JPH02196780A - グリコシダーゼ阻害剤サルボスタチンおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的に活性なプソイドジサツ力うイドサ
ルポスタチン、その生理学的に許容し得る塩、その製造
方法および薬学および植物保護におけるその使用に関す
るものである。

サルボスクチンは、式Ｉおよび特有の化学的学および植
物保護に使用するのに適している。

または物理的性質を有する塩基性の非還元性プソイドジ
サッカライドである。

サルボスクチンは、次の配置を有している。

酵素−阻害作用を有する塩基性のプソイドジサッカライ
ドは、繰返して文献〔米国特許第４．０６２，９５０号
、第４．０６５．５５７号および第４．２５４．２５６
号およびＥ、　　Ｔｒｕｓｃｈｅｉｔ等：　Ａｎｇｅｗ
。

Ｃｈｅｍ、　９３．７３８−７５５（１９８１）を参照
されたい〕に記載されている。これらの化合物は、サッ
カロース−阻害性およびマルトース−阻害性または抗菌
性を有しておりそして例えば真性糖尿病の治療にまたは
抗生物質として使用することができる。

本発明の物質であるサルボスクチンは、グリコシダーゼ
−阻害活性を有しそしてそれ故に薬このような塩基性の
環状の非−還元性エーテルは、まだ報告されていない。

本発明の他の主題は、サルボスクチンの明らかな化学的
均等物および生理学的に許容し得る塩、特に一般に知ら
れている方法で製造することのできる塩酸塩のような酸
付加塩に関するものである。

更に、本発明は、 （ａ）商業的に入手できる微生物ストレプトミセスアル
プス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ）　（Ａ
ＴＣＣ２１８３ｇ）およびその変異体および突然変異体
を、培養培地中において、式１の化合物が培養物中に蓄
積されるまで成長させ、そして、もし適当な場合は、 （ｂ）化合物を単離および精製しそして誘導体を形成さ
せることからなるサルボスクチンの製造方法に関するも
のである。

とりわ（す、サルボスクチンは、これらの目的に対して
慣習的である炭素源および窒素源および無機塩を含有す
る栄養溶液中で、ストレプトミセスアルプス（ＡＴＣＣ
２１８３８）によって生産することができる。

勿論、突然変異体および変異体が本発明の化合物を生産
する場合は、菌株２１８３８の代りに突然変異体および
（または）変異体を使用することができる。このような
突然変異体は、紫外線照射またはＸ−線によってまたは
例えばメチルエタンスルホネート（ＥＭＳ）または２−
ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）の
ヨウな化学的変異誘発原によって、それ自体既知の方法
で得ることができる。

好気性醗酵に対する好ましい炭素源の例は、代謝可能な
炭水化物および糖アルコール、例えばグルコース、ラク
トース、またはＤ−マンニトールおよび炭水化物−含有
天然物質例えば麦芽エキスそしてまた油脂である。使用
できる窒素−含有栄養物は、とりわけ、アミン酸、ペプ
チドおよび蛋白およびそれらの分解生成物例えばペプト
ンまたはトリプトン、さらに、肉エキス、粉砕した種子
類、例えばとうもろこし、小麦、大豆または棉植物の種
子、アルコール生産からの蒸溜残留物、肉粉まＩ；は酵
母エキスそしてまたアンモニウム塩および硝酸塩である
。栄養溶液が含有することのできる他の無機塩の例は、
アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩化物、炭酸塩
、硫酸塩または燐酸塩または微量の元素例えば鉄、亜鉛
、コバルトおよびマンガンである。

サルボスクチンは、全体の栄養溶液の重量に関して、大
豆粉、大豆油およびマンニトールのような栄養構成成分
０．１−１５％特にそれぞれの場合において０．１〜３
％を含有する栄養溶液中で有利に形成される。醗酵は、
もし適当であるならば、空気または酸素を導入して振盪
フラスコまたは醗酵基中で振盪または撹拌する好気的例
えば深部培養によって実施される醗酵は、約１８〜３５
°Ｃ１好ましくは約２５〜３０℃、特に２８〜３０℃の
温度範囲で実施することができる。ｐＨ範囲は、６〜８
の間、有利には６．５〜７．５の間にしなければならな
い。これらの条件下において、通常、培養混合物は、６
〜１５日後に、サルボスクチンの評価し得る程度の濃度
を示す。

菌を数回の工程で培養すること、即ち、はじめに１回ま
たはそれより多くの予備培養を液体培養培地中で実施し
そして次に主培養である生産培地にこれらの培養物を例
えばｌ：１０容量比で接種することが有利である。例え
ば、予備培養物は、栄養溶液に胞子−生産菌糸体を接種
しそして培養菌を約８０〜４００時間成長させることに
よって得られる。胞子−生産菌糸体は、菌株を固体また
は液体の培養培地、例えば酵母−麦芽寒天上で約１２日
成長させることによって得ることができる。

醗酵方法は、培養液のｐＨまＩ；は菌糸体の容量によっ
て、または、生物学的活性度の試験によって監視するこ
とができる。菌糸および培養炉液の間者がサルボスクチ
ンを含有している。しかしながら、大量のサルボスクチ
ンは、一般に、培養が液中に見出される。

前述した化合物は、例えばイオン交換体上におけるクロ
マトグラフィー処理、分子篩、吸着樹脂および逆相支持
体によるようなまたは溶剤中の沈澱、逆浸透および他の
方法によるような生成物の化学的、物理的および生物学
的性質を考慮に入れた既知の方法によって培地から単離
することができる。

更に、例えばか過または遠心分離によって水性相を菌糸
から分離しそしてそれぞれの相からサルボスクチンを単
離および精製することが有利である。

好ましい方法は、培養が液をブタノールで抽出して脂肪
を除去しそして水性相を真空濃縮することからなる。水
性濃縮物を、２〜５倍量のメタノールでうすめ、これを
沈澱した高分子量の物質から遠心分離によって分離する
。次の工程においては、例えばＤｏｖｅｘ■５０　ＷＸ
　２のような強酸性イオン交換体を使用して塩基性構成
成分を水性メタノール性上澄液から単離する。次に、例
えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅＯＩＲＡ−６８のような陰イオ
ン***換体を使用して両性物質をこれから除去する。

残留する塩基性フラクションは、サルボスクチンを含有
する。例えば５ｅｐｈａｄｅｘＯＬＨ−２のような分子
篩の助けにより脱鉱物質化した後、イオン−交換体クロ
マトグラフィー処理および再度の脱鉱物質化によって、
純粋なサルボスクチンが得られる。第１図は、純粋なサ
ルボスクチンの’　Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。スペ
クトル（ａ）は、４００　ＭＨｚおよび３００にでｄ　
＠−ＤＭＳＯ中で記録した。

化学シフトは、ＴＭＳに関する。スペクトル（ｂ）は、
３００にでＨ２Ｏ１％を添加したｄ＠−ＤＭＳＯ中で記
録しｔこ。

本発明によるサルボスクチンは、ヒトおよび恒温動物に
おける代謝疾患の治療に対するグリコシダーゼ阻害剤と
して適している。トレハラーゼ阻害剤として、サルボス
クチンは、植物保護剤として適している。トレハロース
は、昆虫、カビそしてまた植物界例えばある花粉粒に対
する重要なエネルギー貯蔵物質である。事実恒温動物に
対して重要でないトレハロース化＆は、常に加水分解性
酵素トレハラーゼを包含する。

もしこの酵素が阻害される場合は、選択的にトレバラー
ゼ−依存性である有機体を標的とすることができる。

サルボスクチンによる酵素トレハラーゼの阻害は、高度
に有効である。１Ｏ−７〜１Ｏ−８モルサルボスタチン
溶液は、５０％の酵素阻害を示す。酵素動力学における
詳細な調査は、サルボスクチンがトレハロースに関して
競合的トレハラーゼ阻害剤であるということを示す。阻
害剤恒数Ｋｉは１．８Ｘ　１０−’Ｍである。

更に、本発明は、本発明の化合物の内容を示しそして一
般に知られている方法〔例えば、欧州特許第０．２４０
．８５３号および第０．２２４．０２４号を参照された
〕によって製造することのできる薬学的製剤および植物
保護剤に関するものである。

トレハラーゼ試験ニ ドレバラーゼ試験は、トレハラーゼの作用によってトレ
ハロースから遊離するＤ−グルコースの比色測定に基づ
くものである。

試験を開始する前に、トレハラーゼ（ＳｉｇｍａＮｏ、
　Ｔ　８７７８）を、ｐＨ６，５の２０ｍＭ燐酸塩緩衝
液を使用してｌ　：　１０００の比にうすめる。トレハ
ロースは、０．１Ｍ　２−　（ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸中の０．１Ｍの濃度に溶解する。

試験のはじめに、■、０、トレハロースおよびトレハラ
ーゼのそれぞれ１００μａを合しそして混合物を３７°
Ｃで３０分一定の温度に保持する。バッチを１００°Ｃ
に加熱することによって、反応を中止する。比較対照バ
ッチは、沸騰によって直接（０分）中止する。適当であ
る場合に、サルボスクチンを、水の代りに、種々な濃度
で反応バッチに加える。

トレハロースから遊離するグルコースを、比色的に測定
する。この終りに、グルコースをグルコースオキシダー
ゼによって反応させそして形成したＨ、０を０−ジアニ
シジンの酸化に対して使用する。酸化したジアニシジン
を光度計を使用して測定する。グルコース測定に対する
前述した試薬は、すべて、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、　Ｇｅ
ｒｍａｎｙ、　Ｎｏ−５１０−ＤＡ）によって製造され
たグルコースキットを使用しそして試薬は、同封されて
いるプロトコールに従って、実施した。

実施例　１ 醗酵（２０００（２）によるサルボスクチンの製造。

醗酵によって本発明のグルコシダーゼ阻害剤を得るため
に、生産微生物ストレプトミセスアルプスＡＴＣＣ２１
８３８を、微生物学において慣習であるように、凍結乾
燥永久保存形態のこの菌株から出発して培養する。菌は
、はじめに、滅菌ベトリー皿中の固体の培養培地上で培
養する。

次に、個々のコロニーを、更に斜面寒天管中で培養しそ
して醗酵に対して必要な胞子のマス生産をこれらの培養
菌を使用してＲｏｕｘびん中で実施する。

固体培養培地の寒天培地： デキストリン　　　　　　１５．０９／　Ｑシュクロー
ス　　　　　　　２．０９／　Ｑ肉エキス　　　　　　
　　１．Ｏｇｚｌ酵母エキス　　　　　　　　２．０ｙ
／ｂＫｘＨＰＯ＊　　　　　　　　　　０−５ｆｌ／　
ＱＦｅＳＯ４＠　７Ｈｔｏ　　　　　　　　０．０１ｇ
／　Ｑ寒天　　　　　　　　　　２．０ｙ／　ｒｔりＨ
７，３ １２０℃で２０分滅菌 ３０°Ｃで９日間培養 １本のＲｏｕｘびんの胞子懸濁液を滅菌水１００＋ｎｆ
２にとりそして第１の予備的段階の深部栄養醗酵（バッ
チ容量１．２ｆｆ）に対する接種体として使用する。

予備的段階用の培地： 可溶性澱粉　　　　　　　４．０ｇ／Ｑグルコース　　
　　　　　　１．Ｏｇ／Ｉ２カゼインペプトン　　　　
１．Ｏｇ／Ｑとうもろこし浸出液　　　０．４９／　０
大豆粉　　　　　　　　　０．４９／ａ（ＮＨ４）！Ｓ
Ｏ４０，８ｙ／　ｒｔ ｐＨ８，３ １２０℃で２０分滅菌 １５０ｉｐｍおよび５ｃＩ＋の振幅の振盪機上で１８℃
で２日間培養 ４８時間後に、得られた第１の予備的培養菌（上記参照
）を有する１本のＦｅｒｎｂａｃｈフラスコの内容物を
、再び、上記予備的段階用培地を使用した第２の予備的
段階（容量２００１２）に対する接種体として使用する
。滅菌時間は、３０分である。培養は、５ｍ／秒の周辺
速度およびＯｏ−１ｖｖの通気速度で撹拌しながら、２
８℃で４８時間実施する。

第２の予備培養の内容物を、主醗酵に対する接種体とし
て使用する。

主醗酵用の培地： 落花生粉末　　　　　　　３０．０９／　１２とうもろ
こし浸出固体　　１０．０９／　Ｑとうもろこし澱粉　
　　　２０．ｈ／　Ｑデキストリン　　　　　　４０．
０ｙ／　Ｑ（Ｎｏ、）ｔｓｏｔ　　　　　　　　　５．
０９／　ｒｔＭｇＳＯｓ　＠　７ＨｘＯ５，０９／　Ｑ
ＣａＣＯ３８，０９／　Ｑ ｐＨ６，８ １２０℃で５０分滅菌 主醗酵は、４ｍ／秒の周辺速度およびＱ、５ｖｖｍの通
気速度で撹拌しなから２８°Ｃで実施する。本発明の阻
害剤の形成は、４日後にはじまりそして１０〜１２日後
に最高に達する。最高の醗酵形成に達した後に、醗酵の
内容物を収穫する。式１のサルボスクチンの収量は、培
養溶液Ｎ２当り０．５〜５１９の間にある。

実施例　２ 培養溶液からのサルボスクチンの単離 実施例１からの醗酵溶液２０００（２から、フィルター
プレスの助けによってビオマスを除去しそして透明な液
体をそれぞれｎ−ブタノール６００ｇを使用して２回抽
出する。脂肪を水性相から除去し、次に後者を下向き通
風蒸発器中で１５０Ｑに濃縮しそして次にこの濃縮物を
メタノール６００１２を使用してうすめる。これは、淡
い柔毛状の沈澱を形成する。この沈澱を遠心分離によっ
て分離しそして捨てる。水性のメタノール性上澄液を再
び濃縮し次に乾燥して褐色の粘稠な生成物１８Ｊ１９を
得る。次に、これを、水性媒質中において陽イオン交換
体ＤｏｖｅＸ［Ｆ］５０　ＷＸ　２　（酸形前）上に吸
着させ、吸着した交換体をきれいな水で洗滌しそして阻
害剤を０．５Ｍ水酸化アンモニウム溶液を使用して脱着
する。トレノ１ラーゼー阻害溶離液を集めそして乾燥す
る（３．５ｋｇ）。これから、無定形の化合物を、同様
な操作によって陰イオン交換体Ａ＋ｂｅｒｌｉｔｅ＠Ｉ
ＲＡ−６８７０１２上で分離する。このカラムからの溶
離液は、サルボスクチンを含有する。阻害−活性溶離液
を凍結乾燥して、乾燥した生成物８５０ｇを得る。この
活性物質の５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０上のゲルクロ
マトグラフィーおよび凍結乾燥によって、粗製サルボス
クチン６２９を得る。

次に、この物質３０９を、含量２．４ＱのＳ−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに適用する。こ
の陽イオン交換体は、予め酢酸アンモニウム緩衝液（＋
）Ｈ３，１）で平衡化する。

０〜０．６モル酢酸アンモニウム勾配液を使用して、サ
ルボスクチンを溶離する。トレハラーゼ−阻害フラクシ
ョンを、凍結乾燥しそして次に５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ
−２０そして再びＦｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　ＭＷ−
４０上で脱鉱物質化し次いで凍結乾燥する。純粋な、非
晶質の白色のサルボスクチン５２０ｍｇが得られた。

旋光度〔σ〕Ｗは＋１１５°（氷中Ｃ−である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、 純粋なサルポスタチンの’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す
。 ａ）は４００ ＭＨｚおよび３００ にでｄ、−ＤＭＳＯ中で記録 したものであり、 ｂ）は３００ にでＨ，０ １％を添加 したｄ、−ＤＭＳＯ中で記録したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物およびその明らかな化学的均等物およびその生
   理学的に許容し得る塩。 ２）微生物ストレプトミセスアルブスＡＴＣＣ２１８３
   ８またはその突然変異体または変異体の１つを培養し、
   培養濾液および（または）菌糸体から式 I の化合物を
   単離しそしてそれを精製することからなる請求項１記載
   の式 I の化合物の製法。 ３）培養を深部培養で、好気的条件下に実施する請求項
   ２記載の方法。 ４）請求項１記載の化合物を含有する薬学的製剤。 ５）グルコシダーゼ阻害剤としての請求項１記載の化合
   物の使用。 ６）代謝疾患の治療に対する請求項１記載の化合物の使
   用。 ７）請求項１記載の化合物を含有する植物保護剤。 ８）植物保護剤における活性成分としての請求項１記載
   の化合物の使用。 ９）植物を請求項１記載の化合物で処理することからな
   る植物を昆虫および（または）有害なカビから保護する
   方法。