JPH02162260A

JPH02162260A - 免疫分析用試薬

Info

Publication number: JPH02162260A
Application number: JP31720088A
Authority: JP
Inventors: Takahisa Ueno; 貴久上野; Mamoru Umeda; 梅田　衛
Original assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 1988-12-15
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1990-06-21
Anticipated expiration: 2012-06-25
Also published as: JP2623325B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は免疫分析用試薬、更に詳細には、試料中に存在
する特定の抗原又は抗体を簡単な操作で、感度よく測定
することのできる免疫分析用試薬に関する。

〔従来の技術〕

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患の
臨床診断等において極めて重要であり、種々の測定法が
知られている。その中でも、近年、マーカーを封入させ
たリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を感作させ
、この感作リポソームを検体と共存させてリポソームに
共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体又は抗原
と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複合体を特
異的に破壊させてリポソームから流出するマーカーを測
定し、一方上記と同様の感作リポソームを種々既知量の
抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に流出マーカ
ーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検体に関
する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて、抗体
又は抗原を定量する方法が提案されており、この方法は
操作が簡単な点で注目をあびている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記方法に使用される感作リポソームは、リポソームの
表面に抗体又は抗原を、例えば、Ｎ−スクシンイミジル
３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰ＾）　
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐマドレイミドフェニル）
プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ　−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）及びＮ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（
８ＭＣ３）等の三官能試薬を架橋剤として用いて固定し
たものである。そしてまた、本発明者は、抗体を温和な
条件で過ヨウ素酸で酸化し、次いでこれをヒドロキシア
ミノ基、ヒドラジノ基、ウレイド基、又はアミノ基を有
する化合物を含有するリポソームに結合させて感作リポ
ソームを得る方法（以下、「過ヨウ素酸法」と称する）
を見出し、先に特許出願した。

しかしながら、上記以外の固定化法、例えば、カルボジ
イミド法、カルバミル化法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドパルミチン酸エステル等の活性エステルを用いる方
法等によって固定化した感作リポソームの場合には、リ
ポソームの表面上で抗原抗体反応が生起しているにもか
かわらず、充分に補体を活性化することができないため
、充分なマーカーリリースが得られず、上記の免疫測定
法に使用できなかった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者は鋭意研究を行なった結
果、ハブテン化リン脂質を配合して構成したリポソーム
に抗体又は抗原を固定化すれば、補体活性が向上し、何
れの固定化法によって得られた感作リポソームでも上記
免疫測定法に使用できることを見出し、本発明を完成し
た。

す１工わち、本発明は、リン脂質、ノ＼ブテン化リン脂
質及びコレステロールを主要構成成分とするリポソーム
の表面に抗体又は抗原を固定し、かつリポソーム内に親
水性標識物質を封入したことを特徴とする免疫分析用試
薬を提供するものである。

本発明のリポソームは、従来一般に使用されているリン
脂質、コレステロールとハプテン化リン脂質によって構
成される。

ハプテン化リン脂質としては、トリニトロフェニル（Ｔ
ＮＰ）−丁ミツカブロイル（Ｃａｐ）Ｌ−α−ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＢ）、
ジニトロフェニル（ＤＮＰ）　−ＤＰＰＢ　、ロＮＰ−
Ｃａｐ−〇ＰＰＢ、フルオレッ七インチオカルバミル（
Ｆｌ）−ＤＰＰＢ、アゾベンゼンアルソネート（八Ｂ＾
）−チロシル（Ｔｙｒ）−ロＰＰ［ｌ、ダンシル（ＤＮ
Ｓ）−ＤＰＰＢ、４−ジメチルアミノ−アゾベンゼン−
４′−スルホニル（０＾０Ｓ）−ＤＰＰＢ　、マレイミ
ドベンゾイル（ＭＯ）−ロＰＰＢ、ジチオピリジル（Ｄ
ＴＰ）−ＤＰＰＢ等が挙げられる。

本発明のリポソームの主要構成成分のリン脂質とコレス
テロールは約１　：　１．（モル比）が好ましい。また
ハブテン化リン脂質はリン脂質１モルに対し０．００５
〜０．１モルであることが必要であり、これより少ない
と補体の活性化が不十分であり、またこれを超えて配合
すると補体活性が強くなりすぎて、試料中の不純物によ
ってリポソームが破壊されてしまうので、正確な測定を
行うことができない。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（１０−３
Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレ
セインのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）　；酸化酵素の作用
により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもた
らすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラ
ペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化
合物；ニコチンアミドアゾニシンヌクレオチド（ＮＡＯ
）のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラ
ジカル化合物などが望ましい。

しかしながら、酵素類は本発明にふいては標識物質とし
て使用しない。これらの化合物は、検出方法、感度及び
リポソームの安定性等の因子を勘案した上で、適宜に選
択される。

本発明の免疫分析用試薬は、例えば次の方法で製造され
る。まず、リン脂質、ハプテン化リン脂質、コレステロ
ール、更に必要に応じて、抗体又は抗原と結合し得る官
能基を有する化合物、例えばＤＰＰＢ、ヒドラジン化合
物、ヒドロキシルアミン化合物、ヒドラゾン化合物を加
え、Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ法によってリポソームを調製す
る。具体的には、上記混合物に溶媒を加えて反応させた
後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄
膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を
加え、密栓をして振とうし、リポソムムの懸濁液を得る
。

一方、抗体又は抗原は、過ヨウ素酸法の場合には、抗体
の分子中の糖鎖水酸基のみがホルミル基に酸化されるよ
うな温和な条件で、過ヨウ素酸等を用いて酸化して修飾
抗体とする。ｔたＮ−ヒドロキシスクシンイミドパルミ
チン酸エステル（ＮＨ３Ｐ）等の活性エステル法の場合
には、抗原又は抗体と当該活性エステルをインキユベー
トして修飾抗体とする。

最後に、リポソームと修飾抗体とを緩衝液中で反応せし
めることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られる。

かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に抗体又
は抗原が固定化されたマイクロカプセルとして得られる
。

本発明の免疫分析用試薬を用いる検体試料中の抗原又は
抗体の定量は例えば次のようにして行なわれる。まず、
該試薬、抗原又は抗体を含む試料及び補体を適当な緩衝
液（例えば、ゼラチン−ベロナール緩衝液）中で混合し
、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせる。す
ると、かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識
物質が放出されてくる。

次いで、この標識物質に応じた分析方法（例えば、標識
物質が蛍光物質であれば、蛍光分析法）により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗体
又は抗原の量を測定することができる。

定量操作において使用する補体は、格別限定されないが
、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。

〔発明の効果〕

叙上の如く、ハブテン化リン脂質を構成成分としてリポ
ソームを調製した本発明免疫分析用試薬は、抗体又は抗
原の何れの固定化法によっても高い補体活性を示し、高
感度で被検試料中の抗原又は抗体を定量することができ
る。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１（ｉ）マーカー封入リポソームの調製：口ＰＰＣ（１０
ｍＭ、１００μｌ）、コレステロール（１０ｍＭ、１０
０　μｍ　）　、ＤＴＰ−ＤＰＰＢ　（１ｍＭ、■なし
、■５μ１１■１０μｌ又は■２０μりのクロロホルム
溶解液を１０ａｌ！フラスコに入れ、溶媒のクロロホル
ムをエバポレータで揮散させればフラスコ内面にフィル
ム状物が付着形成される。このフィルム状物を１〜２時
間に亘り真空乾燥した後に、マーカーとして用いられる
カルボキシフルオレセインの０．ＩＮ　Ｎａ０ｔｌ溶液
１００μｌを添加し、ポルテックスミキサーで５〜１０
分間激しく攪拌する。

次いで、過剰のカルボキシフルオレセインを１００００
　Ｘ　Ｇで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセイン
がマーカーとして封入されたリポソーム（ＭＬＶ型）が
得られる。

このリポソームは、０．０１ＭのＨＢＰＢＳ緩衝液（０
，１５Ｍ　、ＮａＣｌ５ｐＨ７，４５）　５００　ｐ　
１中に懸濁させて保存しておく。

（ｉｉ　）修飾抗体の調！ｉｌ：３０ａ＋Ｍ　ＮＨ３Ｐのジメチルホルムアミド溶液ｌＯ
μｌを２％オクチルグルコシド（界面活性剤。

１ｍ１）に加えた。これに更にヤギＩ＠Ｇ（２ｍｇ／ｍ
ｆｆ１．　１ｍりを加え、３７℃で１６時間インキュベ
ートとする。これをセファデックスＧ−５０でゲル濾過
して界面活性剤を除去し、蛋白分画（１ｍｇ／−）を採
取して修飾抗体とする。

（ｉｉｉ　）　リポソームの抗体感作：（ｉ）で得たリ
ポソーム懸濁液５００μｌに（ｉｉ　）で得た修飾抗体
溶液（１■／ｄ）５００μｌを添加して、４℃で１６〜
２０時間インキュベートし、遠心処理して本発明の免疫
分析用試薬である抗体感作リポソームを得た。

斯くして得た抗体感作リポソームは、ｌｄのゼラチン−
ベロナール緩衝液に懸濁して、４℃にて保存する。

（ｉｖ）ウサギ抗ヤギＩｇＧによるリリースアッセイ　
　：希釈には、ゼラチン−ベロナール緩衝液（ＧＶＢ−）　
　に０．１　ｍＭ　ＭｇＣ１＊及び０．０３ｍＭ　［：
ａＣｌｉを添加した緩衝液（ＧＶＢ”ａを使用した。測
定には、（ｉｉｉ　）で調製した抗体感作リポソーム保
存液をＧＶＢ”＋で３００倍希釈して使用した。

又、モルモット補体は同様にＧＶＢ”＋で１ｍ５単位に
なるように希釈して用いた。測定は次の様に行なわれた
。９６穴マイクロプレートに、検体〔ウサギ抗ヤギＩｇ
Ｇ　　（Ｘ　１０”〜×１０’　）　３２５μｌを分申
し、引き続き３００倍希釈したリポソーム懸濁液２５μ
ｌ、補体（３単位）２５μｌの順で分注する。３７℃。

１時間反応させた後、補体反応を停止させるため、１０
＋ｍＭ　ＨＯＴ＾含有ベロナール緩衝液１００μｌを加
える。検体中の抗原量は、リポソームから放出されたカ
ルボキシフルオレセイン量に比例するので、４９０ｎｍ
で励起し、５３０ｎＩ１１のケイ光放出量を測定する。

尚ケイ光強度は、界面活性剤でリポソームを破壊して得
られるケイ光量を１００％として、それに対するマーカ
ーリリース％で表わした。

その結果を第１図に示す。第１図中、曲線■はＤＴＰ−
ＤＰＰＢ無添加、曲線■は５μ！添加、曲線■は１０μ
ｌ添加、曲線■は２０μ！添加のものを示す。第１図に
示す如＜　、ＤＴＰ−ＤＰＰＨの添加によって補体活性
が向上したことがわかる。

実施例２（ｉ）マーカー封入リポソームの調製：ＤＰＰＣ：コレ
ステロール：　［］ＰＰＢ：ＤＴＰ−［］ＰＰＥｌを１
　：　１　：　０．１：　（０，０，００５，０，０１
，０，０２）で用いて実施例１の（ｉ）と同様にしてリ
ポソームを得た。

（ｉｉ）修飾抗体の調製：抗ＣＲＰ抗体（ヤギＩｇＧ分画）　　（４，６■／−１
５００μｌ）を０．１ＭＩ￥酸バッファー（ｐＨ４，０
）を用いるセファデックスＧ２５のゲル濾過によりバッ
ファー交換を行なった。得られたタンパク分画１．６　
ｍｌ　（４，３ｍｇ蛋白／ａｆ）を分取し、これに過ヨ
ウ素酸ナトリウムを０．　ＯＩＭとなるように加え、２
５℃のウォーターバス中で３０分放置した。次いで、反
応物を０．１５ＭＮａＣｌを含む０．月間炭酸バッフｙ
　−（ｐＨ９，２）を用い、セファデックスＧ２５でゲ
ル濾過し、タンパク分画１−（約１．９ｍｇ蛋白／ｒｎ
ｌ）を得た。

（ｉｉｉ　）　リポソームの抗体感作：（１１）で得た
タンパク分画く修飾抗体）に、（ｉ）で得たリポソーム
ペレットを加え、４℃で一昼夜転倒混和した。次いで、
ＧＶＢ−で遠心洗浄し、１ｍ１ＧＶＢ−（０，１％Ｎａ
Ｎａ含有）に懸濁してヤギＩｇＧ結合リポソーム（以下
「抗ＣＲＰリポソーム」と略称する）を得た。

（ｉｖ）’ＣＲＰの定量：９６穴マイクロプレートに、６ｖロ◆３で４００倍希釈
した抗ＣＲＰリポソーム２５μ１１精製ＣＲＰ抗原２５
μｌを加え、３７℃で１時間インキコベートする。これ
に１００倍希釈した抗ＣＲＰ抗体（ウサギ血清）２５μ
１１補体＜４Ｃ１１，。）２５μｌを加え３７℃で１時
間インキュベートした。以下実施例１の（ｉｖ　）と同
様にして補体反応を停止させ、ケイ光放出量を測定して
、マーカーリリース％を求めた。

その結果を第２図に示す。第２図中、曲線■は口ＴＰ−
ロＰＰ［ｌ無添加、曲線■は０．００５添加、曲線Ｏは
Ｑ、（Ｉｎ加、曲線Ｏは０．０２添加のものを示す。

実施例３実施例２の（ｉ）〜（ｉｉｉ　）に＄ける１）ＰＰＩ３
の代りにε−Ｃａｐ　−ＯＰＰ［ｌ　　を用いる以外は
同様にして抗ＣＲＰ　ＩＩポソームを得た。これを用い
て実施例２の（ｉｖ）と同様に操作してマーカーリリー
ス％を求めた。

その結果を第３図に示す。第３図中、曲線■は０ＴＰ−
ロＰＰ８無添加、曲線■は０．０１添加、曲線■は０．
０２添加のものを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得た免疫分析用試薬を用いてウサ
ギ抗ヤギＩｇＧ抗体を測定したときのＤＴＰ−〇ＰＰＢ
添加量とマーカーリリースとの関係を示す図である。第
２図は実施例２で得た免疫分析用試薬を用いてＣＲＰ抗
原を測定しｔこときのＤＴＰ−ＤＰＰＢ添加量とマーカ
ーリリースとの関係を示す図である。第３図は実施例３
で得た免疫分析用試薬を用いてＣＲＰ抗原を測定したと
きのＤＴＰ−ＤＰＰ［ｌ添加量とマーカーリリースとの
関係を示す図である。以　　上

Claims

【特許請求の範囲】１　リン脂質、ハプテン化リン脂質及びコレステロール
を主要構成成分とするリポソームの表面に抗体又は抗原
を固定し、かつリポソーム内に親水性標識物質を封入し
たことを特徴とする免疫分析用試薬。２　リン脂質１モルに対してハプテン化リン脂質が０．
００５〜０．１モルである請求項１記載の免疫分析用試
薬。