JPH02219589A

JPH02219589A - ペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH02219589A
Application number: JP1132895A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Kashimoto; 和久樫本; Katsukiyo Sakurai; 桜井　勝清
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1989-05-29
Publication date: 1990-09-03
Anticipated expiration: 2013-07-16
Also published as: JP2777193B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的］（産業上の利用分野）本発明は、ペプチドの製造方法に関するものであり、詳
しくは環状ペプチド、例えば合成カルシトニン誘導体の
合成中間体として有用な環状ペプチドの製造方法に関す
る。

（従来の技術）従来より、強力な血清カルシウム及びリン低下、骨形成
促進作用及び骨吸収抑制作用、尿中リン***促進作用等
の優れた薬理作用を有するポリペプチドとして、カルシ
トニンが広く知られている。カルシトニンは、ヒトなど
の各種哨乳動物の甲状腺から、又は魚類、円ロ類、鳥類
の鯰後体から抽出採取され、そのアミノ酸配列が明らか
にされており、この配列に基づき類似構造の合成カルシ
トニンに関する報告も多く存在する。動物由来のカルシ
トニンは、いずれも３２個の構成アミノ酸からなるポリ
ペプチドであって、その１番目と７番目のアミノ酸がシ
スティンであり、両者のメルカプト基がジスルフィド結
合を形成し、そしてカルボキシル基末端がプロリンアミ
ドである点で全て共通している。

合成カルシトニン誘導体としては、ｌ及び７番目のシス
ティンを次式：％式％（式中、ｎは３〜７の整数を表す、）で示されるα−アミノ酸で置き換えたものが知られてお
り、そこでは次式：％式％（式中、ＡはＳｅｒ、　　Ｇｌｙ又はＡｌａを、ＢはＡ
ｓｎ又はＳｅｒを、Ｘは水酸基又はペプチド化学で常用
のカルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペ
プチド残基な、Ｒは活性エステル残基な表し、ｎは前記
と同義であり、各アミノ酸残基はペプチド化学で常用の
保護基で保護されていてもよい）で示されるペプチドを液相中で環化反応に付し、カルシ
トニンの一部に相当するペプチドフラグメントを液相中
で更にカップリングさせること（以下「液相合成法」と
いう、）により、目的とするカルシトニン誘導体を合成
している（特公昭５３−４１６７７号公報、特開昭６１
−１１２０９９号公報、特開昭６３−２０３６９９号公
報、ファルマシアレビューＮｏ、３ｒ新しい薬を求めて
　生理活性ペプチド」　（ファルマシアレビュー編集委
員会編）１５３−１５４頁等）。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら、従来の液相合成法ではアミノ酸の数が増
すに従ってその溶解度が微妙に変化し、適当な溶媒を見
出すのが次第に困難になり、それにつれて未反応物や副
生成物との分離の困難さも増大して（る、特に、環化反
応においては副生成物の生成を極力抑えるため、溶媒で
希釈しながら合成し、溶媒を大過剰に使用するため、反
応後の処理が困難で不経済なことから工業的に充分満足
できるものではなかった。

本発明者は、蛋白分解酵素を用いた酵素化学的縮合によ
り環化反応を行うことにより、その目的を達成しうるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒
、その他に関し略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣの規定
、あるいは当該分野における慣用記号に従い、次のとお
り表記する。ただし、アミノ酸等に関し光学異性体があ
る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。

Ｔｙｒ　　　チロシン残基１１ｅ　　　イソロイシン残基Ｇｌｙ　　　グリシン残基Ｓｅｒ　　　セリン残基Ａｒｇ　　　アルギニン残基５ｐＬｙｓＰｒ。

ｅｕｈｒｌｕｉｎＶａｌＡｓｎｉｓＡｌａＭｅｔｈｅｏａｍｏｃｚｏｓＭｅアスパラギン酸残基リジン残基プロリン残基ロイシン残基スレオニン残基グルタミン酸残基グルタミン残基バリン残基アスパラギン残基ヒスチジン残基アラニン残基メチオニン残基フェニルアラニン残基ｔ−ブトキシカルボニル９−フルオレニルメチルオキシカルボニルベンジルペンジルオキシカルボニルトシルメチルエステルＢｚＮＰＳｕＦＡＨＦＭＦＭＳＯＭＰＡＣＣＳＣＯＳｕＯＢｔＯＮＢベンジルエステルｐ−ニトロベンジルエステルＮ−ヒドロキシコハク酸イミドニステルトリフルオロ酢酸テトラヒドロフランジメチルホルムアミドジメチルスルホキシドヘキサメチルホスホリルトリアミドジシクロへキシルカルボジイミドＮ−エチル−Ｎｏ−ジメチルアミノプロピルカルポジイミドＮ−ヒドロキシコハク酸イミドｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾ− ルＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネシー２．３−ジカルボン酸イミドＭｅＯＨメタノールＥｔＯＨエタノールＡｃＯＨ酢酸［発明の構成］（課題を解決するための手段）本発明は、次式（１）：（式中、ＡはＳｅｒ、　　Ｇｌｙ又はＡｌａを、ＢはＡ
ｓｎ又はＳｅｒを、Ｘは水酸基又はペプチド化学で常用
のカルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペ
プチド残基を、ｎは３〜７の整数を表し：各アミノ酸残
基はペプチド化学で常用の保護基で保護されていてもよ
い）で示されるペプチドを蛋白分解酵素で処理することを特
徴とする次式（■）：（式中の記号は前記と同義である）で示されるペプチドの製造方法に関するものである。

前記（１）及び（Ｉｆ）において、Ｘで表されるカルボ
キシル基の保護基は、カルボキシル基の保護基としてペ
プチド化学で常用のものであれば特に制限はなく、例え
ば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロ
ポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、５ｅｃ−ブト
キシ基、　ｔｅｒｔ−ブトキシ基等のアルコキシ基：ベ
ンジルオキシ基、ｐ−ニトロベンジルオキシ基、ｐ−ク
ロロベンジルオキシ基、ベンズヒドリルオキシ基等のア
ラルキルオキシ基；カルボベンゾキシヒドラジノ基、ｔ
ｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジノ基、トリチ
ルヒドラジノ基等の置換ヒドラジノ基が挙げられる。

Ｘで表されるアミノ酸残基は、カルシトニンの相当する
アミノ酸残基であり、例えばＶａｌ、Ｍｅｔが挙げられ
る。

Ｘで表されるペプチド残基は、カルシトニンの相当する
ペプチド残基であり、例えば１次式：−Ｃ−Ｌｅｕ−Ｄ
−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−に−Ｌ−Ｍ−Ｎ−０−Ｐ−
Ｑ−Ｒ−３−Ｔ−Ｕ−Ｇｌｙ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｎ
Ｈ＊（式中、ＣはＶａｌ又はＭｅｔを、ＤはＳｅｒ又はＧｌｙを、ＥはＬｙｓ、　Ｔｈｒ又はＡｌａを、ＦはＬｅｕ又はＴｙｒを、ＧはＳｅｒ、　　Ｔｈｒ又はＴｙｒを、ＨはＧｉｎ、　
　Ｌｙｓ又はＡｒｇを、ＩはＧｌｕ、　　Ａｓｐ又はＡ
ｓｎを。

ＪはＬｅｕ又はＰｈｅを、ＫはＨｉｓ又はＡｓｎを、ＬはＬｙｓ又はＡｓｎを、鯖はＬｅｕ％Ｐｈｅ又はＴｙｒを、ＮはＧｉｎ又はＨｉｓを、０はＴｈｒ又はＡｒｇを、ＰはＴｙｒ又はＰｈｅを。

ＱはＰｒｏ又はＳｅｔを。

ＲはＡｒｇ％Ｇｌｙ又はＧｉｎを、Ｓ′はＴｈｒ又はＮｅｔを、ＴはＡｓｐ、　　Ａｌａ％Ａｓｎ又はＧ１３１を、Ｕは
Ｖａｌ、Ｉｌｅ、　　Ｔｈｒ又はＰｈｅを、ＶはＡｌａ
、　　Ｇｌｙ％Ｐｒｏ又はＳｅｔを、ＷはＧｌｙ又はＧ
ｌｕを、ＸはＴｈｒ、　　Ａｌａ又はＶａｌを表す）で示される
ペプチド残基又はそのフラグメントが挙げられる。Ｘで
表されるペプチド残基は、Ｌｅｕ、　　Ｖａｌ、　Ｉｌ
ｅ、　　Ｐｈｅ等の脂溶性アミノ酸を含まないほうが好
ましい、蛋白分解酵素は、これらのアミノ酸のＮ端側の
合成、分解の平衡反応に関。

与するので、目的以外の結合部分の分解を伴う可能性が
あるからである。

前記（Ｉ）又は（ｎ）で示されるペプチドにおいて、各
アミノ酸残基はペプチド化学で常用の保護基で保護され
ていてもよい。

かかるペプチド化学で常用の保護基のうち、カルボキシ
ル基の保護基としては、Ｘで表されるカルボキシル基の
保護基として前述したものと同様のものが挙げられる。

また、アミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ
％ＦＤＩＯＣ％ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル基、
インボニルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボ
ニル基、アゲマンチルオキシカルボニル基、トリフルオ
ロアセチル基、フタリル基、ホルミル基、０−ニトロフ
ェニルスルフェニル基、ジフェニルホスフィノチオイル
基等が挙げられる。

本発明に用いる前記式（Ｉ）で示されるペプチドは、例
えば、次のようにして製造することができる。

即ち、次式・：（ＣＨｉ）　ｎ−Ｃ０ＯＨＨＪＣＨＣＯＯＹ（式中、Ｙはカルボキシル基の保護基、例えば低級アル
キル基を表し、ｎは前記と同義である）で示されるα−アミノ酸、例えばアミノスペリン酸−α
−低級アルキルエステルにＮ保護スレオニンを混合酸無
水物法等で縮合し、次いでアミノスペリン酸側鎖カルボ
キシル基を活性化させた後。

セリルアスパラギンと縮合し、得られたテトラペプチド
にＮ保護セリン、Ｎ保護ロイシンを混合酸無水物法、活
性エステル法等の通常のペプチド合成法に従い縮合する
ことにより得られる。

本発明の特徴は、前記式（Ｉ）で示されるペプチドを蛋
白分解酵素で処理して液相法で環化させる点にある。

従来、蛋白分解酵素は主としてペプチド結合の開裂に使
用されてきたが、その逆反応であるペプチド結合の生成
反応にも使用し得ることが知られている。しかし、これ
らのペプチド結合生成反応は直鎮オリゴペプチド等のペ
プチド結合生成反応に使用されており、またこれらのペ
プチド結合生成反応は蛋白分解酵素が有機溶媒中で不溶
であるため、水系での使用に限られていた。

本発明に用いる蛋白分解酵素としては、特に制限はなく
１例えば、サーモライシン、プロリシン、クシナーゼ等
の金属プロテアーゼを挙げることができる。

サーモライシンは、国際生化学連合（ＩＵＢ）酵素委員
会に酵素番号ＥＣ，３，４，２４，４として登録されて
おり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌ
ｉｔｉｃｕｓが産生する酵素で、大和化成社などから市
販されている。また、プロリシンはＢａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ。

ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが産生する酵素で
、上田化学社などから、タシナーゼＮはＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓが産生ずる酵素で、
協和発酵工業社から、それぞれ市販されている。

本発明の蛋白分解酵素による環化反応は、ｐｉ（４〜１
０、好ましくはｐＨ５〜８の緩衝液を含む媒質中で行わ
れる。

用いる緩衝液はｐＨ値が前記範囲内のものであれば、そ
の種類は特に限定されるものではなく、各種のものを使
用することができ、例えば、トリス塩酸緩衝液、マツク
イルベイン緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩
衝液、アドキンス＆パンチン氏緩衝液、ベロナール緩衝
液等を挙げることができる。

これらの緩衝液を反応媒質として使用する場合、該緩衝
液は通常、水混和性有機溶媒と混合して使用される０反
応媒質の一部として用いうる該水混和性有機溶媒として
は、例えば、ＤＭＦ、Ｄ＆ＩＳＯ１ＨＭＰＡ、　ＭｅＯ
Ｈ，ＥｔＯＨ等を挙げることができ、これらのうち、　
ＤＭＦ、　ＭｅＯＨ，ＥｔＯＨが特に好ましい、これら
の有機溶媒はそれぞれ単独で又は２種もしくはそれ以上
組合わせて使用してもよい。

溶媒中のペプチド濃度は厳密に制限されるものではない
が、ペプチドは低濃度がよく、ペプチド１ｇ当り溶媒は
１１２以上が望ましい。

前記緩衝液と該水混和性有機溶媒の混合割合は、緩衝液
対有機溶媒の容積比で一般に２二８乃至８：２、好まし
くは５ニア乃至７：５の範囲内とするのが有利である。

本発明の反応媒体中での反応は、前記蛋白分解酵素が作
用する温度範囲、一般には、約２０〜５０℃、好ましく
は約２５〜４０℃の範囲内の温度において行うことがで
きる。

前記蛋白分解酵素の使用量は臨界的ではなく、反応条件
に応じて変えることができる。また、酵素は一般的な方
法、例えば担体結合法、架橋法、包括法、その他の方法
により固定化した固定化酵素を利用して反応させること
もできる。担体結合法で用いる担体としては、セルロー
ス、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、
ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス等が挙げられる
。架橋法で使用する架橋試薬としてはグルタルアルデヒ
ド、ビスジアゾベンジジン、Ｎ、Ｎ−ポリメチレンビス
ヨードアセトアミド、Ｎ、Ｎ−エチレンビスマレインイ
ミド等が挙げられる。包括法で用いる素材としては、ポ
リアクリルアミドゲル、ポリアクリルアルコールゲル、
デンプン、コンニャク粉、ナイロン、ポリウレア、ポリ
スチレン、エチルセルロース、コロジオン、硝酸セルロ
ース等が挙げられる。しかし、その固定化法は何らこれ
らに限定されるものではない。

本発明において、一般には、セリンプロテアーゼやアミ
ダーゼ活性を持たない酵素を用いるが、これらの活性を
有する酵素を使用する場合は、これら酵素の阻害剤、例
えばポテトインヒビター等を反応系に加えてもよい。

また、本発明は固相合成法によっても製造することがで
きる。

即ち１次式（Ｉａ）：（式中、ＡはＳｅｒ、　　Ｇｌｙ又はＡｌａを、ＢはＡ
ｓｎ又はＳｅｒを、Ｘ′は直接結合又はアミノ酸残基も
しくはペプチド残基な、　ＲＥＧＩＮは不溶性樹脂残基
を、ｎは３〜７の整数を表し、各アミノ酸残基はペプチ
ド化学で常用の保護基で保護されていてもよい）で示されるペプチド樹脂を蛋白分解酵素で処理して、次
式（ｆｌｌ）：（式中の記号は前記と同義である）で示されるペプチド樹脂を得、次いで、不溶性樹脂を脱離させることにより、次式（Ｉ
Ｉａｌ：（式中、ｘ′′は水酸基、アミノ基又はアミノ酸残基も
しくはペプチド残基を表し：他の記号は前記と同義であ
る）で示されるペプチドを製造することができる。

前記固相合成法においては、前記ペプチド樹脂（Ｉ　ａ
）をカラムに充填し、蛋白分解酵素を含む前記媒質を還
流して連化反応に付し、次いでフッ化水素（ＨＦ）、ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理等の方法で不溶性樹脂を
脱離させる。

ＴＦＡにより脱離させることができる不溶性樹脂として
は、例えば、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ア
ミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベ
ンズヒドリル樹脂、４−アミノメチルフェノキシメチル
樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４
−オキジメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等が挙げ
られる。

特にα−アミノ基の保護基としてＦｍｏｃを使用する場
合は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂等の
ＴＦＡで脱離できる樹脂がよく、Ｂｏｃを使用する場合
は、４−オキジメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等
のフッ化水素で脱離できる樹脂が望ましい。

樹脂中に結合するペプチド量としては、樹脂１ｇ当りペ
プチドは０．１ｍｍｏｌ以下の範囲を挙げることができ
る。

また、本発明は、前記の方法において、式（Ｉ）又は式
（Ｉ　ａ）で示されるペプチドをポリエチレングリコー
ル誘導体で修飾された蛋白分解酵素で処理して式（ＩＩ
　）又は式（Ｉｌａ）で示されるペプチドを製造するこ
とができる。

この方法では、蛋白分解酵素をポリエチレングリコール
誘導体で修飾することにより１本来有機溶媒中では不溶
である酵素が溶けるようになり。

有機溶媒中で酵素反応を行わせることができるようにな
るため、水を含まない又は含水率の低い水混和性有機溶
媒中で酵素反応を行わせることができ、好収率で目的ペ
プチドを得ることができる。

このポリエチレングリコール誘導体で修飾された蛋白分
解酵素は、親油性及び親水性を有するポリエチレングリ
コールな活性基と結合させてこれ。

を酵素と反応させ、酵素蛋白のアミノ基に部分的に結合
させて修飾したものであって１例えば次の反応式に示す
ように、０−メトキシポリエチレングリコール（分子量
２０００〜８０００）を２．４．６−ドリクロローｓ−
トリアジンと反応させて得られる２、４−ビス（０−メ
トキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−５−）
リアジン（ＰＥＧ２）を蛋白分解酵素と反応させること
により、修飾酵素が得られる。このような製法は特公昭
６１−４２５５８号公報が参照される。

ｒ＃ＰＥ６２−酵素本発明によって得られる前記式（ＩＩ　）又は（ＩＩ　
ａ　）で示されるペプチドは、更に、ペプチド合成に通
常用いられる方法、具体的には「ザ・ペプチド（Ｔｈｅ
　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ第１巻（１９６６年）［５ｃｈ
ｒｅｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、］あ
るいは「ペプチド合成」　（東屋ら著、丸善株式会社（
１９７５年）１に記載されている方法に従い、例えばア
ジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法
、ＤＣＣ法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエス
テル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シ
アノメチルエステル法等）、ウッドワード試薬Ｋを用い
る方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−
アディティブ（ＨＯＮＢＪＯＢｔ、　ＨＯＳｕｌ法、固
相法等を利用することにより１合成カルシトニン誘導体
に変換することができる。その際、通常、−ｆｉのポリ
ペプチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次１
個ずつアミノ酸を縮合させる、いわゆるステップワイズ
法によって、又は数個のフラグメントに分けてカップリ
ングさせていく方法を利用することができる。

また、合成カルシトニン誘導体の合成反応工程では、反
応に関与すべきではない官能基は、ペプチド化学で常用
の保護基で保護され、反応終了後、保護基は脱離する。

更に、反応に関与する官能基は通常活性化される。これ
ら各反応方法は公知であり、それに用いられる試薬等も
公知のものから適宜選択し得る。

カルボキシル基及びアミノ基の保護基としては、前述し
たものが挙げられる。また、カルボキシル基の活性化さ
れたものとしては、例えば、対応する酸クロライド、酸
無水物又は混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペン
タクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾ
ール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジ
カルボキシイミド等とのエステル）等が挙げられる。な
お、ペプチド結合形成反応は、縮合剤、例えばジシクロ
へキシルカルボジイミド、カルボシイミグゾール等のカ
ルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト等の
存在下に実施し得る場合もある。

（発明の実施例）以下、合成例、実施例及び参考例により本発明を更に詳
細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。

合成例１（ＣＨｉ）　５ｃＯＯＨ（１）　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ）−ＨＮＣＨ−ＣＯＯＣ
Ｈｓの製造Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ−ＯＲ３０，９ｇ１
ｒ：ＤＭＦ　２００ｍ１に溶解し、ドライアイス−エタ
ノールで一２０℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン１１
．０ｍｌ、次いでイソブチルクロロホルメイト　１３．
２ｍｌを滴下した後、−２０℃で１分間撹拌して該当す
る混合酸無水物を作成した。この反応液をし一アミノス
ペリン酸−α−メチルニスエル２０．３ｇを含むＴＨＦ
　２００ｍｆ溶液と混合し、０℃で５分間、室温で２０
分間撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル４００−
を加え、ＩＮ　ＨＣｌ２００ｍ７で２回、飽和食塩水で
２回、の順で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後
、減圧濃縮し、標記目的物の油状物４４．５ｇを得た。

（ＣＨ，）　５−ＣＯｏＳｕ ■ （２）　Ｂｏａ−Ｔｈｒ　（Ｂｚ）−ＩＮＣＩ−ＣＯＯ
ＣＨｓの製造上記（１）により得た油状物４４．５ｇを
ＴＨＦ　３００ｍ７に溶解し、冷却下、ＨＯＳｕ　１０
．４ｇ及びＤＣＣＨ８，６ｇを加えて、−４℃で一夜撹
拌した。ジシクロヘキシルウレア（ｎｃｕ）の白色物質
は除去し、Ｔ肝を減圧留去して、標記目的物の油状物５
３．２ｇを得た。

（３）　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ　（Ｂｚ）　−Ａｓｎ−ＯＨの
製造Ｈ−Ａｓｎ−ＯＨ１９，８ｇ％Ｎ−メチルモルホリ
ン１６．５ｍｆ及びＢｏｃ−３ｅｒ（Ｂｚ）−０Ｓｕ　
３９．２ｇをＤＭＦ　２００ｍｆに溶解し、室温で一夜
撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル６００ｍ７を
加え、ＩＮ　ＨＯ２２００−で２回、飽和食塩水２００
ｍｆで２回の順で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、減圧濃縮した。残渣なエーテルで処理して固化し
、メタノール−エーテルより再結晶化して、標記目的物
２３．０ｇ　（５６，２％）を得た。

ｍｐ　　８３〜８４℃ ［α］　　＝　−４，０（Ｃ＝１．ＤＭＦ）元素分析（
Ｃ，。ＨｚｔＮｓＯｔ）として計算値　Ｃ５５，７４％
　Ｈ６，６５％　Ｎ　１０．２６％測定値　Ｃ５５，７
２％　Ｈ６，７０％　Ｎ　１０．２２％（ＣＩＩ）　５
ｃＯ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｎ−ＯＨ（４）　Ｂｏ
ｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ）−ＨＮＣＨ−ＣＯＯＣＨｓの製造上
記（３）で得たＢｏｃ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｎ−
ＯＨ２０，５ｇに氷冷下ＴＦＡ　５０ｍ７を加えて溶解
し、３０分間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をエーテ
ルで処理し、析出した生成物を炉取し、水酸化ナトリウ
ム上で真空乾燥してＨ−Ｓｅｒ　（Ｂｚ）−Ａｓｎ−Ｏ
Ｈ４ＦＡを得た。

得られた生成物をＤＭＦ　２００ｍｆに溶かし、これに
水冷下、ＴＥＡでｐＩ（４，０に調整した後、（Ｃ１，
）　１ｃＯＯｓｕＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ）−ＨＮＣＨ−ＣＯＯＣＨ，３０
，０ｇを含んだＤＭＦ１００ｍｆ溶液を添加した。０℃
で１時間、室温で一夜撹拌後、減圧濃縮した。残渣に酢
酸エチル６００ｍ！を加え、　ＩＮ　ＨＣｌ　２００ｍ
１で２回、水２００ｍ７で２回の順で洗浄後、減圧濃縮
した。残渣をエーテルで処理して固化し、メタノール−
エーテルより再結晶化して、標記目的物２８．５ｇ（収
率７２，５％）を得た。

ｍｐ　　　９３〜９４℃ ［α］　　＝　−９，１（Ｃ＝１．ＤＭＦ１元素分析　
（Ｃ３ＪｓｓＮａＯ＋＊）として計算値　Ｃ５９，６０
％　Ｈ７，０５％　Ｎ　８．９１％測定値　Ｃ５９，５
５％　Ｈ７，１１％　Ｎ８．７１％（ＣＨｓ）　５ｃｏ
−３ｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｎ−ＯＨ（５１Ｂｏｃ−Ｓ
ｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ｔｈｒ　（ＢｚＪ−ＨＮＣＨ（：０
ＯＣＨａの製造（ＣＨｇ）　５ｃＯ−５ｅｒ　（Ｂｚ）
　−Ａｓｎ−ＤＨＢｏｃ−Ｔｈｒ［Ｂｚ）−ＩＮＣＩ−
ＣＯＯＣＨｓ　２３．６ｇに水冷下ＴＦＡ５０ｍｌを加
えて溶解し、３０分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣
をエーテルで処理し、析出した生成物を炉取し、水酸化
ナトリウム上で真空乾燥した。

得られた生成物をＤＭＦ　２００ｍＪｌに溶かし、これ
に水冷下、ＴＦＡでｐＨ４，０に調整した後、Ｂｏｃ−
３ｅｔ（Ｂｚｌ−Ｏ５ｕ　１５．７ｇを含んだＤ＆４Ｆ
　５０ｍ７溶液を添加した。０℃で１時間、室温で一夜
撹拌し、水冷下。

Ｎ、Ｎ−ジメチルエチレンジアミン１．３２ｍ１を加え
、０℃で１時間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に酢酸
エチル６００ｍＡ’を加え、ＩＮ　ＨＣｌ　２００ｍｆ
で２回、水２００ｍ７で２回の順で洗浄後、減圧濃縮し
た。残渣をエーテルで処理して固化し、メタノール−エ
ーテルより再結晶化して、標記目的物２４．０ｇ（収率
８３．１％）を得た。

ｍｐ　　９５〜９６℃ ｒａｌ　＝−１０，４（（：＝１．ＤＭＦ）元素分析　
（Ｃ４ＪｓｓＮｓＯ＋Ｊとして計算値　Ｃ６１，１１％
　Ｈ６，９１％　Ｎ　８．７３％測定値　Ｃ６１，０７
％　Ｈ７，０Ｏ％　Ｎ　８．５０％（ＣＨｘ）　５ｃＯ
−３ｅｒ　（Ｂｚ）　−Ａｓｎ−ＯＨＢｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｓｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｔｈｒ　（Ｂｚ）−ＩＮＣＩ−Ｃ
ＯＯＣＨ，の製造（Ｃ１，）　５ｃＯ−Ｓｅｔ　（Ｂｚ
）　−Ａｓｎ−ＯＨＢｏｃ−３ｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ｔｈ
ｒ　（Ｂｚ）　−ＨＮＣＨ−ＣＯＯＣＨｓ　２２．３ｇ
に氷冷下ＴＦＡ　５０ｍｆを加えて溶解し、３０分間撹
拌した後、減圧？ｌ！した。残渣をエーテルで処理し、
析出した生成物を炉取し、水酸化ナトリウム上で真空乾
燥した。

得られた生成物をＤＭＦ　２００ｍ１ｌに溶かし、これ
に水冷下、ＴＥＡ″′ｃｐＨ４，０に調整した後、Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｏ３ｕ　９．９ｇを含んだＤＭＦ　５０ｍ
１溶液を添加した。０℃で１時間、室温で一夜撹拌し、
氷冷下、Ｎ、Ｎ−ジメチルエチレンジアミン１．３２ｍ
ｆを加え、０℃で１時間撹拌した後、減圧濃縮した。残
渣に酢酸エチル６００ｍ／を加え、ＩＮ　ＨＣＩ　２０
０ｍ１で２回、水２００ｍ１で２回の順で洗浄後、減圧
濃縮した。残渣をエーテルで処理して固化し、熱メタノ
ール−酢酸エチルより再結晶化して、標記目的物ｚｏ、
ｔｇ（収率８０，７％）を得た。

ｍｐ　　１５３〜１５５℃ ［α］　＝　−１１，５（ｃ＝ｔ、ｏｕｐ１元素分析　
　（Ｃｓｓｌｌ−１Ｎ７０．ｓ）として計算値　Ｃ６１
，３８％　Ｈ７，２１％　Ｎ９．１１％測定値　Ｃ６１
，０２％　Ｈ７，６３％　Ｎ９．０１％実施例１の製造（ＣＨ，）　５ｃＯ−Ｓｅｔ　（Ｂｚ）　−Ａｓｎ−Ｏ
ＨＢｏａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ−
ＨＮＣＨ−ＣＯＯＣＨ，１０，０ｇに水冷ＴＴＦＡ　５
０ｍ７を加えて溶解し、３０分間撹拌した後、減圧濃縮
した。残渣をエーテルで処理し、析出した生成物を枦取
し、水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。

得られた生成物を、メタノール５６０１に溶解し、２０
ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶液・５．０１にサーモ
ライシン７０００ＰＵ／ｍｇを８．０ｇ溶解した溶液を
加えた。７％アンモニア水でｐＨ６，２５に調整し、３
７℃で一夜撹拌した後、サーモライシン７０００ＰＵ／
ｍｇを２．０ｇ加え、ｐＨ６，２５に調整し、更に３７
℃で一夜撹拌した。１．０％ＥＤＴＡ溶液４５０−を加
えた後、メタノールを濃縮し、沈殿物を炉取した。得ら
れた粉末的１０ｇにメタノール：水＝９：１の溶液５０
０ｍＪを加え、３０分間、４０℃で撹拌後、混液を室温
に冷却下、不溶物と炉液に分けた。ろ液はＤｏｗｅｘ−
１−Ｘ４（２，３Ｘ　１８ｃｍ）及びＤｏｗｅｘ　５０
Ｗ−Ｘ８　（２，３Ｘ　１８ｃｍ）の連続したカラムを
通した後、溶媒は濃縮し、エーテルで固化、メタノール
−エーテルより再結晶化して標記目的物５．１ｇ（収率
５７．３％）を得た。

また、メタノール−水混液での不溶物はメタノール１４
０ｍ７に溶解し、２０ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶
液６０ｍ１にサーモライシン７０００ＰＵ／ｍｇを０．
２ｇ溶解した溶液を加えた。７％アンモニア水でｐＨ７
，５に調整し、３７℃で一夜撹拌し、１．０％ＥＤＴＡ
溶液４５０ｍ７を加えた後、メタノールを濃縮し、沈殿
物を消散した。酵素分解して得られた粉末３．９ｇ（回
収率３９．０％ｒは原料として再度使用することができ
る。

ｍｐ　　１６６℃・（分解）［ａ　］　＝−８，８（Ｃ＝１．ＤＭＦ１元素分析　（
Ｃ１゜ＨｓｔＮｙＯ＋ｉｌとして計算値　Ｃ６２，６８
％　Ｈ７，０５％　Ｎ　１０．２３％測定値　Ｃ６２，
１７％　Ｈ７，４３％　Ｎ　１０．０１％合成例２（１）　Ｈ−Ａｓｕ−ＲＥＧＩＮの製造（ａ）　Ｚ−Ａ
ｓｕ　（ＯＭｅ）−０Ｂｚの製造ＭｅＯＨ５００ｍ７を
−ｌＯ℃に冷却し、撹拌しながら塩化チオニル１３ｍ１
を徐々に加えた。１０分後、Ｚ−Ａｓｕ−ＯＢｚ　２０
．７ｇを加え、室温で２日間撹拌した後、減圧蒸留して
得られた油状残渣を酢酸エチルに溶かした。これをＩＮ
　ＨＣＩで洗浄し、次いで４回水洗、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、酢酸チェルを減圧留去し、標記目的物より
なる油状物１９．７ｇを得た。

（ｂ）　Ｈ−Ａｓｕ　［ＯＭｅ）−ＯＨの製造Ｚ−Ａｓ
ｕ　（ＯＭｅ）−０Ｂｚよりなる油状物１９．７ｇを、
ＭｅＯＨ５００ｍ７及びＩＮ　ＨＩＪ’　４８ｍ１に溶
解し、パラジウム炭素を加え、２０時間水素添加を行っ
た。触媒を炉別後、ＭｅＯＨを留去乾燥後、酢酸エチル
３００ｍ７及びＩＮ　Ｈ（４３００ｍ１に溶解し、この
水層をｌＮＮａＯＨでｐｔｔ７．０に調整し、４℃で一
夜放置した。生成した沈殿を消散し、水洗乾燥して、標
記目的物８．４ｇを得た。

ｍｐ　　　１７５〜１７６℃（分解）［ａ］　　＝＋２０．６（Ｃ＝１．ＡｃｏＨｌ元素分析
　　（ｃｓｎ＋ｔＮｏ４）として計算値　Ｃ５３，１９
％　Ｈ８，４３％　Ｎ６．８９％測定値　Ｃ５２，９９
％　Ｈ８，６６％　Ｎ６．６６％（ｃｌ　Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｕ　（ＯＭｅ）−ＯＨの製造Ｈ−Ａｓｕ　（ＯＭｅ）
　−ＯＨ８，ＩｇをＴＨＦ　２５０ｍ７に溶解し、Ｆｍ
ｏｃ−Ｃ１１２，９ｇを加えて４℃で一夜撹拌した。溶
媒を留去し、酢酸エチルに溶かし、これをＩＮ　ＨＣＩ
で洗浄し、次いで４回水洗、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、酢酸エチルを減圧留去して、標記目的物よりなる油
状物１５．３ｇを得た。

（ｄ）　Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ（ＯＭｅｌ−ＲＥＧＩＮの製
造Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ（ＯＭｅｌＯＨ４，２５ｇをＤＭＦ
に溶解し、ＤＣＣで対称酸無水物とした後、これを４−
ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂１０．０ｇ　（
０，０２ｍｍｏｌ／ｇｌの存在下に２時間撹拌した。樹
脂はＭｅＯＨで洗浄し、標記目的物を得た。

（ｅ）　Ｈ−Ａｓｕ−ＲＥＧＩＮの製造Ｆｍｏｃ−Ａｓ
ｕ　（ＯＭｅ）−ＲＥＧＩＮに、ＭｅＯＨ２０ｍ７　に
ｌＮＮａＯＨ２，２当量を加え、３０分間放置後、　Ｍ
ｅＯＨで洗浄して乾燥し、標記目的物を得た。

（ＣＨａ）　５ｃＯ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｎ−Ｏ
Ｈ（２）　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｔ
ｈｒ　（Ｂｚｌ−ＨＮＣＨ−ＣＯ−ＲＥＧＩＮの製造Ｈ−Ａｓｕ−ＲＥＧＩＮ　Ｏ，５ｍｍｏｌ（０，０２ｍ
ｍｏｌ／ｇ）を出発原料とし、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂ
ｚ）−ＯＨを固相合成法の活性エステル法に従い縮合し
、次いでＤＣＣ−ＨＯＳｕのＤＭＦ溶液で側鎖を活性エ
ステルとした後、Ｈ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｎ−Ｏ
Ｈ（１ｍｍｏｌ）を縮合、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−
０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（各１ｍｍａｌｌを固相
合成法の活性エステル法に従い順次縮合して、標記ペプ
チド樹脂を得た。

実施例２の製造合成例２（２）で得たペプチド樹脂をピペリジンで処理
した後、カラムに充填し、３７℃に保ったサーモライシ
ン（５ｇ＃’）のリン酸緩衝溶液（０，０２Ｍ酢酸カル
シウムを含む）をポンプで２時間還流した。溶液を水で
洗浄した後、再度３７℃に保ったサーモライシン（５ｇ
、＃）のリン酸緩衝溶液（０，０２Ｍ酢酸カルシウムを
含む）をポンプで逆方向から２時間還流した。ペプチド
樹脂なカラムより取り出し、均一に攪拌し、再度カラム
に充填し、上記サーモライシン処理をくりかえした。溶
液は水で洗浄し、標記ペプチド樹脂を得た。

の製造上記（１１で得たペプチド樹脂をＴＦＡで処理した後、
得られた粉末的１．２ｇにメタノール：水＝９：１の溶
液ｌ口Ｏｍｌを加えて溶かし、Ｄｏｗｅｘ　５０■−ｘ
８（２，３Ｘ　１８ｃｍ１のカラムを通した後、溶媒を
濃縮し、エーテルで固化、メタノール−エーテルより再
結晶して、標記目的物０．７ｇを得た。

ｍｐ　　１８０℃（分解）［α］　＝−１３，０（Ｃ＝１．ＤＭＦ）元素分析　（
Ｃ，。ＨｓｓＮＪ□）として計算値　Ｃ６２，３４％　
Ｈ６，９４％　Ｎ　１０．３９％測定値　Ｃ６２，１０
％　Ｈ７，３２％　Ｎ　１０．１１％合成例３　ポリエ
チレングリコール誘導体で修飾された蛋白分解酵素の製
造：サーモライシン１０ｇを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）２７に、２．４−ビス（θ−メトキシポリエチ
レングリコール−６−クロロ−ｓ−トリアジン（分子量
的１１．０００）　３１．７ｇを加え、３７℃で１時間
反応させた。限外濾過法により精製し、白色粉末の修飾
サーモライシン３０ｇを得た。このものの分子量は約２
０万であり、Ｃａ５ｅｉｎ−Ｆｏｌｉｎ測定法による酵
素活性は未修飾サーモライシンの１０％を保持していた
。

Ｃａ５ｅｉｎ−Ｆｏｌｉｎ測定法：基質蛋白質溶液とし
てカゼインを用い、蛋白分解酵素を作用後、除蛋白剤を
加え、非沈殿性分解物についてＦｏｌｉｎ試薬を用いて
蛋白分解量を測定する方法。

実施例３の製造（ＣＨ，）　５ｃＯ−Ｓｅｒ　（Ｂｚ）　−Ａｓｎ−０
■Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚ）−Ｔｈｒ（Ｂｚ）−ＩＮＣＩ
−ＣＯＯＣＨｓ　ｉｏ、ｏｇに氷冷下ＴＦＡ　５Ｏｍ７
を加えて溶解し、３０分間撹拌した後、減圧濃縮した。

残渣をエーテルで処理し、析出した生成物をｔ月収し、
水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。

上記生成物を、メ・タノール５．Ｏ１に溶解し、２０ミ
リモル濃度酢酸カルシウムのメタノール溶液５．０１に
合成例３で得た修飾サーモライシンを８．０ｇを溶解し
た溶液を加えた。　ｐ）１６．２５に調整し、３７℃で
一夜撹拌後、修飾サーモライシンを２．０ｇ加え、ｐＨ
６，２５に調整し、さらに３７℃で一夜攪拌後、エタノ
ールをａ＃１し、沈殿物をｔ月収し、水洗後乾燥した。

得られた粉末的１０ｇにメタノール：水＝９：１の溶液
５００ｍ７を加え、３０分間４０℃で攪拌後、混液は室
温に冷却下、不溶物とる液に分けた。ろ液はＤｏｗｅｘ
−１−Ｘ４（２，３Ｘ　１８ｃｍ１及びＤｏｗｅｘ　５
Ｏ−Ｘ８　（２，３Ｘ１８ｃｍｌの連続したカラムを通
した後、溶媒は濃縮し、エーテルで固化、メタノール−
エーテルより再結晶化して標記目的物５．１ｇ（収率５
７．３％）を得た。

又、メタノール−水混液での不溶物はメタノール１４０
ｍ１に溶解し、２０ミリモル濃度の酢酸カルシウム溶液
６０ｍ１にサーモライシン７０００ＰＵ／ｍｇを０．２
ｇを溶解した溶液を加えた。７％アンモニア水でｐＨ７
，５に調整し、３７℃で一夜撹拌し、　１．０％ＥＤＴ
Ａ溶液４５０ｍ１を加えた後、メタノールを濃縮し、沈
殿物を消散した。酵素分解して得られた粉末３．９ｇ　
（回収率３９．０％）は原料として再度使用した。

ｍｐ　　１６６℃（分解）［α］　＝　−８，８（Ｃ＝１．ＤＭＦ）元素分析　（
Ｃ６ｏ１１ａｔＮ、０．ｚ）として計算値　Ｃ６２，６
８％　Ｈ７，０５％　Ｎ　１０．２３％測定値　Ｃ６２
，１７％　１７．４３％　Ｎ　１０．０１％実施例４の製造合成例２（２）で得たペプチド樹脂をピペリジンで処理
した後、固相合成機から取り出してカラムに充填し、合
成例３で得た修飾サーモライシン５ｇを含む３７℃に保
ったＤＭＦ溶液をポンプで２時間還流した。溶液を水で
洗浄した後、再度修飾サーモライシン５ｇを含む３７℃
に保ったＤＭＦ溶液をボンブで逆方向から２時間還流し
た。ペプチド樹脂なカラムより取り出し、均一に撹拌し
、再度カラムに充填し、上記修飾サーモライシン処理を
くりかえした。溶液を水で洗浄し、標記ペプチド樹脂を
得た。

の製造上記＋１）で得たペプチド樹脂をＴＦＡで処理した後、
得られた粉末的１．２ｇにメタノール：水＝９＝１の溶
液１００ｎ＋７を加えて溶かし、Ｄｏｗｅｘ−５０■−
ｘ８（２，３Ｘ　１８ｃｍ）の連続したカラムを通した
後、溶媒を濃縮し、エーテルで同化、メタノール−エー
テルより再結晶化して標記目的物０．８ｇを得た。

ｍｐ　　１００℃（分解）［α］　＝　−１３，０（Ｃ＝１．ＤＭＦ１元素分析　
　（Ｃ−ｓＨｔｓＮｙｏ＋＊）として計算値　Ｃ６２，
３４％　Ｈ６，９４％　Ｎ　１０．３９％測定値　Ｃ６
２，１０％　Ｈ７，３２％　　Ｎ　ＩＯ，１１％参考例の製造４．８ｇをＤＭＦ　２５０ｍｊに溶解し、水冷撹拌下、
２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液ｌＯ，ローを３０分間かけ
て滴下した。水冷下で５時間撹拌した後、ＩＮ　ＨＩＪ
でｐＨ７にし、減圧濃縮してＤＭＦを留去した。残渣に
水を加えて固化し、熱メタノール−エーテルで２回再結
晶化して、標記目的物４．５ｇ（収率９５．３％）を得
た。このものは、実施例４（２）で得られたものと同一
の物性値を示した。

−ＣＯ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの製造Ｚ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ　１．９ｇをメタノール
１００ｍ１に溶解し、ＩＮ　ＨＣ７４，３ｍｌ及び１０
％パラジウム／炭素０．２ｇ存在下水素添加した。６時
間室温で撹拌後、触媒を除去し、減圧！１１ｉＪｌた。

残渣の油状物を水酸化ナトリウム上で一夜真空乾燥して
Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ−ＨＣ７を得た。

得られた生成物と、４．０ｇ及びＨＯＢｔ　０．５７ｇをＤＭＦ　１００ｍ
ｆに溶解し、これに水冷下、ＴＥＡ１’　ｐＨ４，０に
調整した後、ＷＳＣ０，７７ｍ１を添加した。０℃で１
時間、室温で一夜撹拌後、減圧濃縮した。残渣にＩＮ　
ＭＣＩを加えて固化、ＤＭＦ−酢酸エチルで２回再結晶
化して、標記目的物４．７ｇ　（収率９０．４％）を得
た。

ｍｐ　　２２８℃（分解）［α］　＝−１７，０（Ｃ・１．ＤＭＦ）元素分析　（
ＣａＪｓｏＮ＋ｏＯ＋ｓ）として計算値　Ｃ６１，６５
％　Ｈ７，３９％　Ｎ　１１．４１％測定値　Ｃ６１，
３５％　Ｈ７，７９％　Ｎ　１１．０２％−ＣＯ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨの製造−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−ＯＭｅ　４．５ｇをＤＭＦ　１２０ｍｊに溶解し
、水冷攪拌下、　２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３．１ｍ
ｌを３０分間かけて滴下した。水冷下で５時間撹拌した
後、ＩＮ　ＨＣ７でｐＨ７にし、減圧濃縮してＤＭＦを
留去した。残渣に水を加えて固化し、　ＤＭＦ−酢酸エ
チルで２回再結晶化して、標記目的物４．２ｇ（収率９
４．４％）を得た。

ｍｐ　　２４０℃（分解）【α］　ニー、１８．５（Ｃ＝１．ＤＭＦ１元素分析　
（ＣａｚＨａｓＮｔｏｏｌｓ）として計算値　Ｃ６１，
３７％　Ｈ７，３１％　Ｎ　１１．５４％測定値　ＣＧ
１．１２％　Ｈ７，５６％　Ｎ　１１．２７％−ＣＧ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　（２１−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｇｌｎ−−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ）　−
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ　（２１−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔ
ｈｒ　（Ｂｚ）　−−Ｔｙｒ　（Ｂｚ）　−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ　（Ｔｏｓ）　−Ｔｈｒ　（Ｈｚ）　−Ａｓｐ　（
ＯＢｚ）　−−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ　（Ｂｚ）　−Ｐｒｏ−ＮＨｚの製造Ｂｏｃ−Ｌｙｓ
　［２１−Ｌｅｕ−３ｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｇｉｎ−Ｇｌ
ｕ　（ＯＢｚ）　−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　
−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ　（Ｂｚ）　−Ｔｙｒ　（Ｂ
ｚｌ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓｌ　−Ｔｈｒ　（Ｂｚ
）　−Ａｓｐ　（ＯＢｚ）　−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ−Ｐｒｏ−ＮＨｓ　７．２ｇ
に水冷下、アニソール２ｍｌ及びＴＦＡ　１５ｍ７を加
えて溶解し、３０分間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣
をエーテルで処理し、析出した生成物を消散し、水酸化
ナトリウム上で真空乾燥してＨ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ
）　−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−Ｌｅｕ−Ｇ
ｉｎ−Ｔｈｒ　（Ｂｚ）　−Ｔｙｒ　（Ｂｚ）　−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓｌ　−Ｔｈｒ　（Ｂｚ）　−Ａｓｐ
　（ＯＢｚ）　−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ（Ｂｚ）　−Ｐｒｏ−ＮＨｇ　４ＦＡを得た。得ら
れた生成物と、ｍｐ　　１７４〜１７７　℃ ［α］　　＝−１７，５［ｃ＝１．ＤＭＦ１元素分析　
（Ｃｉ＜　１ＨｓｉＪ４ｔｏｓｓｓ・２ＨｘＯ）として
計算値　Ｃ６０，５９％　Ｈ６，８７％　Ｎ　１１．８
７％測定値　Ｃ６０，３５％　Ｈ６，７９％　Ｎ　１１
．６９％アミノ酸組成；Ａｓｐ　Ｏ，９２（１、Ｔｈｒ　２．８８（３）、Ｓｅ
ｔ　１．０５（１）。

Ｇｌｕ　３．０８（３、Ｐｒｏ　１．９９（２）、Ｇｌ
ｙ　１．９６（２１゜Ａｌａ　Ｏ，９８（１、Ｖａｌ　
Ｏ，９８（１）、Ｌｅｕ　３．０９（３）。

Ｔｙｒ　Ｏ，９２（１、Ｈｉｓ　Ｏ，９３（１）、Ｌｙ
ｓ　２．１６（２）。

Ａｒｇ　１．０６（１ −Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ２，９ｇ及びＨＯＢｔ
　０．３３ｇをＤＭＦ　２００ｍ１に溶解し、これに水
冷下、ＴＥＡでｐＨ４，０に調整した後、ＷＳＣ０，４
５ｍＪを添加した。０℃で１時間、室温で一夜撹拌後、
減圧濃縮した。残渣にＩＮ　ＨＣＩを加えて固化、ＤＭ
Ｆ−酢酸エチルで１回、ＤＭＦ−メタノールで２回再結
晶化して、標記目的物９．０ｇ　（収率９６．１％）を
得た。

Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨｇの製造Ｃ０
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−Ｌｅｕ
−３ｅｒ　（Ｂｚ）　−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ）−
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−
Ｔｈｒ　（Ｂｚ）　−Ｔｙｒ　（Ｂｚ）　−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ　（Ｔｏｓ）　−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ　−Ａｓｐ　（
ＯＢｚｌ　−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
　（Ｂｚ）　−Ｐｒｏ−ＮＨｇ　４．７ｇをフッ化水素
７５ｍ７とアニソール８ｍｌ中で０℃で３０分間反応さ
せた０反応後、フッ化水素を留去し、残渣をエーテルで
処理し、析出した生成物を消散し、水酸化ナトリウム上
で真空乾燥した。これをＩＭ酢酸溶液１５０ｍｆに溶解
し、Ｄｏｗｅｘ　１−Ｘ４　（酢酸型）に通し、流出液
を凍結乾燥して粉末３．０ｇを得た。

この粉末を０．０５Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に溶解し
、ＣＭ−セルロースを充填したカラム（４Ｘ３０ｃ＋ｎ
）上に注入し、　０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（
ｐＨ４，４）　５００ｍｆ〜０．１１Ｍ酢酸アンモニウ
ム水溶液（ｐＨ４，４１５００ｍ７の直線型濃度勾配溶
出（６０ｍｌ／時間）を行い、溶出液を１０ｍｆずつ分
画採取し、高速液体クロマトグラフィーにより分析し、
目的画分を集めて凍結乾燥して粉末６０１ｍｇを得た。

この粉末を０．１１１酢酸に溶解し、セファデックスＧ
−１０（２，２Ｘ　１１０ｃｍ）に注入し、０．１Ｍ酢
酸で溶出して目的画分を凍結乾燥して上記目的物５７２
ｍｇを得た。

ｍｐ　　２４１”Ｃ（分解）［ａ　］　　＝　−９４，６（Ｃ：１．０．　ＩＭＡｃ
ＯＨ１元素分析　（Ｃ１４゜Ｈ！ｎ４Ｎ４□０４．・２
ＣＨＩＣＯＯＨ・５Ｈ，０）として計算値　Ｃ５１，０８％　Ｈ７，３９％　Ｎ　１６．４
６％測定値　Ｃ５１，００％　■７．５０％　Ｎ　１６
．４２％アミノ酸組成；Ａｓｐ　Ｏ，９４（１１，Ｔｈｒ　２．９２（３）、Ｓ
ｅｔ　１．０７（１）。

Ｇｌｕ　３．０８（３）、Ｐｒｏ　２．０１（２）、Ｇ
ｌｙ　２．００（２）。

Ａｌａ　１．００（１）、Ｖａｌ　Ｇ、９［１）、Ｌｅ
ｕ　３．０９（３１゜Ｔｙｒ　Ｏ，９４（１）、Ｈｉｓ
　Ｏ，９５（１１，Ｌｙｓ　２．１Ｇ（２）。

Ａｒｇ　１．０６（１１［発明の効果］本発明の方法によれば、既知の合成方法に比べて、以下
に述べるような利点があり、工業的に極めて有用である
。

イ）酵素反応による生成物は反応系外に沈殿するため、
溶媒を濃縮することなく処理することができ、沈殿によ
り目的とする生成物が得られる確率が高くなるため、収
率よく合成できる。

ロ）酵素反応の性質上、副反応を伴わず反応させること
ができ、しかもうセミ体を伴わず合成することができる
。

ハ）未反応物と共に、副生成物は酵素分解することによ
り、回収再利用できるので工業的に有利である。

固相合成法では、さらに以下に述べるような利点がある
。

イ）固相反応は、通常樹脂を高希釈条件下で実施するた
め、溶媒を多量に使用し、処理が困難になるが、本誌に
よれば、これらの溶媒を濃縮することなく処理すること
ができる。

口）また固相合成法では、樹脂なカラムに充填して行う
ため、縮合した化合物はほとんどが単量体環化物で得ら
れるので、精製が容易である。

ハ）固相合成法は、液相法による鎖長延長に伴う不溶化
を考える必要がないなど、操作が単純であり、短期間で
の合成が可能である。

また、修飾蛋白分解酵素を用いる方法では、以下に述べ
るような利点を有する。

イ）修飾酵素を用いる反応では、水を含まない又は含水
率の低い水混和性有機溶媒で行われるため、回収溶媒の
濃縮が容易である。

口）修飾酵素を用いる反応は、水を含まない又は含水率
の低い有機溶媒中で行われるため、平衡反応のペプチド
合成反応が優位で収率よく行われる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中、ＡはＳｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａを、ＢはＡｓｎ
又はＳｅｒを、Ｘは水酸基又はペプチド化学で常用のカ
ルボキシル基の保護基又はアミノ酸残基もしくはペプチ
ド残基を、ｎは３〜７の整数を表し、各アミノ酸残基は
ペプチド化学で常用の保護基で保護されていてもよい）で示されるペプチドを蛋白分解酵素で処理することを特
徴とする次式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II）（式中の記号は前記と同義である）で示されるペプチドの製造方法。
（２）次式（ I ａ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ）（式中、ＡはＳｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａを、ＢはＡｓｎ
又はＳｅｒを、Ｘ′は直接結合又はアミノ酸残基もしく
はペプチド残基を、ＲＥＧＩＮは不溶性樹脂残基を、ｎ
は３〜７の整数を表し、各アミノ酸残基はペプチド化学
で常用の保護基で保護されていてもよい）で示されるペプチド樹脂を蛋白分解酵素で処理して次式
（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III）（式中の記号は前記と同義である）で示されるペプチド樹脂を得、次いで、不溶性樹脂を脱離させることを特徴とする次式（IIａ）
： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）（式中、ｘ″は水酸基、アミノ基又はアミノ酸残基もし
くはペプチド残基を表し、他の記号は前記と同義である
）で示されるペプチドの製造方法。
（３）請求項１又は２における蛋白分解酵素の代りに、
ポリエチレングリコール誘導体で修飾された蛋白分解酵
素を用いる式（II）又は式（IIａ）で示されるペプチド
の製造方法。