JPH0220293A - 抗腫瘍抗生物質ＬＬ―Ｅ３３２８８γ↓２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ３３’２８８γ２好気
性発酵によりヨード又はブロム同族体のいずれかとして
製造する方法に関する。

要するに本発明は抗腫瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ　３３２８８
γ２−Ｂｔ−及びＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−Ｉの新規な
好気性発酵法を記述する。

−緒にしてＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の抗生
物質及び抗腫瘍剤の同族体は、一連の関連米国特許願、
即ち１９８４年１１月１６日付けの特許願第６７２，０
３１号、１９８５年１０月１７日付けの特許願第７８７
，０６６号、及び１９８７年１月３０日付けの特許願第
００９，３２１号に記述され且つ特許請求されている。

これらの特許願は、Ｌ’Ｌ−Ｅ３３２８８複合体、その
成分、即ちＬ　Ｌ−Ｅ　３３２８８　ａ　＋　　１３　
ｒ、ＬＬ−Ｅ３３２８８α＋　　Ｉ、ＬＬ　　Ｅ３３２
８８（Ｚ２　　Ｂｒ、ＬＬ　　Ｅ３３２８８１Ｊ２　１
．Ｌ、Ｉ−。

Ｆ、　３３２８８　ａ　３Ｂ　ｒ　、　Ｌ　Ｌ　’　Ｅ
　３３２８８ａ３−１．ＬＬ−Ｅ３３２８８α’、−Ｂ
ｒ、Ｉ−ＬＥ３３２８８β、−Ｂｒ、Ｌ、Ｌ−Ｅ３３２
８８β１、ＬＬ−Ｅ３３２８８β２−Ｂｒ、ＬＬ−Ｅ３
３２８８β２−１．ＬＬ−Ｅ３３２８８γＢ　ｒ　、　
ＬＬ　　Ｅ　３３２８８　ｒ　＋　　Ｉ　、及びＬＬＥ
３３２８８δ、−１及びこれらの、ミクロモノスポラ・
エチノスポラ亜種カリチエンシス或いはその天然の又は
誘導された変種の新しい種を用いる好気性発酵による製
造法を記述している。

本発明は抗腫瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２好気性
発酵によりヨード又はブロム同族体のいずれかとして製
造する方法に関する。

ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−■は次の試験において示され
るように抗腫瘍剤として活性である。

リンパ球　血　Ｐ３８８試験 用いた動物はＢ　Ｄ　Ｆ　＋の雌のマウスであった。

試験群当り５又は６匹のマウスを用いた。腫瘍の移植は
、リンパ球白血病Ｐ３８８の細胞１×１０６コを含む希
腹水液０．５ｍｌの腹腔的注射により、０白目として行
なった。次いで試験化合物を、無菌の、発熱物質を含ま
ない食塩水中０．５ｍｌの容量で、〈腫瘍移植に対して
）１．５及び９白目に指示投薬量で腹腔内投与した。３
０日間にわたり規則的な基準でマウスを秤量し、生存数
を記録した。

処置した（Ｔ）／未処置の（Ｃ）動物に対する中位生存
期間を計算した。結果を第１表に示す。

メラニン沈着黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｔｉｃ　　Ｍｅ　ｌ
　ａｎｏｍａ）Ｂ１６試験 用いた動物はＢＤＦｌの雌のマウスであった。

試験当り５又は６匹のマウスを用いた。メラニン沈着黒
色ＪｉＢ　１６の腫瘍の１ｇ部分を、バランスのとれた
冷塩溶液１０ｍ１中で均質化し、そしてこの均質化物の
０．５＋ｎＮ画分を試験マウスの各に腹腔内移植した。

次いで試験化合物を１〜９日目日日ｌｉ瘍接種日に対し
て）に指示投薬量で腹腔内投与した。６０日間にわたり
規則的な基準でマウスを秤量し、生存数を記録した。処
置しな（Ｔ）／未処置の（Ｃ）動物に対する割合及び中
位生存期間を計算した。結果を第■表に示す。

第■表 ＬＬ−Ｅ３３２８８０．００５　　　　　　　３４　　
　　　　　１６２γ２−１　　　０．００２５　　　　
　３８　　　　　　１８１０．００１２５　　　　　３
３．５　　　　　　１６００．０００６　　　　　　２
８．５　　　　　　１３６０．０００３　　　　　　２
６　　　　　　　　１２４ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−１
は第１図に示す紫外線スペクトル、第１Ｉ図に示すプロ
トン核磁気共鳴スペクトル、第■図に示す赤外線スペク
トル、及び第■図に示す質量スペクトルを有する。

ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−Ｉは以下に示す如き推定構造
を有する： 抗腫瘍剤ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２１及びＬＬＥ３３２８
８γ２−Ｂｒはミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種カ
リチエンシスの新種の制御された条件下での培養中に生
成しうる。この微生物はアメリカン・サイアナミド社医
学研究部門（Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ＋Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｃｙａｎａｍ
ｉｄＣｏ、、Ｐｅａｒｌ　　Ｒｉｖｅｒ＋Ｎｅｗ　　Ｙ
。

ｒｋ）のカルチャー・コレクションに培養物番号ＬＬ−
Ｅ３３２８８として保管されている。この新しい微生物
の生活培養物は、米国農業省北部研究センター、カルチ
ャー・コレクション研究所（Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ＋Ｎｏｔｈｅｒｎ　　ＲｅｇｉｏｎａＩ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｃｅｎｔｅｒ、、Ｕ、Ｓ、Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉ　１１．）に預託され。現在種表示
ＮＲＲＬ−１５８３９のもとに永久コレクションに加え
られている。２つの誘導された変種、即ちＬＬ−Ｒ３３
２８８γ２−Ｉ及びＬＬ−Ｒ３３２８８ｒ　２　　Ｂ　
ｒも生成するＬＬ−Ｒ３３２８８−Ｒ６６（ＮＲＲＬ−
１５９７５）及びＬＬ−Ｒ３３２８８−ＵＶ７８４（Ｎ
ＲＲＬ−１８１４９）もこの貯蔵所に預託しである。本
特許願の未決中における上記種表示のもとの該培養物へ
の接近は、Ｃ，Ｆ、Ｒ，＠１．１４及び３５Ｕ、Ｓ、Ｃ
，＠　１２２のちとに権利の与えられた特許及び登録商
標庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　　ｏｆ　　Ｐａ
ｔｅｎｔｓ　　ａｎｄ　　Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓ）によ
り決定されたものには可能となる。そのような培養物の
公共が利用する時のすべての制限は、本特許願が米国特
許として認められた場合、最終的にとり除かれよう。

ミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種カリチエンシスＮ
ＲＲＬ−１５８３９，１５９７１、又は１８１４９の培
養は多種類の液体培養媒体中で行なうことができる。Ｌ
Ｌ−Ｒ３３２８８γ、−１及びＬ　Ｌ　　Ｅ　３３２８
８　ｒ　２　　Ｂ　ｒの製造に有用な媒体は同化しうる
炭素源例えば殿粉、糖、糖蜜、グリセロールなど；同化
しうる窒素源例えば蛋白質、蛋白質加水分解物、ポリペ
プチド、アミノ酸、トウモロコシ浸漬液なと；及び無機
アニオン及びカチオン例えばカリウム、ナトリウム、ア
ンモニウム、カルシウム、サルフェート、カーボネニト
、ホスフェート、クロライドなど；及び臭素又はヨウ素
源例えば（ブロム誘導体が所望ならば）臭化ナトリウム
又は（ヨード誘導体が所望ならば）ヨウ化カリウム、を
含む。痕跡量の元素例えばホウ素、モリブデン、銅など
は媒体の他の成分の不純物として供給される。タンク及
びビンでのばっ気は、無菌の空気を発酵媒体中に又はそ
の表面上に強制的に送入することによって供給される。

タンク中での更なる撹拌は機械的な羽根によって付与さ
れる。消泡剤例えばシリコーンも必要に応じて添加しう
る。

本発明は以下の限定を意味しない特別な実施例と関連し
て更に詳細に記述されよう。

実施例１ 隻長蔓α４１ １次接種物を生長させるために用いた代表的な媒体を次
の配合に従って準備した： ビーフ抽出物　　　約０．３％ トリプトン　　　　約０．５％ デキストロース　　約０．５％ デキストリン　　　約２．４％ 炭酸カルシウム　　約０．４％ イースト抽出物　　約０，５％ 水　　　１００％にするのに十分な量 この媒体をｐＨ７，０に調節し、次いで殺菌した。この
無菌媒体１００ｍ１’部分をフラスコ中に入れ、これに
培養物ＮＲＲＬ−１５８３９の凍結した菌糸を接種した
。この接種した媒体を回転振とう機にとりつけ、３２℃
で４８時間激しく撹拌した。次いでこの接種した媒体を
用いて、１４Ｉの発酵器内の上記無菌媒体１０１に接種
した。この媒体を撹拌しなから４８時間３２℃に保温し
て２次接種物を得た。次いでこの２次接種物を用いて、
タンク内の上記無菌媒体３００１に接種し、そして羽根
を１８０〜２０Ｏｒｐｍで駆動させることによって撹拌
しなから３０℃で４８時間培養し、３次又は種接種物を
得た。

実施例２ 久４久ル降 発酵媒体を次の配合に従って準備した：デキストロース
　　　　　　　　約０．５％サクロース　　　　　　　
　　　約１．５％ペプトン、バクテリヤ学的純度級　約
０．２％二二塩性性燐酸カリウム　　　約０．０１％Ｉ
Ｉ蜜　　　　　　　　　　　約０．５％炭酸カルシウム
　　　　　　　　約０．５％ヨウ素源＊　　　　　　　
　　　痕跡量水　　　　　１００％にするのに十分な量
＊Ｌ　Ｌ　　Ｅ　３３２８８　ｒ　２　　Ｂ　ｒを製造
する場合には、痕跡量の臭素源を用いるべきである。

上記媒体の２８００１部分を殺菌し、次いで実施例１に
記述した如く製造した３次（種）接種物３００−Ｉを接
種した。ばつ気は無菌空気０．５３１／マツシュｌ／分
の速度で行ない、１１０ｒｐｍで駆動する羽根で撹拌し
た。温度を約２８℃に保ち、発酵を約９７時間後に終了
させ、この時点でマツシュを収穫した。

この発酵は、抗バクテリヤ活性、生化学的誘導分析、Ｔ
ＬＣ及びＨＰＬＣ分析によＬＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−
Ｉの製造に関して監視した。

実施例３ ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−１及びＬＬ−Ｅ３３２８８δ
、−Ｉの　合　の予　的 実施例２に記述した如く行なった発酵からの全収穫マツ
シュをｐＨ６に調節し、次いでマツシュの容量の１への
酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を脱溶媒し、
次いでメタノール及びヘキサン間に分配することによっ
て脱脂した。このメタノール相を乾固するまで濃縮した
。得られた粘稠なゴム状物を塩化メチレン中に入れ、シ
リカゲルでの清浄（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）クロマトグラフ
ィーに供した。所望の代謝物を、塩化メチレン中３〜５
％メタノールの段階的グラジェントを用いて分画した。

γ１−■、γ２−Ｉ、δ、−１及びεＩ代謝物を含有す
る回収された固体を、ウォータ−ズ（Ｗａｔｅ　ｒｓ）
ＬＣ１５００型分取装置により分割した。クロマトグラ
フィーは、アセトニトリル４５部及び０．２Ｍ酢酸アン
モニウム溶液（ＰＨ７，０＞５５部からなる溶媒系を用
いる逆相プレパック（Ｐｒｅｐａｋ）カートリッジによ
り行なった。このクロマトグラフィーで回収された物質
はＬ　Ｌ　−Ｅ　３３２８８γ２−１及びＬＬ−Ｅ　３
３２８８δ、−Ｉの混合物であった。

実施例４ ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−Ｉの単離 ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−Ｉ及びＬＬ−Ｅ　３３２８８
δ、−−Ｉを含有する実施例３の生成物の２５０１１１
ｇ部分を、Ｃ１８ボンダパック（Ｂ　ｏ　ｎ　ｄ　ａ　
ｐａｋ）担体〈粒径２５μ）の１インチの充填カラムに
仕込み、そしてセパレーションズ・テクノロジー・ラブ
（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　　Ｔｅｃｈｎｏ　ｌ　ｏｇ
ｙ　　Ｌａｂ）８００Ａ装置を用いてＨＰＬＣに供した
。この溶媒系はアセトニトリル３５部及び０．１Ｍ酢酸
アンモニウム（ｐＨ４．５）緩衝液６５部からなった。

２００＋ｍＺずつ画分を集めた。

＝１６− クロマトグラフィーは２５４ｎｍで監視した。画分２及
び３を一緒にし、脱溶媒し、そして酢酸エチルで抽出し
た。この抽出物を乾燥し、次いで数Ｍ１まで濃縮し、そ
して撹拌しなからヘキサン２０社に滴下した。沈殿を集
め、乾燥し、ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２１１３ｍｇを得た
。

実施例５ ＬＬ　　Ｅ３３２８８　２　　Ｉの ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−１及びＬ　Ｉ−−Ｅ　３３２
８８δ、−−Ｉを含有する実施例３の生成物１０４ｍｇ
部分をアセトニトリル３ｍｌに溶解した。この溶液に、
アセトニトリル０．２ｍ４中ジチオスレイトール１１．
２＋ａｇの溶液を添加した。２．５時間後、この混合物
を濾過し、炉液を７．５ｍｌまで希釈し、実施例４に記
述した如きＣｌ１ｌボンダパツクの１インチの充填した
カラムに仕込んだ。このカラムをアセトニトリル：０．
１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）［衝液（３５：６
５）で展開し、２４５　ｎ　ｍで監視し、そして２００
＋ｆｆｉずつ画分を集めた。両分３〜６を一緒にし、脱
溶媒し、酢酸エチルで抽出した。この抽出物を乾燥し、
２〜３ｍｌに濃縮し、そしてヘキサノ２０ｖ１１に滴下
した。得られた沈殿を集め、アセトンの沸とう温度で高
真空下に乾燥し、Ｌ　Ｌ　　Ｅ　３３２８８　ｒ　２　
　Ｉ　　１３　ｍｇを灰色がかった固体として得た。

実施例６ ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２−Ｉの　離 ＬＬ−Ｆ、３３２８８γ２−１及びＬＬ−Ｅ３３２８８
δ、−−Ｉを含む実施例３の生成物の２５０１１１ｇ部
分をアセトニトリル５．５ｍｌに溶解した。

この溶液にアセトニトリル０．５ｍｆ中ジチオスレイト
ール２５ｍｇの溶液を添加した。反応を１．５時間行な
い、次いで枦遇した。炉液を３〜４ｍｌまで濃縮し、同
容量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４’、５＞Ｍ衝
液を添加した。この混合物を実施例５に記述したように
クロマトグラフィーに供し、アセトニトリル：０．１Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐ　Ｈ４。

５）Ｗ衝液（３８：６２＞で展開した。流出物を２５４
ｎｍで監視し、２００ｉずつ画分を集めた。

画分３．４及び５を一緒にし、乾燥し、脱溶媒し、そし
て酢酸エチルで抽出した。この抽出物を乾燥し、数社ま
で濃縮し、撹拌しなからヘキサノ２０Ｍ１に滴下した。

この沈殿を集め且つ乾燥して、ＬＬ　−Ｅ　３３２８８
７−２　　Ｉ　　２５　ｍｇを灰色がかった固体として
得た。

【図面の簡単な説明】

第１．２．３、及び４図はＬＬ、−Ｅ３３２８８γ２−
Ｉの、それぞれ紫外線スペクトル、プロ１ヘン核磁気共
鳴スペクトル、赤外線スペクトル、及び質量スペクトル
を示す。 特許出願人　アメリカン・サイアナミド・カンパ手続補
正書（放） 平成１年７月　３日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 平成１年特許願第１２０６１９号 ２、発明の名称 抗腫瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ３３２８８γ２の製造法３、補
正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　アメリカン・サイアナミド・カンパニ４、代理人
　〒１０７ １、補正命令の日付 なし ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有機体ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒ
   ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）亜種カ
   リチエンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ−１
   ５８３９、又はＮＲＲＬ−１５９７５及びＮＲＲＬ−１
   ８１４９を含むその変種を、炭素、窒素、ヨウ素、及び
   無機塩の同化しうる源を含有する液体媒体中において、
   実質的な抗生物質活性が該媒体に付与されるまで好気的
   に発酵させ、次いでこれからＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２
   −Ｉを回収することを特徴とする抗腫瘍抗生物質ＬＬ−
   Ｅ３３２８８γ＿２−Ｉの製造法。 ２、炭素、窒素、ヨウ素及び無機塩の同化しうる源を含
   有し且つ有機体ミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種カ
   リチエンシスＮＲＲＬ−１５８２９、又はＮＲＲＬ−１
   ５９７５及びＮＲＲＬ−１８１４９を含むその変種の生
   活培養物を予め接種した液体媒体を好気的に発酵させ、
   該発酵培養物を約２４〜３２℃の温度で約９０〜２００
   時間維持し、マツシユを収穫し、そしてそれからＬＬ−
   Ｅ３３２８８γ＿２−Ｉを抽出することを特徴とする抗
   腫瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２−Ｉの製造法。 ３、有機体ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒ
   ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）亜種カ
   リチエンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ−１
   ５８３９、又はＮＲＲＬ−１５９７５及びＮＲＲＬ−１
   ８１４９を含むその変種を、炭素、窒素、ヨウ素、及び
   無機塩の同化しうる源を含有する液体媒体中において、
   実質的な抗生物質活性が該媒体に付与されるまで好気的
   に発酵させ、次いでこれからＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２
   −Ｂｒを回収することを特徴とする抗腫瘍抗生物質ＬＬ
   −Ｅ３３２８８γ＿２−Ｂｒの製造法。 ４、炭素、窒素、ヨウ素及び無機塩の同化しうる源を含
   有し且つ有機体ミクロモノスポラ・エチノスポラ亜種カ
   リチエンシスＮＲＲＬ−１５８２９、又はＮＲＲＬ−１
   ５９７５及びＮＲＲＬ−１８１４９を含むその変種の生
   活培養物を接種した液体媒体を好気的に発酵させ、該発
   酵培養物を約２４〜３２℃の温度で約９０〜２００時間
   維持し、マツシユを収穫し、そしてそれからＬＬ−Ｅ３
   ３２８８γ＿２−Ｂｒを抽出することを特徴とする抗腫
   瘍抗生物質ＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２−Ｂｒの製造法。 ５、ａ）マツシユをｐＨ６に調節し、そしてマツシユの
   容量の１／２の酢酸エチルで抽出し；ｂ）この酢酸エチ
   ル抽出物を、メタノール及びヘキサン間に分配すること
   により脱溶媒及び脱脂し； ｃ）メタノール部分を脱溶媒し、塩化メチレンに溶解し
   、そして塩化メチレン中３〜５％メタノールの段階的グ
   ラジエントで流出させるシリカゲルのクロマトグラフィ
   ーにかけ、そしてＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿１、ＬＬ−Ｅ
   ３３２８８γ＿２、ＬＬ−Ｅ３３２８８δ＿１及びＬＬ
   −Ｅ３３２８８εの混合物を得； ｄ）これらの成分を、溶媒系アセトニトリル：０．２Ｍ
   酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）（４５：５５）を用い
   る逆相クロマトグラフィーにより分画して、ＬＬ−Ｅ３
   ３２８８γ＿２及びＬＬ−Ｅ３３２８８δ＿１の混合物
   を得；そして ｅ）この混合物をアセトニトリル：０．１Ｍ酢酸アンモ
   ニウム（ｐＨ４．５）を用いるクロマトグラフィーで分
   画してＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２を得る、 工程を含んでなる特許請求の範囲第１〜４項記載のいず
   れかに記述した如く誘導される全収穫マツシユからのＬ
   Ｌ−Ｅ３３２８８γ＿２の抽出法。 ６、ａ）混合物をアセトニトリルに溶解し；ｂ）ジチオ
   スレイトールのアセトニトリル中溶液と反応させ； ｃ）アセトニトリル：０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
   ４．５）（３５：６５）で流出させるクロマトグラフィ
   ーで分離し； ｄ）活性画分を脱溶媒し且つ酢酸エチルで抽出し； ｅ）この抽出物をヘキサンに添加し、そしてＬＬ−Ｅ３
   ３２８８γ＿２を回収する、 工程を含んでなるＬＬ−Ｅ３３２８８γ＿２及びＬＬ−
   Ｅ３３２８８δ＿１の混合物からＬＬ−Ｅ３３２８８γ
   ＿２を分離する方法。