの測定においても、被検血漿中
のフィブリノーゲンがフイブリンに転換・析出す
る時点をもつて凝固終了とするという原理は共通
のものである。

また、APTT測定やその他の凝固検査に関し
ても、使用する試薬が異なるだけで、凝固を判定
する現象はPTとなんら変るところはない。

上述の如く、血液凝固の測定とはフイブリンの
形成・析出の検出であると言い換えることができ
る。その具体的な方法は、従来より各種のものが
提案されているが、凝固検査の信頼性を大きく左
右するものであり、極めて重要である。

最も基本的には、肉眼によりフイブリンの析出
を判断しストツプウオツチで凝固時間を計時する
のであるが、高度な熟練が必要であり、又測定者
の個人差があつて信頼性に不安がある。更に、機
械的な振動を与えたり、電気抵抗を測定する方法
も提案されているが、前者では凝固反応の進行中
に常に不自然な応力を加え続けるため測定値の正
確さに疑問があり、後者では異物として挿入する
プローブの影響や試料間の汚染の問題がある。ま
た、上述したいずれの方法も、近年著しい検体数
の増加に応ずる連続処理には多大の労力を必要と
し、迅速な多数検体処理には不向である。

そこで今日、フイブリン析出時に光透過率が変
動する現象を利用し、これを光学的に検出する機
構が種々提案されている。これら光学的検出では
被検試料に非接触の自然な状態で凝固機序に影響
を与えることなく測定ができ、多数検体の迅速処
理にも適しているがフイブリン析出に伴なう光透
過率の変化が小さく、従つて前後で凝固の光透過
量はなだらかな変動を示すだけであり、凝固検出
感度という点では不十分なものである。特に凝固
因子に異常を示す血液の測定では、凝固反応以外
のノズルに比べてフイブリン析出時の信号が弱
く、凝固の正確な判定は一層困難であり、信号光
検出後の演算処理（例えば、平滑化処理、微分処
理やそれらの組合わせなど）をもつてしても満足
できるものではない。さらに、透過光を利用して
いるため、病態によつては普通に発生する高度に
濁つた検体の測定は全く不可能である。

本発明者らは、上記欠点に鑑み鉛意研究の結
果、血液凝固反応が進行して析出するフイブリン
にレーザー光を照射したとき生ずる散乱光を検出
する場合は、フイブリン析出に起因する散乱光の
強度の変化を選択的に検出することができる角度
が存在することを見出だし、本発明を完成するに
至つた。

即ち、本発明は、血液凝固反応が進行して被検
液中で析出したフイブリンにレーザー光を照射し
それにより生ずる散乱光を検出することにより行
う血液凝固の光学的測定方法に於いて、該散乱光
のうち、後方散乱光を検出することにより行うこ
とを特徴とする血液凝固の光学的測定方法であ
る。

本発明は、例えば次のようにして、容易に実施
することができる。

即ち、例えば被検血液あるいは血漿と試薬から
なる混合液に、レーザー光線を照射して、後方散
乱光の強度の変化を測定することにより、凝固時
間、凝固態様を知り血液凝固を測定するのであ
る。

本発明は、従来の血液凝固の測定方法と同じく
光学的検出方法を用いるものであるが、透過光を
利用する従来の方法に対し散乱光を、しかも散乱
光のうち特に後方散乱光を、好ましくは散乱角θ
＝30°〜60°で検出するもので、従来法に比して感
度に優れかつ高濁度の検体に対しても効果的な検
出方法を提供するものである。第１図は本発明の
方法により散乱光強度Ａの凝固に伴なう経時変化
を記録したものである。図のａの部分（散乱光強
度As）は被検試料と試薬の混合によつて凝固反
応は進行しているが未だフイブリンの析出は認め
られない状態、ｂの部分はフイブリンの析出が盛
んに進行している状態、ｃの部分（散乱光強度
Af）はフィブリノーゲンのフイブリンへの転換
析出が終了した状態と解されており、ａからｂへ
移行する時点Tcがフイブリン析出の開始時点で
あることが経験的に知られている。すなわち凝固
の検出は、ｂの部分の検出に相当し、凝固前後の
状態ａと状態ｃの間の差が明確である程感度の良
い測定ができる。

透過光を利用した測定では、フイブリンの析出
前後に第１図と類似の（但し増減の方向は逆であ
る）曲線が透過光量について得られるが、前述の
如く凝固前に凝固後の信号の差は後方散乱光の場
合に比較してはるかに小さく、凝固異常を示す血
漿や高濁度の血漿では肉眼で凝固が確認されるに
も拘らず透過光量信号は何ら変化を示さない。本
発明は後方散乱光の強度の変化を、好ましくは散
乱角θ＝30°〜60°で測定することにより行う血液
凝固の光学的測定方法の発明であり、これによる
と透過光量を測定する方法に比べて優れた凝固検
出感度を得ることができる。

第２図に本発明に係るレーザー光源と光の散乱
源である被検試料及び光検出器の配置を１つの実
施例として示す。反応キユベツト２内の被検試料
と試液の混合液４はレーザー光源１より発せられ
た一定光量のレーザー光束によつて照射され混合
液の状態に応じて該入射光束を散乱する。この散
乱光の強度を測定して電気信号に変換する光検出
器３が反応キユベツト２に対して特定の位置に配
置される。レーザー光源１は、例えば発振彼長
632.8nｍのヘリムウ・ネオンレーザーがよく、反
応キユベツト２は、例えば内経５mmの試験管キユ
ベツト、また、光検出器３は通常の光電変換素子
が用いられる。反応キユベツト２の中心を通るレ
ーザー光軸と光検出器３のなす角度をθとする
と、散乱光の強度は光の散乱源の状態に応じ散乱
光検出角度θへの異る依存性を示す。上述の実施
例の装置を用いて凝固前の被検血漿と試液の混合
液からの散乱光の強度をθに対して記録したもの
が第３図である。いくつかの小さなピークを単純
化して示したものであるが、θが大きな方向すな
わち前方散乱に対して散乱光の強度が増大してい
るのが特徴的である。この凝固以前の散乱光強度
Asに対し凝固後の散乱光強度Afは、Asにフイブ
リンの析出による変化分（Af−As）が重畳する
形となる。一方、凝固検出感度、即ち凝固反応前
後での散乱光の強度の変化の割合を示す値とし
て、フイブリン析出による散乱光の強度の変化と
凝固前の散乱光の強度の割合Ｒ＝（Af−As）／
Asをとり、Ｒとθの関係を上述の実施例につい
て示したものが第４図である。これによれば、凝
固検出感度が最も高くなるような最適検出角度範
囲が存在することがわかる。被検試料と試薬の混
合液の違い、すなわち凝固因子異常の有無、濁り
の高低は、第３図に示した凝固前の散乱光の強度
の散乱角度特性には影響を及ぼすが、第４図に示
した検出感度の散乱角度特性より知れる最適検出
角度範囲にはあまり影響を与えない。その一例と
して、高い濁りを有する高脂血漿２種と通常の濁
りを有する血漿を検体として、所定の散乱角度で
のＲ値の測定を行つた結果を第６図に示す。第６
図に於いて、−△−は通常の濁りを有する血漿を、
−○−は高脂血漿を、−●−は高脂血漿を検
体とした場合の結果を夫々示す。この結果から明
らかな如く、高い濁りを有する高脂血漿を試料と
した場合には、θが90°以上（即ち、前方散乱光
を測定した場合）では、Ｒ値が０となる場合もあ
る。一方、後方散乱光により測定する場合、特に
θが30°〜60°では、いずれの検体の場合にもＲ値
の測定が可能であることが判る。即ち、血液凝固
により析出するフイブリンを後方散乱光により、
好ましくは散乱角θ＝30°〜60°で検出すれば、試
料が濁りを有するものであるか否かにかかわら
ず、Ｒ値の測定が可能となる訳である。従つてこ
の角度範囲に配置された光検出器を使用すれば、
凝固検査が必要とされるどのような被検試料に対
しても、最良の検出感度での測定ができ、それは
凝固検査の正確さにそのまま結びつくものであ
る。このように散乱光の強度の空間分布状態の研
究に基いて血液凝固信号を最良感度で選択的に検
出するという点に関して本発明に係る技術開示以
前に言及した例は無い。特に本発明の特徴的な点
は、従来の光学的測定法では全く測定することが
できなかつた血球を分離しない全血試料に対して
も同様な後方散乱光を利用して測定することがで
きるようにしたことである。これは、光源として
レーザー光源を使用したことと最も感度の良い検
出角度のみを選択することができるとの知見によ
つてはじめてできることである。全血を用いる測
定では、血球分離の多大な労力と操作の繁雑さが
除かれ迅速に多数検体を処理することができ、ま
た被検患者の血液採取量の負担を軽減することが
できる点も重要なことである。

第５図は、本発明を実際の血液凝固測定装置と
して構成した装置のブロツク図である。光検出器
で電気信号に変換された散乱光の強度信号は、信
号増幅器５により増幅されＡ／Ｄ変換器６に入力
される。コンピユーター７は該Ａ／Ｄ変換器によ
つてデジタル量に変換された散乱光の強度信号を
演算処理し凝固時点を判定する。凝固点の判定は
従来フイブリンの析出信号そのもの、あるいはそ
れの一次微分信号、二次微分信号の利用、またこ
れらとその他の判定基準の組み合せなどで実行さ
れており、各々に対応する様々なプログラムが作
成できることは周知であるが、それは本発明の実
施態様を制限するものではない。さらに、コンピ
ユーターで処理したデータの表示・印字部８、凝
固過程を連続的に観測する記録計１０、及び試薬
自動分注機構・自動検体準備機構９、またブロツ
ク図には示されていないが、反応条件を同一にす
るための反応キユベツト温度制御機構によつて装
置は構成される。このように、本発明と既存技術
の組合わせによつて自動化・省力化された血液凝
固測定装置が容易に実現できることは明らかであ
る。

以上、本発明の特定の実施例についても併せて
述べたが、本発明はこれらの実施例にのみ限定さ
れるものではなく本発明の範囲内で各種の具体例
に応用することができるものである。

本発明は、上述した如く、散乱光の強度の血液
凝固による変化のみを最も感度よく測定できるた
め、従来の光学的検出方法と同じく凝固機序に影
響を与えることなく一定した測定方法を提供しな
がら、かつその欠点であつた凝固異常を示す被検
試料での測定感度の低さや高濁度被検試料での測
定の困難さを解決するものであり、従来測定でき
なかつた被検試料に対しても正確で精密かつ迅速
な凝固測定をできるものとし、本発明を具体化す
る自動測定装置では各種凝固試験を迅速正確に高
感度で実施することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は被検試料と試薬との混合液の時間−散
乱光強度特性図、第２図は本発明による測光系原
理図、第３図は散乱光検出角度−凝固前散乱光強
度特性図、第４図は散乱光検出角度−凝固検出感
度特性図、第５図は本発明を応用した血液凝固測
定装置のブロツク図である。 １……レーザー光源、２……反応キユベツト、
３……光検出器、６……Ａ／Ｄコンバーター、７
……コンピユーター。 第６図は高脂血漿２種と通常の濁りを有する血
漿を検体として、所定の散乱角度でのＲ値の測定
を行つた結果を示し、−△−は通常の濁りを有す
る血漿を、−○−は高脂血漿を、−●−は高脂血
漿を検体とした場合の結果を夫々示す。尚、Ｒ
値は以下のように定義される。 Ｒ＝（Af−As）／As As；検体の血液凝固反応前の散乱光強度を示す。 Af；検体の血液凝固反応後の散乱光強度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液凝固反応が進行して被検液中で析出した
   フイブリンにレーザー光を照射しそれにより生ず
   る散乱光を検出することにより行う血液凝固の光
   学的測定方法に於いて、該散乱光のうち、後方散
   乱光を検出することにより行うことを特徴とする
   血液凝固の光学的測定方法。 ２ 後方散乱光の検出を散乱角θ＝30°〜60°で行
   う特許請求の範囲第１項に記載の血液凝固の光学
   的測定方法。 ３ レーザー光の光源が発振波長632.8nｍのヘリ
   ウム・ネオンレーザー光源である特許請求の範囲
   第１項又は第２項に記載の血液凝固の光学的測定
   方法。