RU2073010C1 - Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе - Google Patents
Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2073010C1 RU2073010C1 RU9494039975A RU94039975A RU2073010C1 RU 2073010 C1 RU2073010 C1 RU 2073010C1 RU 9494039975 A RU9494039975 A RU 9494039975A RU 94039975 A RU94039975 A RU 94039975A RU 2073010 C1 RU2073010 C1 RU 2073010C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- synthesis
- lysine
- protected
- solution
- cys
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Использование: в препаративном пептидном синтезе лизин-вазопрессина в растворе. Сущность изобретения: продукт: лизин-вазопрессин, выход 47-48 проц. , биологическая активность 270,3 МЕ/мг. Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией фрагментов по схеме в соответствии с последовательностью аминокислотных остатков (3+4)+2, причем альфа-аминогруппы цистеинов, глутамина и аспарагина защищены бутилоксикарбонильной защитной группой, альфа-аминогруппы тирозина, фенилаланина, лизина, пролина и глицина защищены бензилоксикарбонильной защитной группой, гидроксильная группа тирозина защищена трет-бутильной защитной группой, эпсилон-аминогруппа лизина защищена бутилоксикарбонильной защитной гуппой, меркаптогруппы цистеинов защищены ацетамидометильной защитной группой, а карбоксильные группы фенилаланина и пролина защищены фенилгидразитной защитной группой, которая используется на стадии синтеза фрагментов и удаляется перед конденсацией фрагментов. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Изобретение относится к области органической химии, в частности к области препаративного пептидного синтеза лизин-вазопрессина в растворе.
Лизин-вазопрессин относится к нейрогипофизарным гормонам, продуцируемым ядрами гипоталамуса головного мозга. Лизин-вазопрессин обладает вазопрессорной и утеротонической активностью и используется в медицине (препараты Diapid, Insipidin, Lypressin).
Известно несколько способов химического синтеза лизин-вазопрессина в растворе [1] Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ синтеза лизин-вазопрессина, предложенный в [2] Способ включает последовательное наращивание пептидной цепи, причем в качестве боковых защитных групп используется OBut (для гидроксильной группы тирозина), ВОС (для ε-аминогруппы лизина и a-аминогруппы Cys1), Acm (для меркаптогруппы цистеинов), Z для a-аминогруппы Pro и изопропилиденаминооксикарбонила (Раос) (для a-аминогрупп Tyr, Phe, Gln, Asn и Cys6). Циклизацию линейного пептида проводят обработкой иодом в слабокислой среде метанол/трифторэтанол. Для выделения конечного продукта из реакционной смеси используют комбинацию хроматографических методов - гельпроникающую и ионообменную хроматографию (см. фиг. 1, 2).
Недостатками известного способа являются:
1. Использование коммерчески недоступной изопропилиденаминооксикарбонильной защитной группы;
2. Использование главным образом в схеме последовательного наращивания пептидной цепи, что существенно усложняет применение этого способа для синтеза аналогов [1]
3. Использование токсичного метанола на стадии циклизации, что ухудшает технологичность схемы;
4. Наличие стадии упаривания разбавленного раствора конечного продукта по окончании реакции циклизации.
1. Использование коммерчески недоступной изопропилиденаминооксикарбонильной защитной группы;
2. Использование главным образом в схеме последовательного наращивания пептидной цепи, что существенно усложняет применение этого способа для синтеза аналогов [1]
3. Использование токсичного метанола на стадии циклизации, что ухудшает технологичность схемы;
4. Наличие стадии упаривания разбавленного раствора конечного продукта по окончании реакции циклизации.
Целью изобретения является удешевление и расширение технологических возможностей способа.
Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией фрагментов (3+4)+2, причем a-аминогруппы цистеинов, глутамина и аспарагина защищены бутилоксикарбонильной защитной группой, a-аминогруппы тирозина, фенилаланина, лизина, пролина и глицина защищены бензилоксикарбонильной защитной группой, гидроксильная группа тирозина защищена трет-бутильной защитной группой, e-аминогруппа лизина защищена бутилоксикарбонильной защитной группой, меркаптогруппы цистеинов защищены ацетамидометильной защитной группой, а карбоксильные группы фенилаланина и пролина защищены фенилгидразидной защитной группой, которая используется на стадии синтеза фрагментов и удаляется перед конденсацией фрагментов (см. фиг.3, 4).
Заявляемое техническое решение является новым, т.к. ранее не была описана настоящая схема синтеза.
Заявляемое техническое решение имеет изобретательский уровень, т.к. оно явным образом не следует из уровня техники.
Заявляемое техническое решение является промышленно применимым, т.к. настоящая схема синтеза позволяет осуществлять препаративный синтез лизин-вазопрессина.
Заявляемое техническое решение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Синтез Z-Gly-NH2.
8,05 г Z-Gly-OH (38,47 ммоль) растворяют в 80 мл ДМФА, добавляют 4,87 мл (38,5 ммоль) N-этилморфолина, охлаждают до -36oC и добавляют при интенсивном перемешивании порциями в течение 30 сек 5,5 мл (42,35 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин начинают добавлять (в течение 1,5 мин) 4,45 мл 25%-ного водного аммиака. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают, остаток растворяют в 400 мл хлороформа, промывают 1 н серной кислотой в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, насыщенным раствором карбоната натрия и водой, упаривают и остаток кристаллизуют в эфире. Выход 1,60 г, 15,4 ммоль, 40,0%
Пример 2. Синтез Z-Lys(BOC)-Gly-NH2.
Пример 2. Синтез Z-Lys(BOC)-Gly-NH2.
3,748 г Z-Gly-NH2 (18 ммоль) гидрируют в метаноле над Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, растворяют в 20 мл ДМФА и добавляют 6,847 г Z-Lys(BOC)-OH (18 ммоль) и 2,43 г HOBt. Реакционную смесь охлаждают до 0oC и добавляют 3,78 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают сутки, отфильтровывают дициклогексилмочевину, упаривают ДМФА и остаток растворяют в 500 мл этилацетата. Органический раствор промывают последовательно 1 н фосфорной кислотой, водой, 5%-ным водным раствором соды и водой до нейтральной реакции. Упаривают досуха и остаток кристаллизуют эфиром. Выход 7,44 г, 17 ммоль, 95%
Пример 3. Синтез Z-Phe-NHNH-C6H5.
Пример 3. Синтез Z-Phe-NHNH-C6H5.
16,16 г Z-Phe-OH (54 ммоль), 6,48 г фенилгидразина (60 ммоль) и 7,29 г HOBt растворяют в 100 мл ДМФА, охлаждают до 0oС и добавляют 11,34 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают сутки, отфильровывают дициклогексилмочевину, упаривают ДМФА и остаток растворяют в 500 мл этилацетата. Органический раствор промывают последовательно 1 н фосфорной кислотой, водой, 5%-ным водным раствором соды и водой до нейтральной реакции. Упаривают досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата/гексана. Выход 16,844 г, 43,3 ммоль, 80,2%
Пример 4. Синтез Z-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5.
Пример 4. Синтез Z-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5.
7 г Z-Phe-NHNH-C6H5 (18 ммоль) гидрируют в метаноле над Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, растворяют в 20 мл ДМФА и добавляют 6,685 г Z-Tyr(But)-OH (18 ммоль) и 2,43 г HOBt. Реакционную смесь охлаждают до 0oC и добавляют 3,78 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 24 ч, отфильтровывают ДЦГМ, упаривают фильтрат и остаток растворяют в 300 мл хлороформа. Раствор промывают последовательно 1 н серной кислотой, водой, 5%-ным раствором соды и снова водой до нейтральной реакции. Органический раствор упаривают досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата/гексана. Выход 8,68 г, 14,26 ммоль, 79,2%
Пример 5. Синтез Z-Pro-NHNH-C6H5.
Пример 5. Синтез Z-Pro-NHNH-C6H5.
7,479 г Z-Pro-OH (30 ммоль), 3,78 г фенилгидразина (35 ммоль) и 1,35 г HOBt растворяют в 50 мл ДМФА, охлаждают до 0o C добавляют 6,3 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 24 ч, отфильтровывают ДЦГМ, упаривают фильтрат и остаток растворяют в 500 мл хлороформа. Раствор промывают последовательно 1 н серной кислотой, водой, 5%-ным раствором соды и снова водой до нейтральной реакции. Органический раствор упаривают досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата/гексана. Выход 8,754 г, 25,8 ммоль, 86%
Пример 6. Синтез ВОС-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
Пример 6. Синтез ВОС-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
5,09 г Z-Pro-NHNH-C6H5 (15 ммоль) гидрируют в метаноле над Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, растворяют в 50 мл ДМФА, добавляют 4,386 г BOC-Cys(Acm)-OH (15 ммоль) и 200 мг HOBt. Реакционную смесь охлаждают до 0oC и добавляют 3,15 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают сутки, отфильтровывают дициклогексилмочевину, упаривают ДМФА и остаток растворяют в 500 мл смеси бутанол/хлороформ (1:5). Органический раствор промывают последовательно 1 н фосфорной кислотой в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, 5% -ным раствором соды в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия до нейтральной реакции и водой. Упаривают досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата гексаном. Выход 6,521 г, 13,6 ммоль, 90,6%
Пример 7. Синтез ВОС-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
Пример 7. Синтез ВОС-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
8,487 г ВОС-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5 (17,7 ммоль) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты в присутствии 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин, упаривают на роторном испарителе и обрабатывают эфиром. Супернатант осторожно сливают, обработку эфиром повторяют и остаток растворяют в 50 мл метанола. К раствору добавляют 20 г ионообменной смолы Amberlite IRA-68 в гидроксильной форме, перемешивают, смолу отфильтровывают и фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют 6,359 г ВОС-Asn-ONp (18 ммоль) в ДМФА. Реакционную смесь перемешивают 24 ч, упаривают, растворяют в смеси 300 мл хлороформа и 150 мл бутанола, промывают 5% -ным раствором бикарбоната и водой, упаривают до объема 100 мл и высаживают гексаном. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из этилацетата гексаном. Выход 8 г, 13,48 ммоль, 76,1%
Пример 8. Синтез BOC-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
Пример 8. Синтез BOC-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
8 г ВОС-Asn-Cys(Asm)-Peo-NHNH-C6H5 (13,48 ммоль) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты в присутствии 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин, упаривают на роторном испарителе и обрабатывают эфиром. Супернатант осторожно сливают, обработку эфиром повторяют и остаток растворяют в 50 мл метанола. К раствору добавляют 20 г ионообменной смолы Amberlite IRA-68 в гидроксильной форме, перемешивают, смолу отфильтровывают и фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют 5,144 г ВОС-Gln-ONp (14 ммоль) в ДМФА. Реакционную смесь перемешивают 24 ч, упаривают, растворяют в смеси 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола, промывают водой, упаривают до объема 100 мл и высаживают гексаном. Осадок отфильтровывают и промывают на фильтре гексаном. Выход 8,1 г, 11,22 ммоль, 83,2%
Пример 9. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5.
Пример 9. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5.
4,869 г Z-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5 (8 ммоль) гидрируют в метаноле над Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, растворяют в 20 мл ДМФА и добавляют 2,339 г ВОС-Cys(Acm)-OH (8 ммоль) и 0,54 г HOBt. Реакционную смесь охлаждают до 0oC и добавляют 1,68 г ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 24 ч, отфильтровывают ДЦГМ, упаривают фильтрат и остаток растворяют в 300 мл хлороформа. Раствор промывают последовательно 1 н серной кислотой, водой, 5%-ным раствором соды и снова водой до нейтральной реакции. Органический раствор упаривают досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата/гексана. Выход 4,56 г, 6,09 ммоль, 76,1%
Пример 10. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-OH.
Пример 10. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-OH.
2,247 г ВОС-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-NHNH-C6H5 (3 ммоль) растворяют в смеси, содержащей 100 мл диоксана, 50 мл 1 М водного пиридинийацетатного буфера (готовится смешиванием эквимолярных количеств пиридина и уксусной кислоты, величина рН не контролируется), 30 мл уксусной кислоты и 2,5 мл 0,2 М водного раствора медного купороса. Реакционная смесь перемешивается в условиях, обеспечивающих свободный доступ кислорода воздуха. Протекание реакции контролировали методом ТСХ. По окончании реакции реакционную смесь упарили, остаток растворили в этилацетате, промыли 1 н серной кислотой, водой до нейтральной реакции, упарили и остаток кристаллизовали из эфира гексаном. Выход 1,72 г, 2,61 ммоль, 87,01%
Пример 11. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
Пример 11. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5.
2 г ВОС-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5 (2,77 ммоль) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты в присутствии 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мин, упаривают на роторном испарителе и обрабатывают эфиром. Супернатант осторожно сливают, обработку эфиром повторяют и остаток растворяют в 50 мл метанола. К раствору добавляют 20 г ионообменной смолы Amberlite IRA-68 в гидроксильной форме, перемешивают, смолу отфильтровывают и фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют 1,98 г ВОС-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-OH и 0,405 г HОBt в ДМФА. Реакционную смесь охлаждают и добавляют 0,63 г DCC. Смесь инкубируют 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают и растворяют в 50 мл бутанола и 200 мл хлороформа. Органический раствор промывают последовательно 1 н HCl, водой, карбонатом натрия и водой до нейтральной реакции, упаривают до небольшого объема и обрабатывают ацетоном. Полученный кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре гексаном и сушат на воздухе. Выход 3,156 г, 2,5 ммоль, 90,3%
Пример 12. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH.
Пример 12. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH.
3,156 г BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-NHNH-C6H5 (2,5 ммоль) растворяют в смеси 25 мл 1 М пиридиний ацетатного буфера в ДМФА, 50 мл диоксана и 30 мл 20%-ной водной уксусной кислоты. Добавляют 500 мг медного купороса и перемешивают 24 ч в условиях, обеспечивающих свободный доступ кислорода воздуха. По окончании реакции реакционную смесь упаривают и остаток растворяют в 200 мл смеси хлороформ/бутанол 4:1. Органический раствор промывают 1 н HCl в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия и водой до нейтральной реакции, упаривают до небольшого объема, высаживают петролейным эфиром. Полученный кристаллический осадок фильтруют, промывают на фильтре гексаном, перекристаллизовывают из метанола с эфиром и сушат на воздухе. Выход 2,12 г, 1,8 ммоль, 72,2%
Пример 13. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2.
Пример 13. Синтез BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2.
1,783 г Z-Lys(BOC)-Gly-NH2 (2,0 ммоль) гидрируют в метаноле над Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, растворяют в ДМФА, добавляют 2,12 г BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH (1,8 ммоль), охлаждают и добавляют 0,42 г ДЦГК (2 ммоль) и 0,27 г НОВТ. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, упаривают фильтрат досуха и остаток кристаллизуют из метанола эфиром. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из ацетона. Выход 1,85 г, 1,27 ммоль, 70,5%
Пример 14. Синтез Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Сys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2.
Пример 14. Синтез Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Сys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2.
1,85 г BOC-Cys(Acm)-Tyr(But)-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2. (1,27 ммоль) растворяют в смеси 10 мл анизола и 30 мл TFA. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, упаривают, остаток обрабатывают эфиром, полученный осадок отфильтровывают, тщательно промывают на фильтре эфиром и гексаном и высушивают. Полученный продукт по данным ВЭЖХ имеет чистоту выше 93% и может использоваться для проведения финальной стадии циклизации (см. пример 15) без дополнительной очистки. Выход 1,6 г, 1,12 ммоль, 88%
Пример 15. Синтез
1,6 г Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (1,12 ммоль) растворяют в 1,12 л 5%-ной уксусной кислоты и добавляют 24,6 мл 0,1 М (2,46 ммоль) раствора иода в метаноле. За протеканием реакции следят методом ВЭЖХ. По окончании реакции добавляют твердый тиосульфат натрия до обесцвечивания, и реакционную смесь наносят на колонку 5х20 см, содержащую SP-sephadex, уравновешенный 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером. Колонку промывают тем же буфером и элюируют в градиенте ионной силы 0,2-0,5 М. Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 95% собирают, упаривают до небольшого объема и наносят на колонку, содержащую Toyopearl HW-40, уравновешенный 2%-ной уксусной кислотой. Колонку промывают тем же элюентом и собирают фракции. Фракции, содержащие конечный продукт с чистотой выше 98% объединяют и лиофилизуют. При необходимости процедуру очистки повторяют. Выход 0,619 г, 0,53 ммоль, 47% Аминокислотный анализ (вычислено/найдено Asx 1,00/1,01, Glx 1,00/1,01, Pro 1,00/1,00, Gly 1,00/1,00, Cys 2,00/1,52, Tyr 1,00/0,87, Phe 1,00/0,99, Lys 1,00/1,02. Биологическая активность 270,3 МЕ/мг.
Пример 15. Синтез
1,6 г Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (1,12 ммоль) растворяют в 1,12 л 5%-ной уксусной кислоты и добавляют 24,6 мл 0,1 М (2,46 ммоль) раствора иода в метаноле. За протеканием реакции следят методом ВЭЖХ. По окончании реакции добавляют твердый тиосульфат натрия до обесцвечивания, и реакционную смесь наносят на колонку 5х20 см, содержащую SP-sephadex, уравновешенный 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером. Колонку промывают тем же буфером и элюируют в градиенте ионной силы 0,2-0,5 М. Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 95% собирают, упаривают до небольшого объема и наносят на колонку, содержащую Toyopearl HW-40, уравновешенный 2%-ной уксусной кислотой. Колонку промывают тем же элюентом и собирают фракции. Фракции, содержащие конечный продукт с чистотой выше 98% объединяют и лиофилизуют. При необходимости процедуру очистки повторяют. Выход 0,619 г, 0,53 ммоль, 47% Аминокислотный анализ (вычислено/найдено Asx 1,00/1,01, Glx 1,00/1,01, Pro 1,00/1,00, Gly 1,00/1,00, Cys 2,00/1,52, Tyr 1,00/0,87, Phe 1,00/0,99, Lys 1,00/1,02. Биологическая активность 270,3 МЕ/мг.
Пример 16. Синтез 
1,6 г Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (1,12 ммоль) растворяют в 1,12 л 20%-ной уксусной кислоты и добавляют 24,6 мл 0,1 М (2,46 ммоль) раствора иода в метаноле. За протеканием реакции следят методом ВЭЖХ. По окончании реакции добавляют твердый тиосульфат натрия до обесцвечивания, и реакционную смесь наносят на колонку 5х20 см, содержащую SP-sephadex, уравновешенный 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером. Колонку промывают тем же буфером и элюируют в градиенте ионной силы 0,2-0,5 М. Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 95% собирают, упаривают до небольшого объема и наносят на колонку, содержащую Toyopearl HW-40, уравновешенный 2%-ной уксусной кислотой. Колонку промывают тем же элюентом и собирают фракции. Фракции, содержащие конечный продукт с чистотой выше 98% объединяют и лиофилизуют. При необходимости процедуру очистки повторяют. Выход 0,635 г, 0,54 ммоль, 48% Аминокислотный анализ (вычислено/найдено Asx 1,00/1,01, Glx 1,00/1,01, Pro 1,00/1,00, Gly 1,00/1,00, Cys 2,00/1,52, Tyr 1,00/0,87, Phe 1,00/0,99, Lys 1,00/1,02. Биологическая активность 270,3 МЕ/мг.
1,6 г Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2 (1,12 ммоль) растворяют в 1,12 л 20%-ной уксусной кислоты и добавляют 24,6 мл 0,1 М (2,46 ммоль) раствора иода в метаноле. За протеканием реакции следят методом ВЭЖХ. По окончании реакции добавляют твердый тиосульфат натрия до обесцвечивания, и реакционную смесь наносят на колонку 5х20 см, содержащую SP-sephadex, уравновешенный 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером. Колонку промывают тем же буфером и элюируют в градиенте ионной силы 0,2-0,5 М. Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 95% собирают, упаривают до небольшого объема и наносят на колонку, содержащую Toyopearl HW-40, уравновешенный 2%-ной уксусной кислотой. Колонку промывают тем же элюентом и собирают фракции. Фракции, содержащие конечный продукт с чистотой выше 98% объединяют и лиофилизуют. При необходимости процедуру очистки повторяют. Выход 0,635 г, 0,54 ммоль, 48% Аминокислотный анализ (вычислено/найдено Asx 1,00/1,01, Glx 1,00/1,01, Pro 1,00/1,00, Gly 1,00/1,00, Cys 2,00/1,52, Tyr 1,00/0,87, Phe 1,00/0,99, Lys 1,00/1,02. Биологическая активность 270,3 МЕ/мг.
Список используемых сокращений: ДМФА диметилформамид, ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид, HOBt N-гидроксибензотриазол, AcOH уксусная кислота. Py пиридин, TFA трифторуксусная кислота, РН фенилгидразид, ТСХ тонкослойная хроматография, Z бензилоксикарбонил, ВОС - трет-бутилоксикарбонил, РАОС изопропилиденоксикарбонил, Acm - ацетамидометил, ОРСР пентахлорфенил, OSu гидроксисукцинил, ONp - пара-нитрофенил.
Claims (2)
1. Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе, включающий последовательно-параллельное наращивание пептидной цепи путем конденсации защищенных аминокислот с использованием активных эфиров и дициклогексилкарбодиимида, причем в качестве защитных групп используются ацетамидометил для защиты тиогруппы цистеинов, But для гидроксильной группы тирозина, ВОС для ε-аминогруппы лизина и a-аминогруппы Cys1, Z для a-аминогруппы пролина и защитные группы уретанового типа для a-аминогрупп остальных аминокислот, циклизацию осуществляют обработкой разбавленного раствора линейного пептида йодом в слабокислой среде и по окончании циклизации конечный продукт выделяют методом ионообменной и гель-проникающей хроматографии, отличающийся тем, что наращивание пептидной цепи осуществляют по схеме (3 + 4) + 2, используется Z для защиты a -аминогрупп глицина, лизина, фенилаланина и тирозина, используется ВОС для защиты a -аминогрупп глутамина, аспарагина и Cys2, a-карбоксильные группы фенилаланина и пролина защищены фенилгидразидной защитной группой, которая используется на стадии синтеза фрагментов и удаляется перед конденсацией фрагментов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что циклизацию проводят в среде 5 - 20%-ной уксусной кислоты, а выделение продукта из реакционной смеси проводят методом ионообменной хроматографии на SP-сефадексе в градиенте пиридиний-ацетатного буфера с последующей очисткой методом гель-проникающей хроматографии на Toyopearl.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU9494039975A RU2073010C1 (ru) | 1994-10-26 | 1994-10-26 | Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU9494039975A RU2073010C1 (ru) | 1994-10-26 | 1994-10-26 | Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94039975A RU94039975A (ru) | 1996-08-20 |
| RU2073010C1 true RU2073010C1 (ru) | 1997-02-10 |
Family
ID=20162079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU9494039975A RU2073010C1 (ru) | 1994-10-26 | 1994-10-26 | Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2073010C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110172086A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-27 | 深圳深创生物科技有限公司 | 一种抗利尿和升血压多肽药物的制备方法 |
-
1994
- 1994-10-26 RU RU9494039975A patent/RU2073010C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Папсуевич О.С., Чипенс Г.И., Михайлова С.В. Нейрогипофизарные гормоны. - Рига, Зинатне, 1986. 2. D.Gillesen, A.Trzeciak in Neurohypophyseal Peptide Hormones and Other Biologically Active Peptides./ Ed. by D.H.Schlesinger, 1981, Amsterdam, p.37-47. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110172086A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-27 | 深圳深创生物科技有限公司 | 一种抗利尿和升血压多肽药物的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94039975A (ru) | 1996-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rich et al. | Synthesis of tentoxin and related dehydro cyclic tetrapeptides | |
| Wang et al. | SOLID PHASE SYNTHESIS OF BOVINE PITUITARY GROWTH HORMONE‐(123–131) NONAPEPTIDE | |
| US3749703A (en) | Asn15-bovine thyrocalcitonin | |
| WAKIMASU et al. | 4-Methoxy-2, 3, 6-trimethylbenzenesulfonyl (Mtr): a new amino and imidazole protecting group in peptide synthesis | |
| Izeboud et al. | Synthesis of substance P via its sulfoxide by the repetitive excess mixed anhydride (REMA) method | |
| JPS60226898A (ja) | 新規ゴナドリベリン誘導体およびその製造方法 | |
| RU2073010C1 (ru) | Способ синтеза лизин-вазопрессина в растворе | |
| ORLOWSKA et al. | Sequence dependence in the formation of pyroglutamyl peptides in solid phase peptide synthesis | |
| JPS58140024A (ja) | セクレチンの精製方法 | |
| US6448031B1 (en) | Process for producing LH-RH derivatives | |
| Hofmann et al. | Studies with the S-peptide-S-protein system: The role of glutamic acid-2, lysine-7, and methionine-13 in S-peptide1–14 for binding to and activation of S-protein | |
| US5059679A (en) | Method of selectively sulfating peptides | |
| FujINo et al. | Synthesis of Porcine Motilin and Its D-Phe1-Analog by the Use of Methanesulfonic Acid | |
| EP0360481B1 (en) | New pentapeptide and a process for the preparation thereof | |
| GB2109796A (en) | Anorexigenic tripeptides, process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them | |
| Van Nispen et al. | Synthesis and charge‐transfer properties of two ACTH analogues containing pentamethylphenylalanine in position 9 | |
| US4315853A (en) | Polyprenylpeptides and their production | |
| Schattenkerk et al. | Studies on polypeptides xiv synthesis of possible rennin substrates | |
| OGAWA et al. | Studies on Peptides. LXIV. Synthesis of the Tritetracontapeptide corresponding to the Entire Amino Acid Sequence of Porcine Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) | |
| US4962225A (en) | Aspartic acid derivatives | |
| Hashimoto et al. | Synthesis of a protected sperm whale myoglobin-(77-96)-eicosapeptide and circular dichroism spectra of the related peptides. | |
| Moroder et al. | Studies on cytochrome c. Part VI. Synthesis of the protected pentadecapeptide (sequence 67–81) of Baker's yeast iso‐I‐cytochrome c | |
| KUNO et al. | Studies on Peptides. CXL.: Synthesis of Human Gastrin-Releasing Polypeptide (hGRP) | |
| SASAKI et al. | Studies on α2-Plasmin Inhibitor Fragment T-11. III. Structure-Activity Relationships among the Fragments of T-11, the Plasminogen Binding Site (s) of Human α2-Plasmin Inhibitor | |
| JP3379950B2 (ja) | 新規なペプチド |